Summary
Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.
Abstract
Osteoklasten (OCs) sind knochenresorbierende Zellen, die eine zentrale Rolle bei der Skelettentwicklung und dem Knochenumbau von Erwachsenen spielen. Mehrere Knochenerkrankungen werden durch eine verstärkte Differenzierung und Aktivierung von OCs verursacht, so dass die Hemmung dieser Pathobiologie ein zentrales therapeutisches Prinzip ist. Zwei Schlüsselfaktoren treiben die Differenzierung von OCs von myeloischen Vorläufern voran: der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und der Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B-Liganden (RANKL). Es ist seit langem bekannt, dass sich humane zirkulierende CD14+ -Monozyten in vitro in OCs differenzieren. Die Belichtungszeit und die Konzentration von RANKL beeinflussen jedoch die Differenzierungseffizienz. In der Tat wurden Protokolle für die Erzeugung von humanen OCs in vitro beschrieben, die jedoch oft zu einem schlechten und langwierigen Differenzierungsprozess führen. Hierin wird ein robustes und standardisiertes Protokoll zur zeitnahen Generierung funktionell aktiver, reifer humaner OCs bereitgestellt. CD14+ Monozyten werden aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) angereichert und mit M-CSF geprimt, um RANK hochzuregulieren. Eine anschließende Exposition gegenüber RANKL erzeugt dosis- und zeitabhängig OCs. OCs werden durch Färbung mit Tartratsäure-resistenter Phosphatase (TRAP) und lichtmikroskopischer Analyse identifiziert und quantifiziert. Die Immunfluoreszenzfärbung von Zellkernen und F-Aktin wird verwendet, um funktionell aktive OCs zu identifizieren. Darüber hinaus werden OSCAR+CD14− -reife OCs durch durchflusszytometrische Zellsortierung weiter angereichert und die OC-Funktionalität durch Mineral- (oder Dentin-/Knochen-) Resorptionsassays und Aktinringbildung quantifiziert. Schließlich wird ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, bei reifen OCs eingesetzt, was zeigt, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) für die Integrität des Aktinrings und die OC-Funktion unerlässlich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit ein robuster Assay zur Differenzierung einer hohen Anzahl von OCs etabliert wird, der in Kombination mit Aktinringfärbung und einem ATP-Assay ein nützliches in vitro Modell darstellt, um die OC-Funktion zu bewerten und nach neuen therapeutischen Verbindungen zu suchen, die den Differenzierungsprozess modulieren können.
Introduction
Osteoklasten (OCs) sind mehrkernige Riesenzellen hämatopoetischer Abstammung mit einer einzigartigen Fähigkeit, Knochen zu resorbieren. Sie sind verantwortlich für die Entwicklung und den kontinuierlichen Umbau des Skeletts 1,2. In den skelettalen Entwicklungsphasen leiten sich OCs und geweberesidente Makrophagen von erythromyeloischen Vorläuferzellen ab und besiedeln die Knochennische und das Organgewebe. Unter physiologischen Bedingungen sind erythromyeloische Vorläuferzellen für eine normale Knochenentwicklung und einen Zahndurchbruch erforderlich, während der Zustrom zirkulierender Blutmonozyten in die Knochennische für die postnatale Aufrechterhaltung der OCs, der Knochenmasse und der Knochenmarkhöhle sorgt3. Unter pathologischen Bedingungen werden Monozyten an Orte aktiver Entzündung rekrutiert und können zur pathologischen Knochenzerstörung beitragen 4,5.
Bei Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis kommt es zu einer Gelenkentzündung, die zu einer fortschreitenden Gelenkzerstörung führt, die durch OCs verursachtwird 6. Bei rheumatoider Arthritis (RA) beispielsweise sind überaktivierte OCs für pathologische Knochenerosion und Gelenkzerstörung verantwortlich7,8, und die derzeitigen Behandlungen verbessern oder stoppen die Knochenschädigung oft nicht9,10,11. Veränderungen der zirkulierenden Monozyten sowohl in Bezug auf die Populationsverteilung als auch auf die transkriptomischen und epigenetischen Signaturen wurden bei RA-Patienten berichtet12,13,14. Darüber hinaus wurde berichtet, dass veränderte Monozytenantworten auf Entzündungsstimulation die Osteoklastogenese bei RA-Patienten mit aktiver Erkrankung beeinflussen15,16,17.
Die Differenzierung von OCs ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem myeloische Vorläuferzellen an die Differenzierung in OC-Vorläuferzellen gebunden werden. Während der Osteoklastogenese werden OCs durch Zell-Zell-Fusion, unvollständige Zytokinese und einen Kernrecyclingprozess, der als Spaltung und Fusion bezeichnet wird, riesig und mehrkernig18,19,20. Die Fähigkeit, OCs in vitro zu differenzieren, hat zu bedeutenden Fortschritten im Verständnis der Knochenbiologie geführt21. OCs unterscheiden sich von Vorstufen durch Exposition gegenüber dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und dem Rezeptoraktivator des Kernfaktors kappa-B-Liganden (RANKL). Letzteres ist essentiell für die normale Entwicklung und Funktion von OCs in vitro und in vivo, auch unter entzündlichen Bedingungen6,22,23. RANKL wird durch Osteoblasten und Osteozyten sowie durch aktivierte T-Zellen und Fibroblasten in der entzündeten RA-Synoviapräsentiert 2,24,25. Während des OC-Differenzierungsprozesses regulieren Monozyten, die M-CSF ausgesetzt sind, den Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B (RANK)-Expression auf ihrer Zellmembran hoch und differenzieren sich unter anschließender Stimulation mit RANKL in Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-positive mononukleäre prä-OCs und dann in mehrkernige OCs15,26. OCs produzieren mehrere Enzyme, das wichtigste unter ihnen ist TRAP, das den Abbau von Phosphoproteinen im Knochenermöglicht 27. Ein Regulator und Marker der OC-Differenzierung ist der OC-assoziierte Rezeptor (OSCAR). Es wird früh in Vorläuferzellen hochreguliert, die sich an die OC-Linie binden28. Reife riesige, mehrkernige OCs können die Skelettmatrix abbauen (resorbieren), indem sie eine große Versiegelungszone erzeugen, die aus einem Aktinring besteht, der einen gekräuselten Randumgibt 21,29,30. Die Knochenresorptionsfähigkeit von OCs erfordert eine Reorganisation des Zytoskeletts und die daraus resultierende Polarisation und Bildung einer gewundenen Membran, der sogenannten gekräuselten Grenze. Der gekräuselte Rand ist von einem großen kreisförmigen Band einer F-Aktin-reichen Struktur umgeben, das den Aktinring oder die Dichtungszone darstellt. Die Integrität des Aktinrings ist für OCs essentiell, um Knochen sowohl in vitro als auch in vivo zu resorbieren, und eine fehlerhafte Bildung von gekräuselten Rändern ist mit der Expression der niedervakuolären Adenosintriphosphatase (V-ATPase) assoziiert31,32,33. Darüber hinaus sind OCs mitochondrienreiche Zellen, und Adenosintriphosphat (ATP) assoziiert mit mitochondrialen Strukturen in OCs, die an der gekräuselten Grenze lokalisiert sind31,32,33. Rotenon wirkt als starker Inhibitor des mitochondrialen Komplexes I und beeinflusst die ATP-Produktion. Es wurde auch gezeigt, dass Rotenon die Differenzierung und Funktion von OC hemmt34.
