Summary
Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.
Abstract
Menschliche Leberzellen können eine dreidimensionale (3D) Struktur bilden, die in der Lage ist, einige Wochen lang in Kultur zu wachsen und ihre Funktionsfähigkeit zu erhalten. Aufgrund ihrer Beschaffenheit, sich in den Kulturschalen mit geringen oder keinen Hafteigenschaften zu sammeln, bilden sie Aggregate mehrerer Leberzellen, die als menschliche Lebersphäroide bezeichnet werden. Die Bildung von 3D-Lebersphäroiden beruht auf der natürlichen Tendenz von Leberzellen, in Abwesenheit eines adhäsiven Substrats zu aggregieren. Diese 3D-Strukturen besitzen bessere physiologische Reaktionen als Zellen, die näher an einer In-vivo-Umgebung liegen. Die Verwendung von 3D-Hepatozytenkulturen hat im Vergleich zu klassischen zweidimensionalen (2D) Kulturen zahlreiche Vorteile, darunter eine biologisch relevantere Mikroumgebung, eine architektonische Morphologie, die natürliche Organe wieder zusammensetzt, sowie eine bessere Vorhersage des Krankheitszustands und der In-vivo-ähnlichen Reaktionen auf Medikamente. Verschiedene Quellen können verwendet werden, um Sphäroide zu erzeugen, wie primäres Lebergewebe oder immortalisierte Zelllinien. Das 3D-Lebergewebe kann auch unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zur Ableitung von Hepatozyten hergestellt werden. Wir haben humane Lebersphäroide unter Verwendung von aus Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) gewonnen, die aus unmanipuliertem peripherem Blut durch Aktivierung von humanem membrangebundenem GPI-verknüpftem Protein erzeugt und zu menschlichen Hepatozyten differenziert wurden. Die von BD-PSCs abgeleiteten menschlichen Leberzellen und menschlichen Lebersphäroide wurden durch Lichtmikroskopie und Immunphänotypisierung unter Verwendung humaner Hepatozytenmarker analysiert.
Introduction
In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Sphäroidkultursysteme zu einem wichtigen Werkzeug entwickelt, um verschiedene Bereiche der Krebsforschung, Wirkstoffforschung und Toxikologie zu untersuchen. Solche Kulturen stoßen auf großes Interesse, da sie die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) Zellkultur-Monoschichten und komplexen Organen schließen1.
In Ermangelung einer adhäsiven Oberfläche beruht die Bildung von Sphäroiden im Vergleich zur 2D-Zellkultur auf der natürlichen Affinität dieser Zellen zu Clustern in 3D-Form. Diese Zellen organisieren sich in Gruppen, die aus einer oder mehreren Arten reifer Zellen bestehen. Frei von Fremdstoffen interagieren diese Zellen miteinander wie in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung. Die Zellen in der 3D-Kultur sind viel näher beieinander und haben eine richtige Ausrichtung zueinander, mit einer höheren extrazellulären Matrixproduktion als 2D-Kulturen, und bilden eine nahe an der natürlichen Umgebung 2.
Tiermodelle werden seit langem verwendet, um die menschliche Biologie und Krankheiten zu untersuchen3. In dieser Hinsicht gibt es intrinsische Unterschiede zwischen Mensch und Tier, was diese Modelle für extrapolative Studien nicht vollständig geeignet macht. 3D-Kultursphäroide und -Organoide stellen ein vielversprechendes Werkzeug dar, um gewebeähnliche Architektur, Interaktion und Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, die in vivo auftreten, und können dazu beitragen, Tiermodelle zu reduzieren oder sogar zu ersetzen. Sie sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Pathogenese von Lebererkrankungen sowie für Wirkstoff-Screening-Plattformen4.
