Summary
Osteoklaster är viktiga benresorberande celler i kroppen. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för in vitro-differentiering av osteoklaster från humana perifera blodmonocyter. Denna metod kan användas som ett viktigt verktyg för att ytterligare förstå osteoklastbiologi vid homeostas och vid sjukdomar.
Abstract
Osteoklaster (OC) är benresorberande celler som spelar en avgörande roll i skelettutveckling och ombyggnad av vuxna ben. Flera bensjukdomar orsakas av ökad differentiering och aktivering av OC, så hämningen av denna patobiologi är en viktig terapeutisk princip. Två nyckelfaktorer driver differentieringen av OC från myeloida prekursorer: makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator av kärnfaktor kappa-B-ligand (RANKL). Humana cirkulerande CD14 + -monocyter har länge varit kända för att differentiera till OC in vitro. Exponeringstiden och koncentrationen av RANKL påverkar dock differentieringseffektiviteten. Faktum är att protokoll för generering av humana OCs in vitro har beskrivits, men de resulterar ofta i en dålig och långvarig differentieringsprocess. Häri tillhandahålls ett robust och standardiserat protokoll för att generera funktionellt aktiva mogna mänskliga OCs i tid. CD14 + monocyter anrikas från humana mononukleära celler i perifert blod (PBMC) och grundas med M-CSF för att uppreglera RANK. Efterföljande exponering för RANKL genererar OC på ett dos- och tidsberoende sätt. OCs identifieras och kvantifieras genom färgning med tartrat syrabeständigt fosfatas (TRAP) och ljusmikroskopianalys. Immunofluorescensfärgning av kärnor och F-aktin används för att identifiera funktionellt aktiva OC. Dessutom anrikas OSCAR+CD14− mogna OCs ytterligare via flödescytometricellsortering och OC-funktionalitet kvantifierad genom mineralresorptionsanalyser (eller dentin/ben) och aktinringbildning. Slutligen används en känd OC-hämmare, rotenon, på mogna OCs, vilket visar att adenosintrifosfat (ATP) produktion är avgörande för aktinringintegritet och OC-funktion. Sammanfattningsvis etableras en robust analys för differentiering av ett stort antal OCs i detta arbete, vilket i kombination med aktinringsfärgning och en ATP-analys ger en användbar in vitro-modell för att utvärdera OC-funktion och för att screena för nya terapeutiska föreningar som kan modulera differentieringsprocessen.
Introduction
Osteoklaster (OC) är flerkärniga jätteceller av hematopoetisk härstamning med en unik förmåga att resorbera ben. De ansvarar för utveckling och kontinuerlig ombyggnad av skelettet 1,2. I skelettfaserna av utveckling härrör OC och vävnadsbosatta makrofager från erytro-myeloida föregångare och koloniserar bennischen och organvävnaderna. Under fysiologiska förhållanden krävs erytro-myeloida föregångare för normal benutveckling och tandutbrott, medan tillströmningen av cirkulerande blodmonocyter i bennischen ger postnatalt underhåll av OC, benmassa och benmärgshålighet3. Under patologiska förhållanden rekryteras monocyter till platser med aktiv inflammation och kan bidra till patologisk benförstöring 4,5.
Patienter med flera former av artrit upplever ledinflammation, vilket leder till progressiv ledförstörelse orsakad av OC6. Till exempel, vid reumatoid artrit (RA), är överaktiverade OC ansvariga för patologisk benerosion och ledförstörelse 7,8, och nuvarande behandlingar förbättrar eller stoppar ofta inte benskadorna9,10,11. Förändringar i cirkulerande monocyter både vad gäller populationsfördelning och transkriptomiska och epigenetiska signaturer har rapporterats hos RA-patienter12,13,14. Dessutom har det rapporterats att förändrade monocytsvar på inflammatorisk stimulering påverkar osteoklastogenes hos RA-patienter med aktiv sjukdom15,16,17.
Differentieringen av OC är en komplex flerstegsprocess som innefattar involvering av myeloida prekursorceller för differentiering till OC-prekursorer. Under osteoklastogenes blir OC jätte och flerkärnig genom cell-cellfusion, ofullständig cytokinese och en kärnåtervinningsprocess som beskrivs som fission och fusion18,19,20. Förmågan att differentiera p-piller in vitro har möjliggjort betydande framsteg i förståelsen av benbiologi21. OC skiljer sig från prekursorer vid exponering för makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och receptoraktivator för nukleär faktor kappa-B-ligand (RANKL). Det senare är viktigt för normal utveckling och funktion av p-piller in vitro och in vivo, även under inflammatoriska tillstånd 6,22,23. RANKL presenteras av osteoblaster och osteocyter, samt av aktiverade T-celler och fibroblaster i inflammerat RA-synovium 2,24,25. Under OC-differentieringsprocessen uppreglerar monocyter som exponerats för M-CSF receptoraktivator för kärnfaktorkappa-B (RANK) -uttryck på deras cellmembran och, under efterföljande stimulering med RANKL, differentieras till tartrat resistent surt fosfatas (TRAP)-positiva mononukleära pre-OCs och sedan till multinucleated OCs15,26. OC producerar flera enzymer, den främsta bland dem är TRAP, som möjliggör nedbrytning av fosfoproteiner i ben27. En regulator och markör för OC-differentiering är den OC-associerade receptorn (OSCAR). Det uppregleras tidigt i prekursorceller som förbinder sig till OC-linjen28. Mogna jätte flerkärniga OC kan bryta ner (resorbera) skelettmatrisen genom att generera en stor tätningszon, som är gjord av en aktinring som omger en rufsig kant21,29,30. Benresorptionsförmågan hos OC kräver cytoskelettomorganisation och därmed polarisering och bildning av ett krökt membran, vilket är den så kallade ruffled gränsen. Den rufsiga gränsen är omgiven av ett stort cirkulärt band av en F-aktinrik struktur, som är aktinringen eller tätningszonen. Aktinringintegritet är avgörande för att OC ska resorbera ben både in vitro och in vivo, och defekt ruffled kantbildning är associerad med lägre vakuolär adenosintrifosfatas (V-ATPas) uttryck31,32,33. Dessutom är OC mitokondririka celler, och adenosintrifosfat (ATP) associeras med mitokondriella strukturer i OC lokaliserade vid den rufflade gränsen31,32,33. Rotenon verkar som en stark hämmare av mitokondriellt komplex I och påverkar ATP-produktionen. Rotenon har också visat sig hämma OC-differentiering och funktion34.