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und optimierte Methode der in vitro Osteoklastogenese aus humanen peripheren Blutproben. Im peripheren Blut des Menschen sind CD14+-Monozyten die Hauptquelle für OCs15,35,36. In diesem Protokoll wurden die Kinetik der Exposition und die Konzentrationen von M-CSF und RANKL für eine optimale Osteoklastogenese angepasst. Mononukleäre Zellen werden zunächst durch einen Dichtegradienten von den im Vollblut vorhandenen Erythrozyten und Granulozyten getrennt; Sie werden dann durch positive Selektion durch magnetische Beads für CD14+-Monozyten angereichert. Die isolierten CD14+ Monozyten werden dann über Nacht mit M-CSF inkubiert. Dies bereitet die Monozyten darauf vor, die Expression von RANK15,26 hochzuregulieren. Die anschließende Zugabe von RANKL induziert zeitabhängig die Osteoklastogenese und Multinukleation. Aktiv resorbierende OCs zeigen die charakteristische Verteilung von F-Aktin-Ringen am Rand der Zellmembran30,32 und die Färbung für TRAP. Reife OCs werden durch Quantifizierung von mehrkernigen TRAP+-Zellen (mehr als drei Kerne) analysiert. Die funktionelle Leistungsfähigkeit reifer OCs kann anhand ihrer Resorption, Aktinringintegrität und ATP-Produktion beurteilt werden. Darüber hinaus können differenzierte CD14− OSCAR+ OCs angereichert und verwendet werden, um die Auswirkungen bestimmter Verbindungen auf die OC-Funktionalität über Mineral- (oder Dentin-) Resorption und F-Aktin-Organisation zu bewerten. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, als Beispiel für eine Verbindung verwendet, die die Funktionalität von OCs beeinflusst. Eine verminderte OC-Resorptionsaktivität unter Rotenon ist mit einer verminderten ATP-Produktion und Aktinringfragmentierung verbunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll einen robusten Assay etabliert, der als Referenzmethode verwendet werden kann, um verschiedene biologische Aspekte der OC-Differenzierung und -Funktion in vitro zu untersuchen.
Diese Methodik kann verwendet werden, um (1) das Potenzial zirkulierender Monozyten zur Differenzierung in OCs in Gesundheit und Krankheiten sowie (2) den Einfluss von therapeutischen Kandidaten auf die OC-Differenzierung und -Funktion zu bewerten. Dieses robuste Osteoklastogenese-Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Wirksamkeit und der Mechanismen knochenspezifischer Therapien sowohl auf die Differenzierung von OC aus Vorläuferzellen als auch auf die Funktion reifer OCs.
Protocol
Buffy-Mäntel, die vom Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) erhalten wurden, und Leukozytenzapfen, die von NHS Blood and Transplant (Newcastle) erhalten wurden, werden Forschern der University of Glasgow in vollständig anonymisierter (nicht identifizierbarer) Form von NHS-Blutspendern zur Verfügung gestellt, die vollständig einwilligen. Die Blutbestandteile des Buffy-Mantels und des Leukozytenkegels werden aus einer NHS-Standardblutspende hergestellt, die in einem NHS-Blutspendezentrum in Schottland oder England abgegeben wird. Der Blutspender gibt zum Zeitpunkt der Blutspende eine informierte Zustimmung für überschüssiges Blut, das nicht in der klinischen Standardpraxis des NHS verwendet wird, um für genehmigte medizinische Forschungsstudien verwendet zu werden. Die ethische Genehmigung der NHS-Forschungsethikkommission und die unterschriebenen Einverständniserklärungen der Spender zur Verwendung dieser Blutspenden liegen im Besitz des NHS-Blutspendedienstes. Die Genehmigung für den Zugang zu und die Verwendung dieser genehmigten Blutspenden in genehmigten medizinischen Forschungsstudien wurde unter Verwendung des standardmäßigen internen Antrags- und Überprüfungsverfahrens des National Blood Transfusion Service (Schottland) und des NHS Blood and Transport (England) beantragt und erhalten. Für die Verwendung der Blutbestandteile für die genehmigten medizinischen Forschungsstudien war keine weitere NHS-REC-Genehmigung oder eine interne Genehmigung der Ethikkommission der Universität Glasgow erforderlich.
1. Allgemeine Hinweise vor dem Start
- Gehen Sie bei allen Arbeiten mit Blut mit Vorsicht vor. Berücksichtigen Sie die potenziellen Gefahren verschiedener Infektionserreger, die in den Proben vorhanden sein können.
- Führen Sie alle Arbeiten im Biosicherheitslabor unter sterilen Bedingungen mit Handschuhen und Laborkittel sorgfältig durch.
- Führen Sie die Biosicherheitsentsorgung gemäß den örtlichen Richtlinien durch.
- Holen Sie vor der Probenentnahme die entsprechenden Einwilligungen und ethischen Genehmigungen gemäß den Vorschriften der örtlichen Behörden ein.
- Im Allgemeinen ergibt 1 ml frisches Blut 1 Million PBMCs, und CD14+ -Monozyten machen etwa 10%-30% der PBMCs aus. Im Vergleich dazu können 10 ml eines Leukozytenkegels 5 x 10 8-15 x 108 PBMCs enthalten. Weitere Informationen zur PBMC-Isolierung finden Sie in einem früheren Protokoll37.
2. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus Vollblut
- Sammeln Sie die erforderliche Menge an frischem Blut von gesunden Spendern in Lithium-Heparin-Sammelröhrchen.
HINWEIS: Es können auch andere Sammelröhrchen mit geeigneten Antikoagulanzien verwendet werden (z. B. Natriumheparinröhrchen). Für höhere Zellzahlen können Leukozytenzapfen oder Buffycoats verwendet werden. - Um die PBMCs zu isolieren, wird das Blut in ein neues 50-ml-Röhrchen übertragen und mit steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 bzw. 1:3 für frisches Blut bzw. Leukozytenzapfen/Buffycoats verdünnt.
- Mischen Sie die Zellen vorsichtig mehrmals durch Umkehrung.
- Bereiten Sie 15-ml-Röhrchen mit 3 ml Dichtegradientenmedium vor. Schichten Sie langsam 8-10 ml verdünntes Blut auf das Dichtegradientenmedium und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ohne Bremse.
Anmerkungen: Tragen Sie das Blut vorsichtig auf das Dichtegradientenmedium auf, um ein Vermischen zu verhindern. Das Mischen kann zum Verlust von PBMCs führen. - Entsorgen Sie vorsichtig die oberste Schicht (die das Plasma enthält) mit einer Pasteurpipette, sammeln Sie die darunter liegende Interphasenschicht mit den PBMCs (weiße, ringförmige Struktur) und übertragen Sie diese Schicht in ein neues 50-ml-Röhrchen.
- Suspendieren Sie die Zellen mit sterilem 1x PBS bis zu 50 mL und waschen Sie das Restdichtegradientenmedium ab, indem Sie bei 300 x g für 10 min bei RT mit Vollbremse zentrifugieren.
- Um Restplättchen zu entfernen, wiederholen Sie den Vorgang mit einem zusätzlichen langsameren Schleudern bei 200 x g für 10 min bei RT ohne Bremse.
- Optional: Um die Verschleppung der roten Blutkörperchen zu entfernen, verdünnen Sie den Lysepuffer der roten Blutkörperchen (10x, Materialtabelle) im Verhältnis 1:10 in destilliertem Wasser und tragen Sie 3 ml des verdünnten Puffers auf das Pellet auf. Mischen und 3 Minuten inkubieren. Waschen Sie das Pellet in bis zu 50 ml 1x PBS und zentrifugieren Sie es bei 300 x g für 10 min bei RT mit voller Bremse.