Die 3D-Sphäroidkultur ist für die Krebsforschung von besonderer Bedeutung, da sie die Diskontinuität zwischen den Zellen und ihrer Umgebung beseitigen kann, indem sie den Bedarf an Trypsinisierung oder Kollagenasebehandlung reduziert, der für die Vorbereitung der Tumorzellmonoschichten für 2D-Kulturen erforderlich ist. Tumorsphäroide ermöglichen die Untersuchung, wie normale und bösartige Zellen Signale aus ihrer Umgebung empfangen und darauf reagieren5 und sind ein wichtiger Bestandteil tumorbiologischer Studien.
Im Vergleich zur Monoschicht ähneln 3D-Kulturen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen, in ihren strukturellen und funktionellen Eigenschaften Tumorgeweben und eignen sich daher für die Untersuchung von Metastasen und Invasionen von Tumorzellen. Deshalb tragen solche Sphäroidmodelle dazu bei, die Krebsforschung zu beschleunigen6.
Sphäroide tragen auch dazu bei, die Technologie zur Herstellung menschlicher Organoide zu entwickeln, da die Gewebe- und Organbiologie insbesondere beim Menschen sehr schwierig zu untersuchen ist. Fortschritte in der Stammzellkultur ermöglichen die Entwicklung von 3D-Kulturen wie Organoiden, die aus Stammzellen und Gewebevorläufern bestehen, sowie verschiedene Arten von reifen (Gewebe-)Zellen aus einem Organ mit einigen funktionellen Eigenschaften wie einem echten Organ, das zur Modellierung der Organentwicklung und von Krankheiten verwendet werden kann, aber auch in der regenerativen Medizin als nützlich angesehen werdenkann 7.
Primäre menschliche Hepatozyten werden normalerweise für die Untersuchung der In-vitro-Biologie menschlicher Hepatozyten, der Leberfunktion und der arzneimittelinduzierten Toxizität verwendet. Kulturen menschlicher Hepatozyten haben zwei Hauptnachteile, erstens die begrenzte Verfügbarkeit von primärem Gewebe wie menschlichen Hepatozyten und zweitens die Tendenz von Hepatozyten, sich in 2D-Kulturen schnell zu dedifferenzieren, wodurch ihre spezifische Hepatozytenfunktion verlorengeht 8. 3D-Leberkulturen sind in dieser Hinsicht überlegen und wurden kürzlich aus differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) hergestellt9. Biotechnologisch hergestellte hepatische 3D-Sphäroide sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Entwicklung, Toxizität, genetischen und infektiösen Erkrankungen der Leber sowie für die Wirkstoffforschung zur Behandlung von Lebererkrankungen10. Schließlich haben sie auch das Potenzial, klinisch eingesetzt zu werden, da sie wissen, dass akute Lebererkrankungen eine Sterblichkeitsrate von fast 80 % aufweisen, biokünstliche Leber- und/oder Lebersphäroide diese Patienten möglicherweise retten könnten, indem sie eine partielle Leberfunktion bereitstellen, bis ein geeigneter Spender gefunden werden kann11.
Wir haben ein Protokoll für die Erzeugung von humanen hepatischen Sphäroiden unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen aus Blut (BD-PSCs) zur Herstellung unterschiedlich großer Sphäroide mit 4000 bis 1 x 106 Zellen erstellt und mittels Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz analysiert. Wir testeten auch die Fähigkeit der Hepatozyten-spezifischen Funktion und bewerteten die Expression von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und 2E1 (CYP2E1) Enzymen, die zur Cytochrom-P450-Familie gehören und eine wichtige Rolle im Zell- und Arzneimittelstoffwechsel während des Entgiftungsprozesses spielen12.
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Protocol
Für die Durchführung dieser Experimente wurde die ethische Genehmigung (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) eingeholt und die Einverständniserklärung aller Spender vor der Blutentnahme in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unterzeichnet.
1. Herstellung mononukleärer Zellen (MNCs) aus menschlichem peripherem Blut (PB)
- Extrahieren Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern mit Hilfe von geschultem medizinischem Personal gemäß dem Standardprotokoll.
