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Neuroscience

दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक बंद-खोपड़ी दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और कपाल खिड़की के साथ चूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की इंट्रावाइटल इमेजिंग

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64701
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

Summary

यह अध्ययन चूहों को दोहराए जाने वाले दर्दनाक मस्तिष्क की चोट के वितरण और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरॉन-व्यक्त ईजीएफपी के बाद के इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की के एक साथ आरोपण को दर्शाता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य यह प्रदर्शित करना है कि बहिर्जात उत्तेजनाओं के संपर्क में आने पर किसी जानवर के मस्तिष्क के विशिष्ट सेल प्रकारों के भीतर रुचि के प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण को अनुदैर्ध्य रूप से कैसे देखा जाए। यहां, एक बंद-खोपड़ी दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई) का प्रशासन और चूहों में बाद में अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की का एक साथ आरोपण दिखाया गया है। चूहों को इंट्राक्रैनियल रूप से एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो एक न्यूरोनल विशिष्ट प्रमोटर के तहत बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को व्यक्त करता है। 2 से 4 सप्ताह के बाद, चूहों को एएवी इंजेक्शन स्थान पर वजन घटाने वाले डिवाइस का उपयोग करके दोहराए जाने वाले टीबीआई के अधीन किया जाता है। उसी सर्जिकल सत्र के भीतर, चूहों को एक धातु हेडपोस्ट और फिर टीबीआई प्रभाव स्थल पर एक ग्लास क्रैनियल विंडो के साथ प्रत्यारोपित किया जाता है। ईजीएफपी की अभिव्यक्ति और सेलुलर स्थानीयकरण की जांच महीनों के दौरान आघात के संपर्क में आने वाले एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके की जाती है।

Introduction

दर्दनाक मस्तिष्क की चोट (टीबीआई), जो खेल की चोटों, वाहन टकराव और सैन्य लड़ाई के परिणामस्वरूप हो सकती है, एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य चिंता है। टीबीआई शारीरिक, संज्ञानात्मक और व्यवहार संबंधी घाटे और आजीवन विकलांगता या मृत्यु दर 1,2 का कारण बन सकता है। टीबीआई गंभीरता को हल्के, मध्यम और गंभीर के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है, विशाल बहुमत हल्के टीबीआई (75% -90%) 3 है। यह तेजी से मान्यता प्राप्त है कि टीबीआई, विशेष रूप से टीबीआई की दोहराव वाली घटनाएं, न्यूरोनल अपघटन को बढ़ावा दे सकती हैं और अल्जाइमर रोग (एडी), एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस), फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (एफटीडी), और क्रोनिक ट्रॉमेटिक एन्सेफैलोपैथी (सीटीई) 4,5,6 सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए जोखिम कारक ों के रूप में काम कर सकती हैं।. हालांकि, टीबीआई-प्रेरित न्यूरोडीजेनेरेशन के अंतर्निहित आणविक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं, और इस प्रकार अध्ययन के एक सक्रिय क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। टीबीआई से न्यूरॉन्स कैसे प्रतिक्रिया करते हैं और उससे कैसे उबरते हैं, इस बारे में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, टीबीआई के बाद चूहों में अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग द्वारा विशेष रूप से न्यूरॉन्स के भीतर फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की निगरानी के लिए एक विधि यहां वर्णित है।

इसके लिए, इस अध्ययन से पता चलता है कि बंद-खोपड़ी टीबीआई के प्रशासन के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया को कैसे संयोजित किया जाए, जो पहले7,8 के समान है, साथ ही डाउनस्ट्रीम इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए एक कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के साथ, जैसा कि गोल्डी एट अल9 द्वारा वर्णित है। विशेष रूप से, पहले एक कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित करना और बाद में उसी क्षेत्र में टीबीआई करना संभव नहीं है, क्योंकि टीबीआई को प्रेरित करने वाले वजन में गिरावट का प्रभाव खिड़की को नुकसान पहुंचाने और माउस को अपूरणीय नुकसान पहुंचाने की संभावना है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को टीबीआई को प्रशासित करने और फिर एक ही सर्जिकल सत्र के भीतर प्रभाव स्थल पर सीधे कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। एक ही सर्जिकल सत्र में टीबीआई और क्रैनियल विंडो इम्प्लांटेशन दोनों के संयोजन का एक फायदा यह है कि माउस को सर्जरी के अधीन होने की संख्या में कमी आती है। इसके अलावा, यह किसी को टीबीआई के लिए तत्काल प्रतिक्रिया (यानी, घंटों के टाइमस्केल पर) की निगरानी करने की अनुमति देता है, जो बाद के सर्जिकल सत्र में खिड़की को प्रत्यारोपित करने के विपरीत है (यानी, टीबीआई के बाद के दिनों के टाइमस्केल पर प्रारंभिक इमेजिंग)। कपाल खिड़की और इंट्रावाइटल इमेजिंग प्लेटफॉर्म भी पारंपरिक तरीकों से न्यूरोनल प्रोटीन की निगरानी पर लाभ प्रदान करते हैं जैसे कि निश्चित ऊतकों के इम्यूनोस्टेनिंग। उदाहरण के लिए, इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए कम चूहों की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक ही माउस का अध्ययन कई समय बिंदुओं पर किया जा सकता है, असतत समय बिंदुओं के लिए आवश्यक चूहों के अलग-अलग समूहों के विपरीत। इसके अलावा, एक ही न्यूरॉन्स को समय के साथ निगरानी की जा सकती है, जिससे एक ही सेल के भीतर विशिष्ट जैविक या रोग संबंधी घटनाओं को ट्रैक किया जा सकता है।

अवधारणा के प्रमाण के रूप में, सिनैप्सिन प्रमोटर के तहत एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) की न्यूरॉन-विशिष्टअभिव्यक्ति यहां प्रदर्शित की गई है। इस दृष्टिकोण को अन्य सेल-प्रकार के विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग करके 1) विभिन्न मस्तिष्क कोशिका-प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स के लिए माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) प्रमोटर और एस्ट्रोसाइट्स के लिए ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर11, 2) ईजीएफपी जीन के साथ अपने जीन को फ्यूज करके रुचि के विभिन्न लक्ष्य प्रोटीन, और 3) विभिन्न फ्लोरोफोरे से जुड़े कई प्रोटीनों को सह-व्यक्त करना। यहां, ईजीएफपी को एक इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के माध्यम से एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) वितरण के माध्यम से पैक और व्यक्त किया जाता है। एक बंद-खोपड़ी टीबीआई को एक वेट-ड्रॉप डिवाइस का उपयोग करके प्रशासित किया जाता है, इसके बाद एक कपाल खिड़की का आरोपण होता है। विवो में ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोनल ईजीएफपी का विज़ुअलाइज़ेशन कपाल खिड़की के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। दो-फोटॉन लेजर के साथ, न्यूनतम फोटोडैमेज के साथ कॉर्टिकल ऊतक में गहराई से प्रवेश करना संभव है, जिससे दिनों और महीनों तक 12,13,14,15 तक एक व्यक्तिगत माउस के भीतर एक ही कॉर्टिकल क्षेत्रों की बार-बार अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति मिलती है। संक्षेप में, इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ टीबीआई सर्जरी के संयोजन के इस दृष्टिकोण का उद्देश्य आणविक घटनाओं की समझ को आगे बढ़ाना है जो टीबीआई-प्रेरित रोग विकृति16,17 में योगदान करते हैं।

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Protocol

जानवरों से संबंधित सभी प्रोटोकॉल राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद (यूएस) समिति द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार आयोजित किए गए थे। प्रोटोकॉल को मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल (यूएमएमएस) (परमिट नंबर 202100057) विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। संक्षेप में, जैसा कि अध्ययन के योजनाबद्ध (चित्रा 1) में दिखाया गया है, जानवर को एक वायरस इंजेक्शन, एक टीबीआई, एक खिड़की प्रत्यारोपण, और फिर एक समय अनुक्रम में इंट्रावाइटल इमेजिंग प्राप्त होती है।

नोट: वाणिज्यिक शर्तों को हटा दिया गया है। कृपया उपयोग किए गए विशिष्ट उपकरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. स्टीरियोटेक्सिक डिवाइस का उपयोग करके एएवी का इंट्राक्रैनील इंजेक्शन