- Resuspendieren Sie die isolierten und gereinigten PBMCs in 20 ml 1x PBS und zählen Sie sie mit einem Hämazytometer oder anderen Standardmethoden.
HINWEIS: Die Methoden zur Zellverdünnung und Zellzählung müssen entsprechend der verwendeten Zelldichte und des verwendeten Zählgeräts angepasst werden.
3. Anreicherung von CD14+ Monozyten aus PBMCs
- Isolieren Sie CD14+-Monozyten aus den PBMCs mit einem humanen CD14+-Selektionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Table of Materials).
ANMERKUNG: Klassische CD14+CD16− -Monozyten sind die Hauptquelle für OC-Vorläufer35; Alternative Reinigungsmethoden können in Betracht gezogen werden. - Übertragen Sie 1 x 107 PBMCs in ein geeignetes Styropor-Rundbodenröhrchen (d. h. das in den Magneten des Auswahlkits passt) und pelletieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 x g .
- Verwerfen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in Zellseparationspuffer (PBS, 2% fetales Kälberserum [FBS], 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) auf eine Endkonzentration von 1 x 108 Zellen/ ml und inkubieren Sie es mit 10 μl Antikörpercocktail pro 100 μl bei geschlossenem Deckel für 10 min.
Anmerkungen: Die Zellen werden mit 1 x 108 Zellen/ml resuspendiert; Passen Sie die Lautstärke entsprechend an. - Geben Sie nach der Inkubation 10 μl der magnetischen Nanopartikelkügelchen pro 100 μl hinzu und inkubieren Sie sie 3 Minuten lang mit geschlossenem Deckel.
Anmerkungen: Passen Sie die Volumina des Antikörpercocktails und der magnetischen Beads an, um eine Konzentration von 10 μl/ml zu erhalten. - Füllen Sie das Volumen mit dem Zelltrennpuffer auf 2,5 ml auf, legen Sie das Röhrchen in einen Magneten (ohne Deckel) und inkubieren Sie es 3 Minuten lang. Verwerfen Sie die negative Zellpopulation durch eine kontinuierliche Bewegung durch Umkehrung, während sich die Röhre noch im Magneten befindet.
Anmerkungen: Wenn Sie >2 x 108 PBMCs und einen größeren Magneten verwenden, füllen Sie bis zu 5 ml oder 10 ml mit Zellseparationspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. - Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die angereicherten CD14+ -Monozyten, die an den magnetischen Kügelchen befestigt sind, indem Sie sie in 2,5 ml des Zelltrennpuffers resuspendieren. Inkubieren Sie wie zuvor 3 Minuten lang im Magneten, verwerfen Sie die negative Fraktion und wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.
- Zentrifugieren Sie alle gesammelten Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Alpha-Minimum-Essential-Medium (α-MEM; Tabelle der Materialien) ergänzt mit 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin (komplettes α-MEM) und 10 % FBS.
HINWEIS: Eine Reinheitsprüfung nach der Anreicherung mittels Durchflusszytometrie wird empfohlen, und es sollte mit einer Reinheit von ≥96 % gerechnet werden. Zusätzliche Waschschritte (Schritt 3.6) können die Reinheit erhöhen.
4. OC-Differenzierung in vitro
- Zählen Sie die angereicherten CD14+ Monozyten mit einem Hämazytometer.
- Die Zellen werden bei 300 x g für 5 min pelletiert und bei 1 x 106 Zellen/ ml in vollständigem α-MEM resuspendiert, das mit 10 % FBS angereichert ist.
- Zur Unterscheidung der OCs wird M-CSF in einer Endkonzentration von 25 ng/ml in die Zellsuspension gegeben.
Anmerkungen: Für 1 ml Zellsuspension fügen Sie 0,25 μl M-CSF ab einer Stammkonzentration von 100 μg/ml hinzu. - Mischen Sie durch gründliches Pipettieren, um die Zellsuspension zu homogenisieren und 100 μl/Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden auf eine endgültige Zelldichte von 1 x 105 Zellen/ Well zu homogenisieren.
- Geben Sie 200 μl steriles destilliertes Wasser in die Vertiefungen um die plattierten Zellen herum, um eine Verdunstung des Mediums und Kanteneffekte im Kultursystem zu vermeiden.
- Inkubieren Sie die Zellen über Nacht für ca. 18-20 h bei 37 °C mit 5% CO2.
- Entfernen Sie nach der Inkubation über Nacht vorsichtig die Hälfte des Mediums (50 μl/Well) durch Aspiration mit einer P200-Pipette, vermeiden Sie es, den Boden der Well-Vertiefung zu berühren, und ersetzen Sie es durch frisches, warmes komplettes α-MEM, das 10 % FBS, 25 ng/ml m-CSF und 50 ng/ml RANKL enthält, um eine Endkonzentration von 25 ng/ml zu erreichen
Anmerkungen: Für 1 ml Medium fügen Sie 0,25 μl M-CSF und 0,5 μl RANKL ab einer Stammkonzentration von 100 μg/ml hinzu. - Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage und differenzieren Sie die Zellen für 7-14 Tage in OCs (Abbildung 1).
HINWEIS: Halten Sie die M-CSF- und RANKL-Konzentrationen in der gesamten Kultur konstant.
Abbildung 1: OC-Differenzierungs-Workflow. Schematische Übersicht über die CD14+ Monozytenisolierung aus PBMCs und die Differenzierung in reife OCs in Gegenwart von M-CSF und RANKL für 7-14 Tage. RT = Raumtemperatur. Bild erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. TRAP-Färbung für Osteoklasten
- Entfernen Sie vorsichtig das Medium, fixieren Sie die differenziert adhärenten OCs mit 100 μL/Well der zuvor hergestellten Fixierlösung und inkubieren Sie es 1 min lang. Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen, um Kratzer an den adhärenten Zellen zu vermeiden.
Anmerkungen: Die Fixierlösung wird wie folgt hergestellt: 12,5 ml Citratlösung (im TRAP-Färbekit enthalten), 32,5 ml Aceton und 5 ml 37%iges Formaldehyd. - Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 300 μl sterilem destilliertem Wasser. Klopfen Sie die Teller nach dem Waschen trocken.
- Bereiten Sie eine Färbelösung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle) vor. Fügen Sie 5 μl Fast Granat und 5 μL Natriumnitrit hinzu, um die Fast Granat-Lösung herzustellen; Durch Inversion mischen und 3 Minuten bei RT inkubieren. Bereiten Sie 1 ml Färbelösung vor, indem Sie 900 μl steriles destilliertes Wasser, 10 μl Naphthol, 40 μl Acetatlösung, 50 μl Tartratlösung und 10 μl Fast Granatlösung mischen.
- Fügen Sie 100 μL/Well frisch zubereitete Färbelösung hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C im Dunkeln für 20 Minuten.
- Entfernen Sie nach der Inkubation die Färbelösung durch Inversion und waschen Sie die Platte dreimal mit 300 μl/Well destilliertem Wasser.
- Entfernen Sie das überschüssige Wasser, indem Sie die Teller auf Papiertücher klopfen. Lassen Sie die Teller offen und lichtgeschützt über Nacht an der Luft trocknen.
