Summary
Osteoklaster er viktige beinresorberende celler i kroppen. Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for in vitro differensiering av osteoklaster fra humane perifere blodmonocytter. Denne metoden kan brukes som et viktig verktøy for å forstå osteoklastbiologi i homeostase og i sykdommer.
Abstract
Osteoklaster (OC) er beinresorberende celler som spiller en sentral rolle i skjelettutvikling og remodellering av voksne bein. Flere beinforstyrrelser er forårsaket av økt differensiering og aktivering av OC, så inhiberingen av denne patobiologien er et sentralt terapeutisk prinsipp. To nøkkelfaktorer driver differensieringen av OC fra myeloide forløpere: makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Humane sirkulerende CD14+ -monocytter har lenge vært kjent for å differensiere til p-piller in vitro. Eksponeringstiden og konsentrasjonen av RANKL påvirker imidlertid differensieringseffektiviteten. Faktisk har protokoller for generering av humane OCs in vitro blitt beskrevet, men de resulterer ofte i en dårlig og langvarig differensieringsprosess. Her er det gitt en robust og standardisert protokoll for å generere funksjonelt aktive modne humane OC-er i tide. CD14+ monocytter er beriket fra humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og primet med M-CSF for å oppregulere RANK. Påfølgende eksponering for RANKL genererer p-piller på en dose- og tidsavhengig måte. P-piller identifiseres og kvantifiseres ved farging med syreresistent tartratfosfatase (TRAP) og lysmikroskopianalyse. Immunfluorescensfarging av kjerner og F-aktin brukes til å identifisere funksjonelt aktive OC. I tillegg anrikes OSCAR+CD14− modne p-piller ytterligere via flowcytometricellesortering og OC-funksjonalitet kvantifisert ved mineralske (eller dentin/bein) resorpsjonsanalyser og aktinringdannelse. Endelig brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, på modne OC, noe som viser at adenosintrifosfat (ATP) produksjon er avgjørende for aktinringintegritet og OC-funksjon. Avslutningsvis etableres en robust analyse for å differensiere høyt antall OCer i dette arbeidet, som i kombinasjon med aktinringfarging og en ATP-analyse gir en nyttig in vitro-modell for å evaluere OC-funksjonen og å skjerme for nye terapeutiske forbindelser som kan modulere differensieringsprosessen.
Introduction
Osteoklaster (OC) er multinukleerte gigantiske celler av hematopoietisk avstamning med en unik evne til å resorbere bein. De er ansvarlige for utvikling og kontinuerlig ombygging av skjelettet 1,2. I skjelettfasene av utvikling er OCs og vevsbosatte makrofager avledet fra erytro-myeloide progenitorer og koloniserer beinnisjen og organvevet. Under fysiologiske forhold kreves erytro-myeloide progenitorer for normal beinutvikling og tannutbrudd, mens tilstrømningen av sirkulerende blodmonocytter inn i beinnisjen gir postnatalt vedlikehold av OCs, benmasse og benmarghule3. Under patologiske forhold rekrutteres monocytter til steder med aktiv betennelse og kan bidra til patologisk bein ødeleggelse 4,5.
Pasienter med flere former for leddgikt opplever leddbetennelse, noe som fører til progressiv felles ødeleggelse forårsaket av OCs6. For eksempel, i revmatoid artritt (RA), er overaktiverte OCs ansvarlige for patologisk beinerosjon og felles ødeleggelse 7,8, og nåværende behandlinger forbedrer eller stopper ofte ikke beinskader9,10,11. Endringer i sirkulerende monocytter både med hensyn til populasjonsfordeling og transkriptomiske og epigenetiske signaturer er rapportert hos RA-pasienter12,13,14. Videre er det rapportert at endret monocytrespons på inflammatorisk stimulering påvirker osteoklastogenese hos RA-pasienter med aktiv sykdom15,16,17.
Differensieringen av p-piller er en kompleks flertrinnsprosess som omfatter myeloide forløpercellers forpliktelse til differensiering i OC-forløpere. Under osteoklastogenese blir p-piller gigantiske og multinukleerte gjennom cellefusjon, ufullstendig cytokinese og en kjernefysisk resirkuleringsprosess beskrevet som fisjon og fusjon18,19,20. Evnen til å differensiere p-piller in vitro har muliggjort betydelige fremskritt i forståelsen av beinbiologi21. OC-er skiller seg fra forløpere ved eksponering for makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Sistnevnte er avgjørende for normal utvikling og funksjon av p-piller in vitro og in vivo, selv under inflammatoriske tilstander 6,22,23. RANKL presenteres av osteoblaster og osteocytter, samt av aktiverte T-celler og fibroblaster i betent RA-synovium 2,24,25. Under OC-differensieringsprosessen oppregulerer monocytter eksponert for M-CSF reseptoraktivatoren av nukleær faktor kappa-B (RANK) uttrykk på cellemembranen og, under etterfølgende stimulering med RANKL, differensierer til tartratresistent syrefosfatase (TRAP)-positive mononukleære pre-OCs og deretter til multinukleerte OCs15,26. OC-er produserer flere enzymer, den viktigste blant dem er TRAP, som muliggjør nedbrytning av fosfoproteiner i bein27. En regulator og markør for OC-differensiering er den OC-assosierte reseptoren (OSCAR). Det oppreguleres tidlig i forløperceller som forplikter seg til OC-linjen28. Modne gigantiske multinukleerte OC-er kan nedbryte (resorbere) skjelettmatrisen ved å generere en stor tetningssone, som er laget av en aktinring som omgir en ruffled grense21,29,30. Benresorpsjonsevnen til OC-er krever cytoskjelettomorganisering og den påfølgende polariseringen og dannelsen av en kronglete membran, som er den såkalte ruffled grensen. Den ruffled grensen er omgitt av et stort sirkulært bånd av en F-aktinrik struktur, som er aktinringen eller tetningssonen. Aktinringintegritet er avgjørende for at p-piller skal resorbere ben både in vitro og in vivo, og defekt ruffled border formation er assosiert med lavere vakuolær adenosintrifosfatase (V-ATPase) uttrykk31,32,33. Videre er p-piller mitokondrierrike celler, og adenosintrifosfat (ATP) assosierer med mitokondrielignende strukturer i OC-er lokalisert ved den rufsete grensen31,32,33. Rotenon virker som en sterk hemmer av mitokondriekomplekset I og påvirker ATP-produksjonen. Rotenon har også vist seg å hemme OC differensiering og funksjon34.
