Summary
Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.
Abstract
Menselijke levercellen kunnen een driedimensionale (3D) structuur vormen die in staat is om enkele weken in cultuur te groeien, waardoor hun functionele capaciteit behouden blijft. Vanwege hun aard om te clusteren in de kweekschalen met lage of geen kleefeigenschappen, vormen ze aggregaten van meerdere levercellen die menselijke leversferoïden worden genoemd. De vorming van 3D-leversferoïden is afhankelijk van de natuurlijke neiging van levercellen om te aggregeren in afwezigheid van een kleefbaar substraat. Deze 3D-structuren hebben betere fysiologische reacties dan cellen, die dichter bij een in vivo omgeving staan. Het gebruik van 3D-hepatocytenculturen heeft tal van voordelen in vergelijking met klassieke tweedimensionale (2D) culturen, waaronder een meer biologisch relevante micro-omgeving, architecturale morfologie die natuurlijke organen opnieuw samenstelt, evenals een betere voorspelling met betrekking tot de ziektetoestand en in vivo-achtige reacties op geneesmiddelen. Verschillende bronnen kunnen worden gebruikt om sferoïden te genereren, zoals primair leverweefsel of onsterfelijke cellijnen. Het 3D-leverweefsel kan ook worden gemanipuleerd door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) te gebruiken om hepatocyten af te leiden. We hebben menselijke leversferoïden verkregen met behulp van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) gegenereerd uit ongemanipuleerd perifeer bloed door activering van menselijk membraangebonden GPI-gebonden eiwit en gedifferentieerd tot menselijke hepatocyten. De van BD-PSC's afgeleide menselijke levercellen en menselijke leversferoïden werden geanalyseerd door lichtmicroscopie en immunofenotypering met behulp van menselijke hepatocytenmarkers.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) sferoïde cultuursystemen een belangrijk hulpmiddel geworden om verschillende gebieden van kankeronderzoek, medicijnontdekking en toxicologie te bestuderen. Dergelijke culturen wekken grote belangstelling omdat ze de kloof overbruggen tussen tweedimensionale (2D) celkweek monolagen en complexe organen1.
Bij afwezigheid van een kleefoppervlak, in vergelijking met de 2D-celcultuur, is de vorming van sferoïden gebaseerd op de natuurlijke affiniteit van deze cellen om in 3D-vorm te clusteren. Deze cellen organiseren zich in groepen bestaande uit een of meer soorten volwassen cellen. Vrij van vreemde materialen, deze cellen interageren met elkaar zoals in hun oorspronkelijke micro-omgeving. De cellen in 3D-cultuur zijn veel dichter bij elkaar en hebben een goede oriëntatie op elkaar, met een hogere extracellulaire matrixproductie dan 2D-culturen, en vormen een dicht bij natuurlijke omgeving 2.
Diermodellen worden al heel lang gebruikt om menselijke biologie en ziekten te bestuderen3. In dit opzicht zijn er intrinsieke verschillen tussen mens en dier, waardoor deze modellen niet helemaal geschikt zijn voor extrapolatieve studies. 3D-cultuursferoïden en organoïden vormen een veelbelovend hulpmiddel om weefselachtige architectuur, interactie en overspraak tussen verschillende celtypen te bestuderen die in vivo voorkomen en kunnen bijdragen aan het verminderen of zelfs vervangen van diermodellen. Ze zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van de pathogenese van leverziekten en voor het screenen van geneesmiddelen4.
3D-sferoïdecultuur is van bijzonder belang voor kankeronderzoek omdat het de discontinuïteit tussen de cellen en hun omgeving kan elimineren door de behoefte aan trypsinisatie of collagenasebehandeling te verminderen die nodig is voor het voorbereiden van de tumorcelmonolagen voor 2D-culturen. Tumorsferoïden maken het mogelijk om te bestuderen hoe de normale versus kwaadaardige cellen signalen uit hun omgeving ontvangen en erop reageren5 en zijn een belangrijk onderdeel van tumorbiologische studies.