- Isolieren Sie PBMNCs mit Dichtegradientenmedien gemäß dem von Becker-Kojić et al.13 veröffentlichten Protokoll. Isolieren Sie durch Pipettieren die Interphasenschicht zwischen Plasma- und Dichtegradientenmedien und verwenden Sie sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), um die isolierten Zellen zu waschen.
- Verwenden Sie eine Zählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Standardmethoden.
2. Dedifferenzierung von MNCs nach Aktivierung mit humanem GPI-verankertem Glykoprotein
- 6 x 106 mononukleäre Zellen in PBS/1% Rinderserumalbumin (BSA) in ein Polystyrolröhrchen (15 ml) geben und mit dem spezifischen Antikörper 30 min bei 37 °C nach Becker-Kojić et al.13 inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei Raumtemperatur und ersetzen Sie PBS/BSA durch Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
- Züchten Sie die Zellen in 15-ml-Polystyrolröhrchen in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C für 8-10 Tage, wie in Becker-Kojić et al.13 beschrieben. Geben Sie an Tag 5 (D5) 1-2 ml Iscove-Medium, ergänzt mit 10% FBS, in jedes 15-ml-Röhrchen.
3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen
- Zentrifugieren Sie die kultivierte Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 300 x g und aspirieren Sie mit einer sterilen Pipette den resultierenden Überstand nach Becker-Kojić et al.13.
- Resuspendieren Sie das durch Zentrifugation in 90 μl kaltem PBS-Puffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA und 2 mM EDTA) erhaltene Pellet und fügen Sie 10 μl CD45-positive Magnetkügelchen in Nanogröße hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang auf Eis.
- Waschen Sie die Zellsuspension mit 2 ml PBS-Puffer, zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur und geben Sie 500 μl PBS-Puffer in die Zellen und resuspendieren Sie sie gründlich.
- Pipettieren Sie 500 μl vorgekühlten PBS-Puffer zum Waschen in die Säule und legen Sie ihn mit einem Magnetständer in das Magnetfeld.
- Waschen Sie die auf der Säule platzierten Zellen zweimal mit 500 μl PBS-Puffer und sammeln Sie Durchflusszellen, die CD45-negative Zellen enthalten, in Iscoves Medium, das mit 10% FBS ergänzt wird.
- Verwenden Sie eine Zählkammer, um die Anzahl der umprogrammierten Zellen zu bestimmen.
4. Herstellung von Glasdeckgläsern für die Erzeugung menschlicher Hepatozyten
- Glasdeckgläser (14 mm) trennen und 10 min in nichtionischem Reinigungsmittel inkubieren. Waschen Sie Glasdeckgläser in deionisiertem Wasser, bis keine Blasen mehr vorhanden sind, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in 1M HCl (nach Marchenko et al.14).
- Waschen Sie Glasdeckgläser mindestens 3x mit deionisiertem Wasser und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Autoklavieren Sie getrocknete Glasdeckgläser in einem geeigneten Behälter.
5. Beschichtung von Zellkulturplatten mit Biolaminin zur 2D-hepatischen Differenzierung von BD-PSCs
- Legen Sie autoklavierte Glasdeckgläser mit einer sterilen Pinzette in 4-Well-Platten und schalten Sie das UV-Licht 30 Minuten lang ein, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
- Tauen Sie Aliquots von Biolaminin auf und geben Sie 120 μl 5 μg/ml Biolaminin in jedes Glasdeckglas. Lassen Sie die beschichteten Glasdeckgläser über Nacht bei 4 °C stehen.
- Entfernen Sie den Überschuss an Biolaminin und fügen Sie 200 μl Hepatozyten-Differenzierungsmedium hinzu, wie unten beschrieben.