Denne protokollen beskriver en effektiv og optimalisert metode for in vitro osteoklastogenese fra humane perifere blodprøver. I humant perifert blod er CD14+-monocytter hovedkilden til p-piller15,35,36. I denne protokollen er kinetikken for eksponering og konsentrasjonen av M-CSF og RANKL justert for optimal osteoklastogenese. Mononukleære celler separeres først fra erytrocytene og granulocytter som er tilstede i fullblod ved tetthetsgradient; de blir deretter beriket for CD14+ monocytter ved hjelp av positivt utvalg av magnetiske perler. De isolerte CD14+-monocyttene inkuberes deretter over natten med M-CSF. Dette primer monocyttene for å oppregulere uttrykket av RANK15,26. Den påfølgende tilsetningen av RANKL induserer osteoklastogenese og multinukleasjon på en tidsavhengig måte. Aktivresorberende p-piller viser den karakteristiske fordelingen av F-aktinringer ved kanten av cellemembranen30,32 og farging for TRAP. Modne OC-er analyseres ved å kvantifisere TRAP+ multinukleerte (mer enn tre kjerner) celler. Den funksjonelle kapasiteten til modne poc-er kan vurderes ved resorpsjon, aktinringintegritet og ATP-produksjon. Videre kan differensierte CD14− OSCAR+ OC-er berikes og brukes til å vurdere effekten av visse forbindelser på OC-funksjonalitet via mineralresorpsjon (eller dentin) og F-aktinorganisasjon. I tillegg, i dette arbeidet, brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, som et eksempel på en forbindelse som påvirker funksjonaliteten til OC. Redusert OC-resorpsjonsaktivitet under rotenon er assosiert med redusert ATP-produksjon og aktinringfragmentering. Avslutningsvis etablerer denne protokollen en robust analyse som kan brukes som referansemetode for å studere flere biologiske aspekter ved OC-differensiering og funksjon in vitro.
Denne metoden kan brukes til å vurdere (1) potensialet for sirkulerende monocytter for å differensiere til OCs i helse og sykdommer, samt (2) virkningen av terapeutiske kandidater på OC differensiering og funksjon. Denne robuste osteoklastogeneseprotokollen gjør det mulig å bestemme effekten og mekanismene til beinmålrettede terapier på både OC-differensiering fra forløperceller og funksjonen til modne OCer.
Protocol
Buffy-frakker hentet fra Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) og leukocyttkegler hentet fra NHS Blood and Transplant (Newcastle) blir gitt til University of Glasgow-forskere i en fullstendig anonymisert (ikke-identifiserbar) form fra fullt samtykkende NHS-blodgivere. Buffy coat og leukocyte kegle blodkomponenter er produsert fra en NHS standard bloddonasjon gitt på et NHS blodgiversenter i Skottland eller England. Blodgiveren gir informert samtykke på tidspunktet for bloddonasjonen for overskuddsblod som ikke brukes i standard NHS-klinisk praksis til bruk for godkjente medisinske forskningsstudier. Den etiske godkjenningen fra NHS Research Ethics Committee og de signerte donorsamtykkeskjemaene for å bruke disse bloddonasjonene holdes av NHS bloddonasjonstjeneste. Godkjenning for å få tilgang til og bruke disse samtykkede bloddonasjonene i godkjente medisinske forskningsstudier ble søkt og oppnådd ved hjelp av standard intern søknads- og gjennomgangsprosess fra National Blood Transfusion Service (Skottland) og NHS Blood and Transport (England). Ingen ytterligere NHS REC-godkjenning eller intern godkjenning fra University of Glasgow etisk komité var nødvendig for å bruke blodkomponentene til de godkjente medisinske forskningsstudiene.
1. Generelle merknader før start
- Fortsett med alt arbeid med blod med forsiktighet. Vurder de potensielle farene ved ulike smittestoffer som kan være tilstede i prøvene.
- Utfør alt arbeidet forsiktig i biosikkerhetslaboratoriet under sterile forhold mens du bruker hansker og laboratoriefrakker.
- Utfør avhending av biosikkerhet i henhold til lokale retningslinjer.
- Innhent passende samtykke og etiske godkjenninger før prøveinnsamling i henhold til lokale myndigheters forskrifter.
- Vanligvis vil 1 ml friskt blod gi 1 million PBMC, og CD14 + monocytter står for omtrent 10% -30% av PBMCs. Til sammenligning kan 10 ml leukocyttkjegle inneholde 5 x 10 8-15 x 108 PBMC. For ytterligere detaljer om PBMC-isolasjon, se en tidligere protokoll37.
2. Isolering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra fullblod
- Samle det nødvendige volumet av friskt blod fra friske givere i litiumheparinoppsamlingsrør.
MERK: Andre oppsamlingsrør med passende antikoagulantia kan også brukes (f.eks. natriumheparinrør). For høyere celletall kan leukocyttkegler eller buffy strøk brukes. - For å isolere PBMCene, overfør blodet til et nytt 50 ml rør, og fortynn det med sterilt 1x fosfatbufret saltvann (PBS) i forholdet 1: 1 eller 1: 3 for henholdsvis friskt blod eller leukocyttkegler / buffy strøk.
- Bland forsiktig cellene flere ganger ved inversjon.
- Klargjør 15 ml rør inneholdende 3 ml tetthetsgradientmedium. Legg sakte 8-10 ml fortynnet blod på toppen av tetthetsgradientmediet, og sentrifuge ved 400 x g i 30 minutter ved romtemperatur (RT) uten brems.
MERK: Påfør blodet forsiktig på toppen av tetthetsgradientmediet for å forhindre blanding. Blanding kan føre til tap av PBMC. - Kast det øverste laget (som inneholder plasmaet) forsiktig med en Pasteur-pipette, samle det under interfaselaget som inneholder PBMC (hvit, ringlignende struktur), og overfør dette laget til et nytt 50 ml rør.
- Suspender cellene med steril 1x PBS opp til 50 ml, og vask av restgradientmediet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved RT med full brems.
- For å fjerne gjenværende blodplater, gjenta prosessen med et ekstra langsommere spinn ved 200 x g i 10 minutter ved RT uten brems.
- Valgfritt: For å fjerne overføringen av røde blodlegemer, fortynn lysisbuffer for røde blodlegemer (10x, materialfortegnelse) 1:10 i destillert vann, og påfør 3 ml av den fortynnede bufferen på pelleten. Bland og rug i 3 min. Vask pelleten i opptil 50 ml 1x PBS, og sentrifuger ved 300 x g i 10 min ved RT med full brems.