In vergelijking met de monolaag lijken 3D-culturen bestaande uit verschillende celtypen op tumorweefsels in hun structurele en functionele eigenschappen en zijn daarom geschikt voor het bestuderen van metastase en invasie van tumorcellen. Daarom dragen dergelijke sferoïde modellen bij aan het versnellen van kankeronderzoek6.
Sferoïden helpen ook bij het ontwikkelen van de technologie om menselijke organoïden te maken, omdat weefsel- en orgaanbiologie zeer uitdagend zijn om te bestuderen, vooral bij mensen. Vooruitgang in stamcelkweek maakt het mogelijk om 3D-culturen zoals organoïden te ontwikkelen die bestaan uit stamcellen en weefselvoorlopers, evenals verschillende soorten volwassen (weefsel) cellen van een orgaan met enkele functionele kenmerken zoals een echt orgaan dat kan worden gebruikt om orgaanontwikkeling, ziekten te modelleren, maar ze kunnen ook als nuttig worden beschouwd in regeneratieve geneeskunde7.
Primaire menselijke hepatocyten worden meestal gebruikt voor het bestuderen van in vitro biologie van menselijke hepatocyten, leverfunctie en geneesmiddel-geïnduceerde toxiciteit. Culturen van menselijke hepatocyten hebben twee belangrijke nadelen, ten eerste de beperkte beschikbaarheid van primair weefsel zoals menselijke hepatocyten, en ten tweede de neiging van hepatocyten om snel te dedifferentiëren in 2D-cultuur, waardoor hun specifieke hepatocytenfunctie verlorengaat 8. 3D-leverculturen zijn in dit opzicht superieur en zijn onlangs gemaakt van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)9. Bioengineered hepatische 3D-sferoïden zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van ontwikkeling, toxiciteit, genetische en infectieziekten van de lever, evenals bij het ontdekken van geneesmiddelen voor de behandeling van leverziekten10. Ten slotte hebben ze ook het potentieel om klinisch te worden gebruikt, wetende dat acute leverziekten een sterftecijfer van bijna 80% hebben, bio-kunstmatige lever en / of leversferoïden kunnen deze patiënten mogelijk redden door een gedeeltelijke leverfunctie te bieden totdat een geschikte donor kan worden gevonden11.
We hebben een protocol opgesteld voor het genereren van menselijke leversferoïden met behulp van bloedafgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) om sferoïden van verschillende grootte te bereiden die 4000 tot 1 x 106 cellen bevatten en deze geanalyseerd door middel van lichtmicroscopie en immunofluorescentie. We hebben ook het vermogen van hepatocyt-specifieke functie getest, waarbij we de expressie van cytochroom P450 3A4 (CYP3A4) en 2E1 (CYP2E1) enzymen beoordeelden die behoren tot de cytochroom P450-familie die een belangrijke rol spelen in cellulair en geneesmiddelmetabolisme door het proces van ontgifting12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring werd verkregen (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) voor het uitvoeren van deze experimenten en geïnformeerde toestemming werd ondertekend door alle donoren vóór bloedextractie in overeenstemming met institutionele richtlijnen.
1. Bereiding van mononucleaire cellen (MNC's) uit menselijk perifeer bloed (PB)
- Extraheer 30 ml bloed van gezonde donoren met behulp van getraind medisch personeel volgens het standaardprotocol.
- Isoleer PBMNC's met behulp van dichtheidsgradiëntmedia volgens het protocol gepubliceerd door Becker-Kojić et al.13. Isoleer, door pipetteren, de interfaselaag tussen plasma en dichtheidsgradiëntmedia en gebruik steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) om de geïsoleerde cellen te wassen.
- Gebruik een telkamer en tel het aantal cellen met behulp van standaardmethoden.
2. Dedifferentiatie van MNC's bij activering met humaan GPI-verankerd glycoproteïne
- Plaats 6 x 106 mononucleaire cellen in PBS/1% runderserumalbumine (BSA) in een polystyreenbuis (15 ml) en incubeer met het specifieke antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 °C volgens Becker-Kojić et al.13.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur en vervang PBS/BSA door Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Kweek de cellen in polystyreenbuizen van 15 ml in een 5% CO 2-incubator bij 37 °C gedurende 8-10 dagen zoals beschreven in Becker-Kojić et al.13. Voeg op dag 5 (D5) 1-2 ml Iscove's medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke buis van 15 ml.