HINWEIS: Trockene Platten können bis zu 6 Monate gelagert werden. Manchmal können Restpuffer die Schimmelbildung begünstigen, die unter dem Mikroskop sichtbar ist. Diese kann jederzeit entfernt werden, indem die betroffenen Brunnen mit destilliertem Wasser gewaschen und wieder an der Luft getrocknet werden. - Nehmen Sie Bilder mit 10-facher oder 20-facher Vergrößerung auf, indem Sie ein Hellfeldmikroskop mit einer Kacheloption verwenden, um die gesamte Well-Oberfläche zu erfassen.
- Zählen Sie die OCs, die als TRAP+ violett gefärbte Zellen mit mehr als drei Kernen identifiziert wurden, manuell mit einer Bildanalysesoftware mit einem Zellzähler-Plugin.
HINWEIS: Die Anzahl der TRAP+ OCs pro Well ist vom Spender abhängig und kann zwischen ~200-1.600 OCs/Well variieren, mit einem Durchschnitt von etwa 1.000 OCs/Well. Darüber hinaus sollten zur Analyse der Daten die OC-Zahlen in drei verschiedenen Vertiefungen (technische Replikate) bestimmt und der Durchschnitt für jede Bedingung und für jedes biologische Replikat berechnet werden.
6. Knochenresorptions-Assay
- Die frisch angereicherten CD14+-Monozyten werden auf 96-Well-Osteo-Assay-Platten mit Calciumphosphat bei 1 x 105 Zellen/Well beschichtet und die OCs für 7-14 Tage differenziert, wie in den Schritten 4.1-4.8 angegeben, und das Medium alle 3 Tage gewechselt.
HINWEIS: Dentin-/Elfenbein- oder rinderkortikale Knochenschnitte können anstelle von Osteo-Assay-Platten verwendet werden. Wenn dies der Fall ist, sollte die Gesamtzeit der Kultur aufgrund des komplexeren zu resorbierenden Substrats auf 14-21 Tage verlängert werden. - Entfernen Sie am Ende vorsichtig das Medium, vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung zu berühren, und lysieren Sie die Zellen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung. Waschen Sie die Brunnen dreimal mit destilliertem Wasser.
- Scannen Sie die trockenen Platten mit einem Hellfeldmikroskop und analysieren/quantifizieren Sie die aufgenommenen Bilder der Resorptionsgruben mit einer Bildanalysesoftware.
7. Aktinring-Fluoreszenzfärbung
- Platte 100 μL/Well der isolierten CD14+ Monozyten in einem 18-Well-Kammerobjektträger mit einer Zelldichte von 1 x 105 Zellen/ Well. Unterscheiden Sie die OCs in Gegenwart von M-CSF und RANKL wie zuvor beschrieben (Schritte 4.1-4.8), einschließlich des Mediumwechsels alle 3 Tage.
- Entfernen Sie am Ende vorsichtig das Medium und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 μL/Well vorgewärmtem PBS, pH 7,4. Lassen Sie die Vertiefungen zwischen den Schritten nicht trocknen.
- Fixieren Sie die Probe mit 100 μL/Well 4%iger Formaldehydlösung in PBS und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei RT auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln.
Anmerkungen: Methanol kann Aktin während des Fixierungsprozesses stören. Daher ist es am besten, auf methanolhaltige Fixiermittel zu verzichten. Das bevorzugte Fixiermittel ist methanolfreies Formaldehyd. Der in diesem Schritt des Protokolls verwendete Orbitalshaker wurde auf eine Leistungseinstellung von 3 von 10 eingestellt. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 μl/Well PBS, permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μL/Well 0,1%iger Triton X-100-Lösung, verdünnt in PBS, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei RT auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln.
- Zweimal mit 200 μL/Well PBS waschen. Um die unspezifische Bindung zu blockieren und das Signal zu verstärken, fügen Sie 100 μl/Well Blockierungslösung hinzu, die mit 2%iger Rinderserumalbumin (BSA)/PBS-Lösung hergestellt wurde. Inkubation für 20 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung und fügen Sie 100 μl/Well fluoreszenzkonjugierte Phalloidinlösung hinzu, die in 2%iger BSA/PBS-Lösung verdünnt ist. 20 min bei RT auf einem Orbitalschüttler mit leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubieren.
Anmerkungen: Passen Sie die Konzentration des Phalloidin-Farbstoffs gemäß den Empfehlungen des Herstellers an. - Zweimal mit 200 μL/Well PBS waschen, die Kerne mit 100 μL/Well einer PBS-Lösung mit 300 nM DAPI färben und 10-15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler mit leichtem Schütteln und lichtgeschützt inkubieren.
HINWEIS: DAPI wird in destilliertem Wasser verdünnt, um eine 14,3 mM (5 mg/ml) DAPI-Stammlösung herzustellen. Die Stammlösung wird weiter auf die Endkonzentration von 300 μM verdünnt. Schließlich wird die 300 μM DAPI-Lösung noch einmal in PBS auf eine Endkonzentration von 300 nM verdünnt. - Entfernen Sie nach 10-15 Minuten die DAPI-Lösung und ersetzen Sie sie durch 100 μL/Well PBS.
HINWEIS: Bewahren Sie den Objektträger je nach gewähltem Kammerobjektträger entweder mit einem geeigneten PBS-Volumen (100 μL/Well für 18-Well-Objektträger) auf oder montieren Sie den Objektträger mit Deckgläsern und einem geeigneten Eindeckmedium. Die Kammerobjektträger können bis zu 1 Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden. Verwenden Sie für Objektträger mit 18-Well-Kammern ein Färbevolumen von 50-100 μl und 200-300 μl zum Waschen. Skalieren Sie entsprechend für die anderen Kammerobjektträgergrößen. Um eine Verdunstung zu vermeiden, bewahren Sie die Deckgläser während der Inkubationszeiten in einem abgedeckten Behälter auf. Die Verwendung eines Orbitalschüttlers wird empfohlen, ist aber nicht zwingend erforderlich. - Visualisieren Sie die Färbung mit geeigneten Immunfluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopen und Vergrößerungen zwischen 4x und 40x.
8. Anreicherung von reifen OCs und OC-Precursoren mittels Durchflusszytometrie-Sortierung
- Resuspendieren Sie die frisch angereicherten CD14+ -Monozyten mit 1 x 106 Zellen/ml und differenzieren Sie sie in Gegenwart von M-CSF und RANKL auf die gleiche Weise wie oben beschrieben (Schritte 4.1-4.8) in reife OCs.
HINWEIS: Wenn Sie von einer 96-Well-Platte auf eine größere Plattengröße skalieren, befolgen Sie Tabelle 1. Diese Volumina werden ausgehend von einer Lösung von 1 x 106 Zellen /ml berechnet und bieten eine optimale Dichte für die Zell-Zell-Fusion. - Waschen Sie die Vertiefungen an Tag 7 einmal mit warmem PBS und fügen Sie 50 μl bis 1 ml Accutase hinzu (das Volumen wird durch die verwendete Plattengröße bestimmt). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% CO2 für 20 min.
- Überprüfen Sie die Platten nach der Inkubation unter einem Lichtmikroskop, um festzustellen, ob sich die Zellen abgelöst haben. Nehmen Sie die Zellen weiter ab, indem Sie die Platten von allen Seiten klopfen und auf und ab pipettieren.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Vertiefungen mit warmem PBS (keinCa2+, kein Mg2+) und kombinieren Sie sie mit der Zellsuspension. Wiederholen Sie die Schritte 8.2-8.3 ein- oder zweimal, bis sich die meisten Zellen gelöst haben.