- Resuspender de isolerte og rensede PBMCene i 20 ml 1x PBS og tell dem ved hjelp av et hemacytometer eller ved å følge andre standardmetoder.
MERK: Cellefortynnings- og celletellingsmetodene må justeres tilsvarende basert på celletettheten og telleenheten som brukes.
3. Anrikning av CD14+ monocytter fra PBMC
- Isoler CD14+-monocytter fra PBMC-ene med et CD14+-valgsett for mennesker i henhold til produsentens protokoll (materialfortegnelse).
MERK: Klassiske CD14 + CD16 - monocytter er hovedkilden til OC forløpere35; Alternative rensemetoder kan vurderes. - Overfør 1 x 107 PBMC til et egnet polystyren rundbunnsrør (dvs. som passer til valgsettmagneten), og pellet cellene ved 300 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten, resuspender cellepelleten i celleseparasjonsbuffer (PBS, 2 % føtal bovint serum [FBS], 1 mM etylendiamintetraeddiksyre [EDTA]) til en endelig konsentrasjon på 1 x 108 celler/ml, og inkuber med 10 μL antistoffcocktail per 100 μL med lokket på i 10 minutter.
MERK: Cellene resuspenderes ved 1 x 108 celler/ml; Juster volumene tilsvarende. - Etter inkubering, tilsett 10 μL av magnetiske nanopartikkelperler per 100 μL, og inkuber i 3 minutter med lokket på.
MERK: Juster volumene av antistoffcocktailen og magnetiske perler for å oppnå en konsentrasjon på 10 μL / ml. - Fyll opp volumet til 2,5 ml med celleseparasjonsbufferen, plasser røret i en magnet (uten lokket) og inkuber i 3 minutter. Kast den negative cellepopulasjonen med en kontinuerlig bevegelse ved inversjon mens røret fortsatt er i magneten.
MERK: Hvis du bruker >2 x 108 PBMC og en større magnet, fyll på opptil 5 ml eller 10 ml med celleseparasjonsbuffer i henhold til produsentens instruksjoner. - Fjern røret fra magneten, og vask de berikede CD14+ monocyttene som er festet til magnetkulene ved å resuspendere dem i 2,5 ml av celleseparasjonsbufferen. Inkuber i 3 minutter inne i magneten som før, kast den negative fraksjonen, og gjenta en gang til.
- Sentrifuge alle de oppsamlede cellene ved 300 x g i 5 minutter, kast supernatanten og resuspender cellene i 5 ml alfa minimum essensielt medium (α-MEM; Tabell over materialer) supplert med 1% L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (komplett α-MEM) og 10% FBS.
MERK: En renhetskontroll etter anrikning via flowcytometri anbefales, og ≥96 % renhet kan forventes. Ytterligere vasketrinn (trinn 3.6) kan øke renheten.
4. OC-differensiering in vitro
- Tell de berikede CD14+ monocytter ved hjelp av et hemacytometer.
- Pellet cellene ved 300 x g i 5 minutter, og resuspendere ved 1 x 106 celler / ml i komplett α-MEM supplert med 10% FBS.
- For å differensiere OC-ene, tilsett M-CSF ved en endelig konsentrasjon på 25 ng/ml til cellesuspensjonen.
MERK: For 1 ml cellesuspensjon, tilsett 0,25 μL M-CSF fra en stamkonsentrasjon på 100 μg/ml. - Bland ved å pipetere grundig for å homogenisere cellesuspensjonen og plate 100 μL / brønn i en flatbunns 96-brønnplate til en endelig celletetthet på 1 x 105 celler / brønn.
- Tilsett 200 μL/brønn sterilt destillert vann i brønnene rundt de belagte cellene for å forhindre middels fordampning og kanteffekter i dyrkningssystemet.
- Inkuber cellene over natten, i ca. 18-20 timer, ved 37 °C med 5% CO2.
- Etter inkubering over natten, fjern forsiktig halvparten av mediet (50 μL / brønn) ved aspirasjon ved hjelp av en P200-pipette, unngå å berøre bunnen av brønnen, og erstatt med frisk varm komplett α-MEM inneholdende 10% FBS, 25 ng / ml M-CSF og 50 ng / ml RANKL for en endelig konsentrasjon på 25 ng / ml
MERK: For 1 ml medium, tilsett 0,25 μL M-CSF og 0,5 μL RANKL fra en stamkonsentrasjon på 100 μg/ml. - Bytt media hver 3. dag og differensiere cellene til p-piller i 7-14 dager (figur 1).
MERK: Hold M-CSF- og RANKL-konsentrasjonene konsistente gjennom hele kulturen.
Figur 1: OC differensiering arbeidsflyt. Skjematisk oversikt over CD14+ monocyttisolering fra PBMC og differensiering til modne p-piller i nærvær av M-CSF og RANKL i 7-14 dager. RT = romtemperatur. Bilde opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. TRAP-farging for osteoklaster
- Fjern mediet forsiktig, fest de differensierte adherente OCene med 100 μL / brønn av den tidligere tilberedte fikseringsløsningen, og inkuber i 1 min. Ikke berør bunnen av brønnene for å unngå å skrape de tilhørende cellene.
MERK: Den fikserende løsningen fremstilles som følger: 12,5 ml citratoppløsning (inkludert i TRAP-fargesettet), 32,5 ml aceton og 5 ml 37% formaldehyd. - Vask brønnene tre ganger med 300 μL sterilt destillert vann. Trykk på platene tørre etter vask.
- Forbered en fargeløsning i henhold til produsentens instruksjoner (materialfortegnelse); tilsett 5 μL Fast Garnet og 5 μL natriumnitritt for å lage Fast Garnet-løsningen; bland ved inversjon, og inkuber i 3 minutter ved RT. Forbered 1 ml fargeoppløsning ved å blande 900 μL sterilt destillert vann, 10 μL naftol, 40 μL acetatoppløsning, 50 μL tartrat oppløsning og 10 μL Fast Garnet-løsning.
- Tilsett 100 μL/brønn nylaget fargeløsning, og rug platen ved 37 °C i mørket i 20 min.
- Etter inkubering, fjern fargeløsningen ved inversjon, og vask platen tre ganger med 300 μL / brønn destillert vann.
- Fjern overflødig vann ved å banke platene på papirhåndklær. La platene være åpne og beskyttet mot lyset for å lufttørke over natten.