  1. AAV (PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. 1 x 1013 वायरल जीनोम प्रति मिलीलीटर (vg / mL) के वायरल टिटर का उपयोग करें। Syn1 Synapsin1 को संदर्भित करता है, जो एक न्यूरोनल विशिष्ट प्रोमोटर है जो न्यूरॉन्स में प्रतिबंधित वायरल अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। वायरस को इन-हाउस या आउटसोर्स करके तैयार किया जा सकता है।
  2. एएवी के प्रशासन के लिए स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन सर्जरी की तैयारी
    1. आटोक्लेव नियमित कैंची, एक सर्जिकल कैलिपर, सर्जिकल स्प्रिंग कैंची, सर्जिकल फोर्स, मच्छर बल, धुंध, एक कपास युक्त एप्लीकेटर, और एक ग्लास माइक्रोलीटर सिरिंज।
    2. 75% इथेनॉल का उपयोग करके सर्जरी क्षेत्र को साफ करें। स्टीरियोटैक्सिक प्लेटफॉर्म पर सर्जरी क्षेत्र को कवर करने के लिए डिस्पोजेबल बाँझ सर्जिकल ड्रेप का विस्तार करें।
      नोट: इंजेक्शन सर्जरी के दौरान पशु शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए, एक प्रतिक्रिया विनियमित हीटिंग उपकरण का उपयोग करें।
    3. माउस शरीर के वजन को तौलें और रिकॉर्ड करें।
    4. ऑक्सीजन टैंक वाल्व खोलें और ऑक्सीजन प्रवाह को 1.5 एल / मिनट तक समायोजित करें। संज्ञाहरण मशीन खोलें और आइसोफ्लुरेन स्तर मान को तीन पर सेट करें।
      नोट: वाहक गैस इस चरण में या तो कमरे की हवा या 100% ऑक्सीजन हो सकती है।
    5. माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और पूर्ण संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए इसे 5 मिनट तक रहने दें।
    6. एक बार जब माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर), माउस को प्रेरण कक्ष से हटा दें और माउस सिर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें।
    7. एनेस्थीसिया टयूबिंग नाक शंकु को माउस के स्नूट पर रखें।
    8. सर्जरी के अंत तक 1 एल / मिनट प्रवाह दर पर वाहक गैस के साथ 1.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें। समय-समय पर सांस की आवृत्ति की जांच करें, और उचित संज्ञाहरण का आकलन करने के लिए सर्जरी के दौरान कम से कम हर 15 मिनट में पूंछ या पैर की अंगुली की चुटकी दें। संज्ञाहरण की वांछित गहराई को बनाए रखने के लिए उपयुक्त के रूप में आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को समायोजित करें।
    9. वायरस समाधान के साथ एक माइक्रोलीटर सिरिंज (10 μL) भरें। फिर, स्टीरियोटेक्सिक डिवाइस के मिलान किए गए माइक्रोइंजेक्टर पंप पर सिरिंज को ठीक करें।
  3. इंजेक्शन सर्जरी
    1. एक डिस्पोजेबल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके ब्यूप्रेनोर्फिन (1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का प्रबंधन करें और माउस की आंखों पर स्नेहक नेत्र मरहम लागू करें।
    2. नियमित कैंची से ट्रिम करके सिर के ऊपर खोपड़ी से बालों को हटा दें 1.
    3. स्कैल्प स्किन को धुंध और कॉटन युक्त एप्लीकेटर्स से साफ करें। पहले 75% इथेनॉल और फिर बीटाडीन का उपयोग करके त्वचा को कीटाणुरहित करें। इसे तीन बार दोहराएं (यानी, इथेनॉल के बाद बीटाडाइन), त्वचा पर बीटाडीन के अंतिम आवेदन को छोड़ दें।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए एनेस्थेटिक गहराई की फिर से जांच करें कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर)। दाहिने पार्श्विका खोपड़ी को उजागर करने के लिए मध्य रेखा के साथ नियमित कैंची 2 का उपयोग करके ~ 1 सेमी चीरा लगाएं, और कपास के साथ एप्लिकेटर का उपयोग करके पेरीओस्टेम को हटा दें।
    5. इन निर्देशांकों पर एक मार्कर पेन का उपयोग करके खोपड़ी पर दो बिंदुओं को चिह्नित करें: बिंदु ए: ब्रेग्मा के पीछे 2.5 मिमी और दाएं गोलार्ध पर मध्य रेखा के लिए 1 मिमी पार्श्व; बिंदु बी: ब्रेग्मा के पीछे 2.5 मिमी और दाएं गोलार्ध पर मध्य रेखा के लिए 2 मिमी पार्श्व।
    6. ठीक ईएफ 4 कार्बाइड बिट के साथ एक इलेक्ट्रिक डेंटल ड्रिल का उपयोग करके चिह्नित निर्देशांक पर खोपड़ी के माध्यम से दो छेदों को सावधानीपूर्वक ड्रिल करें।
      नोट: सावधान रहें कि मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान न पहुंचे।
    7. माइक्रोलीटर सिरिंज सुई की नोक को खोपड़ी के छेद से संरेखित करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम को समायोजित करें जो मध्य रेखा के 1 मिमी पार्श्व है।
    8. मस्तिष्क की सतह को छूने के लिए सिरिंज सुई को कम करें, और फिर उस स्थान को शून्य बिंदु (जेड-अक्ष के लिए) के रूप में सेट करें। सुई की नोक को मस्तिष्क प्रांतस्था में 0.5 मिमी की गहराई तक कम करें, और धीरे-धीरे 200 एनएल / मिनट की गति से वायरस के घोल के 1 μL को इंजेक्ट करें।
    9. घोल के बैकफ्लो को रोकने के लिए सुई को वापस लेने से पहले वायरस समाधान को पूरी तरह से मस्तिष्क के ऊतकों में इंजेक्ट करने के बाद 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
    10. धीरे-धीरे सिरिंज सुई को हटा लें। इंजेक्शन को दूसरी साइट पर दोहराएं। एक बाँझ, गैर-अवशोषित सर्जिकल सीवन (6-0 गेज) के साथ चीरा को सींघा।
    11. सर्जरी के बाद सेफाज़ोलिन [500 मिलीग्राम / किग्रा (333 मिलीग्राम / एमएल, आमतौर पर ~ 45 μL), इंट्रामस्क्युलर रूप से, और मेलोक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का प्रबंधन करें, जबकि जानवर अभी भी एनेस्थेटाइज है।
    12. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से माउस को छोड़ें और संज्ञाहरण बंद करें। माउस को हीटिंग कंबल के ऊपर एक साफ पिंजरे में रखें, और जानवर की निगरानी करें जब तक कि यह एम्बुलेटरी (लगभग 15 मिनट) न हो। फिर, घर के पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    13. पहले ब्यूप्रेनोर्फिन इंजेक्शन के बाद क्रमशः 8 घंटे, 16 घंटे और 24 घंटे पर बुप्रेनोर्फिन (1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) और मेलॉक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का प्रशासन करें।
      नोट: वायरस इंजेक्शन के 2-4 सप्ताह बाद, माउस को एएवी इंजेक्शन के रूप में एक ही साइट पर टीबीआई और कपाल खिड़की आरोपण प्राप्त होता है।

2. दोहराए जाने वाले टीबीआई प्रेरण का प्रशासन।

नोट: टीबीआई पैरामीटर पिछली रिपोर्ट7,8 से समायोजित किए जाते हैं, जिसमें टीबीआई प्रभाव एक बार वितरित किया गया था। यहां प्रोटोकॉल एक ही पैरामीटर लागू करता है, कुल प्रभाव संख्या को 10 तक बढ़ाने को छोड़कर।

