Summary
Denne undersøgelse viser levering af en gentagen traumatisk hjerneskade på mus og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende intravital billeddannelse af en neuron-udtrykt EGFP ved hjælp af to-fotonmikroskopi.
Abstract
Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan man i længderetningen visualiserer ekspression og lokalisering af et protein af interesse inden for specifikke celletyper i et dyrs hjerne ved udsættelse for eksogene stimuli. Her vises administrationen af en lukket kranietraumatisk hjerneskade (TBI) og samtidig implantation af et kranievindue til efterfølgende langsgående intravital billeddannelse hos mus. Mus injiceres intrakranielt med en adenoassocieret virus (AAV), der udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under en neuronal specifik promotor. Efter 2 til 4 uger udsættes musene for en gentagen TBI ved hjælp af en vægttabsenhed over AAV-injektionsstedet. Inden for samme kirurgiske session implanteres musene med en metalhovedstolpe og derefter et kranievindue af glas over TBI-påvirkningsstedet. Ekspression og cellulær lokalisering af EGFP undersøges ved hjælp af et to-fotonmikroskop i samme hjerneområde udsat for traumer i løbet af måneder.
Introduction
Traumatisk hjerneskade (TBI), som kan skyldes sportsskader, køretøjskollisioner og militær kamp, er et verdensomspændende sundhedsproblem. TBI kan føre til fysiologiske, kognitive og adfærdsmæssige underskud og livslang handicap eller dødelighed 1,2. TBI-sværhedsgraden kan klassificeres som mild, moderat og svær, langt størstedelen er mild TBI (75% -90%)3. Det anerkendes i stigende grad, at TBI, især gentagne forekomster af TBI, kan fremme neuronal degeneration og tjene som risikofaktorer for flere neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal demens (FTD) og kronisk traumatisk encefalopati (CTE) 4,5,6. Imidlertid forbliver de molekylære mekanismer, der ligger til grund for TBI-induceret neurodegeneration, uklare og repræsenterer således et aktivt studieområde. For at få indsigt i, hvordan neuroner reagerer på og kommer sig efter TBI, er en metode til overvågning af fluorescerende mærkede proteiner af interesse, specifikt inden for neuroner, ved langsgående intravital billeddannelse hos mus efter TBI beskrevet heri.
Til dette formål viser denne undersøgelse, hvordan man kombinerer en kirurgisk procedure til administration af TBI med lukket kranium, der ligner det, der tidligere er rapporteret7,8, sammen med en kirurgisk procedure til implantation af et kranievindue til nedstrøms intravital billeddannelse, som beskrevet af Goldey et al9. Især er det ikke muligt at implantere et kranievindue først og derefter udføre en TBI i samme region, da virkningen af vægtfaldet, der inducerer TBI, sandsynligvis vil beskadige vinduet og forårsage uoprettelig skade på musen. Derfor blev denne protokol designet til at administrere TBI og derefter implantere kranievinduet direkte over slagstedet, alt sammen inden for samme kirurgiske session. En fordel ved at kombinere både TBI og kranial vinduesimplantation i en enkelt kirurgisk session er en reduktion i antallet af gange, en mus udsættes for kirurgi. Desuden giver det mulighed for at overvåge den øjeblikkelige reaktion (dvs. på timeskalaen) på TBI, i modsætning til at implantere vinduet ved en senere kirurgisk session (dvs. indledende billeddannelse, der starter på en tidsskala på dage efter TBI). Kranievinduet og den intravitale billeddannelsesplatform giver også fordele i forhold til overvågning af neuronale proteiner ved konventionelle metoder såsom immunfarvning af fast væv. For eksempel kræves færre mus til intravital billeddannelse, da den samme mus kan studeres på flere tidspunkter, i modsætning til separate kohorter af mus, der er nødvendige for diskrete tidspunkter. Endvidere kan de samme neuroner overvåges over tid, så man kan spore specifikke biologiske eller patologiske hændelser i samme celle.
Som et bevis på konceptet demonstreres det neuronspecifikke udtryk for forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under synapsinpromotoren her10. Denne tilgang kan udvides til 1) forskellige hjernecelletyper ved at anvende andre celletypespecifikke promotorer, såsom myelinbasisk protein (MBP) promotor til oligodendrocytter og glialfibrillært surt protein (GFAP) promotor til astrocytter11, 2) forskellige målproteiner af interesse ved at fusionere deres gener med EGFP-genet og 3) co-ekspression af flere proteiner fusioneret til forskellige fluoroforer. Her pakkes EGFP og udtrykkes via adeno-associeret virus (AAV) levering gennem en intrakraniel injektion. En TBI med lukket kranium administreres ved hjælp af en vægtfaldsanordning efterfulgt af implantation af et kranievindue. Visualisering af neuronal EGFP opnås gennem kranievinduet ved hjælp af to-fotonmikroskopi til påvisning af EGFP-fluorescens in vivo. Med to-fotonlaseren er det muligt at trænge dybere ind i det kortikale væv med minimal fotoskade, hvilket muliggør gentagen langsgående billeddannelse af de samme kortikale regioner inden for en individuel mus i dage og op til måneder12,13,14,15. Alt i alt har denne tilgang til at kombinere en TBI-operation med intravital billeddannelse til formål at fremme forståelsen af de molekylære begivenheder, der bidrager til TBI-induceret sygdomspatologi16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrerelaterede protokoller blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr udgivet af National Research Council (US) Committee. Protokollerne blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (tilladelsesnummer 202100057). Kort sagt, som vist i undersøgelsesskemaet (figur 1), modtager dyret en virusinjektion, en TBI, en vinduesimplantation og derefter intravital billeddannelse i en tidssekvens.
BEMÆRK: Handelsbetingelser er blevet fjernet. Se materialefortegnelsen for det specifikke udstyr, der anvendes.
1. Intrakraniel injektion af AAV ved hjælp af en stereotaksisk enhed
- AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
- Brug en viral titer på 1 x 1013 virale genomer pr. milliliter (vg / ml). Syn1 refererer til Synapsin1, som er en neuronal specifik promotor, der muliggør begrænset viral ekspression i neuroner. Virussen kan fremstilles internt eller outsources.
- Forberedelse til stereotaksisk injektionskirurgi til administration af AAV
- Autoklave almindelig saks, en kirurgisk tykkelse, kirurgisk fjedersaks, kirurgisk tang, mygtang, gasbind, en bomuldsspidsapplikator og en glasmikrolitersprøjte.
- Desinficer operationsområdet ved hjælp af 75% ethanol. Udvid det sterile engangskirurgiske drapering for at dække operationsområdet på den stereotaksiske platform.