NOTAT: Tørre plater kan lagres i opptil 6 måneder. Noen ganger kan gjenværende buffere fremme utviklingen av mugg, som er synlig under mikroskopet; Dette kan fjernes når som helst ved å vaske de berørte brønnene med destillert vann og la dem lufttørke igjen. - Ta bilder ved 10x eller 20x ved hjelp av et brightfield-mikroskop med et flisealternativ for å fange hele brønnoverflaten.
- Tell manuelt OC-ene identifisert som TRAP + lilla fargede celler med mer enn tre kjerner ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare med en celleteller-plugin.
MERK: Antallet TRAP + OCs per brønn er donoravhengig og kan variere fra ~ 200-1,600 OC / brønn, med et gjennomsnitt på ca 1,000 OC / brønn. Videre, for å analysere dataene, bør OC-tallene bestemmes i tre forskjellige brønner (tekniske replikater), og gjennomsnittet skal beregnes for hver tilstand og for hver biologisk replikat.
6. Benresorpsjonsanalyse
- Plate de nyberikede CD14 + monocytter på 96-brønns osteoanalyseplater belagt med kalsiumfosfat ved 1 x 105 celler / brønn, og differensiere OCs i 7-14 dager, som angitt i trinn 4.1-4.8, og endre mediet hver 3. dag.
MERK: Dentin / elfenben eller storfe kortikale beinskiver kan brukes i stedet for osteo-analyseplater. I så fall bør kulturens totale tid forlenges til 14-21 dager på grunn av det mer komplekse substratet som skal resorberes. - På sluttpunktet, fjern forsiktig mediet, unngå å berøre bunnen av brønnen, og lyse cellene med 10% natriumhypoklorittoppløsning. Vask brønnene tre ganger med destillert vann.
- Skann de tørre platene ved hjelp av et lysfeltmikroskop, og analyser / kvantifiser de oppkjøpte bildene av resorpsjonsgropene ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare.
7. Aktinring fluorescerende farging
- Plate 100 μL / brønn av de isolerte CD14 + monocyttene i et 18-brønns kammerlysbilde ved en celletetthet på 1 x 105 celler / brønn. Differensiere p-pillene i nærvær av M-CSF og RANKL som beskrevet tidligere (trinn 4.1-4.8), inkludert endring av medium hver 3.
- På slutttidspunktet fjerner du mediet forsiktig og vasker hver brønn to ganger med 200 μL/brønn av forvarmet PBS, pH 7,4. Ikke la brønnene tørke mellom noen av trinnene.
- Fest prøven med 100 μL / brønn av 4% formaldehydoppløsning i PBS, og inkuber i 10 min ved RT på en orbital shaker med forsiktig risting.
MERK: Metanol kan forstyrre aktin under fikseringsprosessen. Derfor er det best å unngå metanolholdige fikseringsmidler. Det foretrukne fikseringsmiddelet er metanolfritt formaldehyd. Orbital shakeren som ble brukt i dette trinnet i protokollen ble satt til en effektinnstilling på 3 av 10. - Vask to ganger med 200 μL / brønn av PBS, permeabiliser cellene med 100 μL / brønn på 0,1% Triton X-100 løsning fortynnet i PBS, og inkuber i 10 minutter ved RT på en orbital shaker med forsiktig risting.
- Vask to ganger med 200 μL/brønn PBS. For å blokkere ikke-spesifikk binding og øke signalet, tilsett 100 μL / brønn blokkeringsløsning laget med 2% bovint serumalbumin (BSA) / PBS-løsning. Inkuber i 20 min ved RT på en orbital shaker med forsiktig risting.
- Fjern blokkeringsoppløsningen, og tilsett 100 μL / brønn fluorescerende konjugert falloidinoppløsning fortynnet i 2% BSA / PBS-oppløsning. Inkuber i 20 min ved RT på en orbital shaker med forsiktig risting og beskyttet mot lys.
MERK: Juster konsentrasjonen av phalloidinfargestoffet i henhold til produsentens anbefalinger. - Vask to ganger med 200 μL / brønn av PBS, flekk kjernene med 100 μL / brønn av en løsning av PBS inneholdende 300 nM DAPI, og inkuber i 10-15 min ved RT på en orbital shaker med forsiktig risting og beskyttet mot lys.
MERK: DAPI fortynnes i destillert vann for å lage en 14,3 mM (5 mg/ml) DAPI-lagerløsning. Stamløsningen fortynnes videre til den endelige konsentrasjonen på 300 μM. Til slutt fortynnes 300 μM DAPI-løsningen enda en gang i PBS til en endelig konsentrasjon på 300 nM. - Etter 10-15 min, fjern DAPI-oppløsningen, og erstatt den med 100 μL / brønn PBS.
MERK: Avhengig av hvilke kammerlysbilder som er valgt, må du enten lagre med et passende volum PBS (100 μL / brønn for 18-brønns kammerlysbilder), eller montere lysbildet med deksel og et passende monteringsmedium. Kammerets lysbilder kan lagres i opptil 1 uke i kjøleskapet. For 18-brønns kammerlysbilder, bruk et 50-100 μL fargevolum og 200-300 μL for vask. Skaler opp for de andre lysbildestørrelsene i kammeret tilsvarende. For å unngå fordampning, hold dekslene inne i en dekket beholder i inkubasjonstidene. Bruk av en orbital shaker anbefales, men ikke avgjørende. - Visualiser fargingen ved hjelp av passende immunfluorescens eller konfokale mikroskoper og forstørrelser mellom 4x og 40x.
8. Anrikning av modne OC-er og OC-forløpere via flowcytometrisortering
- Resuspender de nyanrikede CD14+ -monocyttene ved 1 x 106 celler/ml, og differensiere dem til modne p-piller i nærvær av M-CSF og RANKL på samme måte som beskrevet ovenfor (trinn 4.1-4.8).
MERK: Når du skalerer opp fra en plate med 96 brønner til en større platestørrelse, følg tabell 1; Disse volumene beregnes med utgangspunkt i en 1 x 106 celler/ml oppløsning og gir en optimal tetthet for cellefusjon. - På dag 7, vask brønnene en gang med varm PBS, og tilsett 50 μL til 1 ml (volum bestemt av platestørrelsen som brukes) accutase. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 20 minutter.
- Etter inkubering, kontroller platene under et lysmikroskop for å se om cellene har løsnet. Videre løsner du cellene ved å banke på platene på alle sider og pipetere dem opp og ned.
- Samle cellesuspensjonen i et 15 ml konisk rør. Vask brønnene med varm PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+), og kombiner dem med cellesuspensjonen. Gjenta trinn 8.2-8.3 en eller to ganger til de fleste cellene har løsnet.