3. Sorteren van nieuw gegenereerde gededifferentieerde cellen
- Centrifugeer gekweekte celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 300 x g en zuig met een steriele pipet het resulterende supernatant volgens Becker-Kojić et al.13.
- Resuspendeerde pellet verkregen door centrifugeren in 90 μL koude PBS-buffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA en 2 mM EDTA) en voeg 10 μL CD45-positieve magnetische nanokorrels toe en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.
- Was de celsuspensie met 2 ml PBS-buffer, centrifugeer deze gedurende 10 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur en voeg 500 μL PBS-buffer toe aan de cellen en resuspensie grondig.
- Pipetteer 500 μL voorgekoelde PBS-buffer in de kolom om deze te wassen en plaats deze in het magnetisch veld met behulp van een magnetische standaard.
- Was de cellen die op de kolom zijn geplaatst, tweemaal met 500 μL PBS-buffer en verzamel doorstroom met CD45-negatieve cellen in het medium van Iscove, aangevuld met 10% FBS.
- Gebruik een telkamer om het aantal geherprogrammeerde cellen te bepalen.
4. Voorbereiding van glazen dekplaten voor het genereren van menselijke hepatocyten
- Scheid glazen afdekplaten (14 mm) en incubeer ze gedurende 10 minuten in niet-ionisch reinigingsmiddel. Was glazen afdekkingen in gedeïoniseerd water totdat er geen belletjes overblijven en incubeer ze in 1M HCl gedurende 30 minuten (aangepast van Marchenko et al.14).
- Was glazen afdekplaten minimaal 3x met gedeïoniseerd water en droog ze een nacht op kamertemperatuur. Autoclaaf gedroogde glazen afdekplaten in een geschikte container.
5. Celkweekplaten coaten met biolaminine voor 2D hepatische differentiatie van BD-PSC's
- Plaats geautoclaveerde glazen afdekkingen met een steriel pincet in 4 putplaten en schakel UV-lampen gedurende 30 minuten in om steriele omstandigheden te garanderen.
- Ontdooi aliquots biolaminine en voeg 120 μL van 5 μg/ml biolaminine toe aan elke glazen afdeklaag. Laat de gecoate glazen afdekplaten een nacht op 4 °C staan.
- Verwijder het teveel aan biolaminine en voeg 200 μL hepatocytendifferentiatiemedium toe zoals hieronder beschreven.
6. Bereiding van hepatocytendifferentiatiemedia
- Maak 500 ml hepatoblast knockout serum replacement (KSR)/dimethylsulfoxide (DMSO) medium bestaande uit 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,1% β-mercaptoethanol, 1% DMSO en 1% penicilline-streptomycine (Pen/Strep).
- Bereid 500 ml hepatocytenrijpingsmedium met 1% L-glutamine, 10 μM hydrocortison, 21-hemisuccinaatnatriumzout (HCC) en 1% Pen/Strep.
- Aliquote medium uit de stam en voeg verse hepatocytengroeifactor (HGF) en oncostatine M (OSM) toe in eindconcentraties van 10 ng/ml en/of 20 ng/ml voor elke mediumverandering.
OPMERKING: Oncostatine M is een cytokine dat behoort tot de interleukine 6-groep van cytokines, belangrijk voor hematopoiese en voor de ontwikkeling van de lever.
7. Het kweken van levercellen gedifferentieerd van BD-PSC's
- Plaats 3 x 105 BD-PSCS-cellen in elke put van een 4-well plaat bedekt met biolaminine.
- Plaats de 4-putplaten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek de cellen gedurende 5 dagen in KSR / DMSO hepatoblastmedium dat endodermale differentiatie ondersteunt en verander het medium elke tweede dag.
- Schakel op dag 5 over op hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen nog eens 7-10 dagen in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium elke 48 uur.
8.3D sferoïde leverdifferentiatie
- Tel cellen met behulp van een telkamer.