HINWEIS: Accutase, die empfohlene Methode vor der Oberflächenfärbung für die durchflusszytometrische Analyse, löst keine sehr großen OCs ab. Die Rückgewinnungsrate beträgt ~50%-70%. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PBS und zählen Sie die Zellen durch Trypanblau-Ausschluss.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 x 106 Zellen/ml, entfernen Sie 100 μl, was 1 x 10 5 Zellen entspricht, und übertragen Siediese Zellen in ein neues Polypropylen-Reagenzglas. Fügen Sie 200 μl des Zellsortierpuffers hinzu und legen Sie diesen als ungefärbte Kontrolle auf Eis beiseite.
- Die restlichen Zellen werden mit Lebend-/Totfarbstoff gefärbt, der bei 1:750 für 10 min bei RT verdünnt und vor Licht geschützt ist.
HINWEIS: Die Lebend-/Totfärbung muss in Abwesenheit von FBS durchgeführt werden, um eine starke Hintergrundfärbung zu vermeiden. - Füllen Sie das 15-ml-Sammelröhrchen mit der lebenden/tot gefärbten Zellsuspension mit warmem Zellsortierpuffer auf (1 x PBS, kein Ca 2+, kein Mg2+, 1 % FBS und 5 mM EDTA) und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 300 x g, um die Zellen zu pelletieren.
Anmerkungen: Eine hohe EDTA-Konzentration und eine niedrige FBS-Konzentration im Sortierpuffer werden empfohlen, um Zellverklumpungen zu vermeiden. - Entnehmen Sie ein Volumen, das 1 x 105 Zellen entspricht , und übertragen Sie sie in ein neues Polypropylen-Reagenzglas für die OSCAR-Isotypkontrolle. Übertragen Sie alle verbleibenden Zellen zur Färbung und Zellsortierung in ein anderes Polypropylen-Reagenzglas.
Anmerkungen: Für die Sortierung werden Reagenzgläser aus Polypropylen verwendet, da die Zellen an diesen Röhrchen weniger haften, als an Styroporröhrchen. - Drehen Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 400 x g , um die Zellen zu pelletieren, und verwerfen Sie den überschüssigen Überstand durch Inversion.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer Antikörper-Mastermix-Lösung, die gemäß Tabelle 2 hergestellt wird. Anstelle des OSCAR-Antikörpers wird das OSCAR-Isotyp-Kontrollröhrchen mit CD14-Antikörpern und OSCAR-Isotyp-Kontrollen angefärbt.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C lichtgeschützt für 30 min.
- Nach 30 Minuten werden die Zellen durch Zugabe von fünf Volumina des Zellsortierpuffers gewaschen und 5 Minuten bei 4 °C bei 400 x g zentrifugiert.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 300-1.000 μl kaltem Zellsortierpuffer und erfassen Sie die Zellen mit einer Durchflusszytometrie-Sortiermaschine, die mit einer 100-μM-Düse ausgestattet ist.
HINWEIS: OCs sind sehr klebrige Zellen, daher ist es wichtig, sie vor der Sortierung durch eine sterile 70-μm-Membran zu filtern. - Gate der OCs und Pre-OCs als CD14−OSCAR+. Stellen Sie das OSCAR+ -Gate basierend auf dem OSCAR-Isotyp-Kontrollrohr ein.
- Die sortierten Zellen werden in Polypropylen-Reagenzgläsern gesammelt, die vollständiges α-MEM enthalten, das mit 20 % FBS bei 8 °C angereichert ist.
- Nach der Sortierung werden die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 Minuten bei RT pelletiert, die Zellen gezählt und für nachgelagerte Anwendungen resuspendiert.
HINWEIS: Um ~ 1 x 105 sortierte Pre-OCs/OCs zu erhalten, beginnen Sie normalerweise mit ~ 10 x 106 Zellen, die an Tag 0 plattiert sind. Die geringe Wiederfindungsrate wird durch den Zellverlust während der Ablösung mit Accutase und durch die Aufbereitung zur Färbung und Sortierung beeinflusst. Es wird empfohlen, das gesamte Verfahren mit sterilen Puffern und Reagenzien durchzuführen und unter sterilen Bedingungen zu arbeiten.
9. ATP-Assay für mitochondriale Aktivität
- Die angereicherten CD14+ -Monozyten werden in Gegenwart von M-CSF und RANKL in einer 96-Well-Platte auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben (Schritte 4.1-4.8) inkubiert. Legen Sie vier zusätzliche Bedingungen in dreifacher Ausführung auf, um sie als Kontrollen zu verwenden.
- Führen Sie den ATP-Assay mit dem Lumineszenz-ATP-Detektions-Assay-Kit gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers durch. Um die ATP-Lösung herzustellen, werden kurz 10 ml der Substratpufferlösung in das lyophilisierte Substrat gegeben und 30 Minuten bei RT inkubiert.
HINWEIS: Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um die intrazelluläre ATP-Produktion zu messen. In dieser Arbeit haben wir die Detektion der ATP-Produktion durch Lumineszenz verwendet. - Während der Inkubation werden die Kontrollen wie folgt vorbereitet und direkt in die Kontrollvertiefungen gegeben: 2-Desoxy-D-Glucose (2DG) bei 10 mM und 100 mM, Oligomycin bei 1 μM und 100 mM 2DG in Kombination mit 1 μM Oligomycin. 30 min bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.
HINWEIS: Das 2DG blockiert die Glykolyse, während Oligomycin ein Inhibitor der oxidativen Phosphorylierung ist. Die Kombination dieser beiden Inhibitoren führt zu einem vollständigen Verlust der ATP-Produktion durch Glykolyse und oxidative Phosphorylierung, was bedeutet, dass sie als interne Kontrolle für den ATP-Assay dienen. Für 10-mM- und 100-mM-2DG-Kontrollen fügen Sie 0,5 μl bzw. 5 μl 2M 2DG-Stammlösung pro 100-μl-Kulturvertiefung hinzu. Für 1 μM Oligomycin wird die 5 mM Stammlösung 1:100 in Medium verdünnt und 2 μL/Well in die dafür vorgesehenen Kontrollwellen gegeben. Für die letzte Kontrolle werden 5 μl 2DG und 2 μl verdünnte Oligomycinlösung pro Well hinzugefügt. - Geben Sie 50 μl der ATP-Lösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen, und inkubieren Sie sie bei RT auf einem Schüttler bei 700 U/min für 5-10 Minuten vor Licht geschützt.
- Übertragen Sie 100 μl des Überstands auf eine 96-Well-White-Bottom-Platte, die speziell für den ATP-Assay entwickelt wurde, und lesen Sie die Platte mit einem Lumineszenz-Reader ab.