BEMÆRK: For at opretholde dyrets kropstemperatur under injektionsoperationen skal du bruge et feedbackreguleret varmeapparat. - Vej og registrer musens kropsvægt.
- Åbn iltbeholderventilen, og juster iltstrømmen til 1,5 l / min. Åbn anæstesimaskinen, og indstil isofluranniveauværdien til tre.
BEMÆRK: Bæregassen kan enten være rumluft eller 100% ilt i dette trin. - Sæt musen i induktionskammeret og lad den forblive i 5 minutter for at opnå fuld bedøvelse.
- Når musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 s, kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks), skal du fjerne musen fra induktionskammeret og placere musehovedet i stereotaksrammen.
- Placer anæstesislangens næsekegle over musens snude.
- Oprethold anæstesi ved hjælp af 1,5% isofluran med bærergas ved en 1 l / min strømningshastighed indtil operationens afslutning. Kontroller regelmæssigt åndedrætfrekvensen, og giv en hale eller tåklemme mindst hvert 15. minut under hele operationen for at vurdere passende anæstesi. Isoflurankoncentrationen justeres efter behov for at opretholde den ønskede anæstesidybde.
- Fyld en mikroliter sprøjte (10 μL) med virusopløsningen. Fastgør derefter sprøjten på den matchede mikroinjektorpumpe på den stereotaksiske enhed.
- Injektion kirurgi
- Buprenorphin (1 mg/kg, subkutant) administreres ved hjælp af en engangsinsulinsprøjte og påføres øjensalve med smøremiddel i musens øjne.
- Fjern hårene fra hovedbunden oven på hovedet ved at trimme med en almindelig saks 1.
- Rens hovedbundens hud med gaze og bomuldsspidsede applikatorer. Desinficer huden med 75% ethanol først og derefter betadin. Gentag dette tre gange (dvs. ethanol efterfulgt af betadin), og lad den endelige anvendelse af betadin være på huden.
- Kontroller bedøvelsesdybden igen for at sikre, at musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 s kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks). Lav et ~ 1 cm snit ved hjælp af almindelig saks 2 langs midterlinjen for at udsætte det højre parietale kranium, og fjern periosteum ved hjælp af en applikator med bomuldsspids.
- Marker to punkter på kraniet ved hjælp af en markørpen ved disse koordinater: punkt A: 2,5 mm bagud til Bregma og 1 mm lateralt til midterlinjen over højre halvkugle; punkt B: 2,5 mm bagud til Bregma og 2 mm til midterlinjen over højre halvkugle.
- Bor forsigtigt to huller gennem kraniet ved de markerede koordinater ved hjælp af en elektrisk tandbor med en fin EF4-hårdmetalbit.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige hjernevævet. - Juster den stereotaksiske ramme for at justere mikroliter sprøjtekanylespidsen til kraniehullet, der er 1 mm lateralt til midterlinjen.
- Sænk kanylen for at berøre hjerneoverfladen, og indstil derefter denne placering som nulpunktet (for z-aksen). Sænk nålespidsen ned i hjernebarken til en dybde på 0,5 mm, og tilsæt langsomt 1 μL af virusopløsningen med en hastighed på 200 nL/min.
- Vent 5 minutter efter, at virusopløsningen er injiceret fuldstændigt i hjernevævet, før nålen trækkes ud for at forhindre tilbagestrømning af opløsningen.
- Træk langsomt kanylen ud. Gentag injektionen på det andet sted. Sutur snittet med en steril, ikke-absorberbar kirurgisk sutur (6-0 gauge).
- Administrer cefazolin [500 mg / kg (333 mg / ml, normalt ~ 45 μL), intramuskulært] og meloxicam (5 mg / kg, subkutant) efter operationen, mens dyret stadig er bedøvet.
- Frigør musen fra den stereotaksiske ramme og afbryd anæstesi. Placer musen i et rent bur over et varmetæppe, og overvåg dyret, indtil det er ambulant (ca. 15 min). Overfør derefter til hjemmeburet.
- Administrer buprenorphin (1 mg/kg, subkutant) og meloxicam (5 mg/kg, subkutant) igen i henholdsvis 8 timer, 16 timer og 24 timer efter den første injektion med buprenorphin.
BEMÆRK: 2-4 uger efter virusinjektion modtager musen TBI og kranievinduesimplantation på samme sted som AAV-injektionen.
2. Administration af en gentagen TBI-induktion
BEMÆRK: TBI-parametrene er justeret fra tidligere rapporter7,8, hvor TBI-effekten blev leveret én gang. Protokollen her anvender den samme parameter, bortset fra at øge det samlede effekttal til 10.
- TBI-udstyr
- Brug en specialbygget bærbar enhed til administration af en TBI med lukket kranium (figur 2A) til musehovedet på højre side, som angivet i figur 2B.
- Forberedelse før operationen
- Autoklave kirurgisk udstyr, herunder almindelig saks, en kirurgisk tykkelse, kirurgisk fjedersaks, kirurgisk tang, mygtang, hovedstolpestykker, gaze og bomuldsspidsede applikatorer.
- Vej og registrer musens kropsvægt 2 timer før operationen. For at minimere hjerneødem under implantation af kranievinduer injiceres dexamethasonnatriumphosphat i en dosis på 4,8 mg/kg [2 mg/ml, normalt ~70 μl (skal injiceres to steder)] i quadriceps musklen ved hjælp af en insulinsprøjte. Efter injektion af dexamethason, men inden TBI-kirurgi påbegyndes, klargøres glasvinduerne som angivet i trin 3.1 til senere brug.
- Desinficer det kirurgiske stadium og TBI-udstyr ved hjælp af 75% ethanol, og udvid det sterile kirurgiske engangsdrapering for at dække operationsstadiet på den stereotaxiske platform. Tænd for varmeapparatet og temperaturmåleren, og indstil måltemperaturen til 37 °C.
- Åbn iltbeholderventilen, og juster iltstrømmen til 1,5 l / min. Åbn anæstesimaskinen, og indstil isofluranniveauværdien til tre.
BEMÆRK: 100% ren ilt kan hjælpe dyret med at overleve TBI-påvirkningerne. - Sæt musen i induktionskammeret og lad den forblive i 5 minutter for at opnå fuld bedøvelse.
- Når musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 s, kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks), skal du fjerne musen fra induktionskammeret og placere musehovedet i stereotaksrammen.
- Placer anæstesislangens næsekegle over musens snude.
- Bevar anæstesi ved hjælp af 1,5% isofluran blandet med 100% ren ilt ved en 1 l / min strømningshastighed indtil afslutningen af operationen. Kontroller regelmæssigt åndedrætfrekvensen, og giv en hale eller tåklemme mindst hvert 15. minut under hele operationen for at vurdere passende anæstesi. Isoflurankoncentrationen justeres efter behov for at opretholde den ønskede anæstesidybde.