Detta protokoll beskriver en effektiv och optimerad metod för in vitro osteoklastogenes från humana perifera blodprover. I humant perifert blod är CD14 + -monocyter huvudkällan till OC15,35,36. I detta protokoll har exponeringskinetiken och koncentrationerna av M-CSF och RANKL justerats för optimal osteoklastogenes. Mononukleära celler separeras först från erytrocyterna och granulocyterna närvarande i helblod genom densitetsgradient; de berikas sedan för CD14 + -monocyter med hjälp av positivt urval med magnetiska pärlor. De isolerade CD14 + monocyterna inkuberas sedan över natten med M-CSF. Detta primar monocyterna för att uppreglera uttrycket av RANK15,26. Den efterföljande tillsatsen av RANKL inducerar osteoklastogenes och multinukleation på ett tidsberoende sätt. Aktivt resorberande OC visar den karakteristiska fördelningen av F-aktinringar vid kanten av cellmembranet30,32 och färgning för TRAP. Mogna OCs analyseras genom att kvantifiera TRAP+ flerkärniga (mer än tre kärnor) celler. Den funktionella kapaciteten hos mogna OC kan bedömas genom deras resorption, aktinringintegritet och ATP-produktion. Dessutom kan differentierade CD14− OSCAR+ OCs anrikas och användas för att bedöma effekterna av vissa föreningar på OC-funktionalitet via mineralresorption (eller dentin) och F-aktinorganisation. I detta arbete används dessutom en känd OC-hämmare, rotenon, som ett exempel på en förening som påverkar funktionaliteten hos OC. Minskad OC-resorptionsaktivitet under rotenon är förknippad med minskad ATP-produktion och aktinringfragmentering. Sammanfattningsvis etablerar detta protokoll en robust analys som kan användas som referensmetod för att studera flera biologiska aspekter av OC-differentiering och funktion in vitro.
Denna metod kan användas för att bedöma (1) potentialen hos cirkulerande monocyter att differentiera till OC i hälsa och sjukdomar, samt (2) effekten av terapeutiska kandidater på OC-differentiering och funktion. Detta robusta osteoklastogenesprotokoll möjliggör bestämning av effekt och mekanismer för benriktade terapier på både OC-differentiering från prekursorceller och funktionen hos mogna OC.
Protocol
Buffyrockar erhållna från Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) och leukocytkottar erhållna från NHS Blood and Transplant (Newcastle) tillhandahålls till forskare vid University of Glasgow i en helt anonymiserad (icke-identifierbar) form från fullt samtyckande NHS-blodgivare. Buffy coat och leukocytkon blodkomponenter produceras från en NHS standard bloddonation ges vid ett NHS blodgivarcenter i Skottland eller England. Blodgivaren ger vid tidpunkten för blodgivningen sitt informerade samtycke till överskottsblod som inte används i normal klinisk praxis inom NHS och som ska användas för godkända medicinska forskningsstudier. Det etiska godkännandet från NHS Research Ethics Committee och de undertecknade givarmedgivandeformulären för att använda dessa bloddonationer innehas av NHS blodgivningstjänst. Godkännande för att få tillgång till och använda dessa godkända bloddonationer i godkända medicinska forskningsstudier söktes och erhölls med hjälp av den vanliga interna ansöknings- och granskningsprocessen för National Blood Transfusion Service (Skottland) och NHS Blood and Transport (England). Inget ytterligare NHS REC-godkännande eller internt godkännande från University of Glasgows etiska kommitté krävdes för att använda blodkomponenterna för de godkända medicinska forskningsstudierna.
1. Allmänna anmärkningar före start
- Fortsätt med allt arbete med blod med försiktighet. Tänk på de potentiella farorna med olika smittämnen som kan finnas i proverna.
- Utför allt arbete försiktigt i biosäkerhetslaboratoriet under sterila förhållanden medan du bär handskar och labbrockar.
- Utför biosäkerhetsdestruktion enligt de lokala riktlinjerna.
- Inhämta lämpligt samtycke och etiska godkännanden före provtagning enligt lokala myndigheters föreskrifter.
- I allmänhet kommer 1 ml färskt blod att ge 1 miljon PBMC, och CD14 + monocyter står för cirka 10% -30% av PBMC. Som jämförelse kan 10 ml av en leukocytkon innehålla 5 x 10 8-15 x 108 PBMC. Mer information om PBMC-isolering finns i ett tidigare protokoll37.
2. Isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från helblod
- Samla den nödvändiga volymen färskt blod från friska givare i litiumheparinuppsamlingsrör.
OBS: Andra uppsamlingsrör med lämpliga antikoagulantia kan också användas (t.ex. natriumheparinrör). För högre celltal kan leukocytkottar eller buffy coats användas. - För att isolera PBMC, överför blodet till ett nytt 50 ml rör och späd det med steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i förhållandet 1: 1 eller 1: 3 för färskt blod respektive leukocytkottar / buffy coats.
- Blanda försiktigt cellerna flera gånger genom inversion.
- Förbered 15 ml rör innehållande 3 ml densitetsgradientmedium. Lägg långsamt 8-10 ml utspätt blod på toppen av densitetsgradientmediet och centrifugera vid 400 x g i 30 minuter vid rumstemperatur (RT) utan broms.
OBS: Applicera blodet försiktigt ovanpå densitetsgradientmediet för att förhindra blandning. Blandning kan leda till förlust av PBMC. - Kassera försiktigt det översta lagret (innehållande plasma) med en Pasteur-pipett, samla upp det undre interfasskiktet som innehåller PBMC (vit, ringliknande struktur) och överför detta lager till ett nytt 50 ml rör.
- Häng upp cellerna med steril 1x PBS upp till 50 ml och tvätta bort restdensitetsgradientmediet genom centrifugering vid 300 x g i 10 minuter vid RT med full broms.
- För att ta bort kvarvarande blodplättar, upprepa processen med ytterligare en långsammare snurrning vid 200 x g i 10 minuter vid RT utan broms.
- Valfritt: För att ta bort överföringen av röda blodkroppar, späd röda blodkroppar lysbuffert (10x, materialtabell) 1:10 i destillerat vatten och applicera 3 ml av den utspädda bufferten på pelleten. Blanda och inkubera i 3 min. Tvätta pelleten i upp till 50 ml 1x PBS och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter vid RT med full broms.