- Centrifugeer BD-gededifferentieerde celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendien BD-gededifferentieerde cellen in KSR/DMSO-medium bij 2 x 106 cellen/ml.
- Haal de cellen door een celzeef van 40 μm om een eencellige suspensie te garanderen en om extra vuil te verwijderen.
- Tel cellen met behulp van een telkamer en bereid een voldoende volume voor elke celzaaidichtheid voor om het vereiste volume per put af te geven. Bereid een gradiënt voor met topzaaien van 1 x 106 cellen tot een lage zaaidichtheid van 4000 cellen.
- Doseer 100 μL KSR/DMSO-medium in 96 goed lage bevestigingsplaten en voeg 100 μL celzaaiverdunning toe.
- Plaats een lage bevestigingsplaat in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2 en kweek ze gedurende 5 dagen.
- Verander 50% van het medium vanaf dag 3-4 na het zaaien wanneer de sferoïden voldoende compact zijn.
- Verander op dag 5 het medium in hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen gedurende nog eens 7-10 dagen voor verdere rijping. Verander het medium om de twee dagen.
9. Immunofluorescentieanalyse van nieuw gegenereerde 2D-levercelculturen
- Kweek de cellen volgens de hierboven beschreven differentiatiemethode gedurende 4, 8, 15 en 24 dagen en verwijder media.
- Incubeer cellen met een voorverwarmd fixatief bestaande uit 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Gooi het fixeermiddel weg en was de cellen 2x met PBS gedurende 5 min elk. Voeg onmiddellijk 0,1% triton X-100-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten. Was 2x met PBS.
- Voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5% BSA toe en plaats deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een wipplaat.
- Verdun primaire antilichamen in verdunningsbuffer 1% BSA/PBS als volgt: albumine (ALB) 1:50, alfa-1 foetoproteïne (AFP) 1:250, cytokeratine 18 (CK18) 1:50, hepatocyten nucleaire factor 4 alfa (HNF4α) 1:1000 en transthyretine (TTR) 1:50. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put.
- Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens de antilichaamoplossing weg, was de cellen gedurende 5 minuten en herhaal de wasstap 3x.
- Bereid de volgende secundaire antilichamen in verdunningsbuffer: konijn anti-kip IgG (Texas rood) 1:1000, geit anti-muis IgG (488) 1:1000 en geit anti-konijn (488) 1:500. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen 3x met PBS gedurende 5 minuten elk en monteer de coverslips met montagemedia die DAPI bevatten voor microscopische analyse.
10. Levende kleuring van nieuw gevormde leversferoïden
- Gooi kweekmedia voorzichtig weg zonder de sferoïden aan te raken, voeg vers gemaakte PBS toe met 0,1% triton X-100-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten om de cellen te permeabiliseren.
- Was de sferoïden met het medium door langzaam te pipetteren gedurende 5 minuten, herhaal 2x.
- Incubeer de sferoïden met de primaire antilichamen ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) en CYP3A4 (1:200) bereid in PBS met 1% BSA gedurende 1 uur in 5% CO 2-incubator bij 37 °C. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put.
- Verwijder voorzichtig de overtollige antilichaamoplossing en was de sferoïden met medium 3x.
- Bereid de overeenkomstige secundaire antilichamen geiten anti-muis IgG (Cy3), geit anti-muis IgG (488) en konijn anti-kip IgG (Texas rood) in een verdunning van 1:1000 en 1:500 voor geit anti-konijn (488) in PBS in 1% BSA. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put en incubeer gedurende 20 minuten in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
- Was voorzichtig 3x met medium en laat de plaat 30 minuten in de couveuse staan bij 37 °C en 5% CO2 voordat u fluorescentiemicroscopie uitvoert.
11. Onderzoek van sferoïden met behulp van een fluorescentiemicroscoop
- Schakel de fluorescentielichtbron 10 minuten voor gebruik in, schakel de computer in en open de beeldbewerkingssoftware.
- Gebruik een objectief met 4x vergroting, klik op knop 4x in de werkbalk om de juiste schaalbalk te selecteren en plaats vervolgens de 96-well plaat op de middenplaat van het podium.