- TBI kirurgi
- Buprenorphin (1 mg/kg, subkutant) administreres ved hjælp af engangsinsulinsprøjter og påføres oftalmisk salve på musens øjne.
- Fjern håret fra toppen af hovedet ved at trimme med saks 1, og påfør derefter hårfjerningsmiddel i 1 min.
FORSIGTIG: Anvend ikke hårfjerningsmidlet i mere end 3 minutter i hovedbunden, da det er hudirriterende. Undgå at få hårfjerningsmiddel på musens øjne. - Rens hovedbundens hud ved at påføre gaze og applikatorer med bomuldsspids. Desinficer derefter huden ved først at bruge 75% ethanol og derefter betadin. Gentag dette tre gange (dvs. ethanol efterfulgt af betadin), og lad den endelige anvendelse af betadin være på huden.
- Kontroller bedøvelsesdybden igen for at sikre, at musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 s kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks). Telt huden med kirurgisk pincet 3, og lav et 12-15 mm langt snit i midterlinjen, der starter ca. 3 mm bageste fra øjnene.
- Skær huden over venstre og højre halvkugle af kraniet ved hjælp af fjedersaks 2.
- Når kraniet er udsat, skal du fjerne periosteum ved forsigtigt at gnide med en steril applikator med bomuldsspids og skylle med sterilt saltvand.
- Undersøg visuelt kraniets tilstand for at sikre, at den er intakt, bortset fra de to små huller, der blev lavet til den tidligere virusinjektionsoperation.
- Tør kranieområdet og markér TBI-nedslagsstedet ved følgende koordinater: 2,5 mm bagved Bregma og 2 mm lateralt fra sagittalsuturen til højre (figur 2B).
- Fjern hurtigt musen fra den stereotaksiske ramme og læg hovedet på bufferpuden under TBI-enheden.
- Juster slaglegemets spids med det markerede anslagssted.
- Løft metalsøjlen ved at trække den tøjrede nylonstreng til 15 cm over musehovedet og slip den derefter, så vægten falder frit på transducerstangen, som er i kontakt med kranietoppe på TBI-stedet. Rør ikke ved musehovedet, når du leverer TBI-effekten.
- Flyt musen over på varmetæppet, og læg den på ryggen, mens du overvåger vejrtrækningsstatus.
- Når musen har ret sig selv fra liggende til en udsat position, placeres musen i isofluraninduktionskammeret i ~5 min med 3% isofluran blandet med 100% ren ilt ved en strømningshastighed på 1,5 l / min.
- Når musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 sek., kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks), gentages trin 2.3.9-2.3.14 for at opnå i alt 10 stød.
BEMÆRK: Ti TBI-påvirkninger har vist sig at inducere robust fænotype med lav musedødelighed i vores undersøgelse (data endnu ikke offentliggjort). Parametrene kan justeres for at opnå en anden sværhedsgrad af hjerneskade ved at øge eller mindske antallet af stød og / eller den højde, hvorfra vægten frigives. Alle parametre skal godkendes af den lokale IACUC. - Kontroller kraniet under et kirurgisk mikroskop, og fjern musen fra undersøgelsen, hvis der er opstået kraniebrud.
- For en skinoperation skal du følge de samme procedurer som beskrevet ovenfor, herunder placering af dyret under slaglegemet, men uden at levere TBI-virkningerne.
- Når musen har rettet sig fra en liggende til en udsat position efter det 10. TBI-stød, skal du placere musen i isofluraninduktionskammeret i ~ 5 minutter. Følg trin 2.2.6-2.2.8 for at placere musehovedet på den stereotaksiske ramme til kranievinduesimplantationsoperationen, der er beskrevet nedenfor.
3. Kranial vinduesimplantationskirurgi
BEMÆRK: Trinnene til implantation af kranievinduer nedenfor blev vedtaget fra Goldey et al.9, og deres specifikationer for hovedstolpen og billeddannelsesbrønden blev anvendt her.
- Forberedelse af vinduer
BEMÆRK: Afslut vinduesforberedelsen i trin 2.2.2, inden TBI-operationen påbegyndes. Vinduet er fremstillet af to runde glasdæksler (en 3 mm og en 5 mm i diameter, som angivet i figur 2C), der er forbundet med gennemsigtigt optisk klæbemiddel som beskrevet nedenfor.- Desinficer glasdækslerne ved at nedsænke dem i 75% ethanol i 15 min. Tag glasdækslerne ud af ethanolen og lad dem tørre på en steril overflade (dvs. låget på en steril plade med 24 brønde) i ~ 10 minutter.
- Fyld en insulinsprøjte med gennemsigtig optisk lim, samtidig med at du undgår bobledannelse. Under mikroskop 1 (Materialefortegnelse) ved 0,67x forstørrelse anbringes en lille dråbe (~1 μL) optisk lim i midten af 5 mm dæksel. Placer derefter straks 3 mm dækselen ovenpå, og centrer den med 5 mm dæksel.
- Tryk forsigtigt med fine pincet for at sprede limen jævnt. Kassér glasruden, hvis der dannes en boble eller væg omkring 3 mm dækslet.
- For at hærde limen skal du placere dækslerne i en UV-kasse i 150 s ved en effekt på 20 x 100 μJ / cm2. Kontroller, at de to dæksedler er sikkert fastgjort, ved hjælp af pincet 4 til forsigtigt at skubbe siden af 3 mm slippen. Hvis dækslet bevæger sig, skal du sætte det tilbage i UV-boksen i yderligere 60 sekunder. Opbevar glasvinduet i en steril plade med 24 brønde til senere brug.
- Grov kraniets overflade.
BEMÆRK: Herfra skal du udføre alle trin i afsnit 3 under et kirurgisk mikroskop. Start med 10x, og juster til den ønskede forstørrelse.- Bor forsigtigt og langsomt overfladen af kraniet ved hjælp af en FG4-hårdmetalbit ved lav rotorhastighed (dvs. outputnummer indstillet til ~ 1-2) for at fjerne det resterende periosteum og skabe en ru kranieoverflade, således at tandcementen binder sikkert med kraniet. En skalpel kan også bruges her i stedet for en boremaskine som et alternativ.
- Brug saltvand til at skylle og fjerne knoglestøv fra kraniets overflade.
- Adskil musklerne.