- Resuspendera de isolerade och renade PBMC i 20 ml 1x PBS och räkna dem med hjälp av en hemacytometer eller enligt andra standardmetoder.
OBS: Metoderna för cellutspädning och cellräkning måste justeras i enlighet med detta baserat på den celldensitet och räknaranordning som används.
3. Anrikning av CD14 + monocyter från PBMC
- Isolera CD14 + -monocyter från PBMC: erna med ett humant CD14 + urvalssats enligt tillverkarens protokoll (Table of Materials).
OBS: Klassiska CD14 + CD16 − monocyter är huvudkällan till OC-prekursorer35; Alternativa reningsmetoder kan övervägas. - Överför 1 x 107 PBMC till ett lämpligt polystyrenrör med rund botten (dvs. som passar urvalssatsmagneten) och pellet cellerna vid 300 x g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten, suspendera cellpelleten på nytt i cellseparationsbuffert (PBS, 2 % fetalt bovint serum [FBS], 1 mM etylendiamintetraättiksyra [EDTA]) till en slutlig koncentration på 1 x 108 celler/ml och inkubera med 10 μl antikroppscocktail per 100 μl med locket på i 10 minuter.
OBS: Cellerna återsuspenderas vid 1 x 108 celler / ml; Justera volymerna därefter. - Efter inkubation, tillsätt 10 μL av de magnetiska nanopartikelpärlorna per 100 μl och inkubera i 3 minuter med locket på.
OBS: Justera volymerna på antikroppscocktailen och magnetkulorna för att få en koncentration på 10 μl / ml. - Fyll på volymen till 2,5 ml med cellseparationsbufferten, placera röret i en magnet (utan lock) och inkubera i 3 minuter. Kassera den negativa cellpopulationen genom en kontinuerlig rörelse genom inversion medan röret fortfarande är i magneten.
OBS: Om du använder >2 x 108 PBMC och en större magnet, fyll på upp till 5 ml eller 10 ml med cellseparationsbuffert enligt tillverkarens instruktioner. - Ta bort röret från magneten och tvätta de anrikade CD14 + -monocyterna fästa vid magnetpärlorna genom att återsuspendera dem i 2,5 ml av cellseparationsbufferten. Inkubera i 3 minuter inuti magneten som tidigare, kassera den negativa fraktionen och upprepa en gång till.
- Centrifugera alla uppsamlade celler vid 300 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och suspendera cellerna igen i 5 ml alfa minsta essentiella medium (α-MEM; Tabell över material) kompletterad med 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (komplett α-MEM) och 10% FBS.
OBS: En renhetskontroll efter anrikning via flödescytometri rekommenderas och ≥96% renhet bör förväntas. Ytterligare tvättsteg (steg 3.6) kan öka renheten.
4. OC-differentiering in vitro
- Räkna de berikade CD14 + -monocyterna med hjälp av en hemacytometer.
- Pellet cellerna vid 300 x g i 5 minuter och resuspendera vid 1 x 106 celler / ml i fullständig α-MEM kompletterad med 10% FBS.
- För att differentiera OC, tillsätt M-CSF vid en slutlig koncentration av 25 ng / ml till cellsuspensionen.
Anmärkning: För 1 ml cellsuspension, tillsätt 0,25 μL M-CSF från en lagerkoncentration på 100 μg/ml. - Blanda genom pipettering noggrant för att homogenisera cellsuspensionen och platta 100 μl/brunn i en platta med 96 brunnar med plan botten till en slutlig celldensitet på 1 x 105 celler/brunn.
- Tillsätt 200 μl/brunn sterilt destillerat vatten i brunnarna runt de pläterade cellerna för att förhindra mediumavdunstning och kanteffekter i odlingssystemet.
- Inkubera cellerna över natten, i ca 18-20 timmar, vid 37 °C med 5% CO2.
- Efter inkubation över natten, avlägsna försiktigt hälften av mediet (50 μl/brunn) genom aspiration med en P200-pipett, undvik att vidröra brunnens botten och ersätt med färsk varm komplett α-MEM innehållande 10% FBS, 25 ng/mL M-CSF och 50 ng/ml RANKL för en slutlig koncentration på 25 ng/ml
Anmärkning: För 1 ml medium tillsätts 0,25 μL M-CSF och 0,5 μL RANKL från en lagerkoncentration på 100 μg/ml. - Byt media var 3: e dag och differentiera cellerna i OC i 7-14 dagar (figur 1).
OBS: Håll M-CSF- och RANKL-koncentrationerna konsekventa i hela kulturen.
Bild 1: Arbetsflöde för OC-differentiering. Schematisk översikt över CD14 + monocytisolering från PBMC och differentiering till mogna OCs i närvaro av M-CSF och RANKL i 7-14 dagar. RT = rumstemperatur. Bild skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. TRAP-färgning för osteoklaster
- Avlägsna försiktigt mediet, fixera de differentierade vidhäftande OC med 100 μl/brunn av den tidigare beredda fixeringslösningen och inkubera i 1 min. Rör inte brunnarnas botten för att undvika att repa de vidhäftande cellerna.
OBS: Fixeringslösningen framställs enligt följande: 12,5 ml citratlösning (ingår i TRAP-färgningssatsen), 32,5 ml aceton och 5 ml 37% formaldehyd. - Tvätta brunnarna tre gånger med 300 μL sterilt destillerat vatten. Knacka plattorna torra efter tvätt.
- Förbered en färgningslösning enligt tillverkarens instruktioner (materialförteckning); tillsätt 5 μL Fast Garnet och 5 μL natriumnitrit för att göra Fast Garnet-lösningen; blanda genom inversion och inkubera i 3 min vid rumstemperatur. Bered 1 ml färgningslösning genom att blanda 900 μl sterilt destillerat vatten, 10 μl naftol, 40 μl acetatlösning, 50 μl tartrat och 10 μl Fast Garnet-lösning.
- Tillsätt 100 μl/brunn nyberedd färgningslösning och inkubera plattan vid 37 °C i mörker i 20 minuter.
- Efter inkubation, avlägsna färgningslösningen genom inversion och tvätta plattan tre gånger med 300 μl/brunn destillerat vatten.
- Ta bort överflödigt vatten genom att knacka på plattorna på pappershanddukar. Lämna plattorna öppna och skyddade från ljuset för att lufttorka över natten.