MERK: Accutase, den anbefalte metoden før overflatefarging for flowcytometrisk analyse, løsner ikke veldig store OC-er. Utvinningsgraden er ~ 50% -70%. - Sentrifuger cellene ved 300 x g i 5 minutter, resuspender cellepelleten i 1 ml PBS, og tell cellene ved trypanblå ekskludering.
- Resuspender cellene ved 1 x 106 celler/ml, fjern 100 μL tilsvarende 1 x 105 celler, og overfør disse cellene til et nytt polypropylenreagensrør. Legg til 200 μL av cellesorteringsbufferen, og sett denne til side på is som ufarget kontroll.
- Beis resten av cellene med levende / dødt fargestoff fortynnet ved 1:750 i 10 minutter ved RT og beskyttet mot lys.
MERK: Levende / død farging må utføres i fravær av FBS for å unngå høy bakgrunnsfarging. - Fyll på 15 ml oppsamlingsrøret som inneholder levende / døde farget cellesuspensjon med varmcellesorteringsbuffer (1x PBS, ingen Ca 2+, ingen Mg2+, 1% FBS og 5 mM EDTA), og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter for å pelletere cellene.
NOTAT: En høy konsentrasjon av EDTA og en lav konsentrasjon av FBS anbefales i sorteringsbufferen for å forhindre celleklumper. - Fjern et volum tilsvarende 1 x 105 celler, og overfør dem til et nytt polypropylen reagensrør for OSCAR isotypekontroll. Overfør alle de gjenværende cellene til et annet polypropylenreagensrør for farging og cellesortering.
MERK: Polypropylen reagensrør brukes til sortering som cellene er mindre sannsynlighet for å feste seg til disse rørene enn til polystyren rør. - Spinn rørene ved 400 x g i 5 minutter for å pelletere cellene, og kast overflødig supernatant ved inversjon.
- Resuspender cellepelleten i en antistoff master mix oppløsning fremstilt etter tabell 2. Flekk OSCAR isotype kontrollrør med CD14 antistoff og OSCAR isotype kontroll i stedet for OSCAR antistoff.
- Inkuber cellene ved 4 °C, beskyttet mot lys i 30 minutter.
- Etter 30 minutter vasker du cellene ved å tilsette fem volumer av cellesorteringsbufferen, og sentrifugerer ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellene i 300-1000 μL kaldcellesorteringsbuffer, og skaff cellene ved hjelp av en flowcytometri-sorteringsmaskin utstyrt med en 100μM dyse.
MERK: OC-er er veldig klebrige celler, så det er viktig å filtrere dem gjennom en steril 70 μm membran før sortering. - Angi OC-er og pre-OC-er som CD14−OSCAR+. Still inn OSCAR+ -porten basert på OSCAR-isotypekontrollrøret.
- Samle de sorterte cellene i polypropylen reagensrør som inneholder komplett α-MEM supplert med 20% FBS ved 8 ° C.
- Etter sortering, pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved RT, telle cellene og resuspendere for nedstrøms applikasjoner.
MERK: Vanligvis, for å få ~ 1 x 105 sortert pre-OC / OC, start fra ~ 10 x 106 celler belagt på dag 0. Den lave utvinningsgraden påvirkes av celletap under løsrivelse med accutase og ved behandling for farging og sortering. Det anbefales å utføre hele prosedyren ved bruk av sterile buffere og reagenser, og arbeide under sterile forhold.
9. ATP-analyse for mitokondriell aktivitet
- Inkuber de anrikede CD14+ -monocyttene i nærvær av M-CSF og RANKL i en 96-brønnsplate på samme måte som beskrevet tidligere (trinn 4.1-4.8). Plate fire ekstra betingelser i triplikater å bruke som kontroller.
- Utfør ATP-analysen med luminescens-ATP-deteksjonsanalysesettet i henhold til produsentens håndbok. Kort, for å forberede ATP-løsningen, tilsett 10 ml av substratbufferløsningen til det frysetørkede substratet, og la det inkubere ved RT i 30 minutter.
MERK: Ulike metoder kan brukes til å måle den intracellulære ATP-produksjonen. Her har vi brukt deteksjon av ATP-produksjon ved luminescens. - Under inkubasjonen, klargjør og legg kontrollene direkte til kontrollbrønnene som følger: 2-deoksy-D-glukose (2DG) ved 10 mM og 100 mM, oligomycin ved 1 μM og 100 mM 2DG i kombinasjon med 1 μM oligomycin. Inkuber i 30 minutter ved 37 °C med 5 % CO2.
MERK: 2DG blokkerer glykolyse, mens oligomycin er en inhibitor av oksidativ fosforylering. Kombinere disse to hemmere resulterer i fullstendig tap av ATP-produksjon via glykolyse og oksidativ fosforylering, noe som betyr at de tjener som en intern kontroll for ATP-analysen. For 10 mM og 100 mM 2DG kontroller, tilsett henholdsvis 0,5 μL og 5 μL 2M 2DG stamløsning per 100 μL kulturbrønn. For 1 μM oligomycin, fortynn 5 mM stamløsning 1:100 i medium, og tilsett 2 μL/brønn til de dedikerte kontrollbrønnene. For den siste kontrollen, tilsett 5 μL 2DG og 2 μL fortynnet oligomycinoppløsning per brønn. - Tilsett 50 μL av ATP-løsningen til hver brønn for å stoppe reaksjonen, og inkuber ved RT på en shaker ved 700 o / min i 5-10 minutter beskyttet mot lys.
- Overfør 100 μL av supernatanten til en 96-brønns hvitbunnplate spesifikk for ATP-analysen, og les platen ved hjelp av en luminescensleser.