  1. टीबीआई उपकरण
    1. दाईं ओर माउस सिर पर एक बंद-खोपड़ी टीबीआई (चित्रा 2 ए) के प्रशासन के लिए एक कस्टम-निर्मित पोर्टेबल डिवाइस का उपयोग करें, जैसा कि चित्र 2 बी में दर्शाया गया है।
  2. सर्जरी से पहले तैयारी
    1. आटोक्लेव सर्जरी उपकरण, जिसमें नियमित कैंची, एक सर्जिकल कैलिपर, सर्जिकल स्प्रिंग कैंची, सर्जिकल फोर्स, मच्छर बल, हेडपोस्ट टुकड़े, धुंध और कपास से भरे एप्लिकेटर शामिल हैं।
    2. सर्जरी से 2 घंटे पहले माउस के शरीर के वजन को तौलें और रिकॉर्ड करें। कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के दौरान मस्तिष्क एडिमा को कम करने के लिए, इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके क्वाड्रिसेप्स मांसपेशियों में 4.8 मिलीग्राम / किग्रा [2 मिलीग्राम / एमएल, आमतौर पर ~ 70 μl (दो साइटों पर इंजेक्ट करने की आवश्यकता)] की खुराक पर डेक्सामेथासोन सोडियम फॉस्फेट इंजेक्ट करें। डेक्सामेथासोन के इंजेक्शन के बाद, लेकिन टीबीआई सर्जरी शुरू करने से पहले, बाद में उपयोग के लिए चरण 3.1 में बताए गए अनुसार ग्लास खिड़कियां तैयार करें।
    3. 75% इथेनॉल का उपयोग करके सर्जिकल चरण और टीबीआई उपकरण को कीटाणुरहित करें, और स्टीरियोटैक्सिक प्लेटफॉर्म पर सर्जरी चरण को कवर करने के लिए डिस्पोजेबल बाँझ सर्जिकल ड्रेप का विस्तार करें। हीटिंग उपकरण और तापमान मॉनिटर चालू करें, लक्ष्य तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    4. ऑक्सीजन टैंक वाल्व खोलें और ऑक्सीजन प्रवाह को 1.5 एल / मिनट तक समायोजित करें। संज्ञाहरण मशीन खोलें और आइसोफ्लुरेन स्तर मान को तीन पर सेट करें।
      नोट: 100% शुद्ध ऑक्सीजन जानवर को टीबीआई प्रभावों से बचने में मदद कर सकता है।
    5. माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और पूर्ण संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए इसे 5 मिनट तक रहने दें।
    6. एक बार जब माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर), माउस को प्रेरण कक्ष से हटा दें और माउस सिर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें।
    7. एनेस्थीसिया टयूबिंग नाक शंकु को माउस के स्नूट पर रखें।
    8. सर्जरी के अंत तक 1 एल / मिनट प्रवाह दर पर 100% शुद्ध ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 1.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें। समय-समय पर सांस की आवृत्ति की जांच करें, और उचित संज्ञाहरण का आकलन करने के लिए सर्जरी के दौरान कम से कम हर 15 मिनट में पूंछ या पैर की अंगुली की चुटकी दें। संज्ञाहरण की वांछित गहराई को बनाए रखने के लिए उपयुक्त के रूप में आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को समायोजित करें।
  3. टीबीआई सर्जरी
    1. डिस्पोजेबल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके ब्यूप्रेनोर्फिन (1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का प्रबंधन करें और माउस की आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
    2. कैंची 1 से ट्रिम करके सिर के शीर्ष से बालों को हटा दें, और फिर 1 मिनट के लिए डिपिलेटरी एजेंट लगाएं।
      सावधानी: खोपड़ी पर 3 मिनट से अधिक समय तक डिपिलेटरी एजेंट उत्पाद लागू न करें, क्योंकि यह त्वचा की जलन है। माउस की आंखों पर किसी भी डिपिलेटरी एजेंट को प्राप्त करने से बचें।
    3. स्कैल्प स्किन को धुंध और कॉटन युक्त एप्लिकेटर लगाकर साफ करें। फिर, त्वचा को कीटाणुरहित करें, पहले 75% इथेनॉल और फिर बीटाडीन का उपयोग करें। इसे तीन बार दोहराएं (यानी, इथेनॉल के बाद बीटाडाइन), त्वचा पर बीटाडीन के अंतिम आवेदन को छोड़ दें।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए एनेस्थेटिक गहराई की फिर से जांच करें कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर)। सर्जिकल फोर्स 3 के साथ त्वचा को तम्बू करें, और, आंखों से लगभग 3 मिमी पीछे से शुरू होने वाला 12-15 मिमी लंबा मध्य रेखा चीरा लगाएं।
    5. वसंत कैंची का उपयोग करके खोपड़ी के बाएं और दाएं गोलार्ध पर त्वचा का उत्पादन करें।
    6. एक बार खोपड़ी के उजागर होने के बाद, बाँझ कपास वाले एप्लिकेटर के साथ धीरे से रगड़कर और बाँझ खारा के साथ फ्लश करके पेरीओस्टेम को हटा दें।
    7. यह सुनिश्चित करने के लिए खोपड़ी की स्थिति का निरीक्षण करें कि यह बरकरार है, दो छोटे छेदों को छोड़कर, जो पिछली वायरस इंजेक्शन सर्जरी के लिए बनाए गए थे।
    8. खोपड़ी क्षेत्र को सुखाएं और निम्नलिखित निर्देशांक पर टीबीआई प्रभाव स्थल को चिह्नित करें: ब्रेग्मा के पीछे 2.5 मिमी और दाईं ओर 2 मिमी पार्श्व (चित्रा 2 बी)।
    9. स्टीरियोटेक्सिक फ्रेम से माउस को जल्दी से हटा दें और टीबीआई डिवाइस के नीचे बफर कुशन पर सिर रखें।
    10. इम्पैक्टर टिप को चिह्नित प्रभाव साइट के साथ संरेखित करें।
    11. माउस सिर से 15 सेमी ऊपर टेथर्ड नायलॉन स्ट्रिंग खींचकर धातु स्तंभ को उठाएं और फिर इसे छोड़ दें, जिससे वजन ट्रांसड्यूसर रॉड पर स्वतंत्र रूप से गिर सके, जो टीबीआई साइट पर खोपड़ी-शीर्ष के संपर्क में है। टीबीआई प्रभाव देते समय माउस सिर को न छुएं।
    12. माउस को हीटिंग कंबल पर ले जाएं, और श्वास की स्थिति की निगरानी करते हुए इसे अपनी पीठ पर रखें।
    13. एक बार जब माउस खुद को लापरवाह से एक प्रवण स्थिति में ले जाता है, तो माउस को ~ 5 मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन प्रेरण कक्ष में रखें, जिसमें 1.5 एल / मिनट प्रवाह दर पर 100% शुद्ध ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 3% आइसोफ्लुरेन हो।
    14. एक बार जब माउस पूरी तरह से बेहोश हो जाता है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर), कुल 10 प्रभावों को प्राप्त करने के लिए चरण 2.3.9-2.3.14 दोहराएं।
      नोट: हमारे अध्ययन में कम माउस मृत्यु दर के साथ मजबूत फेनोटाइप को प्रेरित करने के लिए दस टीबीआई प्रभाव पाए गए हैं (डेटा अभी तक प्रकाशित नहीं हुआ है)। मापदंडों को प्रभावों की संख्या और / या ऊंचाई से वजन जारी करके मस्तिष्क की चोट की एक अलग गंभीरता को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। सभी पैरामीटर स्थानीय IACUC द्वारा अनुमोदन के अधीन हैं।
    15. एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत खोपड़ी की जांच करें, और यदि खोपड़ी फ्रैक्चर हुआ है तो अध्ययन से माउस को हटा दें।
    16. एक दिखावटी सर्जरी के लिए, ऊपर वर्णित समान प्रक्रियाओं का पालन करें, जिसमें इम्पैक्टर के तहत जानवर का प्लेसमेंट शामिल है, लेकिन टीबीआई प्रभावों को वितरित किए बिना।
    17. 10वें टीबीआई प्रभाव के बाद माउस को लापरवाह से एक प्रवण स्थिति में ले जाने के बाद, माउस को ~ 5 मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन प्रेरण कक्ष में रखें। नीचे वर्णित कपाल खिड़की प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए माउस सिर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखने के लिए चरण 2.2.6-2.2.8 का पालन करें।

3. क्रेनियल विंडो इम्प्लांटेशन सर्जरी

नोट: नीचे दिए गए कपाल खिड़की प्रत्यारोपण चरणों को गोल्डी एट अल.9 से अपनाया गया था, और हेडपोस्ट और इमेजिंग वेल के उनके विनिर्देशों को यहां लागू किया गया था।