OBS: Torra plattor kan förvaras i upp till 6 månader. Ibland kan kvarvarande buffertar främja utvecklingen av mögel, vilket är synligt under mikroskopet; Detta kan avlägsnas när som helst genom att tvätta de drabbade brunnarna med destillerat vatten och låta dem lufttorka igen. - Ta bilder på 10x eller 20x med ett ljusfältmikroskop med ett kakelalternativ för att fånga hela brunnytan.
- Räkna manuellt de OC som identifierats som TRAP + lila färgade celler med mer än tre kärnor med hjälp av en bildanalysprogramvara med ett cellräknarplugin.
OBS: Antalet TRAP + OCs per brunn är givarberoende och kan variera från ~ 200-1,600 OCs / brunn, med ett genomsnitt på cirka 1,000 OC / brunn. För att analysera data bör dessutom OC-numren bestämmas i tre olika brunnar (tekniska replikat), och genomsnittet bör beräknas för varje tillstånd och för varje biologisk replikat.
6. Benresorptionsanalys
- Platta de nyligen anrikade CD14 + -monocyterna på 96-brunns osteoanalysplattor belagda med kalciumfosfat vid 1 x 105 celler / brunn och differentiera OC i 7-14 dagar, som anges i steg 4.1-4.8, och byt medium var tredje dag.
OBS: Dentin / elfenben eller bovina kortikala benskivor kan användas i stället för osteoanalysplattor. Om så är fallet bör kulturens totala tid förlängas till 14-21 dagar på grund av det mer komplexa substratet som ska resorberas. - Vid sluttiden, ta försiktigt bort mediet, undvik att vidröra botten av brunnen och lysera cellerna med 10% natriumhypokloritlösning. Tvätta brunnarna tre gånger med destillerat vatten.
- Skanna de torra plattorna med hjälp av ett ljusfältmikroskop och analysera / kvantifiera de förvärvade bilderna av resorptionsgroparna med hjälp av en bildanalysprogramvara.
7. Fluorescerande färgning av aktinring
- Platta 100 μL/brunn av de isolerade CD14+-monocyterna i ett 18-brunnskammarglas vid en celldensitet av 1 x 105 celler/brunn. Differentiera OC i närvaro av M-CSF och RANKL som beskrivits tidigare (steg 4.1-4.8), inklusive byte av medium var 3:e dag.
- Vid sluttidpunkten, ta försiktigt bort mediet och tvätta varje brunn två gånger med 200 μL/brunn förvärmd PBS, pH 7,4. Låt inte brunnarna torka mellan något av stegen.
- Fixera provet med 100 μl/brunn 4 % formaldehydlösning i PBS och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i orbitalskakapparat med försiktig skakning.
OBS: Metanol kan störa aktin under fixeringsprocessen. Därför är det bäst att undvika metanolhaltiga fixeringsmedel. Det föredragna fixativet är metanolfri formaldehyd. Orbitalskakaren som användes i detta steg i protokollet var inställd på en effektinställning på 3 av 10. - Tvätta två gånger med 200 μl/brunn PBS, permeabilisera cellerna med 100 μl/brunn med 0,1 % Triton X-100-lösning utspädd i PBS och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur på en orbitalskakapparat med försiktig skakning.
- Tvätta två gånger med 200 μl/brunn PBS. För att blockera ospecifik bindning och öka signalen, tillsätt 100 μl/brunn blockerande lösning gjord med 2% bovint serumalbumin (BSA)/PBS-lösning. Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur i orbitalskakning med försiktig skakning.
- Ta bort blockeringslösningen och tillsätt 100 μl/brunn fluorescerande konjugerad falloidinlösning utspädd i 2 % BSA/PBS-lösning. Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur i orbitalskakning med lätt skakning och skyddad från ljus.
OBS: Justera koncentrationen av falloidinfärgen enligt tillverkarens rekommendationer. - Tvätta två gånger med 200 μl/brunn PBS, färga kärnorna med 100 μl/brunn av en lösning av PBS innehållande 300 nM DAPI och inkubera i 10–15 minuter vid rumstemperatur på en orbitalskakapparat med försiktig skakning och skyddad från ljus.
DAPI späds i destillerat vatten för att göra en 14,3 mM (5 mg/ml) DAPI-stamlösning. Stamlösningen späds vidare till den slutliga koncentrationen 300 μM. Slutligen späds 300 μM DAPI-lösningen ytterligare en gång i PBS till en slutlig koncentration på 300 nM. - Efter 10-15 minuter, ta bort DAPI-lösningen och ersätt den med 100 μL/brunn PBS.
OBS: Beroende på vilka kammarglas som valts, förvara antingen med en lämplig volym PBS (100 μL/brunn för kammarglas med 18 brunnar) eller montera glaset med täckglas och ett lämpligt monteringsmedium. Kammarglasen kan förvaras i upp till 1 vecka i kylskåpet. För 18-brunnskammarglas, använd en färgningsvolym på 50-100 μL och 200-300 μL för tvätt. Skala upp för de andra kammarglidstorlekarna i enlighet med detta. För att undvika avdunstning, håll täckglasen inuti en täckt behållare under inkubationstiderna. Användning av orbitalshaker rekommenderas men är inte nödvändigt. - Visualisera färgningen med lämpliga immunofluorescens- eller konfokalmikroskop och förstoringar mellan 4x och 40x.
8. Anrikning av mogna OC och OC-prekursorer via flödescytometrisortering
- Resuspendera de nyligen anrikade CD14+ -monocyterna vid 1 x 106 celler/ml och differentiera dem till mogna OCs i närvaro av M-CSF och RANKL på samma sätt som beskrivits ovan (steg 4.1-4.8).
OBS: När du skalar upp från en platta med 96 brunnar till en större plattstorlek, följ tabell 1; Dessa volymer beräknas med utgångspunkt från en 1 x 106 celler/ml lösning och ger en optimal densitet för cell-cellfusion. - På dag 7, tvätta brunnarna en gång med varm PBS och tillsätt 50 μL till 1 ml (volym bestämd av den använda plattstorleken) accutas. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2 i 20 minuter.
- Efter inkubation, kontrollera plattorna under ett ljusmikroskop för att se om cellerna har lossnat. Lossa cellerna ytterligare genom att knacka på plattorna på alla sidor och pipettera dem upp och ner.
- Samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör. Tvätta brunnarna med varm PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+) och kombinera dem med cellsuspensionen. Upprepa steg 8.2-8.3 en eller två gånger tills de flesta cellerna har lossnat.