Representative Results
OC-Generierung aus CD14+ Monozyten
Diese Methode zielte darauf ab, eine große Anzahl von OCs aus humanen CD14+-Monozyten im peripheren Blut in vitro, typischerweise innerhalb von 1 Woche, leicht zu unterscheiden. Zunächst wurden CD14+-Monozyten aus PBMCs angereichert und über Nacht mit M-CSF geprimt, um RANK hochzuregulieren, wie bereits berichtetwurde 15. Um nach dem Monozyten-Priming die optimale Konzentration von RANKL für die OC-Differenzierung und -Reifung zu bestimmen, wurden RANKL-Konzentrationen von 1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml zusammen mit 25 ng/ml m-CSF verwendet. Die Zugabe von RANKL führte zu einer zunehmenden Anzahl großer TRAP-positiver mehrkerniger OCs in dosisabhängiger Weise, was mittels TRAP-Färbung untersucht wurde. Reife OCs sind definiert als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise mehr als drei; Abbildung 2A,B und ergänzende Abbildung 1). Des Weiteren wurde die Kinetik der OC-Differenzierung von Monozyten mittels TRAP-Färbung und Lichtmikroskopie über einen Kulturzeitraum von 2-14 Tagen untersucht. In diesem Fall wurde eine OC-Differenzierung mit einer mittleren Konzentration von 50 ng/ml RANKL gewählt, um zu beurteilen, wie schnell sich OCs in Kultur differenzieren. Unter diesen Kulturbedingungen waren ab Tag 5 mehrkernige OCs sichtbar, und eine optimale Differenzierung wurde an Tag 7 erreicht (Abbildung 2C). Die verlängerte Inkubation von Kulturen über 10 Tage auf Kunststoffen hinaus führte zu abnorm riesigen fusionierten Zellen. In diesem Protokoll werden in der Regel die Tage 6-8 als optimaler Endpunkt der OC-Generierung verwendet. Die OCs können quantifiziert oder für Downstream-Assays verwendet werden.
Funktionelle Bewertung differenzierter OCs
Um die funktionelle Aktivität der erzeugten OCs zu bestimmen, untersuchten wir ihre resorptive Aktivität durch Differenzierung der OCs auf einer mineralisierten Oberfläche. Da große OCs erst nach einer Kulturperiode von 7 Tagen gebildet werden und um genügend Zeit für die Resorption des Mineralsubstrats zu haben, wurden die Kulturen bis zum 10. Tag beibehalten. Die Bildung von runden Löchern oder Resorptionsgruben wurde nur auf den mineralisierten Oberflächen von Bohrlöchern beobachtet, die Zellen enthielten, die sowohl mit M-CSF als auch mit RANKL behandelt worden waren (Abbildung 3). Der prozentuale Anteil der gelösten mineralisierten Oberfläche (Resorptionsgruben) ermöglicht somit die Bestimmung der OC-Resorptionskapazität. Darüber hinaus zeigten die OCs, die nach diesem Protokoll bis Tag 7 differenziert wurden, sowohl auf Kunststoff- als auch auf Glaskammerobjektträgern, eine gut organisierte Aktinringstruktur, die durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden konnte (ergänzende Abbildung 2).
Wirkung eines Inhibitors auf die reife OC-Funktion
Die oben genannten Kultivierungsbedingungen wurden genutzt, um die funktionelle Leistungsfähigkeit der in vitro erzeugten OCs in Gegenwart des bekannten OC-Inhibitors Rotenon34 zu bestimmen. Die OCs wurden für 6-8 Tage differenziert und CD14−OSCAR+ OCs und OC-Vorstufen mittels Durchflusszytometrie angereichert (Abbildung 4). Die angereicherten Zellen wurden dann mit 50.000 Zellen/pro Well für 3 Tage auf eine mineralbeschichtete 96-Well-Platte in pro-osteoklastogenem Medium (25 ng/mL M-CSF und RANKL) plattiert. Die Behandlung mit Rotenon (Abbildung 5A,B) hemmte dosisabhängig die Resorption der mineralisierten Oberfläche im Vergleich zur unbehandelten Kontrollbohrung, was mit früheren Studien übereinstimmt34. Zusätzlich wurde die OC-Funktionalität anhand der ATP-Produktion und der Aktinringbildung untersucht. Die Rotenon-abhängige Hemmung der OC-Resorption war mit der Hemmung der ATP-Produktion assoziiert (Abbildung 5C). Resorbierende OCs sind stark polarisierte Zellen, die ihre Resorptionskapazität regulieren, indem sie die Organisation des Zytoskeletts fördern. Alexa Fluor 647 konjugiertes Phalloidin wurde verwendet, um das F-Aktin-Zytoskelett der reifen OCs zu markieren, die in An- oder Abwesenheit von Rotenon kultiviert wurden. Rotenon verursachte die Fragmentierung des RANKL-abgeleiteten Aktinrings der reifen OCs (Abbildung 5D).
Abbildung 2: OCs, die sich effizient von CD14+ -Monozyten-Vorläufern unterscheiden. CD14+ Monozyten wurden magnetisch angereichert, mit 1 x 105 Zellen /Well in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht mit 25 ng/mL M-CSF inkubiert. (A) M-CSF-geprimte Monozyten wurden mit steigenden Konzentrationen von RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml) stimuliert, fixiert und an Tag 7 für TRAP gefärbt. Es wurden Bilder aufgenommen und die mehrkernigen TRAP+ -Zellen (MNCs) gezählt. Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 3). Die Daten wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und dem Holm-Sidak-Mehrfachvergleichstest für gepaarte Daten analysiert. * P ≤ 0,05 und ** P ≤ 0,005. (B) Repräsentatives Bild einer TRAP-gefärbten Vertiefung einer 96-Well-Platte, die die typische Menge an erwarteten OCs/Well und deren Morphologie unter 25 ng/mL RANK-L im Vergleich zu M-CSF-abgeleiteten Makrophagen an Tag 7 zeigt. Maßstabsbalken: 1000 μm. (C) Repräsentative Bilder der OC-Bildung unter 50 ng/ml RANKL, bewertet mittels TRAP-Färbung von Tag 2 bis Tag 14. OCs sind ab Tag 5 sichtbar. Riesige, abnorm verschmolzene OCs sind nach 10 Tagen vorhanden. Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Resorptive OCs im Unterschied zu CD14+ Monozyten. CD14+ Zellen, die aus PBMCs isoliert wurden, wurden in Gegenwart von 25 ng/mL M-CSF (M) und RANKL (R) auf Mineralassay-Oberflächenplatten (Osteo-Assay) für 10 Tage in OCs differenziert. (A) Bilder von repräsentativen rekonstruierten Brunnen, die mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, um die Resorption an Tag 10 zu analysieren (mineralisches Substrat in grau; Resorptionsgruben in weiß). Maßstabsbalken: 1000 μm. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der resorbierten Fläche. Die Resorptionsdaten wurden mit einer Wilcoxon-Paaranalyse analysiert. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrische Anreicherung von CD14−OSCAR+ OCs. CD14+ Monozyten wurden aus PBMCs angereichert und die OCs wie zuvor beschrieben differenziert. Adhärente OC-Kulturen wurden mit Accutase abgelöst und für die Durchflusszytometrie gefärbt. (A-C) Die OCs an Tag 8 wurden anhand der CD14- und OSCAR-Expression sortiert. (A) Repräsentative Sortier-Gating-Strategie. Die Zellen wurden als Singuletts gated und negativ für die Totfärbung, und die CD14+ OSCAR+ (rot) und CD14− OSCAR+ (blau) Untergruppen wurden sortiert. (B) Repräsentative Diagramme, die die überlappende OSCAR-Färbung von RANKL-abgeleiteten OCs (cyan) und Kontroll-M-CSF-abgeleiteten Makrophagen (orange) zeigen. In Rot ist die OSCAR-isotypgefärbte Kontrolle von RANKL-abgeleiteten OCs dargestellt. (C) Die sortierten Populationen wurden auf Plastik plattiert und 2 h lang in pro-OC-Medium (25 ng/mL M-CSF und 50 ng/mL RANKL) haften, gefolgt von TRAP-Färbung und Visualisierung. Die repräsentativen Bilder zeigen einen Mangel an TRAP+-Zellen in der CD14+-Untergruppe (rot) und ein- und mehrkernige TRAP+-Prä-OCs und OCs in der CD14−-Untergruppe (blau). Maßstabsbalken: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Assays zur Beurteilung der Funktion reifer OCs. Um die Funktion reifer OCs zu evaluieren, wurden CD14+ Zellen, die aus PBMCs isoliert wurden, entweder mit M-CSF (M) allein oder in Kombination mit RANKL (R) für 7 Tage kultiviert, die OCs mittels Durchflusszytometrie angereichert und die OCs dann 24 h lang mit dem Inhibitor Rotenon behandelt. (A) Reife OCs wurden mittels Durchflusszytometrie (CD14−OSCAR+) und wurden 3 Tage lang auf einer Mineralassay-Oberfläche in An- oder Abwesenheit von Rotenon kultiviert, wonach die Zellen gebleicht und bei 10x abgebildet wurden, um den resorbierten Bereich (Resorptionsgruben in weiß) sichtbar zu machen. (A) Repräsentative rekonstruierte Bilder von Brunnen. Maßstabsbalken: 1000 μm. (B) Die Quantifizierung des Prozentsatzes der resorbierten Fläche. Die Daten in (B) wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Dunn-Mehrfachvergleichstest (n = 7) analysiert; * P ≤ 0,05 und** P ≤ 0,01. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD. (C) Gesamter intrazellulärer ATP-Gehalt von undifferenzierten und am Tag 7 differenzierten reifen OCs, die mit RANKL differenziert und entweder mit Vehikel oder Rotenon (10 nM und 30 nM) behandelt wurden. Hier wurden 2DG und Oligomycin als Positivkontrollen für den Assay verwendet und 30 min vor der Zelllyse und ATP-Quantifizierung zugegeben. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 4). Die Daten wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und dem Dunnett-Mehrfachvergleichstest für gepaarte Daten analysiert. ** P ≤ 0,01. (D) Ein repräsentatives 20-faches Bild reifer OCs, die auf Aktinringbildung (rot) und Zellkerne (blau) gefärbt wurden, zeigt den Verlust des Aktinrings mit dem Inhibitor. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Plattenformat | 96 Well-Platte | 48 Well-Platte | 24-Well-Platte | 12-Well-Platte | 6-Well-Platte |
| Volumen | 100 μL | 225–250 μL | 450–500 μL | 0,8–1 ml | 1,8–2 ml |
Tabelle 1: Volumen der Zellsuspension für verschiedene Plattenformate. Die Volumina werden ausgehend von einer 1 x 106 Zellen/ ml Lösung berechnet und bieten eine optimale Dichte für die Zell-Zell-Fusion.
| Fluorophor, Klon | Volumen (μL) pro 106 Zellen | |
| CD14 | PE/Cyanin7, HCD14 | 5 μL |
| OSCAR | FITC, REA494 | 10 μL |
| Puffer für die Zellsortierung | 80 μL |
Tabelle 2 : Antikörper-Mastermix-Lösung.
Ergänzende Abbildung 1: TRAP-Färbung der RANKL-Dosis-Wirkungs-Beziehung. CD14+ -Monozyten wurden magnetisch angereichert, mit 1 x 105 Zellen /Well in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht mit 25 ng/mL M-CSF inkubiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung zeigen MCSF-grundierte Monozyten, die mit steigenden Konzentrationen von RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml) stimuliert, fixiert und an Tag 7 für TRAP gefärbt wurden. Maßstabsbalken: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Wirkende Ringfärbung in vollständig differenzierten OCs. (A) Eine 10-fache Vergrößerung von OCs, die auf TC-Kunststoff differenziert und mit AF647-Phalloidin (in rot) gefärbt wurden. Maßstabsleiste: 400 μm. (B) Eine 40-fache Vergrößerung von OCs, die auf Objektträgern aus Glaskammer differenziert und mit AF488-Phalloidin (in gelb) gefärbt wurden. Maßstabsbalken: 100 μm.Die Kerne sind mit DAPI gefärbt, dargestellt in blau in (A) und in cyan in (B). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Einfluss verschiedener FBS-Chargen auf die OC-Differenzierungseffizienz. OCs wurden von CD14+ Monozyten in Gegenwart von 25 ng/mL M-CSF und 50 ng/mL RANKL (MR) für 7 Tage unterschieden. Die Kontrollbohrungen wiesen nur M-CSF (M) auf. (A) Repräsentative 10-fache Vergrößerung (Maßstabsbalken: 400 μm) und (B) Quantifizierung von TRAP-gefärbten OCs, die von einem Donor in zwei verschiedenen FBS-Chargen unterschieden wurden. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD von drei technischen Replikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Die einfache Kultivierung und Isolierung einer großen Anzahl funktioneller OCs in vitro ist wichtig, um das Verständnis der Knochenbiologie und der OC-vermittelten Erkrankungen zu verbessern. Klassischerweise wurden OCs in Kokulturen mit Osteoblasten oder Stromazellen und hämatopoetischen Zellen aus der Milz oder dem Knochenmark erzeugt38,39. Ein bedeutender Durchbruch im Verständnis der Osteoklastogenese war die Identifizierung von RANKL als Hauptregulator der OC-Bildung, -Differenzierung und -Überleben40. Frühe Protokolle von RANKL-abhängigen Kultursystemen verwendeten PBMCs für die OC-Generation21,41,42. Diese Mischkulturen sind jedoch langwierig und weisen viele Störfaktoren auf, die die Möglichkeit einschränken, die direkten Auswirkungen auf die Differenzierung und Funktion von OC zu testen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes und zuverlässiges In-vitro-Modell der Osteoklastogenese aus humanen peripheren CD14+-Monozyten, bei dem eine optimale Osteoklastogenese innerhalb von 7 Tagen erreicht werden kann (Abbildung 1 und Abbildung 2), was im Vergleich zu einigen anderen Protokollen erheblich schneller ist 43,44,45,46. Die wichtigsten Unterscheidungsmerkmale dieses Protokolls sind (1) die Verwendung von gereinigten CD14+-Monozyten, (2) das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der Exposition mit RANKL, (3) die Länge der Kultur (<7 Tage) und (4) der zuverlässige Nachweis der Hemmung der OC-Bildung (TRAP-Färbung) und der Funktion (Resorption, ATP-Produktion, Aktinringreorganisation) mit Inhibitoren.
Bei der Optimierung der Methodik wurden mehrere kritische Punkte identifiziert. Es konnte beobachtet werden, dass die in vitro Differenzierung von OCs stark von der Saming-Dichte der CD14+ Monozyten abhängt. Daher werden in diesem Protokoll die Zellen mit einer hohen Dichte ausgesät (1 x 105 Zellen/Well einer 96-Well-Platte, in 100 μl Medium), da es für die Zellen unerlässlich ist, miteinander interagieren zu können und sich in der Nähe zu befinden, um zu fusionieren und zu reifen OCs zu werden. In ähnlicher Weise schränkt die Aussaat von Zellen mit einer zu hohen Dichte ihre Differenzierung und ihr Wachstum aufgrund mittlerer Einschränkungen und des Mangels an benötigtem Platz ein. Um mit diesem Protokoll maximalen Erfolg zu erzielen, ist es außerdem wichtig, die Dichtegradiententrennung sorgfältig durchzuführen und sicherzustellen, dass die angereicherte Population von CD14+-Zellen so rein wie möglich ist. So führen z.B. unzureichende Waschschritte zu einer mangelnden Entfernung der Blutplättchen, was folglich die Differenzierung der OC hemmt47,48. In ähnlicher Weise kann das Vorhandensein einer geringfügigen T-Zell-Kontamination in isolierten CD14+-Präparaten, die allein mit M-CSF stimuliert werden, zu einer OC-Differenzierung führen, möglicherweise über die RANKL-Sekretion durch T-Zellen49. Daher ist es wichtig, für jedes Experiment eine M-CSF-Kontrolle einzubauen. Eine routinemäßige Reinheitsprüfung, insbesondere bei Verwendung eines neuen Isolationskits, wird ebenfalls empfohlen, um die Reinheit der Probe sicherzustellen.