6. Herstellung von Hepatozyten-Differenzierungsmedien
- Stellen Sie 500 ml Hepatoblast-Knockout-Serumersatz (KSR)/Dimethylsulfoxid (DMSO)-Medium her, bestehend aus 76,4 % Knockout-DMEM (KO-DMEM), 20 % KSR, 0,5 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,1 % β-Mercaptoethanol, 1 % DMSO und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptokokken).
- Bereiten Sie 500 ml Hepatozyten-Reifungsmedium vor, das 1 % L-Glutamin, 10 μM Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC) und 1 % Pen/Streptokokken enthält.
- Aliquotes Medium aus dem Stamm und Zugabe von frischem Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Oncostatin M (OSM) in Endkonzentrationen von 10 ng/ml und/oder 20 ng/ml für jeden Mediumwechsel.
HINWEIS: Oncostatin M ist ein Zytokin aus der Interleukin-6-Gruppe von Zytokinen, das sowohl für die Hämatopoese als auch für die Leberentwicklung wichtig ist.
7. Kultivierung von Leberzellen, die sich von BD-PSCs unterscheiden
- Geben Sie 3 x 105 BD-PSCS-Zellen in jede Vertiefung einer mit Biolaminin beschichteten 4-Well-Platte.
- Stellen Sie die 4-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator. Kultivieren Sie die Zellen für 5 Tage in KSR/DMSO-Hepatoblast-Medium, das die endodermale Differenzierung unterstützt, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
- Wechseln Sie am 5. Tag auf Hepatozyten-Reifungsmedium und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 . Wechseln Sie das Medium alle 48 h.
8.3D sphäroide hepatische Differenzierung
- Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
- BD-dedifferenzierte Zellsuspension bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie BD-dedifferenzierte Zellen in KSR/DMSO-Medium bei 2 x 106 Zellen/ml.
- Führen Sie die Zellen durch ein 40-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten und zusätzliche Ablagerungen zu entfernen.
- Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie für jede Zellaussaatdichte ein ausreichendes Volumen vor, um das erforderliche Volumen pro Vertiefung abzugeben. Bereiten Sie einen Gradienten mit Top-Seeding von 1 x 106 Zellen bis zu einer niedrigen Seeding-Dichte von 4000 Zellen vor.
- Geben Sie 100 μl KSR/DMSO-Medium in 96 gut niedrige Aufsatzplatten ab und fügen Sie 100 μl Zellaussaatverdünnung hinzu.
- Legen Sie die niedrige Aufsatzplatte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator und kultivieren Sie sie 5 Tage lang.
- Wechseln Sie 50% des Mediums von den Tagen 3-4 nach der Aussaat, wenn die Sphäroide ausreichend kompakt sind.
- Ändern Sie am 5. Tag das Medium in das Reifungsmedium der Hepatozyten und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage zur weiteren Reifung. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
9. Immunfluoreszenzanalyse von neu erzeugten 2D-Leberzellkulturen
- Kultivieren Sie die Zellen nach der oben beschriebenen Differenzierungsmethode für 4, 8, 15 und 24 Tage und entfernen Sie Medien.
- Inkubieren Sie die Zellen mit einem vorgewärmten Fixiermittel, das aus 4% Paraformaldehyd in PBS besteht, für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS für jeweils 5 Minuten. Fügen Sie sofort 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten. 2x mit PBS waschen.
- Blockierende Lösung aus PBS und 5% BSA zugeben und 1 h bei Raumtemperatur auf die Kippplatte legen.
- Verdünnen Sie primäre Antikörper in Verdünnungspuffer 1% BSA/PBS wie folgt: Albumin (ALB) 1:50, Alpha-1-Fetoprotein (AFP) 1:250, Zytokeratin 18 (CK18) 1:50, Hepatozytenkernfaktor 4 alpha (HNF4α) 1:1000 und Transthyretin (TTR) 1:50. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.