OBS: Accutase, den rekommenderade metoden före ytfärgning för flödescytometrisk analys, lossnar inte mycket stora OC. Återvinningsgraden är ~ 50% -70%. - Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter, suspendera cellpelleten igen i 1 ml PBS och räkna cellerna genom trypanblå uteslutning.
- Resuspendera cellerna vid 1 x 106 celler/ml, avlägsna 100 μL motsvarande 1 x 105 celler och överför dessa celler till ett nytt provrör av polypropen. Tillsätt 200 μL av cellsorteringsbufferten och lägg den åt sidan på is som ofärgad kontroll.
- Färga resten av cellerna med levande / dött färgämne utspätt vid 1:750 i 10 minuter vid RT och skyddad från ljus.
OBS: Levande / död färgning måste utföras i frånvaro av FBS för att undvika hög bakgrundsfärgning. - Fyll på 15 ml uppsamlingsröret som innehåller den levande / döda färgade cellsuspensionen med varm cellsorteringsbuffert (1x PBS, ingen Ca 2+, ingen Mg2+, 1% FBS och 5 mM EDTA) och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter för att pellet cellerna.
OBS: En hög koncentration av EDTA och en låg koncentration av FBS rekommenderas i sorteringsbufferten för att förhindra cellklumpar. - Ta bort en volym motsvarande 1 x 105 celler och överför dem till ett nytt polypropenprovrör för OSCAR-isotypkontrollen. Överför alla återstående celler till ett annat polypropenprovrör för färgning och cellsortering.
OBS: Polypropylenprovrör används för sortering eftersom cellerna är mindre benägna att fästa vid dessa rör än vid polystyrenrör. - Snurra rören vid 400 x g i 5 minuter för att pellet cellerna och kassera överflödig supernatant genom inversion.
- Återsuspendera cellpelleten i en masterlösning av antikroppar som beretts enligt tabell 2. Färga OSCAR-isotypkontrollröret med CD14-antikropp och OSCAR-isotypkontroll i stället för OSCAR-antikroppen.
- Inkubera cellerna vid 4 °C skyddade från ljuset i 30 minuter.
- Tvätta cellerna efter 30 minuter genom att tillsätta fem volymdelar av cellsorteringsbufferten och centrifugera vid 400 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Resuspendera cellerna i 300-1,000 μL kallcellssorteringsbuffert och förvärva cellerna med hjälp av en flödescytometrisorteringsmaskin utrustad med ett 100μM munstycke.
OBS: OC är mycket klibbiga celler, så det är viktigt att filtrera dem genom ett sterilt 70 μm membran före sortering. - Grinda OCs och pre-OCs som CD14−OSCAR+. Ställ in OSCAR+ -grinden baserat på OSCAR-isotypkontrollröret.
- Samla de sorterade cellerna i polypropenprovrör som innehåller komplett α-MEM kompletterat med 20% FBS vid 8 °C.
- Efter sortering, pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid RT, räkna cellerna och resuspendera för nedströmsapplikationer.
OBS: Vanligtvis, för att få ~ 1 x 105 sorterade pre-OCs / OCs, börja från ~ 10 x 106 celler pläterade på dag 0. Den låga återvinningsgraden påverkas av cellförlust vid avskiljning med accutas och av bearbetningen för färgning och sortering. Det rekommenderas att utföra hela proceduren med sterila buffertar och reagens och arbeta under sterila förhållanden.
9. ATP-analys för mitokondriell aktivitet
- Inkubera de anrikade CD14+ -monocyterna i närvaro av M-CSF och RANKL i en 96-brunnsplatta på samma sätt som beskrivits tidigare (steg 4.1-4.8). Platta fyra extra villkor i tre exemplar för att använda som reglage.
- Utför ATP-analysen med ATP-detektionssatsen för luminiscens enligt tillverkarens handbok. Kortfattat, för att förbereda ATP-lösningen, tillsätt 10 ml av substratbuffertlösningen till det frystorkade substratet och låt det inkuberas vid RT i 30 minuter.
OBS: Olika metoder kan användas för att mäta den intracellulära ATP-produktionen. Här har vi använt detektering av ATP-produktion genom luminiscens. - Bered och tillsätt kontrollerna direkt till kontrollbrunnarna under inkubationen enligt följande: 2-Deoxy-D-glukos (2DG) vid 10 mM och 100 mM, oligomycin vid 1 μM och 100 mM 2DG i kombination med 1 μM oligomycin. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C med 5 %CO2.
OBS: 2DG blockerar glykolys, medan oligomycin är en hämmare av oxidativ fosforylering. Kombinationen av dessa två hämmare resulterar i fullständig förlust av ATP-produktion via glykolys och oxidativ fosforylering, vilket innebär att de fungerar som en intern kontroll för ATP-analysen. För 10 mM och 100 mM 2DG-kontroller, tillsätt 0,5 μL respektive 5 μL 2M 2DG-stamlösning per 100 μL odlingsbrunn. För 1 μM oligomycin, späd 5 mM stamlösning 1:100 i medium och tillsätt 2 μl/brunn till de särskilda kontrollbrunnarna. För den sista kontrollen, tillsätt 5 μL 2DG och 2 μL utspädd oligomycinlösning per brunn. - Tillsätt 50 μL ATP-lösning till varje brunn för att stoppa reaktionen och inkubera vid rumstemperatur på en shaker vid 700 rpm i 5-10 minuter skyddad från ljus.
- Överför 100 μL av supernatanten till en 96-brunns vitbottenplatta som är specifik för ATP-analysen och läs av plattan med en luminiscensläsare.