  1. विंडो की तैयारी
    नोट: टीबीआई सर्जरी शुरू करने से पहले चरण 2.2.2 में विंडो तैयारी पूरी करें। खिड़की दो गोल ग्लास कवरलिप्स (एक 3 मिमी और एक 5 मिमी व्यास, जैसा कि चित्रा 2 सी द्वारा इंगित किया गया है) से बना है जो पारदर्शी ऑप्टिकल चिपकने वाला द्वारा एक साथ जुड़े हुए हैं, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. ग्लास कवरलिप्स को 15 मिनट के लिए 75% इथेनॉल में डुबोकर साफ करें। इथेनॉल से ग्लास कवरलिप्स को बाहर निकालें और उन्हें ~ 10 मिनट के लिए बाँझ सतह (यानी, बाँझ 24-वेल प्लेट का ढक्कन) पर सूखने के लिए छोड़ दें।
    2. बुलबुला गठन से बचने के दौरान पारदर्शी ऑप्टिकल गोंद के साथ एक इंसुलिन सिरिंज भरें। 0.67x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप 1 (सामग्री की तालिका) के तहत, 5 मिमी कवरस्लिप के केंद्र में ऑप्टिकल गोंद की एक छोटी बूंद (~ 1 μL) डालें। फिर, तुरंत शीर्ष पर 3 मिमी कवरस्लिप रखें, और इसे 5 मिमी कवरस्लिप के साथ केंद्रित करें।
    3. गोंद को समान रूप से फैलाने के लिए महीन बल का उपयोग करके धीरे से दबाव लागू करें। यदि 3 मिमी कवर स्लिप के चारों ओर एक बुलबुला या दीवार बनती है तो कांच की खिड़की को छोड़ दें।
    4. गोंद को ठीक करने के लिए, कवरलिप्स को 20 x 100 μJ /cm2 की शक्ति पर 150 सेकंड के लिए यूवी बॉक्स में रखें। जांचें कि 3 मिमी स्लिप के किनारे को धीरे से घुमाने के लिए फोर्सप्स 4 का उपयोग करके दो कवरलिप सुरक्षित रूप से बंधे हुए हैं। यदि कवरस्लिप चलती है, तो इसे अतिरिक्त 60 सेकंड के लिए यूवी बॉक्स में वापस रखें। ग्लास विंडो को बाद में उपयोग के लिए एक बाँझ 24-वेल प्लेट में स्टोर करें।
  2. खोपड़ी की सतह खुरदरी।
    नोट: यहां से, एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत अनुभाग 3 में सभी चरणों को पूरा करें। 10x से शुरू करें, और वांछित आवर्धन को समायोजित करें।
    1. शेष पेरीओस्टेम को हटाने और एक खुरदरी खोपड़ी की सतह बनाने के लिए कम रोटर गति (यानी, आउटपुट संख्या ~ 1-2 पर सेट) पर एफजी 4 कार्बाइड बिट का उपयोग करके खोपड़ी की सतह को धीरे से और धीरे-धीरे ड्रिल करें, ताकि दंत सीमेंट खोपड़ी के साथ सुरक्षित रूप से बंध जाए। विकल्प के रूप में ड्रिल के बजाय एक स्केलपेल का उपयोग यहां भी किया जा सकता है।
    2. खोपड़ी की सतह से हड्डी की धूल को फ्लश और साफ करने के लिए खारा का उपयोग करें।
  3. मांसपेशियों को अलग करें।
    नोट: मांसपेशियों का पृथक्करण उजागर खोपड़ी की हड्डी के सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए कार्य करता है जो दंत सीमेंट के लिए संपर्क बिंदु के रूप में काम करेगा, जिससे प्रत्यारोपण की संरचनात्मक अखंडता सुनिश्चित होगी। यह मांसपेशी पृथक्करण चरण आमतौर पर अस्थायी खोपड़ी प्लेट के ~ 3 मिमी को उजागर करता है।
    1. आंख के लगभग 5 मिमी पीछे की ओर, जहां पार्श्विका और लौकिक खोपड़ी को जोड़ने वाली सीवन स्थित है, खोपड़ी से पार्श्व मांसपेशियों को अलग करने के लिए धीरे से बंद महीन युक्तियों (# 5/45 फोर्सप्स) को डालें, और धीरे से बंद युक्तियों को पीछे की दिशा में लैम्बडोइड सीवन तक ले जाएं।
    2. उस तरफ की पार्श्व मांसपेशियों को अलग करें जहां कपाल खिड़की का आरोपण होगा।
      नोट: नेत्र धमनी को चोट पहुंचाने से बचने के लिए, आंखों के बहुत करीब मांसपेशियों को अलग न करने के लिए सावधान रहें; अन्यथा, गंभीर और लगातार रक्तस्राव हो सकता है। ओसीसीपिटल हड्डी से मांसपेशियों को अलग न करें, क्योंकि माउस को अपने सिर को उठाने के लिए इन मांसपेशियों की आवश्यकता होती है।
    3. खारा का उपयोग करके सर्जिकल साइट से मलबे को धो लें और धुंध के साथ क्षेत्र को सुखाएं। रक्तस्राव को रोकने के लिए जेल फोम को सर्जिकल साइट पर लागू किया जा सकता है।
  4. हेडपोस्ट को इम्प्लांट करें।
    1. क्रानियोटॉमी सर्जरी करते समय माउस सिर को सुरक्षित रूप से ठीक करने के लिए और बाद में दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए पिछले प्रकाशन9 में वर्णित एक कस्टम-निर्मित टाइटेनियम हेडपोस्ट (चित्रा 2 डी) का उपयोग करें।
    2. दाईं ओर साफ और सूखी खोपड़ी पर क्रैनियोटॉमी की परिधि का पता लगाने के लिए एक मार्कर पेन और सर्जिकल कैलिपर का उपयोग करें। ट्रेस किए गए सर्कल का केंद्र बिंदु ब्रेग्मा से 2.5 मिमी पीछे है और दाएं गोलार्ध पर 1.5 मिमी है। ट्रेस किए गए सर्कल का व्यास लगभग 3.2-3.5 मिमी है, जो 3 मिमी ग्लास कवरस्लिप से थोड़ा बड़ा है। सुनिश्चित करें कि क्रानियोटॉमी सर्कल वायरस इंजेक्शन साइटों (वायरस को इंजेक्ट करते समय किए गए दो छेदों को संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) और टीबीआई साइट को कवर कर सकता है।
    3. कान बार को ढीला करें और सिर को घुमाएं ताकि क्रैनियोटॉमी विमान पूरी तरह से क्षैतिज हो, और फिर कान बार को फिर से कस लें।
    4. हेडपोस्ट के सामने और पीछे के किनारे पर सुपरगोंद की दो छोटी बूंदें जोड़ने के लिए एक कपास टिंप एप्लिकेटर की लकड़ी की छड़ी का उपयोग करें।
    5. क्रैनियोटॉमी के केंद्र पर टाइटेनियम हेडपोस्ट रखें, और जल्दी से इसे उसी विमान के भीतर आराम करने के लिए समायोजित करें जहां कपाल खिड़की प्रत्यारोपित की जाएगी। सुपरगोंद सूखने तक हल्का दबाव लागू करें; यह आमतौर पर ~ 30 सेकंड लेता है।
    6. प्री-कूल्ड सिरेमिक मिक्सिंग डिश में डेंटल सीमेंट तैयार करें (-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कम से कम 10 मिनट रहें): 300 मिलीग्राम सीमेंट पाउडर, त्वरित बेस तरल की छह बूंदें और उत्प्रेरक की एक बूंद मिलाएं, और फिर मिश्रण को अच्छी तरह से मिश्रित होने तक हिलाएं (~ 15 बार)।
      नोट: सीमेंट को पेस्टी होने की आवश्यकता है। यदि यह बहुत पतला है, तो थोड़ा और सीमेंट पाउडर में हिलाएं। यदि यह बहुत गाढ़ा है, तो एक बार में एक बूंद त्वरित आधार तरल में हिलाएं जब तक कि एक पेस्टी स्थिरता प्राप्त न हो जाए।
    7. ट्रेस की गई परिधि के बाहरी परिधि पर दंत सीमेंट मिश्रण की एक उदार मात्रा को जल्दी से लागू करें, और किसी भी उजागर हड्डी की सतह को कवर करें। हालांकि, क्रैनियोटॉमी की साइट को कवर न करें। आगे बढ़ने से पहले दंत सीमेंट को सूखने और सख्त होने के लिए ~ 15 मिनट की अनुमति दें।
    8. कान बार को छोड़ दें और हेडपोस्ट को धातु के फ्रेम में सुरक्षित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सिर चिह्नित क्रैनियोटॉमी परिधि के साथ सटीक ड्रिलिंग के लिए स्थिर है। यदि क्रैनियोटॉमी साइट पर सीमेंट है, तो इसे ड्रिल करने और हटाने के लिए एफजी 4 कार्बाइड बिट का उपयोग करें।
  5. क्रैनियोटॉमी
    1. चिह्नित सर्कल के व्यास को सत्यापित करने के लिए एक सर्जिकल कैलिपर का उपयोग करें, जैसा कि चरण 3.4.2 में परिभाषित किया गया है। आवश्यकतानुसार समायोजित करें, ताकि कपाल खिड़की क्रैनियोटॉमी के अंदर अच्छी तरह से फिट हो जाए।
    2. एक इलेक्ट्रिक डेंटल ड्रिल का उपयोग करके, चिह्नित सर्कल के बाहर खोपड़ी को चप और पतला करें, पहले एफजी 4 कार्बाइड बिट का उपयोग करें (गति आउटपुट ~ 9-10 पर सेट करें)। यह एक "ट्रैक" बनाता है जिसके भीतर खोपड़ी को पतला करना है।
      सावधानी: गर्मी की चोट को कम करने और एक चिकनी ट्रैक प्राप्त करने के लिए, ड्रिल को थोड़ा आगे बढ़ाते रहें। एक ही जगह को 2 सेकंड से अधिक समय तक ड्रिल न करें।
    3. समय-समय पर, ड्रिलिंग बंद करें और ड्रिल से हीटिंग को कम करने और हड्डी की धूल को धोने के लिए, बाँझ खारा के साथ पूरे क्षेत्र की सिंचाई करें।
    4. एफजी 1/4 कार्बाइड बिट का उपयोग करके खोपड़ी को पतला करना जारी रखें, जैसा कि चरण 3.5.2 में वर्णित है, जब तक कि खोपड़ी कागज-पतली और पारदर्शी न हो जाए।
      नोट: ड्रिल को पकड़ने के लिए दो हाथों का उपयोग करने से ड्रिल को नियंत्रित करना आसान हो सकता है और ड्रिल बिट को मस्तिष्क में डालने से बचा जा सकता है।
    5. ईएफ 4 कार्बाइड बिट का उपयोग करके खोपड़ी को पतला करने को पूरा करें। जब हड्डी फ्लैप और आसपास की खोपड़ी की हड्डी के बीच एक दरार होती है, तो कभी-कभी सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) की रिहाई होती है, यह दर्शाता है कि खोपड़ी पूरी तरह से ड्रिल की गई है।
    6. ट्रैक के साथ खोपड़ी के बाकी हिस्सों के माध्यम से पतला और ड्रिलिंग जारी रखें। रक्तस्राव को रोकने के लिए उस बिंदु के माध्यम से ड्रिलिंग से बचें जहां एक स्पष्ट वाहिका खोपड़ी के नीचे से गुजरती है।
    7. दरार वाली जगह के माध्यम से एक बारीक बल टिप (फोर्स 1) ~ 0.5 मिमी डालें, और अंतर्निहित मस्तिष्क को प्रभावित किए बिना हड्डी को धीरे से ऊपर की ओर उठाएं।
    8. हड्डी फ्लैप हटाने के बाद, क्रैनियोटॉमी क्षेत्र को नमकीन से सिंचाई करें। मस्तिष्क की सतह क्रानियोटॉमी किनारे से 1-2 मिमी अधिक हो सकती है।
    9. इस चरण से शुरू करते हुए, मस्तिष्क के ऊतकों की रक्षा के लिए हमेशा उजागर मस्तिष्क को नमकीन के साथ कवर करें।
    10. इंजेक्शन सर्जरी के बाद ऊतक आसंजन और वाहिका वृद्धि के कारण मूल एएवी इंजेक्शन साइटों पर हड्डी फ्लैप उठाते समय रक्तस्राव हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो धीरे से साइट को ~ 2 मिनट (या आवश्यकतानुसार अधिक) के लिए सूखे कपास वाले एप्लिकेटर के साथ दबाएं। रक्तस्राव को रोकने के लिए जेल फोम का उपयोग किया जा सकता है। रक्तस्राव को रोकने के लिए रसायनों या हीटिंग फोर्सेस का उपयोग न करें, क्योंकि इससे चोट लग सकती है।
    11. दिखाई देने वाले अरचनॉइड पदार्थ को धीरे से हटाने के लिए फोर्स 1 का उपयोग करें।
  6. कांच की खिड़की प्रत्यारोपित करें
    1. बाँझ ग्लास विंडो को उठाने के लिए सर्जिकल फोर्सप्स 2 का उपयोग करें, जिसमें 3 मिमी ग्लास कवरस्लिप नीचे की ओर है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि खिड़की क्रैनियोटॉमी किनारे पर अच्छी तरह से फिट हो सकती है, क्रैनियोटॉमी साइट के ऊपर ग्लास विंडो रखें और समायोजित करें। टॉप पर 5 एमएम ग्लास कवरस्लिप है।
    2. दंत सीमेंट निम्नानुसार तैयार करें: 100 मिलीग्राम सीमेंट पाउडर, त्वरित आधार तरल की दो बूंदें और उत्प्रेरक की एक बूंद मिलाएं। मिश्रण को अच्छी तरह से मिश्रित होने तक हिलाएं (~ 15 बार)। ~ 6 मिनट प्रतीक्षा करें जब तक कि सीमेंट पेस्टी और गाढ़ा न हो जाए। यदि सीमेंट बहुत पतला है, तो यह चरण 3.6.4 में खिड़की के नीचे की जगह में रिस सकता है और खिड़की को अस्पष्ट कर सकता है।
    3. सीमेंट के पेस्टी और मोटे होने की प्रतीक्षा करते समय, स्टीरियोटेक्सिक मैनिपुलेटर के माध्यम से खिड़की पर पर्याप्त मात्रा में दबाव लागू करें, यह जांचने के लिए कि खोपड़ी सुरक्षित रूप से और कसकर कांच की खिड़की से संपर्क कर सकती है। सुनिश्चित करें कि चरण 3.6.4 में दंत सीमेंट तरल ग्लास के नीचे की जगह तक नहीं पहुंचेगा और इस प्रकार खिड़की को अस्पष्ट कर देगा।
    4. खोपड़ी के साथ कांच की खिड़की को सील करने के लिए खिड़की के किनारे के साथ थोड़ी मात्रा में सीमेंट जोड़ने के लिए एक समायोज्य परिशुद्धता एप्लिकेटर ब्रश का उपयोग करें। सीमेंट को पूरी तरह से सूखने देने के लिए ~ 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर खिड़की के ऊपर मैनिपुलेटर को धीरे से छोड़ें और हटा दें। इस चरण के रूप में, 10 टीबीआई प्रभावों को पूरा करने और हेडपोस्ट और कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित करने में ~ 4 घंटे लगते हैं।
    5. यदि खिड़की को कवर करने वाला अतिरिक्त सीमेंट है तो एफजी 4 कार्बाइड बिट के साथ डेंटल ड्रिल का उपयोग करके डेंटल सीमेंट को ट्रिम करें।
      नोट: खिड़की के चारों ओर अत्यधिक सीमेंट दो-फोटॉन उद्देश्य लेंस को खिड़की की सतह तक पहुंचने से रोक सकता है।
  7. इमेजिंग को अच्छी तरह से प्रत्यारोपित करना।
    नोट: एक इमेजिंग वेल (चित्रा 2 डी) ~ 1.6 सेमी के बाहरी व्यास के साथ एक रबर रिंग है, जो हेडपोस्ट शीर्ष सतह से मेल खाता है और दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए कपाल खिड़की के ऊपर पानी रखता है।
    1. खिड़की प्रत्यारोपण पूरा होने के बाद, हेडपोस्ट शीर्ष सतह पर दंत सीमेंट मलबे को ड्रिल करें, और गीले सर्जिकल धुंध का उपयोग करके क्षेत्र को साफ करें। ~ 3 मिनट के लिए क्षेत्र को सूखने दें।
    2. सुपरग्लू की थोड़ी मात्रा को डुबोने के लिए एक कपास युक्त एप्लिकेटर का उपयोग करें और इसे हेडपोस्ट शीर्ष सतह पर पेस्ट करें। जल्दी से हेडपोस्ट पर रबर की अंगूठी रखें। हेडपोस्ट के साथ निकट संपर्क सुनिश्चित करने के लिए ~ 2 मिनट के लिए रबर रिंग पर मध्यम दबाव लागू करें। सुपरग्लू का संयम से उपयोग करें, अन्यथा, यह ग्लास विंडो का पालन कर सकता है और दो-फोटॉन इमेजिंग को अस्पष्ट कर सकता है।
  8. एनाल्जेसिक और एंटीबायोटिक प्रशासन
    1. इमेजिंग को अच्छी तरह से प्रत्यारोपित करने के तुरंत बाद, लेकिन आइसोफ्लुरेन को बंद करने से पहले, डिस्पोजेबल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके सेफाज़ोलिन [500 मिलीग्राम / किग्रा (333 मिलीग्राम / एमएल, आमतौर पर ~ 45 μL), इंट्रामस्क्युलर रूप से, और मेलॉक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) का प्रबंधन करें।
    2. दवा प्रशासन के बाद, संज्ञाहरण बंद करें, माउस को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से छोड़ दें, और माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें, जो एक हीटिंग कंबल के ऊपर है।
    3. ~ 15 मिनट के लिए माउस की बारीकी से निगरानी करें जब तक कि यह एम्बुलेटरी न हो।
      नोट: चूहों को व्यक्तिगत रूप से घर दें, क्योंकि वे अन्य चूहों के रबर इमेजिंग को अच्छी तरह से काट सकते हैं। विज्ञापन लिबिटम तक पहुंचने के लिए पिंजरे में माउस के करीब भोजन और पानी जेल प्रदान करें।
    4. कपाल खिड़की प्रत्यारोपण सर्जरी के बाद 48 घंटे तक पिछली खुराक के बाद हर 8 घंटे में ब्यूप्रेनोर्फिन (1 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) और मेलॉक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा, चमड़े के नीचे) को फिर से प्रशासित करें।