- Inkubieren Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann die Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang und wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
- Bereiten Sie die folgenden sekundären Antikörper im Verdünnungspuffer vor: Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) 1:1000, Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) 1:1000 und Ziegen-Anti-Kaninchen (488) 1:500. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS für jeweils 5 min und montieren Sie die Deckgläser mit DAPI-haltigen Einpackmedien für die mikroskopische Analyse.
10. Lebendfärbung neu gebildeter Lebersphäroide
- Entsorgen Sie die Nährmedien vorsichtig, ohne die Sphäroide zu berühren, fügen Sie frisch hergestelltes PBS mit 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren.
- Waschen Sie die Sphäroide mit dem Medium durch langsames Pipettieren für 5 min, wiederholen Sie den Vorgang 2x.
- Die Sphäroide werden mit den Primärantikörpern ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) und CYP3A4 (1:200) inkubiert, die in PBS mit 1% BSA für 1 h in einem 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C hergestellt wurden. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.
- Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Antikörperlösung und waschen Sie die Sphäroide 3x mit medium.
- Bereiten Sie die entsprechenden sekundären Antikörper Ziegen-Anti-Maus-IgG (Cy3), Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) und Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) in einer Verdünnung von 1:1000 und 1:500 für Ziegen-Anti-Kaninchen (488) in PBS in 1% BSA vor. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
- Waschen Sie die Platte vorsichtig 3x mit Medium und lassen Sie die Platte 30 Minuten im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 , bevor Sie eine Fluoreszenzmikroskopie durchführen.
11. Untersuchung von Sphäroiden mit einem Fluoreszenzmikroskop
- Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle 10 Minuten vor Gebrauch ein, schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.
- Verwenden Sie ein Objektiv mit 4-facher Vergrößerung, klicken Sie auf die Schaltfläche 4x in der Symbolleiste, um die richtige Maßstabsleiste auszuwählen, und legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Tischmittelplatte.
- Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein, verwenden Sie den Hellfeldfilter und positionieren Sie die Platte mit dem Einstellknopf für die x-y-Achse an der gewünschten Vertiefung.
- Wechseln Sie zum Lichtweg der Kamera, klicken Sie auf die Schaltfläche Live in der Bildbearbeitungssoftware, um das Bild auf dem Bildschirm zu visualisieren, und stellen Sie sicher, dass das Sphäroid mit den Knöpfen der X-Y-Achse zentriert und mit dem Grob-/Feinfokusknopf fokussiert ist.
HINWEIS: Die Form der Sphäroide bleibt nach dem Auftragen der Lebendfärbung konstant. - Wählen Sie in der Symbolleiste die Hellfeld-Beobachtungsmethode , stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf "Automatisch" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss " in der Kamerasteuerung, um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie dann das Bild als VSI-Datei unter dem entsprechenden Namen im gewünschten Ordner.
- Platzieren Sie die Umgebungslichtabschirmplatte, um das LED-Licht auszuschalten, wechseln Sie zum Filter für die B-Anregung, wählen Sie 488 Beobachtungsmethode in der Symbolleiste, öffnen Sie den Verschluss, nehmen Sie ein Bild auf, indem Sie auf die Schaltfläche Schnappschuss klicken, schließen Sie den Verschluss und speichern Sie die Datei wie oben beschrieben.
- Wiederholen Sie dies mit einem Filter für die G-Anregung mit der entsprechenden Beobachtungsmethode (Texas Red oder CY3). Wiederholen Sie dann das gesamte Verfahren für jede interessante Bohrung.
- Legen Sie die Platte bei 37 °C wieder in den 5 % CO2 -Inkubator und kultivieren Sie sie wie oben beschrieben.
