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Bioengineering

लिवर रोग अध्ययन के लिए परिधीय रक्त से मानव यकृत स्फेरॉइड

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/64703
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1ACA CELL Biotech GmbH, 2Departamento Ciencias Biomédicas, Universidad Cardenal Herrera-CEU

Summary

यहां हम स्थिर-अवस्था परिधीय रक्त से पृथक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग करके मानव ऑटोलॉगस लिवर स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए एक गैर-आनुवंशिक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मानव यकृत कोशिकाएं एक त्रि-आयामी (3 डी) संरचना बना सकती हैं जो कुछ हफ्तों के लिए संस्कृति में बढ़ने में सक्षम हैं, उनकी कार्यात्मक क्षमता को संरक्षित करती हैं। कम या बिना चिपकने वाली विशेषताओं वाले संस्कृति व्यंजनों में क्लस्टर करने की उनकी प्रकृति के कारण, वे कई यकृत कोशिकाओं के समुच्चय बनाते हैं जिन्हें मानव यकृत स्फेरॉइड कहा जाता है। 3 डी लिवर स्फेरॉइड का गठन एक चिपकने वाला सब्सट्रेट की अनुपस्थिति में एकत्रित होने के लिए यकृत कोशिकाओं की प्राकृतिक प्रवृत्ति पर निर्भर करता है। इन 3 डी संरचनाओं में कोशिकाओं की तुलना में बेहतर शारीरिक प्रतिक्रियाएं होती हैं, जो विवो वातावरण के करीब होती हैं। शास्त्रीय दो-आयामी (2 डी) संस्कृतियों की तुलना में 3 डी हेपेटोसाइट संस्कृतियों का उपयोग करने से कई फायदे होते हैं, जिसमें अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक माइक्रोएन्वायरमेंट, वास्तु आकृति विज्ञान शामिल है जो प्राकृतिक अंगों को फिर से इकट्ठा करता है और साथ ही रोग की स्थिति और दवाओं के लिए विवो जैसी प्रतिक्रियाओं के बारे में बेहतर भविष्यवाणी करता है। स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए विभिन्न स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे प्राथमिक यकृत ऊतक या अमर सेल लाइनें। हेपेटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) का उपयोग करके 3 डी यकृत ऊतक को भी इंजीनियर किया जा सकता है। हमने मानव झिल्ली-बाध्य जीपीआई-लिंक्ड प्रोटीन के सक्रियण द्वारा और मानव हेपेटोसाइट्स में विभेदित करके अनियंत्रित परिधीय रक्त से उत्पन्न रक्त-व्युत्पन्न प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) का उपयोग करके मानव यकृत स्फेरॉइड प्राप्त किया है। बीडी-पीएससी-व्युत्पन्न मानव यकृत कोशिकाओं और मानव यकृत स्फेरॉइड का विश्लेषण मानव हेपेटोसाइट मार्करों का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफेनोटाइपिंग द्वारा किया गया था।

Introduction

हाल के वर्षों में तीन आयामी (3 डी) स्फेरॉइड संस्कृति प्रणाली कैंसर अनुसंधान, दवा की खोज और विष विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गई है। ऐसी संस्कृतियां बहुत रुचि पैदा करती हैं क्योंकि वे दो-आयामी (2 डी) सेल कल्चर मोनोलेयर और जटिल अंगों के बीच की खाईको पुल करती हैं।

चिपकने वाली सतह की अनुपस्थिति में, 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में, स्फेरॉइड का गठन इन कोशिकाओं के 3 डी रूप में क्लस्टर करने के लिए प्राकृतिक संबंध पर आधारित है। ये कोशिकाएं खुद को एक या अधिक प्रकार की परिपक्व कोशिकाओं से मिलकर समूहों में व्यवस्थित करती हैं। विदेशी सामग्रियों से मुक्त, ये कोशिकाएं अपने मूल माइक्रोएन्वायरमेंट की तरह एक दूसरे के साथ बातचीत करती हैं। 3 डी संस्कृति में कोशिकाएं बहुत करीब हैं और 2 डी संस्कृतियों की तुलना में उच्च बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन के साथ एक दूसरे के प्रति उचित अभिविन्यास है, और प्राकृतिक वातावरण 2 के करीब हैं।