BEMÆRK: Muskeladskillelse tjener til at øge overfladearealet af den blottede kranieknogle, der vil fungere som kontaktpunkt for tandcementen og derved sikre implantatets strukturelle integritet. Dette muskelseparationstrin udsætter normalt ~ 3 mm af den tidsmæssige kranieplade.- På ca. 5 mm bageste til øjet, hvor suturen, der forbinder parietal og temporale kraniet, er placeret, skal du forsigtigt indsætte de lukkede fine spidser (# 5/45 tang) for at adskille sidemusklerne fra kraniet og forsigtigt bevæge de lukkede spidser i bageste retning indtil Lambdoid sutur.
- Adskil sidemusklerne på den side, hvor implantation af kraniale vinduet vil forekomme.
BEMÆRK: Pas på ikke at adskille musklerne for tæt på øjet for at undgå at skade oftalmisk arterie; Ellers kan der forekomme alvorlig og vedvarende blødning. Adskil ikke muskler fra occipitalbenet, da musen kræver, at disse muskler løfter hovedet. - Vask snavs fra det kirurgiske sted ved hjælp af saltvand og tør området med gasbind. Gelskum kan påføres det kirurgiske sted for at stoppe blødningen.
- Implanter hovedstolpen.
- Brug en specialfremstillet titaniumhovedpost (figur 2D), beskrevet i en tidligere publikation9, til at fastgøre musehovedet sikkert, mens du udfører kraniotomioperationen og til efterfølgende to-fotonbilleddannelse.
- Brug en markørpen og en kirurgisk tykkelse til at spore omkredsen af kraniotomien på det rene og tørre kranium på højre side. Midtpunktet af den sporede cirkel er 2,5 mm bagved Bregma og 1,5 mm fra sagittal sutur på højre halvkugle. Diameteren af den sporede cirkel er ca. 3,2-3,5 mm, lidt større end 3 mm glasdækslet. Sørg for, at kraniotomiklen kan dække virusinjektionsstederne (de to huller, der er lavet under injektion af virussen, kan bruges som reference) og TBI-stedet.
- Løsn ørestangen og drej hovedet, så kraniotomiplanet er perfekt vandret, og stram derefter ørestangen igen.
- Brug træpinden på en applikator med bomuldsspids til at tilføje to små dråber superlim til for- og bagkanten af hovedstolpen.
- Placer titaniumhovedstolpen over midten af kraniotomien, og juster den hurtigt til at hvile inden for det samme plan, som hvor kranievinduet vil blive implanteret. Påfør let tryk, indtil superlimen er tørret; Dette tager normalt ~ 30 s.
- Forbered tandcement i en forkølet keramisk blandeskål (ophold mindst 10 minutter i en -20 °C fryser): Kombiner 300 mg cementpulver, seks dråber hurtig basevæske og en dråbe katalysator, og rør derefter blandingen, indtil den er grundigt blandet (~ 15 gange).
BEMÆRK: Cementen skal være pastaagtig. Hvis det er for tyndt, rør lidt mere cementpulver i. Hvis den er for tyk, omrøres hurtig basisvæske en dråbe ad gangen, indtil der opnås en pastaagtig konsistens. - Påfør hurtigt en generøs mængde tandcementblanding på ydersiden af den sporede omkreds, og dæk enhver udsat knogleoverflade. Dæk dog ikke stedet for kraniotomien. Lad ~15 minutter for tandcementen tørre og hærde, før du fortsætter.
- Slip ørestangen, og fastgør hovedstolpen til metalrammen for at sikre, at hovedet er stabilt til præcis boring langs den markerede kraniotomislutning. Hvis der er cement over kraniotomistedet, skal du bruge FG4-hårdmetalboret til at bore og fjerne det.
- Kraniotomi
- Der anvendes en kirurgisk tykkelse til at kontrollere diameteren af den markerede cirkel som defineret i trin 3.4.2. Juster efter behov, så kranievinduet passer tæt ind i kraniotomien.
- Brug en elektrisk tandboremaskine til at ætse og tynde kraniet langs ydersiden af den markerede cirkel ved hjælp af en FG4-hårdmetalbit først (hastighed indstillet til en ydelse ~ 9-10). Dette skaber et "spor", inden for hvilket kraniet kan tyndes.
FORSIGTIG: For at minimere varmeskader og opnå et jævnt spor skal du fortsætte med at flytte boret. Bor ikke det samme sted i mere end 2 sekunder. - Stop regelmæssigt boringen og skyl hele området med sterilt saltvand for at reducere opvarmningen fra boret og vaske knoglestøvet væk.
- Fortsæt med at tynde kraniet med en FG1/4 hårdmetalbit, som beskrevet i trin 3.5.2, indtil kraniet er papirtyndt og gennemsigtigt.
BEMÆRK: Brug af to hænder til at holde boret kan gøre det lettere at styre boret og undgå at indsætte boret i hjernen. - Afslut kranieudtyndingen ved hjælp af en EF4-hårdmetalbit. Når der opstår en revne mellem knogleklappen og den omgivende kranieknogle, er der undertiden en frigivelse af cerebral spinalvæske (CSF), hvilket indikerer, at kraniet er blevet boret helt igennem.
- Fortsæt udtynding og boring gennem resten af kraniet langs sporet. Undgå at bore gennem det punkt, hvor en åbenlys vaskulatur krydser under kraniet for at forhindre blødning.
- Indsæt en fin pincetspids (tang 1) ~ 0,5 mm gennem det revnede sted, og løft knogleklappen forsigtigt opad uden at indrykke den underliggende hjerne.
- Når knogleklappen er fjernet, skylles kraniotomiområdet med saltvand. Hjerneoverfladen kunne være 1-2 mm højere end kraniotomikanten.
- Fra dette trin skal du altid dække den udsatte hjerne med saltvand for at beskytte hjernevævet.
- Blødning kan forekomme, når knogleklappen løftes på de oprindelige AAV-injektionssteder på grund af vævsadhæsion og vaskulaturvækst efter injektionsoperationen. Hvis dette sker, skal du forsigtigt trykke på stedet med en applikator med tør bomuldsspids i ~2 minutter (eller længere efter behov). Gelskum kan bruges til at stoppe blødningen. Brug ikke kemikalier eller varmepincet til at stoppe blødningen, da dette kan forårsage personskade.
- Brug tangen 1 til forsigtigt at fjerne det synlige arachnoide stof.
- Implantat glasvindue
- Brug den kirurgiske pincet 2 til at samle det sterile glasvindue op med 3 mm glasdækslet nedad. Placer og juster glasvinduet over kraniotomistedet for at sikre, at vinduet kan passe tæt til kraniotomikanten. 5 mm glasdækslet er på toppen.
- Forbered tandcement som følger: kombiner 100 mg cementpulver, to dråber hurtig basevæske og en dråbe katalysator. Rør blandingen, indtil den er grundigt blandet (~ 15 gange). Vent ~ 6 minutter, indtil cementen bliver pastaagtig og tyk. Hvis cementen er for tynd, kan den sive ind i rummet under vinduet i trin 3.6.4 og skjule vinduet.