Representative Results
OC-generering från CD14 + monocyter
Denna metod syftade till att enkelt skilja ett stort antal OC från humana perifera CD14 + -monocyter in vitro, vanligtvis inom 1 vecka. För det första anrikades CD14 + -monocyter från PBMC och grundades med M-CSF över natten för att uppreglera RANK, som tidigare rapporterats15. Efter monocytpriming, för att bestämma den optimala koncentrationen av RANKL för OC-differentiering och mognad, användes RANKL-koncentrationer på 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml och 100 ng / ml, tillsammans med 25ng / ml m-csf. Tillsatsen av RANKL gav ett ökande antal stora TRAP-positiva flerkärniga OCs på ett dosberoende sätt, och detta bedömdes med hjälp av TRAP-färgning. Mogna OC definieras som TRAP-positiva celler med flera kärnor (vanligtvis mer än tre; Figur 2A, B och kompletterande figur 1). Vidare undersöktes kinetiken för OC-differentiering från monocyter med hjälp av TRAP-färgning och ljusmikroskopi under en 2-14 dagars odlingsperiod. I detta fall valdes OC-differentiering med en mellanliggande koncentration på 50 ng / ml RANKL för att bedöma hur snabbt OCs differentierades i kultur. Under dessa odlingsförhållanden var flerkärniga OC synliga från dag 5 och framåt, och optimal differentiering uppnåddes dag 7 (figur 2C). Den långvariga inkubationen av kulturer utöver 10 dagar på plast resulterade i onormalt jätte smälta celler. I detta protokoll används vanligtvis dag 6-8 som den optimala slutpunkten för OC-generering. OC kan kvantifieras eller användas för nedströmsanalyser.
Funktionell bedömning av differentierade organiserad brottslighet
För att bestämma den funktionella aktiviteten hos de genererade OC: erna undersökte vi deras resorptiva aktivitet genom att differentiera OC: erna på en mineraliserad yta. Eftersom stora OC genereras först efter en 7 dagars odlingsperiod, och för att ge tillräckligt med tid att resorbera mineralsubstratet, bibehölls kulturerna fram till dag 10. Bildandet av runda hål, eller resorptionsgropar, observerades endast på de mineraliserade ytorna av brunnar innehållande celler som hade behandlats med både M-CSF och RANKL (figur 3). Således möjliggör procentandelen upplöst mineraliserad yta (resorptionsgropar) bestämning av OC-resorptiv kapacitet. Dessutom visade OC: erna differentierade efter detta protokoll fram till dag 7, både på plast- och glaskammarglas, en välorganiserad aktinringstruktur som kunde visualiseras genom immunofluorescerande färgning (kompletterande figur 2).
Effekt av en hämmare på mogen OC-funktion
De ovan nämnda odlingsbetingelserna användes för att bestämma den funktionella förmågan hos in vitro-genererade OCs i närvaro av den kända OC-hämmaren, rotenon34. OCs differentierades i 6-8 dagar, och CD14−OSCAR+ OCs och OC-prekursorer anrikades via flödescytometri (figur 4). De anrikade cellerna pläterades sedan vid 50 000 celler/per brunn på en mineralbelagd 96-brunnsplatta i pro-osteoklastogent medium (25 ng/ml, m-csf och RANKL) i 3 dagar. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hämmade dosberoende resorptionen av den mineraliserade ytan i jämförelse med den obehandlade kontrollbrunnen, i överensstämmelse med tidigare studier34. Dessutom utvärderades OC-funktionalitet via ATP-produktion och aktinringbildning. Den rotenonberoende hämningen av OC-resorptionen var associerad med hämningen av ATP-produktionen (figur 5C). Resorberande p-piller är starkt polariserade celler som reglerar deras resorptiva kapacitet genom att främja cytoskeletal organisation. Alexa fluor 647 konjugerat falloidin användes för att märka F-aktincytoskelettet hos de mogna OC: erna odlade i närvaro eller frånvaro av rotenon. Rotenon orsakade fragmenteringen av den RANKL-härledda aktinringen hos de mogna OC (figur 5D).
Figur 2: OC som effektivt skiljer sig från CD14 + monocytprekursorer. CD14 + monocyter anrikades magnetiskt, pläterades vid 1 x 105 celler / brunn i 96-brunnsplattor och inkuberades över natten med 25 ng / mL M-CSF. (A) M-CSF-grundade monocyter stimulerades med ökande koncentrationer av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml och 100 ng/ml), fixerades och färgades för TRAP dag 7. Bilder förvärvades och TRAP + flerkärniga celler (MNC) räknades. Representativa bilder av TRAP-färgning visas i kompletterande figur 1. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 3). Data analyserades med en enkelriktad ANOVA och Holm-Sidaks multipla jämförelsetest för parade data; * P ≤ 0,05 och ** P ≤ 0,005. (B) Representativ bild av en TRAP-färgad brunn på en platta med 96 brunnar som visar den typiska mängden OC/väl förväntat och deras morfologi under 25 ng/ml RANK-L jämfört med M-CSF-härledda makrofager dag 7. Skalstänger: 1000 μm. (C) Representativa bilder av OC-bildning under 50 ng/ml RANKL bedömda via TRAP-färgning från dag 2 till dag 14. OCs är synliga från dag 5 och framåt. Jätte onormalt smälta OC är närvarande efter 10 dagar. Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Resorptiva OC differentierade från CD14 + monocyter. CD14 + -celler isolerade från PBMC differentierades i 10 dagar till OC i närvaro av 25 ng / mL M-CSF (M) och RANKL (R) på mineralanalysytan (osteoanalys) plattor. (A) Bilder av representativa rekonstruerade brunnar tagna med 10x förstoring för att analysera resorptionen på dag 10 (mineralsubstrat i grått; resorptionsgropar i vitt). Skalstänger: 1000 μm. (B) Kvantifiering av procentandelen resorberad area. Resorptionsdata analyserades med en Wilcoxon-paranalys. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 7). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Anrikning av flödescytometri av CD14−OSCAR+ OCs. CD14 + monocyter anrikades från PBMC, och OC differentierades som tidigare beskrivits. Adherent OC-kulturer lossnade med accutas och färgades för flödescytometri. (A–C) OCs vid dag 8 sorterades baserat på CD14 och OSCAR uttryck. (A) Representativ sorteringsgrindstrategi. Cellerna var gated som singlets, negativ för död färgning, och CD14 + OSCAR + (röd) och CD14 − OSCAR + (blå) delmängder sorterades. B) Representativa diagram som visar överlappande OSCAR-färgning av OC härledda från RANKL (cyan) och makrofager som härrör från M-CSF (orange). I rött är OSCAR-isotypfärgad kontroll av RANKL-härledda OCs. (C) De sorterade populationerna pläterades på plast och fick fästa i 2 timmar i pro-OC-medium (25 ng / mL M-CSF och 50 ng / ml RANKL), följt av TRAP-färgning och visualisering. De representativa bilderna visar en brist på TRAP+-celler i CD14+-delmängden (röd) och mono- och flerkärnig TRAP+ pre-OC och OC i CD14−-delmängden (blå). Skalstänger: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Tester för att bedöma funktionen hos mogna aktiva organiska föreningar. För att utvärdera funktionen hos mogna OCs odlades CD14 + -celler isolerade från PBMCs antingen med M-CSF (M) ensam eller kombinerat med RANKL (R) i 7 dagar, OCs anrikades via flödescytometri och OC behandlades sedan med hämmaren rotenon i 24 timmar. (A) Mogna OCs sorterades via flödescytometri (CD14−OSCAR+) och odlades på en mineralanalysyta i närvaro eller frånvaro av rotenon i 3 dagar, varefter cellerna blektes och avbildades vid 10x för att avslöja det resorberade området (resorptionsgropar i vitt). (A) Representativa rekonstruerade bilder av brunnar. Skalstänger: 1000 μm. (B) Kvantifiering av procentandelen resorberad area. Data i (B) analyserades med en enkelriktad ANOVA med Dunns multipla jämförelsetest (n = 7); * P ≤ 0,05 och** P ≤ 0,01. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD. (C) Totalt intracellulärt ATP-innehåll av odifferentierade och dag 7 differentierade mogna OCs differentierade med RANKL och behandlade med antingen vehikel eller rotenon (10 nM och 30 nM). Här användes 2DG och oligomycin som positiva kontroller för analysen och tillsattes 30 min före celllys och ATP-kvantifiering. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD (n = 4). Data analyserades med en enkelriktad ANOVA och Dunnetts multipeljämförelsetest för parade data. ** P ≤ 0,01. (D) En representativ 20x bild av mogna OC färgade för aktinringbildning (röd) och kärnor (blå), som visar förlusten av aktinringen med hämmaren. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Plattans format | 96 brunnsplatta | 48 brunnsplatta | 24 brunnsplatta | 12 brunnsplatta | 6 brunnsplatta |
| volym | 100 μL | 225–250 μL | 450–500 μL | 0,8–1 ml | 1,8–2 ml |
Tabell 1: Cellsuspensionens volym för olika plattformat. Volymerna beräknas med utgångspunkt från en 1 x 106 celler/ml lösning och ger en optimal densitet för cell-cellfusion.
| Fluorofor, klon | Volym (μL) per 106 celler | |
| CD14 | PE/cyanin7, HCD14 | 5 μL |
| OSCAR | FITC, REA494 | 10 μL |
| Buffert för cellsortering | 80 μL |
Tabell 2: Lösning av masterblandning av antikroppar.
Kompletterande figur 1: TRAP-färgning av RANKL-dosresponsen. CD14 + monocyter anrikades magnetiskt, pläterades vid 1 x 105 celler / brunn i 96-brunnsplattor och inkuberades över natten med 25 ng / mL M-CSF, som i figur 2. Representativa bilder av TRAP-färgning visar MCSF-grundade monocyter stimulerade med ökande koncentrationer av RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml och 100 ng / ml), fixerade och färgade för TRAP på dag 7. Skalstänger: 400 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Verkande ringfärgning i helt differentierade OC. (A) En 10x förstoring av OC differentierad på TC-plast och färgad med AF647 falloidin (i rött). Skalstapel: 400 μm. (B) En 40x förstoring av OC differentierad på glaskammarglas och färgad med AF488 falloidin (i gult). Skalstapel: 100 μm.Kärnorna är färgade med DAPI, som visas i blått i (A) och i cyan i (B). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Effekten av olika FBS-satser på OC-differentieringseffektivitet. OCs differentierades från CD14 + monocyter i närvaro av 25 ng / mL M-CSF och 50 ng / mL RANKL (MR) i 7 dagar. Kontrollbrunnarna hade endast M-CSF (M). (A) Representativa förstoringar på 10x (skalstapeler: 400 μm) och (B) Kvantifiering av TRAP-färgade OCs differentierade från en givare i två olika satser av FBS. Felstaplarna visar medelvärdet ± SD för tre tekniska repliker. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Enkel odling och isolering av ett stort antal funktionella OCs in vitro är viktiga för att öka förståelsen av benbiologi och OC-medierade sjukdomar. Klassiskt genererades OC i samkulturer med osteoblaster eller stromaceller och hematopoetiska celler från mjälten eller benmärgen38,39. Ett betydande genombrott i förståelsen av osteoklastogenes var identifieringen av RANKL som den viktigaste regulatorn för OC-bildning, differentiering och överlevnad40. Tidiga protokoll för RANKL-beroende kultursystem använde PBMC för OC-generering21,41,42. Dessa blandade kulturer är dock långa och presenterar många förvirrande faktorer som begränsar möjligheten att testa de direkta effekterna på OC-differentiering och funktion. Detta protokoll beskriver en effektiv och tillförlitlig in vitro-modell av osteoklastogenes från humana perifera CD14 + -monocyter där optimal osteoklastogenes kan erhållas inom 7 dagar (figur 1 och figur 2), vilket är betydligt snabbare jämfört med vissa andra protokoll43,44,45,46. De viktigaste kännetecknen för detta protokoll är (1) användningen av renade CD14 + -monocyter, (2) priming av monocyterna med M-CSF före exponering för RANKL, (3) kulturens längd (<7 dagar) och (4) tillförlitlig detektion av hämning av OC-bildning (TRAP-färgning) och funktion (resorption, ATP-produktion, aktinringomorganisation) med hämmare.
Under optimeringen av metodiken identifierades flera kritiska punkter. Det har observerats att in vitro-differentieringen av OCs till stor del är beroende av sådddensiteten hos CD14 + -monocyterna. Således seedas cellerna i detta protokoll med hög densitet (1 x 105 celler / brunn av en 96-brunnsplatta, i 100 μL medium), eftersom det är viktigt för cellerna att kunna interagera med varandra och att vara i närheten av säkring och bli mogna OC. På samma sätt begränsar såddceller med en densitet som är för hög deras differentiering och tillväxt på grund av medelbegränsningar och brist på det nödvändiga utrymmet. För att uppnå maximal framgång med detta protokoll är det dessutom viktigt att utföra densitetsgradientseparationen noggrant och se till att den anrikade populationen av CD14 + -celler är så ren som möjligt. Till exempel resulterar otillräckliga tvättsteg i brist på avlägsnande av blodplättar, vilket följaktligen hämmar OC-differentiering47,48. På liknande sätt kan förekomsten av mindre T-cellkontaminering i isolerade CD14 + -preparat stimulerade med M-CSF ensam resultera i OC-differentiering, potentiellt via RANKL-utsöndring av T-celler49. Därför är det viktigt att inkludera en M-CSF-kontroll för varje experiment. En rutinmässig renhetskontroll, särskilt vid användning av en ny isoleringssats, rekommenderas också för att säkerställa provets renhet.