4. इंट्रावाइटल टू-फोटॉन इमेजिंग

  1. इंट्रावाइटल इमेजिंग18 के लिए माइक्रोस्कोप 2 (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें, जो एक अक्षम सुसंगत मल्टीफोटॉन लेजर और 20x आवर्धन उद्देश्य (एनए 1.0; जल-विसर्जन) से लैस है। ईजीएफपी सिग्नल के लिए उपयोग किया जाने वाला फ़िल्टर "बीपी 500-550" है।
  2. इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए कपाल खिड़की माउस तैयार करें।
    1. सर्जरी के दिन (दिन 0 के रूप में नामित) से शुरू होकर, टीबीआई के बाद डिज़ाइन किए गए समय बिंदुओं पर दो-फोटॉन इमेजिंग करें। कपाल खिड़की माउस को संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में रखें, और 5 मिनट के लिए 1.5 एल / मिनट प्रवाह दर पर वाहक गैस के साथ मिश्रित 3% आइसोफ्लुरेन का प्रबंधन करें।
      नोट: वाहक गैस या तो कमरे की हवा या 100% ऑक्सीजन हो सकती है।
    2. एक बार जब माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड हो जाता है (यानी, लगभग एक चक्र प्रति 2 सेकंड पर धीमी लेकिन स्थिर श्वास दर, पूंछ-चुटकी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति के साथ मिलकर), माउस को प्रेरण कक्ष से हटा दें और हेडपोस्ट को जल्दी से एक ब्रैकेट में दबा दें। माउस के धड़ को एक गोल प्लास्टिक प्लेट (19 सेमी व्यास) पर रखने दें जो ब्रैकेट से लैस है।
      नोट: इंट्रावाइटल इमेजिंग के दौरान गर्मी समर्थन प्रदान करने के लिए माउस के धड़ के नीचे एक हाथ से गर्म पैड रखा गया था।
    3. माउस की आंखों पर स्नेहक नेत्र मरहम लागू करें और माउस के स्नूट के ऊपर संज्ञाहरण ट्यूबिंग नाक शंकु रखें। 1 एल / मिनट प्रवाह दर पर वाहक गैस के साथ 1.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण बनाए रखें।
    4. समय-समय पर सांस की आवृत्ति की जांच करें, और उचित संज्ञाहरण का आकलन करने के लिए इमेजिंग के दौरान कम से कम हर 15 मिनट में पूंछ या पैर की अंगुली की चुटकी दें। संज्ञाहरण की वांछित गहराई को बनाए रखने के लिए उपयुक्त के रूप में आइसोफ्लुरेन एकाग्रता को समायोजित करें।
    5. माउस हेड को यह सुनिश्चित करने के लिए संरेखित करें कि कपाल खिड़की सीधे दो-फोटॉन उद्देश्य लेंस के नीचे है। कपाल खिड़की के ऊपर इमेजिंग में कुछ पानी डालें। उद्देश्य को कम करें ताकि यह पानी में डूब जाए।
  3. इंट्राक्रैनील विंडो चूहों की इंट्रावाइटल इमेजिंग।
    1. स्कोप मर्करी लैंप चालू करें। पहले ओकुलर के माध्यम से एपिफ्लोरेसेंस के साथ मस्तिष्क को देखें।
      नोट: वाहिका काला दिखाई देता है। उस क्षेत्र का चयन करें जहाँ विंडो स्पष्ट है. एपिफ्लोरेसेंस को बंद करें, ईजीएफपी सिग्नल के लिए लेजर तरंग दैर्ध्य को 860 एनएम पर सेट करें, और इष्टतम (यानी, उज्ज्वल लेकिन संतृप्त नहीं) सिग्नल के लिए लेजर सेटिंग को समायोजित करें।
    2. स्कैन मोड को फ़्रेम पर सेट करें और लाइन चरण को 1 पर सेट करें। औसत संख्या को 16 पर सेट करें, बिट गहराई को 8-बिट तक, मोड को लाइन के रूप में, और विधि को मीन के रूप में।
    3. बाद के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक ही मस्तिष्क क्षेत्र की छवि बनाने के लिए "संदर्भ मानचित्र" के रूप में वाहिका पैटर्न का उपयोग करें। तीन विमानों के लिए सतही स्तर (परत I, मेनिंगियल सतह से 100 μm से कम) की छवि बनाएं, जहां कॉर्टिकल वास्कुलचर जेड-स्टैक मोड के माध्यम से हावी होता है, जिसमें 10 μm का इंटरप्लेन अंतराल होता है, जैसा कि चित्र 3 A में दर्शाया गया है।
    4. चित्र 3ए में दर्शाए अनुसार जेड-स्टैक मोड के माध्यम से गहरे स्तर (परत IV और V, ~ 400 μm गहरा) पर छह विमानों की छवि बनाएं, जिसमें 10 μm का इंटरप्लेन अंतराल और 8 की स्कैनिंग गति है।
    5. इमेजिंग (~ 20 मिनट प्रति माउस) समाप्त करने के बाद, संज्ञाहरण बंद करें, माउस को फ्रेम से छोड़ें, और इसे अपने घर के पिंजरे में वापस करें जो हीटिंग कंबल के ऊपर है। माउस को लगातार मॉनिटर करें जब तक कि यह एम्बुलेटरी न हो, जिसमें आमतौर पर ~ 7 मिनट लगते हैं।
    6. टीबीआई सर्जरी के बाद दिन 0, 1 सप्ताह और 4 महीने में माउस को अनुदैर्ध्य रूप से चित्रित करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एएवी-सिन 1-ईजीएफपी व्यक्त करने वाले वायरल कणों को 3 महीने की उम्र में पुरुष टीडीपी -43 क्यू331 के / क्यू 331 के चूहों (सी 57 बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि) 19 के मस्तिष्क प्रांतस्था में इंजेक्ट किया गया था। यह ध्यान दिया जाता है कि जंगली प्रकार के C57BL / 6J जानवरों का भी उपयोग किया जा सकता है, हालांकि यह अध्ययन TDP-43Q331K / Q331K चूहों में किया गया था क्योंकि प्रयोगशाला न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग अनुसंधान पर केंद्रित है। एएवी इंजेक्शन के 4 सप्ताह बाद एक टीबीआई सर्जरी की गई थी। एक ही सर्जिकल सेटिंग के भीतर, हेडपोस्ट और कपाल खिड़की को प्रत्यारोपित किया गया था। माउस को टीबीआई सर्जरी के बाद दिन 0, 1 सप्ताह और 4 महीने में दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके क्रमिक रूप से चित्रित किया गया था (चित्रा 1)। सामान्य तौर पर, इंजेक्शन सर्जरी में ~ 30 मिनट लगते थे, और टीबीआई सर्जरी में ~ 1 घंटे प्रति माउस लगते थे। टीबीआई सर्जरी के दौरान, चूहों को आमतौर पर प्रारंभिक प्रभावों की तुलना में बाद के प्रभावों के बाद लापरवाह स्थिति से प्रवण स्थिति में खुद को सही करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, एक माउस को पहले प्रभाव के बाद अपनी स्थिति को सही करने के लिए 2 मिनट की आवश्यकता हो सकती है, लेकिन 10वें प्रभाव के बाद अपनी स्थिति को सही करने के लिए 10 मिनट की आवश्यकता होती है। क्रैनियल विंडो इम्प्लांटेशन सर्जरी के लिए, ~ 3 घंटे आमतौर पर सभी चरणों को करने की आवश्यकता होती थी, लेकिन लगातार रक्तस्राव होने पर आवश्यकता से अधिक समय लगा। दो-फोटॉन इमेजिंग को आमतौर पर सभी छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रति माउस 20 मिनट की आवश्यकता होती है। ईजीएफपी की अभिव्यक्ति के साथ तीन चूहों को शामिल करने वाले वर्तमान अध्ययन के लिए, जानवरों ने खोपड़ी के फ्रैक्चर का सबूत नहीं दिखाया, न ही वे सर्जरी के दौरान या सर्जरी के 4 महीने बाद तक मर गए। रुग्णता और खोपड़ी फ्रैक्चर दर दोनों 0% थे। यह टीबीआई को प्रेरित करने के एक समान मॉडल में अपेक्षाकृत कम (<10%) मृत्यु दर के अनुरूप है, लेकिन कपाल खिड़की प्रत्यारोपण 7,8 के बिना।