- Mens du venter på, at cementen bliver pastaagtig og tyk, skal du anvende en tilstrækkelig mængde tryk på vinduet gennem en stereotaksisk manipulator for at kontrollere, at kraniet sikkert og tæt kan kontakte glasvinduet. Sørg for, at tandcementvæsken i trin 3.6.4 ikke når rummet under glasset og dermed skjuler vinduet.
- Brug en justerbar præcisionsapplikatorbørste til at tilføje en lille mængde cement langs vindueskanten for at forsegle glasvinduet med kraniet. Vent i ~ 10 minutter for at lade cementen tørre helt, og slip derefter forsigtigt manipulatoren over vinduet. Fra dette trin tager det ~ 4 timer at afslutte de 10 TBI-stød og implantere hovedstolpen og kranievinduet.
- Trim tandcementen ved hjælp af tandboret med en FG4-hårdmetalbit, hvis der er overskydende cement, der dækker vinduet.
BEMÆRK: Overdreven cement omkring vinduet kan forhindre to-fotonobjektivlinserne i at nærme sig vinduesoverfladen.
- Implantering af billeddannelsesbrønden
BEMÆRK: En billeddannelsesbrønd (figur 2D) er en gummiring med en udvendig diameter på ~ 1,6 cm, der matcher hovedstolpens øverste overflade og holder vand over kranievinduet til to-fotonbilleddannelse.- Når vinduesimplantationen er afsluttet, skal du bore tandcementresterne væk på hovedstolpens øverste overflade og rengøre området ved hjælp af vådt kirurgisk gaze. Lad området tørre i ~3 min.
- Brug en applikator med bomuldsspids til at dyppe en lille mængde superlim og indsætte den på hovedstolpens øverste overflade. Placer hurtigt gummiringen på hovedstolpen. Påfør medium tryk på gummiringen i ~2 min for at sikre tæt kontakt med hovedstolpen. Brug superlim sparsomt, ellers kan det klæbe til glasvinduet og skjule to-fotonbilleddannelsen.
- Analgetisk og antibiotisk administration
- Umiddelbart efter implantering af billeddannelsesbrønden, men inden seponering af isofluran, administreres cefazolin [500 mg/kg (333 mg/ml, normalt ~45 μL), intramuskulært] og meloxicam (5 mg/kg, subkutant) ved hjælp af engangsinsulinsprøjter.
- Efter lægemiddeladministration skal du afbryde anæstesi, frigøre musen fra den stereotaxiske ramme og returnere musen til sit hjemmebur, som ligger over et varmetæppe.
- Overvåg musen nøje i ~ 15 minutter, indtil den er ambulant.
BEMÆRK: Opbevar musene individuelt, da de kan bide gummibilleddannelsesbrønden fra andre mus. Sørg for mad og vandgel tæt på musen i buret for adgang ad libitum. - Buprenorphin (1 mg/kg, subkutant) og meloxicam (5 mg/kg, subkutant) administreres igen hver 8. time efter den forrige dosis indtil 48 timer efter kranievinduesimplantationsoperationen.
4. Intravital to-foton-billeddannelse
- Brug mikroskop 2 (materialetabel), udstyret med en justerbar sammenhængende multifotonlaser og et 20x forstørrelsesmål (NA 1.0; vandnedsænkning) til intravital billeddannelse18. Filteret, der bruges til EGFP-signalet, er "BP 500-550".
- Forbered kraniale vinduesmus til intravital billeddannelse.
- Fra og med operationsdagen (udpeget som dag 0) skal du udføre to-fotonbilleddannelse på designede tidspunkter efter TBI. Placer kranievinduesmusen i anæstesiinduktionskammeret, og administrer 3% isofluran blandet med bæregas ved en 1,5 l / min strømningshastighed i 5 minutter.
BEMÆRK: Bæregassen kan enten være rumluft eller 100% ilt. - Når musen er fuldt bedøvet (dvs. langsom, men stabil vejrtrækning ved ca. en cyklus pr. 2 s, kombineret med fraværet af en haleklemmerefleks), skal du fjerne musen fra induktionskammeret og hurtigt klemme hovedstolpen til et beslag. Lad musens torso ligge på en rund plastplade (19 cm diameter), der er udstyret med beslaget.
BEMÆRK: En håndvarm pude blev placeret under musens torso for at give varmestøtte under intravital billeddannelse. - Påfør smøremiddel oftalmisk salve på musens øjne og læg anæstesislangens næsekegle over musens snude. Bevar anæstesi ved at bruge 1,5% isofluran med bæregas ved en 1 l / min strømningshastighed.
- Kontroller regelmæssigt åndedrætsfrekvensen, og giv en hale eller tåklemme mindst hvert 15. minut under hele billeddannelsen for at vurdere passende anæstesi. Isoflurankoncentrationen justeres efter behov for at opretholde den ønskede anæstesidybde.
- Juster musehovedet for at sikre, at kranievinduet er direkte under to-fotonobjektivlinsen. Tilsæt lidt vand i billeddannelsesbrønden over kranievinduet. Sænk målet, så det nedsænkes i vandet.
- Fra og med operationsdagen (udpeget som dag 0) skal du udføre to-fotonbilleddannelse på designede tidspunkter efter TBI. Placer kranievinduesmusen i anæstesiinduktionskammeret, og administrer 3% isofluran blandet med bæregas ved en 1,5 l / min strømningshastighed i 5 minutter.
- Intravital billeddannelse af intrakranielle vinduesmus
- Tænd for kikkertsigtet kviksølvlampe. Se hjernen med epifluorescens gennem okulær først.
BEMÆRK: Vaskulaturen ser sort ud. Vælg et område, hvor vinduet er ryddet. Sluk for epifluorescensen, indstil laserbølgelængden til 860 nm for EGFP-signalet, og juster laserindstillingen for optimalt (dvs. lyst, men ikke mættet) signal. - Indstil scanningstilstanden til Frame og linjetrinnet til 1. Indstil gennemsnitstallet til 16, bitdybden til 8-bit, tilstanden som linje og metoden som middelværdi.
- Brug vaskulaturmønsteret som et "referencekort" til at afbilde det samme hjerneområde til efterfølgende langsgående billeddannelse. Det overfladiske niveau (lag I, mindre end 100 μm fra meningealoverfladen) afbildes for tre planer, hvor den kortikale vaskulatur dominerer gennem en z-stack-tilstand med et interplaninterval på 10 μm som vist i figur 3A.
- Billede af seks planer på dybt niveau (lag IV og V, ~400 μm dybere end det overfladiske niveau) gennem en z-stack-tilstand som vist i figur 3A med et interplaninterval på 10 μm og en scanningshastighed på 8.