Optimala OC-tal (intervall: ~ 200-1,600 OC / brunn) uppnås med hjälp av α-MEM-medium berikat med nukleosider och L-glutamin. Andra konventionella odlingsmedier, inklusive Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) och Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påverkar OC-avkastningen. Källan till FBS kan också påverka osteoklastogenes. Olika satser av FBS kan leda till minskad RANK-L-härledd osteoklastogenes, liksom uppkomsten av lågt antal TRAP + flerkärniga celler i M-CSF-kontrollerna (kompletterande figur 3). För att uppnå konsekventa resultat rekommenderas därför att testa nya FBS-satser före användning och att fortsätta med samma sats under experimenten för att minimera variationer i differentieringsprocessen. Dessutom utgör variationen mellan givare och donatorer, när det gäller det totala antalet differentierade aktiva substanser som erhållits vid sluttidpunkten, en begränsning när man använder detta protokoll för att jämföra till exempel friska givare med patienter. I dessa fall är det absolut nödvändigt att använda exakt samma förhållanden och samma parti medium, FBS och andra reagens.
Ett annat nödvändigt steg för optimal OC-differentiering och mognad är att prima monocyterna med M-CSF före RANKL-tillsatsen. Cellernas exponering för M-CSF 18-24 timmar före RANKL primar monocyterna för att uppreglera RANK-uttryck15,26. Tillägg av RANKL vid denna tidpunkt säkerställer optimal OC-differentiering på ett dosberoende sätt. Graden av OC-differentiering varierar från givare till givare; 25 ng/ml RANKL är dock vanligtvis tillräckligt för att särskilja ett stort antal OC hos de flesta givare. Dessutom kan 25 ng/ml RANKL användas i analyser för initial screening av föreningar, eftersom det underlättar utvärderingen av både de förstärkande och hämmande effekterna av testföreningarna. Andra odlingssystem har använt längre M-CSF-förinkubationstider före RANKL-tillägg, men detta resulterar i en längre odlingstid för osteoklastogenes50. Dessutom lämnar de grundade monocyterna att inkubera över natten tillåter dem att fästa vid plattan, om än inte i ett helt vidhäftande tillstånd. Därför, när RANKL introduceras för första gången, måste mediet bytas mycket noggrant snarare än helt ändras för att förhindra lossning och förlust av de grundade monocyterna. Mediet måste också uppdateras var 3-4: e dag för att undvika medelutarmning och förhindra celldöd. På grund av den låga volym som används i denna analys (100 μl/brunn i en platta med 96 brunnar) är det dessutom av yttersta vikt att ha en ram av tomma brunnar som är fyllda med en vattenlösning (dvs. steril destilleradH2Oeller PBS) runt analysbrunnarna. Detta förhindrar medium avdunstning och kanteffekter.
Slutligen, för metaboliska analyser (t.ex. ATP-analyser) är det absolut nödvändigt att cellerna är livskraftiga för att undvika stor standardavvikelse mellan replikaten (figur 5). Hög livskraft hos cellerna är också viktigt för sortering av cellerna och för vidare odling av de sorterade OC (figur 4). Denna metod har dock flera begränsningar. Fullt mogna OC är mycket vidhäftande och svåra att lossa från plattorna. De större OC är ofta omöjliga att lossa, vilket kan leda till ett lägre cellutbyte. Därför måste cellerna räknas efter sortering och före plätering vid önskad koncentration. I detta protokoll används dessutom en icke-enzymatisk metod (accutas) för att lossa p-p-ämnena för att förhindra membranförändringar i nedströms ytfärgning för flödescytometri. Användningen av cellskrapor (både med mjuka eller hårda ändar) testades också och ledde till hög celldöd. Enzymatisk avskiljning med 0,05% trypsin / EDTA-lösningar kan användas för ett högre utbyte av fristående OCs när membranintegritet inte krävs för nedströmsapplikationer. Dessutom, för att förhindra att p-piller klumpar ihop, rekommenderas starkt användning av en hög koncentration av EDTA i alla buffertar efter cellavskiljning, liksom lämplig filtrering före flödescytometriförvärv. Det är viktigt att notera att OC-kulturer är en heterogen population av celler som består av mogna OC, OC-prekursorer och makrofager. Makrofager kan lätt skiljas från OC, även om både mononukleära pre-OC och multinukleära OC uttrycker OSCAR och inte kan särskiljas med den nuvarande metoden (figur 4). Den sistnämnda frågan utgör faktiskt den huvudsakliga begränsningen med denna metod. Dessutom finns ett lågt uttryck av OSCAR också i M-CSF-kulturer (figur 4B) och kan indikera makrofager som är grundade för OC-härstamningsåtagande. Det är viktigt att ställa in grinden för OSCAR+ -celler baserat på FMO-färgningssignalen, som visas i figur 4B.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en optimerad och robust metod för effektiv produktion av aktiva och funktionellt mogna OCs från cirkulerande primära humana monocyter. Styrkan i detta protokoll är dess förmåga att generera OC på kort tid och ge ett stort antal differentierade OC. Denna metod öppnar för att undersöka de grundläggande mekanismerna bakom OC-differentiering och funktion.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Flow Core Facility och Glasgow Imaging Facility (GIF) inom School of Infection and Immunity för deras stöd och hjälp i detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
| 8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
| 96-well TC plate | Corning | 3596 | |
| 96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
| Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Acetone | VWR | 20066.330 | |
| Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
| Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
| Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
| ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
| BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
| Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
| Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
| DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
| EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
| EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
| eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
| EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
| Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
| Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
| Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
| Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
| Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
| ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
| L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
| Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
| Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
| Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
| OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
| PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
| Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
| PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
| Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
| REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
| Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
- Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
- Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
- Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
- Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
- Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
- Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
- Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
- Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
- Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
- McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237 (2021).
- Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282 (2020).
- Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
- Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V.
- McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
- Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
- Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
- Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
- Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780 (2021).
- Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
- Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
- Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
- Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
- Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
- Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
- Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
- Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221 (2020).
- Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776 (2021).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
- Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
- Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
- Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632 (2018).
- Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152 (2006).
- Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780 (2018).
- Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
- Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
- D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82 (2012).
- Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).