एक वेट-ड्रॉप डिवाइस (चित्रा 2 ए), जिसे पहले7,8 रिपोर्ट किया गया है, का उपयोग दाईं ओर माउस सिर पर टीबीआई प्रभाव देने के लिए किया गया था, जैसा कि चित्रा 2 बी में दर्शाया गया है। एक पारदर्शी प्लास्टिक ट्यूब (चित्रा 2 ए में संख्या 5; लंबाई में 60 सेमी और आंतरिक व्यास में 1.4 सेमी) को सुरक्षित रूप से और लंबवत रूप से एक धातु ब्रैकेट में रखा गया था, और एक प्लास्टिक इम्पैक्टर कॉलम (चित्रा 2 ए में नंबर 7; लंबाई में 10 सेमी और व्यास में 1.3 सेमी, व्यास में 2 मिमी की सपाट गोल नोक के साथ) को ऊर्ध्वाधर ट्यूब में रखा गया था। एक 50 ग्राम धातु का वजन (चित्रा 2 ए में नंबर 6) को इम्पैक्टर के ऊपर रखा गया था और एक नायलॉन स्ट्रिंग (चित्रा 2 ए में नंबर 4) के साथ जोड़ा गया था। प्रभाव ऊर्जा को बफर करने और अवशोषित करने के लिए माउस हेड के नीचे एक बफर कुशन (चित्रा 2 ए में नंबर 8; 9 सेमी x 9 सेमी x 1 सेमी [लंबाई x चौड़ाई x गहराई], पॉलीथीन फोम और कपास धुंध से बना था) रखा गया था।

कपाल खिड़की ऑप्टिकल चिपकने वाला (चित्रा 2 सी) द्वारा संयुक्त दो ग्लास कवरलिप्स से बना था, और 3 मिमी व्यास का ग्लास कवरस्लिप मस्तिष्क की सतह को छूने वाला पक्ष था। मस्तिष्क की सतह से दो अलग-अलग गहराई (चित्रा 3 ए) पर दो-फोटॉन इमेजिंग की गई थी: 1) एक सतही स्तर जहां कॉर्टिकल वास्कुलचर प्रचुर मात्रा में था और इसमें अपेक्षाकृत बड़ा लुमेन व्यास था जो काला दिखाई देता था, लेकिन विरल ईजीएफपी पॉजिटिव सेल बॉडी के साथ; और 2) एक गहरा स्तर जहां वाहिका विरल थी और इसमें एक छोटा लुमेन व्यास था, जिसमें कई ईजीएफपी सकारात्मक कोशिकाएं दिखाई देती थीं।

सर्जरी के बाद ~ 4 घंटे (दिन 0) पर, सतही स्तर पर 10 μm के अंतराल के साथ तीन विमानों पर दो-फोटॉन इमेजिंग की गई (परत I, मेनिंगियल सतह से 100 μm से कम) पहले जहां वाहिका काली दिखाई देती है ( चित्रा 3 बी में धराशायी लाल रेखाओं द्वारा इंगित), और मूल इमेजिंग क्षेत्र का पता लगाने के लिए अगले इमेजिंग सत्र के लिए एक संदर्भ मानचित्र के रूप में उपयोग किया गया था। इस सतही स्तर पर, कॉर्टिकल वास्कुलचर और न्यूरोनल प्रक्रियाएं मुख्य संरचनाएं थीं जिन्हें देखा जा सकता था, जबकि ईजीएफपी पॉजिटिव सेल बॉडी विरल थीं। सतही स्तर के भीतर इमेजिंग के बाद, ईजीएफपी पॉजिटिव न्यूरोनल सेल निकायों की छवि बनाने के लिए कॉर्टेक्स (परत IV और V) में सतही स्तर से गहरा, ~ 400 μm से नीचे की ओर ध्यान समायोजित किया गया था। छवियों को छह विमानों के भीतर प्राप्त किया गया था, 10 μm के अंतराल के साथ। EGFP प्रोटीन अभिव्यक्ति को पूरे सेल शरीर में फैलाया गया था, जैसा कि चित्रा 3 C में दर्शाया गया है। सेल निकायों के बाहर कभी-कभी कुछ ईजीएफपी पंक्टा की घटना होती थी, जो ईजीएफपी समावेशन का प्रतिनिधित्व कर सकती थी जो अक्षतंतु या डेंड्राइट के भीतर समय के साथ बनती थी। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप इंजेक्शन साइट के आसपास एएवी-SYN1-ईजीएफपी अभिव्यक्ति ~ 2-3 मिमी होती है, जिसे पोस्टमार्टम ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा परिभाषित किया जा सकता है।