- Schakel de LED-lichtbron in, gebruik het brightfield-filter en plaats de plaat in de put van belang met behulp van de x-y-as trapinstelknop.
- Ga naar het lichtpad van de camera, klik op de knop Live in imaging-software om het beeld op het scherm te visualiseren en zorg ervoor dat de sferoïde is gecentreerd met behulp van de x-y-asknoppen en focus met behulp van de grove / fijne scherpstelknop.
OPMERKING: De vorm van de sferoïden blijft constant na het aanbrengen van levende kleuring. - Kies de Brightfield Observation-methode in de werkbalk, zet de belichtingsinstellingen op automatisch en klik op de knop Snapshot in het bedieningspaneel van de camera om een foto te maken. Sla de afbeelding vervolgens op als .vsi-bestand met de juiste naam in de gewenste map.
- Plaats de afschermingsplaat van het omgevingslicht om LED-licht uit te schakelen, verander naar filter voor B-excitatie, kies 488 Observation-methode in de werkbalk, open de sluiter, maak een foto door op de knop Snapshot te klikken, sluit de sluiter en sla het bestand op zoals hierboven beschreven.
- Herhaal dit met een filter voor G-excitatie met behulp van de juiste observatiemethode (Texas rood of CY3). Herhaal vervolgens de hele procedure voor elke bron van belang.
- Breng de plaat terug naar de 5% CO 2-incubator bij 37 °C en kweek deze zoals hierboven beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben met succes menselijke BD-PSC's gedifferentieerd in endoderm / hepatische voorlopercellen en hepatocyten door een tweestappenprotocol toe te passen. Morfologische veranderingen tijdens het leverdifferentiatieproces zijn weergegeven in figuur 1. BD-PSC's differentiëren in hepatocyten die drie verschillende stadia doorlopen. De eerste fase vertegenwoordigt de differentiatie in endodermale cellen L4, de tweede, differentiatie naar levervoorlopercellen (hepatoblast) L8, met een typische veelhoekige morfologie, en de derde, de rijping tot hepatocyten L15-L24.
Immunofluorescentieanalyse werd uitgevoerd om de leverdifferentiatie van BD-PSC's zoals weergegeven in figuur 2 te bevestigen. Sterke expressie van endoderm/humane levervoorlopermarker, zoals alfa-fetoproteïne (AFP), een belangrijk plasma-eiwit in foetaal serum waarvan de concentratie zeer laag is bij volwassen organismen en daarom wordt beschouwd als een marker voor de voorloper van hepatocyten15 en transthyretine (TTR), een belangrijk schildklierhormoonbindend eiwit dat betrokken is bij het transport van thyroxine van de bloedbaan naar de hersenen16 worden aangetroffen in de cellen in de eerste fase van het leverdifferentiatieproces bij L4 tot L8. Hun expressie neemt echter af bij L15, terwijl de expressie van albumine (ALB), het meest voorkomende plasma-eiwit dat voornamelijk door de lever wordt geproduceerd en uiterst kritisch is voor leverdifferentiatie, evenals hepatocytennucleaire factor 4 alfa (HNF-4α), een hepatocytentranscriptiefactor die betrokken is bij de expressie van leverspecifieke genen17 verschijnt eerst bij L4, stijgt gedurende de differentiatietijd L4-L15 en bereikt een sterke en stabiele expressie tijdens de rijpingstijd L15-L24.
Cytokeratine 18 (CK18) is een cytoskeletaal eiwit, een van de belangrijkste componenten van intermediair filament uitgedrukt in de lever18. De resultaten tonen aan dat, zoals verwacht, CK18-expressie correleert met volwassen hepatocyten (L15-L24) en niet tot expressie komt in hepatocytenvoorlopercellen.
Het goed gedefinieerde protocol voor hepatocytendifferentiatie in 2D-culturen maakt de engineering van hepatische 3D-culturen mogelijk, te beginnen met BD-PSC's.
We tonen hier aan dat spontane aggregatie van deze cellen in lage hechtingsplaten die hepatocyteninductie/rijpingsmedium bevatten, sferoïdevorming initieert. Het groeispoor werd gevolgd door beeldvormende cellen op L2, L4 en L7. (Figuur 3A) Er is een consistente correlatie tussen het sferoïde volume en het variabele aantal cellen, zoals weergegeven in figuur 3B.