- Når du er færdig med billeddannelsen (~ 20 min pr. Mus), skal du afbryde anæstesi, frigøre musen fra rammerne og returnere den til sit hjemmebur, der er over et varmetæppe. Overvåg musen fortløbende, indtil den er ambulant, hvilket normalt tager ~ 7 min.
- Langsgående billede musen på dag 0, 1 uge og 4 måneder efter TBI-operationen.
- Tænd for kikkertsigtet kviksølvlampe. Se hjernen med epifluorescens gennem okulær først.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som bevis på konceptet for denne protokol blev virale partikler, der udtrykte AAV-Syn1-EGFP, injiceret i hjernebarken hos mandlige TDP-43 Q331K /Q331K mus (C57BL / 6J baggrund)19 i en alder af 3 måneder. Det bemærkes, at vildtype C57BL/6J dyr også kan anvendes, men denne undersøgelse blev udført i TDP-43 Q331K/Q331K mus, fordi laboratoriet er fokuseret på neurodegenerativ sygdomsforskning. En TBI-operation blev udført 4 uger efter AAV-injektion. Inden for samme kirurgiske indstilling blev hovedstolpen og kraniale vinduet implanteret. Musen blev serielt afbildet ved hjælp af et to-fotonmikroskop på dag 0, 1 uge og 4 måneder efter TBI-operation (figur 1). Generelt tog injektionsoperationen ~ 30 minutter, og TBI-operationen tog ~ 1 time pr. Mus. Under TBI-operationen krævede musene generelt længere tid til at rette sig fra en liggende stilling til en udsat position efter efterfølgende påvirkninger sammenlignet med de indledende påvirkninger. For eksempel kan en mus have krævet 2 minutter at rette sin position efter det første slag, men det krævede 10 minutter at rette sin position efter det 10. slag. Til kranial vinduesimplantationsoperation var ~ 3 timer normalt påkrævet for at udføre alle trin, men det tog længere tid end nødvendigt, hvis der opstod vedvarende blødning. To-foton-billeddannelse krævede normalt 20 minutter pr. mus for at erhverve alle billederne. I den aktuelle undersøgelse, der involverede tre mus med ekspression af EGFP, viste dyrene ikke tegn på kraniebrud, og de døde heller ikke under operationen eller op til 4 måneder efter operationen. Både sygelighed og kraniebrud var 0%. Dette er i overensstemmelse med den relativt lave (<10%) dødelighed i en lignende model for inducerende TBI, men uden et kranievinduesimplantat 7,8.
En vægtfaldsenhed (figur 2A), der tidligere er rapporteret7,8, blev brugt til at levere TBI-påvirkninger på musehovedet på højre side, som angivet i figur 2B. Et gennemsigtigt plastrør (nr. 5 i figur 2A; 60 cm i længden og 1,4 cm i indvendig diameter) blev sikkert og lodret fastspændt til et metalbeslag, og en plastslagsøjle (nr. 7 i figur 2A; 10 cm i længden og 1,3 cm i diameter, med en flad rund spids på 2 mm i diameter) blev anbragt i det lodrette rør. En 50 g metalvægt (nr. 6 i figur 2A) blev anbragt over slaglegemet og tøjret med en nylonsnor (nr. 4 i figur 2A). En bufferpude (nr. 8 i figur 2A; 9 cm x 9 cm x 1 cm [længde x bredde x dybde], lavet af polyethylenskum og bomuldsgaze) blev placeret under musehovedet for at buffere og absorbere slagenergien.
Kranievinduet var lavet af to glasdæksler kombineret med optisk klæbemiddel (figur 2C), og glasdækslet med en diameter på 3 mm var den side, der rørte hjerneoverfladen. To-fotonbilleddannelse blev udført i to forskellige dybder (figur 3A) fra hjerneoverfladen: 1) et overfladisk niveau, hvor den kortikale vaskulatur var rigelig og havde en relativt stor lumendiameter, der syntes sort, men med sparsomme EGFP-positive cellelegemer; og 2) et dybere niveau, hvor vaskulaturen var sparsom og havde en lille lumendiameter, hvor mange EGFP-positive celler var synlige.
Ved ~4 timer (dag 0) efter operationen blev to-fotonbilleddannelse udført på tre planer med et interval på 10 μm på det overfladiske niveau (lag I, mindre end 100 μm fra meningealoverfladen) først, hvor vaskulaturen syntes sort (angivet med de stiplede røde linjer i figur 3B) og blev brugt som referencekort til den næste billeddannelsessession for at lokalisere det oprindelige billeddannelsesområde. På dette overfladiske niveau var de kortikale vaskulatur og neuronale processer de dominerende strukturer, der kunne observeres, mens EGFP-positive cellelegemer var sparsomme. Efter billeddannelse inden for det overfladiske niveau blev fokus justeret nedad med ~ 400 μm, dybere end det overfladiske niveau, ind i cortex (lag IV og V) for at afbilde EGFP-positive neuronale cellelegemer. Billeder blev erhvervet inden for seks planer med et interval på 10 μm. EGFP-proteinekspression blev diffust fordelt i hele cellekroppen, som vist i figur 3C. Der var lejlighedsvis forekomst af nogle EGFP-punkter, uden for cellelegemerne, som kunne repræsentere EGFP-indeslutninger, der blev dannet over tid inden for axoner eller dendritter. Denne protokol resulterer i AAV-SYN1-EGFP-ekspression ~2-3 mm omkring injektionsstedet, som kan defineres ved histologisk analyse af post mortem-væv.
1 uge og 4 måneder efter TBI blev vaskulaturmønsteret observeret på tidspunktet for dag 0 brugt som reference til at lokalisere det samme billeddannelsesområde (figur 3D, F). Vaskulaturmønsteret i figur 3D,F svarer til det i figur 3B. Billeddannelsesproceduren for 1 uge og 4 måneder efter TBI var den samme som beskrevet ovenfor for dag 0-tidspunktet, og EGFP-ekspression blev detekteret i hele cellekroppen som før (figur 3E, G). Fluorescensintensiteten på dag 0 og 4 måneder var ens på både det overfladiske og dybere niveau. Imidlertid var fluorescensintensiteten efter 1 uge lavere end på dag 0 og 4 måneder på både det overfladiske og dybe niveau, hvilket kunne skyldes den translationelle undertrykkelse, der blev rapporteret for andre TBI-modeller20. Især viser kvaliteten af billederne efter 4 måneder sammenlignet med dag 0-tidspunktet, at kranievinduet har opretholdt klarhed og integritet, og at det virale udtryk stadig er robust 4 måneder efter operationen for effektiv intravital billeddannelse. Da EGFP udtrykker sig som et relativt diffust protein, kan fluorescenssignalerne opløses bedre og diskret, når EGFP smeltes sammen med et protein af interesse.