टीबीआई के बाद 1 सप्ताह और 4 महीने में, दिन 0 समय बिंदु पर देखे गए वाहिका पैटर्न का उपयोग उसी इमेजिंग क्षेत्र (चित्रा 3 डी, एफ) का पता लगाने के लिए संदर्भ के रूप में किया गया था। चित्रा 3 डी, एफ में वाहिका पैटर्न चित्रा 3 बी के समान है। टीबीआई के बाद 1 सप्ताह और 4 महीने के लिए इमेजिंग प्रक्रिया वही थी जो दिन 0 समय बिंदु के लिए ऊपर वर्णित थी, और ईजीएफपी अभिव्यक्ति पहले की तरह पूरे सेल शरीर में पाई गई थी (चित्रा 3 ई, जी)। दिन 0 और 4 महीने में प्रतिदीप्ति तीव्रता सतही और गहरे दोनों स्तरों पर समान थी। हालांकि, 1 सप्ताह में प्रतिदीप्ति तीव्रता सतही और गहरे दोनों स्तरों पर दिन 0 और 4 महीने की तुलना में कम थी, जो अन्य टीबीआई मॉडल20 के लिए रिपोर्ट किए गए ट्रांसलेशनल दमन के कारण हो सकती है। विशेष रूप से, दिन 0 समय बिंदु की तुलना में 4 महीने में छवियों की गुणवत्ता दर्शाती है कि कपाल खिड़की ने स्पष्टता और अखंडता बनाए रखी है, और यह कि प्रभावी इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए सर्जरी के 4 महीने बाद भी वायरल अभिव्यक्ति मजबूत है। जैसा कि ईजीएफपी अपेक्षाकृत फैलाने वाले प्रोटीन के रूप में व्यक्त करता है, प्रतिदीप्ति संकेतों को बेहतर ढंग से हल किया जा सकता है और विवेकपूर्ण हो सकता है जब ईजीएफपी को रुचि के प्रोटीन से जोड़ा जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: इस इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए समयरेखा। प्रोटोकॉल वायरस इंजेक्शन के साथ शुरू किया जाता है। वायरस इंजेक्शन के 2-4 सप्ताह बाद एक ही सर्जरी सत्र के भीतर टीबीआई और क्रैनियल विंडो सर्जरी की जाती है। इंट्रावाइटल इमेजिंग टीबीआई के बाद दिन 0, 1 सप्ताह, 4 महीने में की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: टीबीआई डिवाइस, टीबीआई प्रभाव साइट, और विंडो तैयारी के लिए आरेख। (ए) वेट-ड्रॉप टीबीआई डिवाइस के लिए उपकरण। 1: पेडस्टल, 2: ब्रैकेट, 3: समायोज्य क्लैंप, 4: नायलॉन स्ट्रिंग, 5: वेट ड्रॉपिंग टनल, 6: धातु वजन कॉलम (50 ग्राम), 7: इम्पैक्टर, 8: बफर कुशन। (बी) वायरस इंजेक्शन और टीबीआई प्रभाव स्थल का एक योजनाबद्ध, जिसमें निर्देशांक ब्रेग्मा से 2.5 मिमी पीछे और 2 मिमी पार्श्व से दाईं ओर होता है। (सी) कांच की खिड़की तैयार करने के लिए एक योजनाबद्ध। दो ग्लास कवर स्लिप, व्यास में 3 मिमी और 5 मिमी, ऑप्टिकल चिपकने वाला का उपयोग करके संयुक्त होते हैं। (डी) धातु हेडपोस्ट और इमेजिंग अच्छी तरह से के चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इमेजिंग विमानों और छवि डेटा का योजनाबद्ध । (ए) कई विमानों को सतही स्तर पर चित्रित किया जाता है जहां वाहिका स्थित होती है और एक गहरा स्तर होता है। छवियों को निम्नानुसार एकत्र किया जाता है: सतही स्तर पर तीन विमान, जहां कॉर्टिकल वास्कुलचर और न्यूरोनल प्रक्रियाएं मुख्य ईजीएफपी-पॉजिटिव संरचनाएं हैं, और गहरे स्तर पर छह विमान, जहां ईजीएफपी-पॉजिटिव सेल बॉडी मुख्य रूप से देखी जाती हैं, पड़ोसी विमानों के बीच 10 μm अंतराल के साथ। प्रत्येक विमान 425.10 μm x 425.10 μm आकार का है। (बी) दिन 0 समय बिंदु पर सतही स्तर में एक विमान की प्रतिनिधि छवि। धराशायी लाल रेखाएं वाहिका की रूपरेखा को इंगित करती हैं जिसका उपयोग बाद के समय बिंदुओं के लिए मूल इमेजिंग स्थान का पता लगाने के लिए संदर्भ के रूप में किया जा सकता है। (सी) टीबीआई के तुरंत बाद दिन 0 समय बिंदु पर गहरे स्तर में एक विमान की प्रतिनिधि छवि। (डी) 1 सप्ताह के समय बिंदु पर सतही स्तर पर एक विमान की प्रतिनिधि छवि। धराशायी लाल रेखाएं वाहिका को दर्शाती हैं, चित्र 3 बी में दिन 0 पर रूपरेखा के समान, यह पुष्टि करती है कि टीबीआई के बाद दिन 0 और 1 सप्ताह में एक समान स्थान पर दो-फोटॉन इमेजिंग की गई थी। (ई) टीबीआई के बाद 1 सप्ताह के समय बिंदु पर गहरे स्तर में प्रतिनिधि छवि। (एफ) टीबीआई के बाद 4 महीने में बी और डी के समान। (जी) टीबीआई के बाद 4 महीने में सी और ई के समान। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, एएवी इंजेक्शन, टीबीआई प्रशासन और कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के साथ एक हेडपोस्ट को कॉर्टिकल न्यूरॉन्स पर टीबीआई के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए माउस ब्रेन कॉर्टेक्स (परतों IV और V) के भीतर ईजीएफपी-लेबल न्यूरॉन्स के अनुदैर्ध्य इमेजिंग विश्लेषण के लिए जोड़ा गया था। इस अध्ययन में कहा गया है कि हिप्पोकैम्पस के ऊपर यहां चुनी गई टीबीआई साइट, कपाल खिड़की के आरोपण के लिए अपेक्षाकृत सपाट और व्यापक सतह प्रदान करती है। इसके विपरीत, खोपड़ी इस साइट के लिए अपेक्षाकृत संकीर्ण पूर्ववर्ती है, और इसलिए यह सुनिश्चित करना मुश्किल है कि हेडपोस्ट खोपड़ी की सतह से प्रभावी ढंग से संपर्क करेगा। जबकि इस अध्ययन में केवल टीडीपी -43 क्यू 331 के/ क्यू 331 के माउस मॉडल का उपयोग किया गया था, एएलएस और एफटीडी19 पर ध्यान केंद्रित करने वाले प्रयोगशाला के शोध को देखते हुए, यह प्रोटोकॉल अधिकांश अन्य माउस उपभेदों पर लागू होना चाहिए। यहां वर्णित न्यूरॉन्स को लेबल करने के अलावा, इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए अन्य सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए विभिन्न रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है। एक दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप सेसंशोधित चूहों में क्रे-लॉक्स पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करते हुए, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सेल-विशिष्ट तरीके से व्यक्त करना है। एक अन्य दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के सेल-विशिष्ट पारगमन के लिए कुछ वायरल सीरोटाइप को नियोजित करना है। मस्तिष्क में वांछित स्थान पर इंट्राक्रैनील इंजेक्शन करके साइट-विशिष्ट वितरण प्राप्त किया जा सकता है। इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए वायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से सेल-विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने की दक्षता और आसानी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल बनाने पर एक फायदा है।

सर्जरी प्रोटोकॉल के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें सावधानीपूर्वक करने की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल की शुरुआत में वायरस इंजेक्शन के लिए खोपड़ी पर छेद ड्रिलिंग करते समय, खोपड़ी के नीचे ऊतक को नुकसान पहुंचाने से सावधान रहने की आवश्यकता होती है। यदि खोपड़ी पर ड्रिलिंग करते समय ऊतक क्षति होती है, तो चोट स्थल के आसपास सूजन, ऊतक आसंजन और एंजियोजेनेसिस होगा, जिससे कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के लिए क्रैनियोटॉमी के दौरान रक्तस्राव का खतरा बढ़ जाएगा। वेट-ड्रॉप डिवाइस के साथ टीबीआई के प्रशासन के लिए, वर्तमान अध्ययन ने टीबीआई प्रभाव बल को बफर करने के लिए माउस हेड के नीचे एक कुशन रखा, और इस तरह खोपड़ी फ्रैक्चर की संभावना कम हो गई। घूर्णी दिशाओं और त्वरण पर कोई स्पष्ट सिर गति नहीं देखी गई, इस धारणा का समर्थन करते हुए कि इस टीबीआई मॉडल में प्रसार अक्षीय चोट की अपेक्षाकृत कम संभावना है। दिलचस्प बात यह है कि फोडा एट अल ने चूहों पर एक बंद-खोपड़ी टीबीआई चोट का निर्माण करने के लिए एक समान वजन-ड्रॉप डिवाइस का उपयोग किया, और चूहे के सिर के नीचे एक बड़ा, नरम फोम कुशन (12 सेमी मोटा) रखा गया ताकि यह त्वरण के साथ घूर्णी दिशा पर टीबीआई प्रभाव बल के जवाब में आसानी से आगे बढ़ सके, जिसके परिणामस्वरूप प्रसार अक्षीय चोट22 हो सके। ट्यूब-गाइडिंग वेट ड्रॉप टीबीआई मॉडल के फायदों में से एक यह है कि आघात की गंभीरता को वजन घटाने की ऊंचाई (यानी, एक बड़े बल के लिए उच्च ऊंचाई) को बदलकर और / या प्रभाव की संख्या को दोहराकर संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लायर एट अल ने चूहों पर टीबीआई को प्रेरित करने के लिए वर्तमान अध्ययन के समान वजन-ड्रॉप डिवाइस का उपयोग किया; धातु का वजन 333 ग्राम था, जिसने 2 सेमी की ऊंचाई से गिरने पर हल्के टीबीआई को प्रेरित किया और 3 सेमी23 की ऊंचाई से गिरने पर एक गंभीर टीबीआई को प्रेरित किया। खोपड़ी के नीचे मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए, खिड़की प्रत्यारोपण से पहले क्रैनियोटॉमी चरण को भी सावधानी पूर्वक किया जाना चाहिए। समय-समय पर खोपड़ी पर ड्रिल बिट को एक अलग क्षेत्र में ले जाने से एक ही स्थान पर ओवर-ड्रिलिंग से बचने में मदद मिलती है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक हीटिंग, ऊतक क्षति और रक्तस्राव हो सकता है; इसके अलावा, अक्सर खारे पानी से सिंचाई करने से ड्रिलिंग साइट को ठंडा भी किया जा सकता है। कांच की खिड़की को प्रत्यारोपित करते समय, ग्लास प्लेन को संरेखित करना महत्वपूर्ण है जैसे कि यह खोपड़ी की सतह के विमान के समानांतर हो; खोपड़ी के भीतर फिट एक स्नूग खिड़की खिड़की और मस्तिष्क के बीच की जगह में दंत सीमेंट तरल के रिसाव को रोकती है।

यदि टीबीआई सर्जरी के बाद दिन 0 पर खिड़की धुंधली है, लेकिन फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाया जाता है, तो दंत सीमेंट खिड़की और मस्तिष्क के बीच की जगह में प्रवेश कर सकता है, जिससे एक सीमेंट परत बनती है जो मस्तिष्क की सतह को कवर करती है और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को अस्पष्ट करती है। इस स्थिति में, कोई प्रोटोकॉल चरण 3.5 में वर्णित ड्रिलिंग विधि का उपयोग करके खिड़की और दंत सीमेंट को हटा सकता है, और फिर मूल साइट पर एक नई ग्लास विंडो प्रत्यारोपित कर सकता है, जैसा कि गोल्डी एट अल .9 द्वारा विस्तार से वर्णित है। यदि अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान बाद के चरण में खिड़की धुंधली हो जाती है, तो कोई भी कपास-टिंप एप्लिकेटर के साथ खिड़की को धीरे से रगड़कर संभावित मलबे को हटाने का प्रयास कर सकता है। यदि यह समस्या को हल नहीं करता है, तो यह कांच की खिड़की के नीचे हड्डी और मेनिंगेस के पुन: विकास के कारण हो सकता है। इस मामले में, कोई खिड़की को हटा सकता है और फिर से विकसित हड्डी को हटाने के लिए ड्रिल कर सकता है और / या ट्वीज़ को अलग कर सकता है और मेनिंगेस को हटा सकता है, इसके बाद मूल साइट पर एक नई ग्लास विंडो का आरोपण किया जा सकता है, जैसा कि गोल्डी एट अल.9 द्वारा वर्णित है। जैसा कि परिणामों में दिखाया गया है, ईजीएफपी अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति टीबीआई के बाद ~ 4 महीने के समय के दौरान मजबूत है। टीबीआई के बाद पहले सप्ताह के भीतर प्रतिदीप्ति संकेत में कमी की उम्मीद की जा सकती है, जो टीबीआई-प्रेरित ट्रांसलेशनल दमन के कारण होने की संभावना है जो वैश्विक प्रोटीन संश्लेषण20 में अस्थायी कमी का कारण बनता है।