De lever is een orgaan waarin de meeste geneesmiddelen in het menselijk lichaam worden gemetaboliseerd. Cytochroom P450 is een superfamilie van enzymen (monooxygenasen) die van cruciaal belang zijn in de processen van geneesmiddel- en cellulair metabolisme, ontgifting van xenobiotica en homeostase. Om de potentiële functionele activiteit van van BD-PSC's afgeleide leversferoïden te beoordelen, analyseerden we de expressie van geneesmiddel-metaboliserende enzymen zoals CYP3A4 en CYP2E1, leden van CYP3- en CYP2-families19.
De meeste geneesmiddelen die tegenwoordig worden gebruikt, waaronder codeïne, ciclosporine A, erytromycine, paracetamol en diazepam, evenals vele steroïden en carcinogenen, worden gemetaboliseerd als gevolg van de activiteit van CY3A4-enzym20. CYP2E1 is betrokken bij het metabolisme van endogene substraten zoals ethyleenglycol, benzeen, tetrachloorkoolstof en met name de belangrijkste sterk mutagene verbinding zoals nitrosamine21.
De sferoïden die worden gevormd en gedifferentieerd volgens het protocol bij D14, levend gekleurd met antilichamen tegen deze twee enzymen, onthullen de potentiële hepatische functionele activiteit van van BD-PSC's afgeleide sferoïden (figuur 4).
Figuur 1: Differentiatie van BD-PSC's naar leverachtige cellen. Representatieve microfoto's van morfologische veranderingen gedurende hepatische differentiatie van BD-PSC's die endodermaal L4 of polygonale vorm L8-morfologie laten zien die uiteindelijk de rijpingstoestand bereikt bij L15 tot L24. Schaalbalken: bovenste rij 50 μm, onderste rij 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Immunofluorescentieanalyse van BD-PSC's herdifferentiatie naar levercellen. Endoderm/hepatocyten voorloper- en hepatocytenspecifieke markers worden uitgedrukt tijdens leverdifferentiatie van BD-PSC's in 2D-culturen. Op de dagen L4 tot en met L8 tonen micrografieën een verminderde expressie van endoderm/levervoorloper AFP en TTR, terwijl hun expressie verdween uit L8-L24. Expressie van hepatocyten ALB- en HNFα-markers ontstaan bij L4 en nemen toe tijdens de rijping, terwijl de expressie van CK18 het eerst verscheen bij L15 en het maximum bereikte bij L24. Schaalbalken voor grafieken L4-L15: 50 μm en voor L24: 20 μm. De controle is weergegeven in aanvullende figuur 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vorming van 3D-sferoïden bij leverdifferentiatie van BD-PSC's. (A) Variabele celaantallen van BD-PSC's beginnend met 1 x 106 tot 4000 cellen werden in lage hechtingsplaten gezaaid en differentiatie werd uitgevoerd volgens de tweetrapsprocedure zoals vermeld in het Protocol. De generatie van 3D menselijke leversferoïden werd op verschillende tijdstippen in beeld gebracht, getoond zijn representatieve fasecontrastbeelden op elk moment tijdens de kweekperiode. Schaalbalk: 200 μm. (B) Diameters van ten minste 4 leversferoïden voor elke grootte werden gemeten bij L4 met behulp van microscoopbeeldvormingssoftware en volumes werden berekend. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hepatocyten functionele markers worden uitgedrukt in BD-PSC's-afgeleide leversferoïden. BD-PSC's werden gedifferentieerd in hepatocyten. Directe immunofluorescentieanalyse werd uitgevoerd op levende cellen bij L14 met behulp van antilichamen tegen ALB, AFP, CK18 en CYP2E1 en CYP3A4, leden van de cytochroom P450-familie. Schaalbalk: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Negatieve controle voor immunofluorescentieanalyse van BD-PSC's herdifferentiatie naar levercellen. Endoderm/hepatocyten voorloper- en hepatocytenspecifieke markers worden uitgedrukt tijdens leverdifferentiatie van BD-PSC's in 2D-culturen. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lever is een belangrijk orgaan in het menselijk lichaam met veel essentiële biologische functies, zoals de ontgifting van metabolieten. Als gevolg van ernstig leverfalen zoals cirrose en / of virale hepatitis, zijn er wereldwijd bijna 2 miljoen sterfgevallen per jaar. Levertransplantaties staan wereldwijd op de tweede plaats in solide orgaantransplantaties, maar slechts aan ongeveer 10% van de huidige behoefte wordt voldaan22.