Representative Results
OC-generering fra CD14+ monocytter
Denne metoden tok sikte på enkelt å skille et stort antall OCs fra humant perifert blod CD14+ monocytter in vitro, vanligvis i løpet av 1 uke. For det første ble CD14+-monocytter beriket fra PBMC og primet med M-CSF over natten for å oppregulere RANK, som tidligere rapportert15. Etter monocyttpriming, for å bestemme den optimale konsentrasjonen av RANKL for OC differensiering og modning, ble RANKL-konsentrasjoner på 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml og 100 ng / ml, sammen med 25ng / ml m-csf, brukt. Tilsetningen av RANKL ga et økende antall store TRAP-positive multinukleerte p-piller på en doseavhengig måte, og dette ble vurdert ved hjelp av TRAP-farging. Modne OC-er er definert som TRAP-positive celler med flere kjerner (vanligvis mer enn tre; figur 2A,B og tilleggsfigur 1). Videre ble kinetikken til OC-differensiering fra monocytter undersøkt ved hjelp av TRAP-farging og lysmikroskopi over en 2-14 dagers kulturperiode. I dette tilfellet ble OC-differensiering ved bruk av en mellomkonsentrasjon på 50 ng / ml RANKL valgt for å vurdere hvor raskt OCs differensiert i kultur. Under disse dyrkningsbetingelsene var multinukleerte p-piller synlige fra dag 5 og fremover, og optimal differensiering ble nådd dag 7 (figur 2C). Den langvarige inkubasjonen av kulturer utover 10 dager på plast resulterte i unormalt gigantiske smeltede celler. I denne protokollen brukes dag 6-8 vanligvis som det optimale endepunktet for OC-generering. OC-ene kan kvantifiseres eller brukes til nedstrømsanalyser.
Funksjonsvurdering av differensierte p-piller
For å bestemme den funksjonelle aktiviteten til de genererte OC-ene, undersøkte vi deres resorptive aktivitet ved å differensiere OC-ene på en mineralisert overflate. Siden store p-piller bare genereres etter en 7-dagers dyrkningsperiode, og for å gi tilstrekkelig tid til å resorbere mineralsubstratet, ble kulturene opprettholdt til dag 10. Dannelse av runde hull, eller resorpsjonsgroper, ble kun observert på mineraliserte overflater av brønner med celler som var behandlet med både M-CSF og RANKL (figur 3). Dermed tillater prosentandelen av oppløst mineralisert overflate (resorpsjonsgroper) å bestemme OC-resorptivkapasiteten. I tillegg viste p-pillene som ble differensiert etter denne protokollen frem til dag 7, både på plast- og glasskammerlysbilder, en velorganisert aktinringstruktur som kunne visualiseres ved immunfluorescerende farging (tilleggsfigur 2).
Effekt av en inhibitor på moden OC-funksjon
De ovennevnte dyrkingsbetingelsene ble benyttet for å bestemme funksjonsevnen til in vitro-genererte OC-er i nærvær av den kjente OC-hemmeren, rotenon34. P-pillene ble differensiert i 6-8 dager, og CD14−OSCAR+ p-piller og OC-forstadier ble anriket via flowcytometri (figur 4). De anrikede cellene ble deretter belagt med 50 000 celler per brønn på en mineralbelagt 96-brønnsplate i pro-osteoklastogent medium (25 ng / ml m-csf og RANKL) i 3 dager. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hemmet doseavhengig resorpsjonen av den mineraliserte overflaten sammenlignet med den ubehandlede kontrollbrønnen, i samsvar med tidligere studier34. I tillegg ble OC-funksjonalitet vurdert via ATP-produksjon og aktinringdannelse. Den rotenonavhengige hemmingen av OC-resorpsjon var assosiert med hemming av ATP-produksjon (figur 5C). Resorberende OC-er er svært polariserte celler som regulerer deres resorptive kapasitet ved å fremme cytoskjelettorganisasjon. Alexa fluor 647 konjugert falloidin ble brukt til å merke F-aktin cytoskjelettet av de modne OCs dyrket i nærvær eller fravær av rotenon. Rotenon forårsaket fragmenteringen av den RANKL-deriverte aktinringen til de modne OC-ene (figur 5D).
Figur 2: OC-er som effektivt skiller seg fra CD14+ monocyttforløpere. CD14+ monocytter ble magnetisk anriket, belagt med 1 x 105 celler/brønn i 96-brønnsplater, og inkubert over natten med 25 ng/ml M-CSF. (A) M-CSF-primede monocytter ble stimulert med økende konsentrasjoner av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fiksert og farget for TRAP på dag 7. Bilder ble samlet inn, og TRAP + multinucleated cells (MNC) ble talt. Representative bilder av TRAP-farging er vist i tilleggsfigur 1. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD (n = 3). Dataene ble analysert med en enveis ANOVA og Holm-Sidaks flere sammenligningstest for parede data; * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,005. (B) Representativt bilde av en TRAP-farget brønn av en 96-brønns plate som viser den typiske mengden OCs/well expected og deres morfologi under 25 ng/ml RANK-L sammenlignet med M-CSF-avledede makrofager på dag 7. Skalastenger: 1000 μm. (C) Representative bilder av OC-dannelse under 50 ng/ml RANKL vurdert ved TRAP-farging fra dag 2 til dag 14. OC-er er synlige fra dag 5 og utover. Giant unormalt smeltet OCs er tilstede etter 10 dager. Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Resorptive p-piller differensiert fra CD14+ -monocytter. CD14+ -celler isolert fra PBMC ble differensiert i 10 dager til p-piller i nærvær av 25 ng/ml m-csf (m) og RANKL (R) på mineralanalyseoverflater (osteo-assay). (A) Bilder av representative rekonstruerte brønner tatt ved 10x forstørrelse for å analysere resorpsjonen på dag 10 (mineralsubstrat i grått; resorpsjonsgroper i hvitt). Skalastenger: 1000 μm. (B) Kvantifisering av prosentandelen av resorbert areal. Resorpsjonsdataene ble analysert med en Wilcoxon-paret analyse. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD (n = 7). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Flowcytometrianrikning av CD14−OSCAR+ OC. CD14+-monocytter ble anriket fra PBMC, og p-pillene ble differensiert som tidligere beskrevet. Adeherente OC-kulturer ble løsrevet med akkutase og farget for flowcytometri. (AC) POC ved dag 8 ble sortert basert på CD14 og OSCAR-uttrykk. (A) Representativ sorteringsstrategi. Cellene ble gated som singleter, negative for død farging, og CD14 + OSCAR + (rød) og CD14 − OSCAR + (blå) undergrupper ble sortert. (B) Representative plott som viser overlappende OSCAR-farging av RANKL-deriverte OC-er (cyan) og kontroll-M-CSF-deriverte makrofager (oransje). I rødt er OSCAR isotypefarget kontroll av RANKL-avledede OC-er. (C) De sorterte populasjonene ble belagt på plast og fikk feste seg i 2 timer i pro-OC medium (25 ng / ml m-csf og 50 ng / ml RANKL), etterfulgt av TRAP-farging og visualisering. De representative bildene viser mangel på TRAP+-celler i CD14+-undergruppen (rød) og mono- og multinukleerte TRAP+ pre-OC-er og OC-er i CD14−-undergruppen (blå). Skala barer: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyser for å vurdere funksjonen til modne OCer. For å evaluere funksjonen til modne OC ble CD14+-celler isolert fra PBMC dyrket enten med M-CSF (M) alene eller kombinert med RANKL (R) i 7 dager, p-pillene ble anriket via flowcytometri, og p-pillene ble deretter behandlet med inhibitorrotenon i 24 timer. (A) Modne p-piller ble sortert via flowcytometri (CD14−OSCAR+) og ble dyrket på en mineralanalyseoverflate i nærvær eller fravær av rotenon i 3 dager, hvoretter cellene ble bleket og avbildet ved 10x for å avsløre det resorberte området (resorpsjonsgroper i hvitt). (A) Representative rekonstruerte bilder av brønner. Skalastenger: 1000 μm. (B) Kvantifiseringen av prosentandelen av resorbert areal. Dataene i (B) ble analysert med en enveis ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest (n = 7); * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,01. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD. (C) Totalt intracellulært ATP-innhold av udifferensiert og dag 7 differensierte modne OCer differensiert med RANKL og behandlet med enten vehikkel eller rotenon (10 nM og 30 nM). Her ble 2DG og oligomycin brukt som positive kontroller for analysen og ble tilsatt 30 minutter før cellelyse og ATP-kvantifisering. Feilfeltene viser gjennomsnittet ± SD (n = 4). Dataene ble analysert med en enveis ANOVA og Dunnetts multippel sammenligningstest for parede data. ** P ≤ 0,01. (D) Et representativt 20x bilde av modne p-piller farget for aktinringdannelse (rød) og kjerner (blå), som viser tap av aktinringen med inhibitoren. Skala barer: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Plate format | 96 brønn-plate | 48 brønn-plate | 24 brønn-plate | 12 brønn-plate | 6 brønn-plate |
| volum | 100 μL | 225–250 μL | 450–500 μL | 0,8–1 ml | 1,8–2 ml |
Tabell 1: Volum av cellesuspensjon for forskjellige plateformater. Volumene beregnes med utgangspunkt i en 1 x 106 celler/ml løsning og gir en optimal tetthet for cellefusjon.
| Fluorofor, klon | Volum (μL) per 106 celler | |
| CD14 | PE/Cyanine7, HCD14 | 5 μL |
| OSCAR | FITC, REA494 | 10 μL |
| Buffer for cellesortering | 80 μL |
Tabell 2: Antistoff master mix løsning.
Tilleggsfigur 1: TRAP-farging av RANKL-doseresponsen. CD14+ -monocytter ble magnetisk anriket, belagt med 1 x 105 celler/brønn i 96-brønnsplater og inkubert over natten med 25 ng/ml m-csf, som i figur 2. Representative bilder av TRAP-farging viser MCSF-primede monocytter stimulert med økende konsentrasjoner av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fiksert og farget for TRAP på dag 7. Skala barer: 400 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Fungerende ringfarging i fullt differensierte OC-er. (A) En 10x forstørrelse av OCs differensiert på TC-plast og farget med AF647 phalloidin (i rødt). Skala bar: 400 μm. (B) En 40x forstørrelse av OCs differensiert på glass kammer lysbilder og farget med AF488 phalloidin (i gult). Skala bar: 100 μm.Kjernene er farget med DAPI, vist i blått i (A) og i cyan i (B). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Effekt av forskjellige FBS-batcher på OC-differensieringseffektivitet. P-piller ble differensiert fra CD14+ monocytter i nærvær av 25 ng/ml m-csf og 50 ng/ml rankl (mr) i 7 dager. Kontrollbrønnene hadde kun M-CSF (M). (A) Representative 10x forstørrelser (skala barer: 400 μm) og (B) kvantifisering av TRAP-farget OCs differensiert fra en donor i to forskjellige partier av FBS. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD for tre tekniske replikater. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den enkle dyrkingen og isoleringen av et stort antall funksjonelle p-piller in vitro er viktig for å fremme forståelsen av beinbiologi og OC-medierte sykdommer. Klassisk ble p-piller generert i kokulturer med osteoblaster eller stromale celler og hematopoietiske celler fra milten eller benmargen38,39. Et signifikant gjennombrudd i forståelsen av osteoklastogenese var identifiseringen av RANKL som den viktigste regulatoren for OC-dannelse, differensiering og overlevelse40. Tidlige protokoller av RANKL-avhengige kultursystemer benyttet PBMC for OC generasjon21,41,42. Imidlertid er disse blandede kulturene lange og presenterer mange forstyrrende faktorer som begrenser evnen til å teste de direkte effektene på OC differensiering og funksjon. Denne protokollen beskriver en effektiv og pålitelig in vitro-modell for osteoklastogenese fra humane perifere CD14+-monocytter der optimal osteoklastogenese kan oppnås innen 7 dager (figur 1 og figur 2), noe som er betydelig raskere sammenlignet med noen andre protokoller43,44,45,46. De viktigste kjennetegnene ved denne protokollen er (1) bruk av rensede CD14+-monocytter, (2) priming av monocyttene med M-CSF før eksponering for RANKL, (3) lengden på kulturen (<7 dager) og (4) pålitelig påvisning av hemming av OC-dannelse (TRAP-farging) og funksjon (resorpsjon, ATP-produksjon, aktinringreorganisering) med inhibitorer.
Under optimaliseringen av metodikken ble flere kritiske punkter identifisert. Det har blitt observert at in vitro-differensieringen av p-piller i stor grad er avhengig av såtettheten til CD14+-monocyttene. I denne protokollen blir cellene sådd med høy tetthet (1 x 105 celler / brønn av en 96-brønnsplate, i 100 μL medium), da det er viktig for cellene å kunne samhandle med hverandre og være i nærheten av å smelte sammen og bli modne OC. På samme måte begrenser såceller med en tetthet som er for høy deres differensiering og vekst på grunn av middels begrensninger og mangel på nødvendig plass. Videre, for å oppnå maksimal suksess med denne protokollen, er det viktig å utføre tetthetsgradientseparasjonen nøye og for å sikre at den berikede populasjonen av CD14 + -celler er så ren som mulig. For eksempel resulterer utilstrekkelige vasketrinn i mangel på fjerning av blodplater, noe som følgelig hemmer OC-differensiering47,48. På samme måte kan tilstedeværelsen av mindre T-cellekontaminering i isolerte CD14+-preparater stimulert med M-CSF alene resultere i OC-differensiering, potensielt via RANKL-sekresjon av T-celler49. Derfor er det viktig å inkludere en M-CSF-kontroll for hvert eksperiment. En rutinemessig renhetskontroll, spesielt ved bruk av et nytt isolasjonssett, anbefales også for å sikre prøvens renhet.