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Representative Results
Wir haben humane BD-PSCs erfolgreich in Endoderm-/hepatische Vorläuferzellen und Hepatozyten differenziert, indem wir ein zweistufiges Protokoll angewendet haben. Morphologische Veränderungen während des hepatischen Differenzierungsprozesses sind in Abbildung 1 dargestellt. BD-PSCs differenzieren sich in Hepatozyten, die drei verschiedene Stadien durchlaufen. Die erste Stufe stellt die Differenzierung in endodermale Zellen L4 dar, die zweite die Differenzierung zu hepatischen Vorläuferzellen (Hepatoblasten) L8, die eine typische polygonale Morphologie aufweisen, und die dritte Stufe die Reifung zu Hepatozyten L15-L24.
Eine Immunfluoreszenzanalyse wurde durchgeführt, um die hepatische Differenzierung von BD-PSCs zu bestätigen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Starke Expression von Endoderm-/menschlichen Lebervorläufermarkern, wie Alpha-Fetoprotein (AFP), einem wichtigen Plasmaprotein im fetalen Serum, dessen Konzentration in adulten Organismen sehr niedrig ist und daher als Marker für die Vorstufe15 der Hepatozyten und Transthyretin (TTR) gilt, ein wichtiges Schilddrüsenhormon-bindendes Protein, das am Transport von Thyroxin aus dem Blutkreislauf zum Gehirn beteiligt ist16 befinden sich in den Zellen in der ersten Phase des hepatischen Differenzierungsprozesses bei L4 bis L8. Ihre Expression nimmt jedoch bei L15 ab, während die Expression von Albumin (ALB), dem am häufigsten vorkommenden Plasmaprotein, das hauptsächlich von der Leber produziert wird und für die hepatische Differenzierung äußerst wichtig ist, sowie dem Hepatozyten-Kernfaktor 4 alpha (HNF-4α), einem Hepatozyten-Transkriptionsfaktor, der an der Expression leberspezifischer Gene beteiligt ist17 erscheint zuerst bei L4, steigt während der Differenzierungszeit L4-L15 an und erreicht während der Reifezeit L15-L24 eine starke und stabile Expression.
Cytokeratin 18 (CK18) ist ein Zytoskelettprotein, einer der Hauptbestandteile des in der Leber exprimierten Zwischenfilaments18. Die Ergebnisse zeigen, dass die CK18-Expression erwartungsgemäß mit reifen Hepatozyten (L15-L24) korreliert und nicht in Hepatozyten-Vorläuferzellen exprimiert wird.
Das klar definierte Protokoll für die Hepatozytendifferenzierung in 2D-Kulturen ermöglicht das Engineering von hepatischen 3D-Kulturen beginnend mit BD-PSCs.
Wir zeigen hier, dass die spontane Aggregation dieser Zellen in niedrig anhaftenden Platten, die Hepatozyten-Induktions-/Reifungsmedium enthalten, die Sphäroidbildung initiiert. Dem Wachstumspfad folgten bildgebende Zellen bei L2, L4 und L7. (Abbildung 3A) Es besteht eine konsistente Korrelation zwischen dem Sphäroidvolumen und der variablen Anzahl von Zellen, wie in Abbildung 3B dargestellt.
Die Leber ist ein Organ, in dem die meisten Medikamente im menschlichen Körper metabolisiert werden. Cytochrom P450 ist eine Superfamilie von Enzymen (Monooxygenasen), die für die Prozesse des Arzneimittel- und Zellstoffwechsels, der Entgiftung von Xenobiotika und der Homöostase von zentraler Bedeutung sind. Um die potentielle funktionelle Aktivität von BD-PSCs abgeleiteten hepatischen Sphäroiden zu bewerten, analysierten wir die Expression von arzneimittelmetabolisierenden Enzymen wie CYP3A4 und CYP2E1, Mitgliedern der CYP3- und CYP2-Familien19.
Die meisten Medikamente, die heute verwendet werden, einschließlich Codein, Cyclosporin A, Erythromycin, Paracetamol und Diazepam sowie viele Steroide und Karzinogene, werden aufgrund der Aktivität des CY3A4-Enzyms20 metabolisiert. CYP2E1 ist am Stoffwechsel von körpereigenen Substraten wie Ethylenglykol, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff und insbesondere der wichtigsten hochmutagenen Verbindung wie Nitrosamin21 beteiligt.