Primaire menselijke hepatocyten (PHH) worden vaak gebruikt om levertoxiciteit te bestuderen. Deze cellen kunnen korte tijd in cultuur worden gehouden met behoud van hun specifieke functies. Ook is het aantal cellen dat beschikbaar is van een enkele donor beperkt, bovendien kunnen deze cellen niet worden uitgebreid in de kweek, daarom blijft het tekort aan donor-PHH het belangrijkste obstakel voor hepatotoxiciteitsstudies. PSC's vertegenwoordigen een vernieuwingsbron van menselijke weefsels en kunnen worden gebruikt voor het genereren van 3D-leverculturen11.
Lever 3D-kweeksystemen vertonen meerdere voordelen in vergelijking met 2D. Kortere differentiatietijd en nauwkeurige nabootsing van in vivo processen maken nauwkeurigere studies over door geneesmiddelen geïnduceerde toxiciteit mogelijk, een betere voorspelling van leveraansprakelijkheid en zijn kosteneffectiever23. De leversferoïde culturen vanwege hun autologe eigenschap kunnen een groot voordeel zijn ten opzichte van primaire menselijke hepatocyten (PHH) die de nadelen van hun gebruik omzeilen en kunnen een gouden standaard worden voor toepassing bij het testen van geneesmiddeltoxiciteit en heeft een potentiële toekomstige toepassing in regeneratieve geneeskunde.
We hebben hier aangetoond dat BD-PSC's gegenereerd uit steady-state perifeer bloed met succes kunnen worden gedifferentieerd in endodermale / hepatocytenvoorlopers / volwassen hepatocyten met gestage albuminesecretie en fenotypische stabiliteit die hepatocytenmarkers tot expressie brengt. Bovendien tonen de gemanipuleerde 3D menselijke hepatocytensferoïde culturen de potentiële functionele activiteit aan door de enzymen tot expressie te brengen die behoren tot cytochroom P450, zoals CYP3A4 en CYP2E1.
De belangrijkste stap in het protocol is het verkrijgen van een goede kwaliteit en het aantal verse menselijke MNC's voor het herprogrammeringsproces. Het gebruik van bevroren MNC's resulteert in een verminderd aantal geherprogrammeerde cellen.
We hebben menselijke leversferoïden ontworpen met behulp van geactiveerde PBMNC-culturen met en zonder immunomagnetische sortering toe te passen die geherprogrammeerde cellen scheidt van volwassen bloedcellen. Het kleine verschil in het gebruik van deze twee methoden is afhankelijk van de hogere dichtheid van de 3D-structuur bij het gebruik van gezuiverde geherprogrammeerde cellen. De expressie van hepatocytenmarkers blijft consistent in beide celkweekpreparaten.
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van PHH vertegenwoordigt de methode mogelijk het biologisch relevante dichtstbijzijnde alternatief voor autologe verse hepatocyten om de leverfunctie in vitro te bestuderen, zoals xenobiotisch metabolisme en levertoxiciteit, gastheer-pathogeeninterventie en celbiologie in het algemeen. De mogelijkheid om BD-PSC's te gebruiken in regeneratieve geneeskunde terwijl ze autoloog en niet-teratogeen zijn, is het onderwerp van verdere studies in ons laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De corresponderende auteur verklaart dat zij een octrooihouder is met betrekking tot novel human GPI-linked protein. Ze is medeoprichter van en werkt samen met ACA CELL Biotech GmbH. De andere auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs zijn vooral dankbaar voor de technische assistentie van Oksana en John Greenacre. Dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