उच्च इमेजिंग गुणवत्ता बनाए रखने और कई विमानों में इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, चूहों को आंदोलन को सीमित करने के लिए आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण के तहत रखा गया था। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संज्ञाहरण अध्ययन के परिणामों को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया के तहत चूहे जागने वाले चूहोंकी तुलना में फोटोडैमेज के जवाब में अलग-अलग माइक्रोग्लियल गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। दो-फोटॉन इमेजिंग के लिए, स्कैनिंग गति और सिग्नल एवरेजिंग के लिए स्कैन की संख्या ("औसत" के तहत "संख्या" के रूप में सेट) मुख्य कारक हैं जो छवि रिज़ॉल्यूशन निर्धारित कर सकते हैं। रिज़ॉल्यूशन को अनुकूलित करने के लिए, कोई स्कैनिंग गति को कम कर सकता है और औसत संख्या बढ़ा सकता है, हालांकि, धीमी गति और उच्च औसत संख्या किसी विशेष क्षेत्र के लिए इमेजिंग समय को बढ़ाती है और फोटो ब्लीचिंग का कारण बन सकती है। वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक ही मस्तिष्क स्थान पर एक ही जानवर पर पुरानी दीर्घकालिक इमेजिंग को पूरा करना है। पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करते समय संभावित फोटो ब्लीचिंग से बचने के लिए, दो-फोटॉन इमेजिंग 16 की औसत संख्या के साथ 8 की स्कैनिंग गति पर की गई थी।

क्रैनियोटॉमी करने और कांच की खिड़की को प्रत्यारोपित करने का एक वैकल्पिक तरीका खोपड़ी को पतला करना है, इस हद तक कि यह लाइव इमेजिंग25,26,27 के लिए पारदर्शी और "पेपर पतला" है। पतली-खोपड़ी की खिड़की खोपड़ी की अखंडता को बनाए रख सकती है, और इस प्रकार सर्जिकल ऑपरेशन से प्रेरित सूजन से बच सकती है। इसलिए, सूजन-प्रासंगिक मार्करों के साथ लाइव इमेजिंग के लिए पतली-खोपड़ी खिड़की दृष्टिकोण को प्राथमिकता दी जा सकती है और / या अपेक्षाकृत कम समय (यानी, ~ 14 दिन सर्जरी के बाद, जैसा कि25 बताया गया है)। क्रोनिक न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रक्रियाओं की दीर्घकालिक इमेजिंग (यानी, 4 महीने, जैसा कि यहां वर्णित है) के लिए, एक ही जानवर पर टीबीआई के तीव्र प्रभावों का आकलन करने के अलावा, क्रैनियोटॉमी विधि द्वारा प्रत्यारोपित ग्लास विंडो का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, स्तनधारी मस्तिष्क में विभिन्न जैविक और पैथोलॉजिकल घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इंट्रावाइटल इमेजिंग के कई उल्लेखनीय फायदे हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क की चोट मस्तिष्क की चोट का वर्णन करती है, जो आमतौर पर साइट28,29,30 से संपर्क करने वाले बल के विपरीत मस्तिष्क संदूषण या हेमेटोमा से दूर होती है। वर्तमान अध्ययन में, टीबीआई प्रभावों को पार्श्विका लोब तक पहुंचाया गया था; इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए कंट्रेकूप चोट की उम्मीद की जाएगी और दुर्गम होगी। एक हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का उपयोग कपाल खिड़की द्वारा कवर किए गए प्रभाव स्थल के बाहर रुचि के फेनोटाइप की जांच करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, कुछ प्रोटीनों के बहिर्जात अतिवृद्धि भी विषाक्तता या विकृति को प्रेरित कर सकती है। वर्तमान अध्ययन में, कुछ सामयिक ईजीएफपी पंक्टा देखे गए थे, जो प्रोटीन ओवरएक्प्रेशन के कारण संचय का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसलिए, इस संभावना को संबोधित करने के लिए अध्ययन डिजाइन में एक नकारात्मक-नियंत्रण प्रोटीन (जैसे, ईजीएफपी या अकेले आरएफपी) को शामिल करने की सिफारिश की जाती है, खासकर अगर रुचि का प्रोटीन पुंकेट संरचनाओं को बनाने के लिए प्रवण है। प्रोटीन की संख्या जो एक साथ अध्ययन कर सकती है, दो-फोटॉन प्रणाली के लेजर और क्षमताओं द्वारा सीमित है। दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एक से अधिक फ्लोरोफोरे (जैसे, ईजीएफपी, आरएफपी, आदि) की छवि बनाना संभव हो सकता है, हालांकि पारंपरिक वाइड-फील्ड और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताएं अक्सर एक ऊतक नमूने के भीतर अधिक प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति देती हैं। अंत में, एक दिखावटी नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है जो वजन-गिरावट प्रभावों को छोड़कर, टीबीआई जानवर के समान सभी प्रक्रियाएं प्राप्त करता है। क्रैनियल विंडो इम्प्लांटेशन सर्जरी एक आक्रामक ऑपरेशन है और कुछ स्थानीय परिवर्तन ों का कारण बन सकता है, जैसे कि सूजन और परिवर्तित इंट्राक्रैनील दबाव, जो टीबीआई प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है। एक दिखावटी नियंत्रण प्रयोगवादी को फेनोटाइप का आकलन करने में मदद करता है जो प्रभाव बनाम सर्जिकल प्रक्रियाओं के कारण होते हैं।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल टीबीआई के जवाब में विशेष रूप से माउस मस्तिष्क प्रांतस्था के न्यूरॉन्स में प्रोटीन को अनुदैर्ध्य रूप से छवि बनाने के लिए एक विधि का परिचय देता है। टीबीआई के जवाब में विभिन्न सेल-विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य स्तनधारी मस्तिष्क में टीबीआई के तत्काल और दीर्घकालिक परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करना है।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई है।

Acknowledgments

हम मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में डॉ मिगुएल सेना-एस्टेव्स को एएवी (पीएचपी.ईबी)-सिन 1-ईजीएफपी वायरस उपहार में देने के लिए धन्यवाद देते हैं, और मैसाचुसेट्स चैन मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय में डेबरा कैमरन को चूहों की खोपड़ी स्केच बनाने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम बोस्को, शेफर और हेनिंगर प्रयोगशालाओं के वर्तमान और पिछले सदस्यों को उनके सुझावों और समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को रक्षा विभाग (W81XWH202071 / पीआरएआरपी) द्वारा डीएबी, डीएस और एनएच को वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379
BD insulin syringe BD NDC/HRI#08290-3284-38 5/16" x 31G
Betadine Purdue NDC67618-151-17 including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Cefazolin HIKMA Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish Parkell SKU: S387 For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators ZORO catlog #: G9531702
Catalyst Parkell S371 full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder Parkell S396 Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill Foredom H.MH-130
Dental drill controller Foredom HP4-310
Dexamethasone Phoenix NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit Microcopy Lot# C150113 Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal Fisher Scientific 04355223EA 75%
FG1/4 carbide bit Microcopy Lot# C150413 Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit Microcopy Lot# C150309 Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost N/A N/A Custom-manufactured
Heating apparatus CWE TC-1000 Mouse equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket CVS pharmacy E12107 extra heating device and be used after surgery
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber Vetequip 89012-688 induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine Vetequip 911103
Isoflurane volatilizing machine holder Vetequip 901801
Leica surgical microscope Leica LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment Picetal NDC 46066-753-55
Marker pen Delasco SMP-BK
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller World Precision Instruments micro4 and UMP3
Microliter syringe Hamilton Hamilton 80014 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps CAROLINA Item #:625314 Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent McKesson Corporation N/A Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1 Nikon SMZ745 Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2 Zeiss LSM 7 MP two-photon microscope
Multiphoton laser Coherent Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture Harvard Apparatus catlog# 59-6860 6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
No-Snag Needle Holder CAROLINA Item #: 567912
Quick base liquid Parkell S398 "B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1 Eurostat eurostat es5-300
Regular scissor 2 World Precision Instruments No. 501759-G
Round cover glass 1 Warner instruments CS-5R Cat# 64-0700 for 5 mm of diameter
Round cover glass 2 Warner instruments CS-3R Cat# 64-0720 for 3 mm of diameter
Rubber rings Orings-Online Item # OO-014-70-50 O-Rings
Saline Bioworld L19102411PR
Spring scissor 1 World Precision Instruments No. 91500-09 tip straight
Spring scissor 2 World Precision Instruments No. 91501-09 tip curved
Stereotaxic platform KOPF Model 900LS
Super glue Henkel Item #: 1647358
surgical Caliper World Precision Instruments No. 501200
Surgical forceps 1 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical forceps 2 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 0103-5-PO style 5, straight
Surgical forceps 3 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 72912
Surgical forceps 4 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical gauze ZORO catlog #: G0593801
Surgical lamp Leica Leica KL300 LED
UV box Spectrolinker XL-1000 also called UV crosslinker
Vaporguard Vetequip 931401
Vetbond Tissue Adhesive 3M Animal Care Part Number:014006

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References

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दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक बंद-खोपड़ी दर्दनाक मस्तिष्क की चोट और कपाल खिड़की के साथ चूहों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति की इंट्रावाइटल इमेजिंग
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