Die Sphäroide, die gemäß dem Protokoll bei D14 gebildet und differenziert werden und lebend mit Antikörpern gegen diese beiden Enzyme gefärbt sind, zeigen die potentielle hepatische funktionelle Aktivität von von BD-PSCs abgeleiteten Sphäroiden (Abbildung 4).
Abbildung 1: Differenzierung von BD-PSCs zu leberähnlichen Zellen. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen morphologischer Veränderungen während der hepatischen Differenzierung von BD-PSCs, die eine endodermale L4- oder polygonale L8-Morphologie zeigen, die schließlich den Reifezustand bei L15 bis L24 erreicht. Maßstabsbalken: obere Reihe 50 μm, untere Reihe 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunfluoreszenzanalyse der Redifferenzierung von BD-PSCs zu Leberzellen. Endoderm/Hepatozyten-Vorläufer- und Hepatozyten-spezifische Marker werden während der Leberdifferenzierung von BD-PSCs in 2D-Kulturen exprimiert. An den Tagen L4 bis L8 zeigen mikroskopische Aufnahmen eine verminderte Expression von Endoderm/hepatischem Vorläufer AFP und TTR, während ihre Expression von L8-L24 verschwand. Die Expression der Hepatozyten-ALB- und HNFα-Marker tritt bei L4 auf und nimmt während der Reifung zu, während die Expression von CK18 zuerst bei L15 auftrat und das Maximum bei L24 erreichte. Maßstabsbalken für die Diagramme L4-L15: 50 μm und für L24: 20 μm. Die Steuerung ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bildung von 3D-Sphäroiden bei hepatischer Differenzierung von BD-PSCs. (A) Variable Zellzahlen von BD-PSCs, beginnend mit 1 x 10,6 bis 4000 Zellen, wurden in niedrige Attachment-Platten ausgesät, und die Differenzierung wurde nach dem im Protokoll angegebenen zweistufigen Verfahren durchgeführt. Die Erzeugung von 3D-Sphäroiden der menschlichen Leber wurde zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, dargestellt sind repräsentative Phasenkontrastbilder zu jedem Zeitpunkt während des Kulturzeitraums. Maßstabsleiste: 200 μm. (B) Durchmesser von mindestens 4 hepatischen Sphäroiden für jede Größe wurden bei L4 unter Verwendung einer Mikroskop-Bildgebungssoftware gemessen und Volumina berechnet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Hepatozyten-Funktionsmarker werden in BD-PS-abgeleiteten Lebersphäroiden exprimiert. BD-PSCs wurden in Hepatozyten differenziert. Die direkte Immunfluoreszenzanalyse wurde an lebenden Zellen bei L14 unter Verwendung von Antikörpern gegen ALB, AFP, CK18 und CYP2E1 und CYP3A4, Mitglieder der Cytochrom-P450-Familie, durchgeführt. Maßstabsleiste: 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Negativkontrolle für die Immunfluoreszenzanalyse der Redifferenzierung von BD-PSCs zu Leberzellen. Endoderm/Hepatozyten-Vorläufer- und Hepatozyten-spezifische Marker werden während der Leberdifferenzierung von BD-PSCs in 2D-Kulturen exprimiert. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Leber ist ein wichtiges Organ im menschlichen Körper mit vielen wesentlichen biologischen Funktionen, wie z.B. der Entgiftung von Metaboliten. Aufgrund schwerer Leberversagen wie Leberzirrhose und/oder Virushepatitis gibt es weltweit fast 2 Millionen Todesfälle pro Jahr. Lebertransplantationen stehen weltweit an zweiter Stelle bei Transplantationen solider Organe, aber nur etwa 10% des derzeitigen Bedarfs werden gedeckt22.