Figur 1: Tidslinjen for denne intravitale billeddannelsesprotokol. Protokollen indledes med virusinjektion. TBI og kranial vindueskirurgi udføres inden for samme kirurgiske session 2-4 uger efter virusinjektion. Intravital billeddannelse udføres på dag 0, 1 uge, 4 måneder efter TBI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diagrammer for TBI-enheden, TBI-påvirkningssted og vinduesforberedelse . A) Udstyr til TBI-anordningen med vægttab. 1: piedestal, 2: beslag, 3: justerbar klemme, 4: nylonstreng, 5: vægtfaldende tunnel, 6: metalvægtsøjle (50 g), 7: slaglegeme, 8: bufferpude. (B) Et skema over virusinjektions- og TBI-nedslagsstedet med koordinaterne 2,5 mm bagved Bregma og 2 mm lateralt fra sagittalsuturen til højre. (C) Et skema til klargøring af glasruden. To glasdækselglider, 3 mm og 5 mm i diameter, kombineres ved hjælp af optisk klæbemiddel. (D) Billeder af metalhovedstolpen og billeddannelsesbrønden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk oversigt over billedplaner og billeddata . (A) Flere planer er afbildet på et overfladisk niveau, hvor vaskulaturen er placeret og et dybt niveau. Billederne samles som følger: tre planer på det overfladiske niveau, hvor de kortikale vaskulatur og neuronale processer er de overvejende EGFP-positive strukturer, og seks planer på det dybe niveau, hvor EGFP-positive cellelegemer overvejende observeres med et interval på 10 μm mellem naboplanerne. Hvert plan er af en størrelse på 425,10 μm x 425,10 μm. (B) Repræsentativt billede af et fly i det overfladiske niveau på dag 0-tidspunktet. De stiplede røde linjer angiver vaskulaturkonturen, der kan bruges som reference til at lokalisere det oprindelige billeddannelsessted for efterfølgende tidspunkter. (C) Repræsentativt billede af et fly i det dybe niveau på dag 0-tidspunktet kort efter TBI. (D) Repræsentativt billede af et fly i det overfladiske niveau på 1 uges tidspunkt. De stiplede røde linjer angiver vaskulaturen, svarende til omridset på dag 0 i figur 3B, hvilket bekræfter, at to-fotonbilleddannelsen blev udført på et lignende sted på dag 0 og 1 uge efter TBI. (E) Repræsentativt billede i det dybe niveau på 1 uges tidspunkt efter TBI. (F) Samme som B og D, 4 måneder efter TBI. (G) Samme som C og E, 4 måneder efter TBI. Skalabjælke: 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev AAV-injektion, TBI-administration og en hovedpost med kranial vinduesimplantation kombineret til langsgående billeddannelsesanalyse af EGFP-mærkede neuroner i musehjernebarken (lag IV og V) for at observere virkningerne af TBI på kortikale neuroner. Denne undersøgelse bemærker, at TBI-stedet valgt her, over hippocampus, giver en relativt flad og bred overflade til implantation af kranievinduet. Omvendt er kraniet relativt smalt foran dette sted, og derfor er det svært at sikre, at hovedstolpen effektivt kommer i kontakt med kraniets overflade. Mens kun TDP-43 Q331K/ Q331K musemodellen blev brugt i denne undersøgelse, i betragtning af laboratoriets forskning med fokus på ALS og FTD19, bør denne protokol være gældende for de fleste andre musestammer. Ud over at mærke neuroner som beskrevet her, kan forskellige strategier bruges til at mærke andre celletyper til intravital billeddannelse. En tilgang er at udtrykke de genetisk kodede fluorescerende proteiner på en cellespecifik måde ved hjælp af Cre-Lox-rekombinationssystemet i genetisk modificerede mus21. En anden tilgang er at anvende visse virale serotyper til cellespecifik transduktion af genetisk kodede fluorescerende proteiner. Stedspecifik levering kan opnås ved at udføre den intrakranielle injektion på det ønskede sted i hjernen. Den effektivitet og lethed, hvormed man kan udtrykke cellespecifikke proteiner via viral transduktion til intravital billeddannelse, er en fordel i forhold til at skabe transgene musemodeller.
For operationsprotokollerne er der flere kritiske trin, der skal udføres omhyggeligt. Når man borer huller på kraniet til virusinjektion i starten af protokollen, skal man være forsigtig med at beskadige vævet under kraniet. Hvis der opstår vævsskade under boring på kraniet, vil der være betændelse, vævsadhæsion og angiogenese omkring skadestedet, hvilket øger risikoen for blødning under kraniotomien til kranial vinduesimplantation. Til administration af TBI med vægtfaldsenheden placerede denne undersøgelse en pude under musehovedet for at buffere TBI-slagkraften og derved mindske risikoen for kraniebrud. Ingen åbenlys hovedbevægelse på rotationsretninger og acceleration blev observeret, hvilket understøtter forestillingen om, at denne TBI-model har en relativt lav chance for diffusionsaxonal skade. Interessant nok brugte Foda et al. en lignende vægtfaldsanordning til at konstruere en TBI-skade med lukket kranium på rotter, og en større, blød skumpude (12 cm tyk) blev anbragt under rottehovedet, så den let kunne bevæge sig som reaktion på TBI-slagkraften på rotationsretningen med acceleration, hvilket resulterede i diffusionsaxonal skade22. En af fordelene ved den rørstyrende TBI-model er, at traumets sværhedsgrad kan moduleres ved at ændre vægtfaldshøjden (dvs. en højere højde for en større kraft) og / eller gentage antallet af gange, stødet leveres. For eksempel brugte Flierl et al. en lignende vægttabsenhed som den nuværende undersøgelse til at inducere TBI på mus; vægten af metallet var 333 g, hvilket inducerede en mild TBI, når den faldt fra en højde på 2 cm og en alvorlig TBI, når den faldt fra en højde på 3 cm23. Kraniotomi-trinnet før vinduesimplantation skal også udføres omhyggeligt for at undgå at beskadige hjernevævet under kraniet. Periodisk flytning af boret til et andet område på kraniet hjælper med at undgå overboring på samme sted, hvilket kan resultere i overdreven opvarmning, vævsskade og blødning; Desuden kan ofte vanding med saltvand også afkøle borestedet. Ved implantering af glasvinduet er det vigtigt at justere glasplanet, så det er parallelt med kraniets overfladeplan; Et tæt vindue, der passer ind i kraniet, forhindrer lækage af tandcementvæsken i rummet mellem vinduet og hjernen.