Optimale OC-Zahlen (Bereich: ~200-1.600 OCs/Well) werden mit α-MEM-Medium erreicht, das mit Nukleosiden und L-Glutamin angereichert ist. Andere konventionelle Nährmedien, darunter das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco und das Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), beeinflussen die OC-Ausbeute. Die Quelle von FBS kann auch die Osteoklastogenese beeinflussen. Unterschiedliche FBS-Chargen können zu einer reduzierten RANK-L-abgeleiteten Osteoklastogenese sowie zum Auftreten einer geringen Anzahl von mehrkernigen TRAP+ -Zellen in den M-CSF-Kontrollen führen (ergänzende Abbildung 3). Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, wird daher empfohlen, neue FBS-Chargen vor der Verwendung zu testen und während der gesamten Experimente mit derselben Charge fortzufahren, um Schwankungen im Differenzierungsprozess zu minimieren. Darüber hinaus stellt die Variabilität von Spender zu Spender in Bezug auf die Gesamtzahl der differenzierten OCs, die zum Endzeitpunkt erhalten wurden, eine Einschränkung dar, wenn dieses Protokoll verwendet wird, um z. B. gesunde Spender mit Patienten zu vergleichen. In diesen Fällen ist es zwingend erforderlich, genau die gleichen Bedingungen und die gleiche Charge von Medium, FBS und anderen Reagenzien zu verwenden.
Ein weiterer notwendiger Schritt für eine optimale OC-Differenzierung und -Reifung ist das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der RANKL-Zugabe. Die Exposition der Zellen bei M-CSF 18-24 h vor RANKL bereitet die Monozyten darauf vor, die RANK-Expression hochzuregulieren15,26. Die Zugabe von RANKL zu diesem Zeitpunkt sorgt für eine optimale OC-Differenzierung in dosisabhängiger Weise. Der Grad der OC-Differenzierung variiert von Spender zu Spender; 25 ng/ml RANKL sind jedoch in der Regel ausreichend, um bei den meisten Spendern eine hohe Anzahl von OCs zu differenzieren. Darüber hinaus kann 25 ng/ml RANKL in Assays für das erste Screening von Verbindungen verwendet werden, da es die Bewertung sowohl der verstärkenden als auch der hemmenden Wirkung der Testverbindungen erleichtert. Andere Kultursysteme haben längere M-CSF-Vorinkubationszeiten vor der RANKL-Zugabe verwendet, was jedoch zu einer längeren Kultivierungszeit für die Osteoklastogenese führt50. Wenn man die geprimten Monozyten über Nacht inkubieren lässt, können sie sich außerdem an die Platte anheften, wenn auch nicht in einem vollständig haftenden Zustand. Daher muss bei der erstmaligen Einführung von RANKL das Medium sehr vorsichtig halb gewechselt werden, anstatt es vollständig zu verändern, um die Ablösung und den Verlust der geprimten Monozyten zu verhindern. Das Medium muss auch alle 3-4 Tage aufgefrischt werden, um eine Erschöpfung des Mediums zu vermeiden und den Zelltod zu verhindern. Darüber hinaus ist es aufgrund des geringen Volumens, das in diesem Assay verwendet wird (100 μL/Well in einer 96-Well-Platte), von größter Bedeutung, einen Rahmen aus leeren Wells zu haben, die mit einer wässrigen Lösung (d. h. steril destilliertem H2O oder PBS) um die Assay-Wells herum gefüllt sind. Dadurch werden Mediumverdunstung und Kanteneffekte vermieden.
Schließlich ist es für metabolische Assays (z. B. ATP-Assays) unerlässlich, dass die Zellen lebensfähig sind, um eine große Standardabweichung zwischen den Replikaten zu vermeiden (Abbildung 5). Eine hohe Viabilität der Zellen ist auch für die Sortierung der Zellen und für die weitere Kultivierung der sortierten OCs wichtig (Abbildung 4). Diese Methode weist jedoch einige Einschränkungen auf. Voll ausgereifte OCs sind sehr haftend und lassen sich nur schwer von den Platten lösen. Die größeren OCs lassen sich oft nicht ablösen, was zu einer geringeren Zellausbeute führen kann. Daher müssen die Zellen nach der Sortierung und vor dem Ausplattieren in der erforderlichen Konzentration gezählt werden. Darüber hinaus wird im vorliegenden Protokoll eine nicht-enzymatische Methode (Accutase) zur Ablösung der OCs verwendet, um Membranveränderungen bei der nachgeschalteten Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie zu verhindern. Die Verwendung von Zellschaber (sowohl mit weichen als auch mit harten Enden) wurde ebenfalls getestet und führte zu einem hohen Zelltod. Die enzymatische Ablösung mit 0,05%igen Trypsin/EDTA-Lösungen kann für eine höhere Ausbeute an abgelösten OCs verwendet werden, wenn die Membranintegrität für nachgeschaltete Anwendungen nicht erforderlich ist. Um zu verhindern, dass die OCs verklumpen, wird außerdem dringend empfohlen, nach der Zellablösung eine hohe Konzentration von EDTA in allen Puffern sowie eine geeignete Filterung vor der durchflusszytometrischen Erfassung zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass OC-Kulturen eine heterogene Population von Zellen sind, die aus reifen OCs, OC-Vorläufern und Makrophagen besteht. Makrophagen können leicht von OCs unterschieden werden, obwohl sowohl mononukleäre prä-OCs als auch multinukleäre OCs OSCAR exprimieren und mit der vorliegenden Methode nicht unterschieden werden können (Abbildung 4). Letzteres stellt in der Tat die Haupteinschränkung dieser Methode dar. Darüber hinaus ist eine geringe Expression von OSCAR auch in M-CSF-Kulturen vorhanden (Abbildung 4B) und könnte auf Makrophagen hindeuten, die für die OC-Linienbindung vorbereitet sind. Es ist wichtig, das Gate für OSCAR+ -Zellen basierend auf dem FMO-Färbesignal festzulegen, wie in Abbildung 4B dargestellt.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine optimierte und robuste Methode zur effizienten Herstellung aktiver und funktionell reifer OCs aus zirkulierenden primären humanen Monozyten. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, OCs in kurzer Zeit zu generieren und eine große Anzahl differenzierter OCs zu erhalten. Diese Methode eröffnet den Weg, um die grundlegenden Mechanismen zu untersuchen, die der Differenzierung und Funktion von OC zugrunde liegen.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Flow Core Facility und der Glasgow Imaging Facility (GIF) innerhalb der School of Infection and Immunity für ihre Unterstützung und Hilfe bei dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
| 8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
| 96-well TC plate | Corning | 3596 | |
| 96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
| Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Acetone | VWR | 20066.330 | |
| Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
| Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
| Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
| ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
| BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
| Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
| Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
| DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
| EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
| EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
| eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
| EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
| Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
| Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
| Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
| Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
| Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
| ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
| L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
| Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
| Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
| Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
| OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
| PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
| Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
| PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
| Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
| REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
| Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
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