Primäre humane Hepatozyten (PHH) werden häufig zur Untersuchung der Lebertoxizität verwendet. Diese Zellen können für kurze Zeit in Kultur gehalten werden, wobei ihre spezifischen Funktionen beibehalten werden. Außerdem ist die Anzahl der Zellen, die von einem einzelnen Spender verfügbar sind, begrenzt, außerdem können diese Zellen in der Kultur nicht vermehrt werden, daher bleibt der Mangel an Spender-PHH das Haupthindernis für Hepatotoxizitätsstudien. PSCs stellen eine Erneuerungsquelle für menschliches Gewebe dar und können für die Erzeugung von 3D-Leberkulturen verwendet werden11.
Leber-3D-Kultursysteme zeigen im Vergleich zu 2D mehrere Vorteile. Kürzere Differenzierungszeiten und genaue Nachahmung von In-vivo-Prozessen ermöglichen präzisere Studien zur arzneimittelinduzierten Toxizität, eine bessere Vorhersage der Leberhaftung und sind kostengünstiger23. Die Lebersphäroidkulturen könnten aufgrund ihrer autologen Eigenschaft ein großer Vorteil gegenüber primären humanen Hepatozyten (PHH) sein, um die mit ihrer Verwendung verbundenen Nachteile zu umgehen, und könnten zu einem Goldstandard für die Anwendung bei der Prüfung der Arzneimitteltoxizität werden und eine potenzielle zukünftige Anwendung in der regenerativen Medizin haben.
Wir haben hier gezeigt, dass BD-PSCs, die aus peripherem Steady-State-Blut erzeugt werden, erfolgreich in Endodermal-/Hepatozyten-Vorläuferzellen/reife Hepatozyten mit stetiger Albuminsekretion und phänotypischer Stabilität differenziert werden können, die Hepatozytenmarker exprimieren. Darüber hinaus zeigen die künstlich hergestellten 3D-Sphäroidkulturen der humanen Hepatozyten die potenzielle funktionelle Aktivität, indem sie die Enzyme exprimieren, die zu Cytochrom P450 gehören, wie CYP3A4 und CYP2E1.
Der wichtigste Schritt im Protokoll besteht darin, eine gute Qualität und Anzahl frischer menschlicher MNCs für den Reprogrammierungsprozess zu erhalten. Die Verwendung von eingefrorenen MNCs führt zu einer reduzierten Anzahl von umprogrammierten Zellen.
Wir haben menschliche Lebersphäroide unter Verwendung aktivierter PBMNC-Kulturen mit und ohne Anwendung einer immunmagnetischen Sortierung entwickelt, die reprogrammierte Zellen von reifen Blutzellen trennt. Der geringfügige Unterschied bei der Verwendung dieser beiden Methoden beruht auf der höheren Dichte der 3D-Struktur bei der Verwendung gereinigter reprogrammierter Zellen. Die Expression von Hepatozytenmarkern bleibt in beiden Zellkulturpräparaten konsistent.
Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von PHH stellt die Methode potenziell die biologisch relevanteste Alternative zu autologen frischen Hepatozyten dar, um die Leberfunktion in vitro zu untersuchen, wie z.B. xenobiotische Metabolismen und Lebertoxizität, Wirt-Pathogen-Intervention und Zellbiologie im Allgemeinen. Die Möglichkeit, BD-PSCs in der regenerativen Medizin zu verwenden, während sie autolog und nicht-teratogen sind, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen in unserem Labor.
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Disclosures
Die korrespondierende Autorin erklärt, dass sie Patentinhaberin im Zusammenhang mit dem neuartigen humanen GPI-verknüpften Protein ist. Sie ist Mitbegründerin und Mitarbeiterin der ACA CELL Biotech GmbH. Die anderen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Die Autoren sind besonders dankbar für die technische Unterstützung von Oksana und John Greenacre. Diese Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH, Heidelberg, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
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