Optimale OC-tall (område: ~ 200-1,600 OC / brønn) oppnås ved bruk av α-MEM-medium beriket med nukleosider og L-glutamin. Andre konvensjonelle kulturmedier, inkludert Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påvirker OC-utbyttet. Kilden til FBS kan også påvirke osteoklastogenese. Ulike partier av FBS kan føre til redusert RANK-L-derivert osteoklastogenese, samt utseendet på lavt antall TRAP + multinukleerte celler i M-CSF-kontrollene (tilleggsfigur 3). Derfor, for å oppnå konsistente resultater, anbefales det å teste nye FBS-batcher før bruk og fortsette med samme batch gjennom forsøkene for å minimere variasjoner i differensieringsprosessen. I tillegg utgjør variasjon fra donor til donor, i form av totalt antall differensierte p-piller oppnådd ved slutttidspunktet, en begrensning når man bruker denne protokollen til å sammenligne for eksempel friske donorer med pasienter. I disse tilfellene er det viktig å bruke nøyaktig de samme forholdene og samme masse medium, FBS og andre reagenser.
Et annet nødvendig skritt for optimal OC-differensiering og modning er priming av monocyttene med M-CSF før RANKL-tillegget. Eksponeringen av cellene til M-CSF 18-24 timer før RANKL primer monocyttene for å oppregulere RANK-uttrykk15,26. Tillegg av RANKL på dette tidspunktet sikrer optimal OC-differensiering på en doseavhengig måte. Graden av OC-differensiering varierer fra donor til donor; Imidlertid er 25 ng / ml RANKL vanligvis tilstrekkelig til å skille et høyt antall OCs i de fleste givere. I tillegg kan 25 ng / ml RANKL brukes i analyser for den første screeningen av forbindelser, da det letter evalueringen av både de forbedrende og hemmende effektene av testforbindelsene. Andre dyrkningssystemer har brukt lengre M-CSF preinkubasjonstid før RANKL-tillegg, men dette resulterer i lengre dyrkingstid for osteoklastogenese50. I tillegg forlater de primede monocyttene å inkubere over natten, slik at de kan feste seg til platen, om enn ikke i en fullt adherent tilstand. Derfor, når RANKL introduseres for første gang, må mediet halvskiftes veldig forsiktig i stedet for helt endret for å forhindre løsrivelse og tap av de primede monocyttene. Mediet må også oppdateres hver 3-4 dager for å unngå middels uttømming og forhindre celledød. Videre, på grunn av det lave volumet som brukes i denne analysen (100 μL / brønn i en 96-brønnplate), er det av største betydning å ha en ramme av tomme brønner som er fylt med en vandig løsning (dvs. steril destillert H2O eller PBS) rundt analysebrønnene. Dette forhindrer middels fordampning og kanteffekter.
Til slutt, for metabolske analyser (f.eks. ATP-analyser), er det viktig at cellene er levedyktige for å unngå stort standardavvik mellom replikater (figur 5). Høy levedyktighet av cellene er også viktig for sortering av cellene og for videre dyrking av de sorterte p-pillene (figur 4). Denne metoden har imidlertid flere begrensninger. Fullt modne OC-er er svært vedheftende og vanskelige å løsne fra platene. De større OC-ene er ofte umulige å løsne, noe som kan føre til et lavere celleutbytte. Derfor må cellene telles etter sortering og før plating ved ønsket konsentrasjon. Videre brukes i denne protokollen en ikke-enzymatisk metode (accutase) for å løsne p-pillene for å forhindre membranendringer i nedstrøms overflatefarging for flowcytometri. Bruken av celleskrapere (både med myke eller harde endinger) ble også testet og førte til høy celledød. Enzymatisk løsrivelse ved bruk av 0,05 % Trypsin/EDTA-løsninger kan brukes for et høyere utbytte av frittliggende OC-er når membranintegritet ikke er nødvendig for nedstrømsapplikasjoner. I tillegg, for å forhindre at p-pillene klumper seg sammen, anbefales det sterkt å bruke en høy konsentrasjon av EDTA i alle bufferne etter celleløsrivelse, samt passende filtrering før flowcytometrioppkjøp. Det er viktig å merke seg at OC-kulturer er en heterogen populasjon av celler som består av modne OC, OC-forløpere og makrofager. Makrofager kan lett skilles fra OCer, selv om både mononukleære pre-OCs og multinukleære OCs uttrykker OSCAR og ikke kan skilles med dagens metode (figur 4). Faktisk utgjør dette siste problemet hovedbegrensningen for denne metoden. I tillegg er et lavt uttrykk for OSCAR også til stede i M-CSF-kulturer (figur 4B) og kan indikere makrofager som er primet for OC-avstamningsforpliktelse. Det er viktig å stille inn porten for OSCAR+ -celler basert på FMO-fargesignalet, som vist i figur 4B.
Oppsummert beskriver denne protokollen en optimalisert og robust metode for effektiv produksjon av aktive og funksjonelt modne p-piller fra sirkulerende primære humane monocytter. Styrken til denne protokollen er dens evne til å generere OC-er på kort tid og gi et høyt antall differensierte OC-er. Denne metoden åpner for å undersøke de grunnleggende mekanismene som ligger til grunn for OC-differensiering og funksjon.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig Flow Core Facility og Glasgow Imaging Facility (GIF) innen School of Infection and Immunity for deres støtte og assistanse i dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
| 8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
| 96-well TC plate | Corning | 3596 | |
| 96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
| Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Acetone | VWR | 20066.330 | |
| Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
| Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
| Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
| ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
| BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
| Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
| Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
| DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
| EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
| EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
| eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
| EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
| Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
| Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
| Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
| Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
| Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
| ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
| L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
| Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
| Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
| Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
| OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
| PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
| Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
| PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
| Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
| REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
| Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
- Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
- Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
- Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
- Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
- Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
- Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
- Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
- Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
- Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
- McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237 (2021).
- Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282 (2020).
- Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
- Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V.
- McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
- Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
- Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
- Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
- Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780 (2021).
- Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
- Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
- Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
- Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
- Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
- Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
- Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
- Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221 (2020).
- Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776 (2021).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
- Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
- Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
- Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632 (2018).
- Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152 (2006).
- Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780 (2018).
- Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
- Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
- D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82 (2012).
- Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).