Hvis vinduet er sløret på dag 0 efter TBI-operationen, men fluorescerende signaler detekteres, kan tandcementen være kommet ind i rummet mellem vinduet og hjernen og derved danne et cementlag, der dækker hjerneoverfladen og skjuler fluoremissionen. I denne situation kan man fjerne vinduet og tandcementen ved hjælp af boremetoden beskrevet i protokoltrin 3.5 og derefter implantere et nyt glasvindue på det oprindelige sted, som beskrevet detaljeret af Goldey et al.9. Hvis vinduet bliver sløret på et efterfølgende tidspunkt under den langsgående billeddannelsesproces, kan man forsøge at fjerne potentielt snavs ved forsigtigt at gnide vinduet med en applikator med bomuldsspids. Hvis dette ikke løser problemet, kan det skyldes genvækst af knoglen og hjernehinderne under glasruden. I dette tilfælde kan man fjerne vinduet og bore for at fjerne den gengroede knogle og / eller pincet fra hinanden og fjerne hjernehinderne, efterfulgt af implantation af et nyt glasvindue på det oprindelige sted, som beskrevet af Goldey et al.9. Som vist i resultaterne er EGFP-ekspression og fluorescens robust over et tidsforløb på ~ 4 måneder efter TBI. Man kan forvente et fald i fluorescenssignalet inden for den første uge efter TBI, hvilket sandsynligvis skyldes TBI-induceret translationel undertrykkelse, der forårsager en midlertidig reduktion i den globale proteinsyntese20.
For at opretholde høj billedkvalitet og opnå billeddannelse i flere planer var mus under isofluranbedøvelse for at begrænse bevægelsen. Det er dog vigtigt at bemærke, at anæstesi kan påvirke undersøgelsesresultaterne. For eksempel er det blevet rapporteret, at mus under isofluranbedøvelse udviser forskellig mikroglial aktivitet som reaktion på fotoskader sammenlignet med vågne mus24. For to-foton-billeddannelse er scanningshastigheden og antallet af scanninger for signalgennemsnit (indstillet som "tal" under "gennemsnit") de vigtigste faktorer, der kan bestemme billedopløsningen. For at optimere opløsningen kan man reducere scanningshastigheden og øge gennemsnitstallet, men en langsommere hastighed og højere gennemsnitstal øger billedbehandlingstiden for et bestemt synsfelt og kan forårsage fotoblegning. Denne undersøgelse sigter mod at opnå kronisk langsigtet billeddannelse på det samme dyr på samme hjerneplacering. For at undgå potentiel fotoblegning og samtidig opnå tilstrækkelig opløsning blev to-foton-billeddannelse udført med en scanningshastighed på 8 med et gennemsnitligt antal på 16.
En alternativ tilgang til at udføre en kraniotomi og implantere et glasvindue er at tynde kraniet, i det omfang det er gennemsigtigt og "papirtyndt" til levende billeddannelse25,26,27. Det tynde kranievindue kan bevare kraniets intakthed og dermed undgå betændelse induceret af den kirurgiske operation. Derfor kan tyndkranievinduesmetoden foretrækkes til levende billeddannelse med inflammationsrelevante markører og / eller over en relativt kortere periode (dvs. ~ 14 dage efter operationen, som rapporteret25). Til langvarig billeddannelse (dvs. 4 måneder som beskrevet her) af kroniske neurodegenerative processer anbefales det ud over at vurdere de akutte virkninger af TBI på det samme dyr at anvende et glasvindue implanteret ved en kraniotomimetode.
Som nævnt i indledningen er der flere bemærkelsesværdige fordele ved intravital billeddannelse til at studere forskellige biologiske og patologiske hændelser i pattedyrhjernen. Der er dog også nogle begrænsninger i denne protokol. For eksempel beskriver contrecoup hjerneskade hjernekontusionen eller hæmatomet fjernt fra, normalt modsat kraftkontaktstedet28,29,30. I den nuværende undersøgelse blev TBI-virkningerne leveret til parietallappen; Conrecoup skade ville forventes ventralt og utilgængelig for intravital billeddannelse. En histologisk analyse kan anvendes som en supplerende tilgang til yderligere undersøgelse af fænotyper af interesse uden for det nedslagssted, der er dækket af kranievinduet. Derudover kan eksogen overekspression af visse proteiner også inducere toksicitet eller patologi. I denne undersøgelse blev der observeret nogle lejlighedsvise EGFP-punkter, som kan repræsentere akkumuleringer på grund af proteinoverekspression. Derfor anbefales det at inkludere et negativt kontrolprotein (f.eks. EGFP eller RFP alene) i undersøgelsesdesignet for at imødekomme denne mulighed, især hvis proteinet af interesse er tilbøjeligt til at danne punktstrukturer. Antallet af proteiner, som man kan studere samtidigt, er begrænset af lasere og evner i to-fotonsystemet. Det kan være muligt at afbilde mere end en fluorofor (f.eks. EGFP, RFP osv.) ved to-fotonmikroskopi, selvom multiplexeringsevner med konventionelle vidvinkel- og konfokale mikroskoper ofte tillader analyser af flere proteiner i en enkelt vævsprøve. Endelig er det vigtigt at inkludere en skinkontrol, der modtager alle de samme procedurer som TBI-dyret, undtagen vægtfaldsvirkningerne. Cranial vinduesimplantationskirurgi er en invasiv operation og kan forårsage nogle lokale ændringer, såsom betændelse og ændret intrakranielt tryk, hvilket kan påvirke TBI-processen. En skinkontrol hjælper eksperimentalisten med at vurdere fænotyper, der skyldes virkningen versus de kirurgiske procedurer.
Sammenfattende introducerer denne protokol en metode til langsgående billedproteiner specifikt i neuronerne i musehjernebarken som reaktion på TBI. Denne protokol kan ændres til at analysere ekspression og lokalisering af forskellige cellespecifikke proteiner som reaktion på TBI. Målet med denne protokol er at give en tilgang til at studere de umiddelbare og langsigtede konsekvenser af TBI i pattedyrhjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der erklæres ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Miguel Sena-Esteves ved University of Massachusetts Chan Medical School for at give AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP-virus og Debra Cameron ved University of Massachusetts Chan Medical School for at tegne musens kranieskits. Vi takker også nuværende og tidligere medlemmer af Bosco-, Schafer- og Henninger-laboratorierne for deres forslag og støtte. Dette arbejde blev finansieret af forsvarsministeriet (W81XWH202071/PRARP) til DAB, DS og NH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
- Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
- National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
- Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
- Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
- Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
- Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
- Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
- Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
- Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
- von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
- White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
- Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
- Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
- Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
- Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
- Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
- Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
- Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
- Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).