मानव जीव विज्ञान और रोगों का अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल का उपयोग लंबे समय से किया गयाहै। इस संबंध में, मनुष्यों और जानवरों के बीच आंतरिक अंतर हैं, जो इन मॉडलों को पूरी तरह से अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं बनाता है। 3 डी कल्चर स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइडविवो में होने वाले विभिन्न सेल प्रकारों के बीच ऊतक जैसी वास्तुकला, बातचीत और क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और पशु मॉडल को कम करने या यहां तक कि प्रतिस्थापित करने में योगदान कर सकते हैं। वे यकृत रोगों के रोगजनन के साथ-साथ दवा स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म4 का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि रखते हैं।

3 डी स्फेरॉइड कल्चर कैंसर अनुसंधान के लिए विशेष महत्व का है क्योंकि यह 2 डी संस्कृतियों के लिए ट्यूमर सेल मोनोलेयर तैयार करने के लिए आवश्यक ट्रिप्सिनाइजेशन या कोलेजनेज उपचार की आवश्यकता को कम करके कोशिकाओं और उनके पर्यावरण के बीच अलगाव को खत्म कर सकता है। ट्यूमर स्फेरॉइड इस अध्ययन को सक्षम करते हैं कि सामान्य बनाम घातक कोशिकाएं अपने परिवेश से संकेतों को कैसे प्राप्त करती हैं और प्रतिक्रिया देती हैं5 और ट्यूमर जीव विज्ञान अध्ययन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं।

मोनोलेयर की तुलना में, विभिन्न सेल प्रकारों से युक्त 3 डी संस्कृतियां अपने संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों में ट्यूमर ऊतकों से मिलती-जुलती हैं और इसलिए मेटास्टेसिस और ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं। यही कारण है कि इस तरह के स्फेरॉइड मॉडलकैंसर अनुसंधान में तेजी लाने में योगदान दे रहे हैं।

स्फेरॉइड मानव ऑर्गेनोइड बनाने के लिए तकनीक विकसित करने में भी मदद कर रहे हैं क्योंकि ऊतक और अंग जीव विज्ञान अध्ययन करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण हैं, खासकर मनुष्यों में। स्टेम सेल संस्कृति में प्रगति 3 डी संस्कृतियों को विकसित करना संभव बनाती है जैसे स्टेम कोशिकाओं और ऊतक पूर्वजों के साथ-साथ एक अंग से विभिन्न प्रकार की परिपक्व (ऊतक) कोशिकाएं एक वास्तविक अंग की तरह कुछ कार्यात्मक विशेषताओं के साथ होती हैं जिनका उपयोग अंग विकास, रोगों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन उन्हें पुनर्योजी चिकित्सा में भी उपयोगी माना जा सकताहै।

प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स का उपयोग आमतौर पर मानव हेपेटोसाइट्स, यकृत समारोह और दवा-प्रेरित विषाक्तता के इन विट्रो जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। मानव हेपेटोसाइट्स की संस्कृतियों में दो मुख्य कमियां हैं, सबसे पहले, मानव हेपेटोसाइट्स जैसे प्राथमिक ऊतक की सीमित उपलब्धता, और दूसरा, हेपेटोसाइट्स की प्रवृत्ति 2 डी संस्कृति में तेजी से विभेदित होती है जिससे उनके विशिष्ट हेपेटोसाइट फ़ंक्शन 8 को खो दियाजाता है। 3 डी हेपेटिक संस्कृतियां इस संबंध में बेहतर हैं और हाल ही में विभेदित मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) 9 से बनाई गई हैं। बायोइंजीनियर्ड हेपेटिक 3 डी स्फेरॉइड यकृत के विकास, विषाक्तता, आनुवंशिक और संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए विशेष रुचि रखते हैं, साथ ही यकृत रोगों के उपचार के लिए दवा की खोज मेंभी 10. अंत में, उनके पास चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाने की क्षमता भी है, यह जानते हुए कि तीव्र यकृत रोगों की मृत्यु दर लगभग 80% है, जैव-कृत्रिम यकृत और / या हेपेटिक स्फेरॉइड संभावित रूप से आंशिक यकृत समारोह प्रदान करके इन रोगियों को बचा सकतेहैं जब तक कि एक उपयुक्त दाता नहीं मिल सकता है।

हमने रक्त-व्युत्पन्न प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (बीडी-पीएससी) का उपयोग करके मानव यकृत स्फेरॉइड की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है ताकि 4000 से 1 x 106 कोशिकाओं वाले अलग-अलग आकार के स्फेरॉइड तैयार किए जा सकें और प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से उनका विश्लेषण किया जा सके। हमने हेपेटोसाइट-विशिष्ट फ़ंक्शन की क्षमता का भी परीक्षण किया, साइटोक्रोम पी 450 3 ए 4 (सीवाईपी 3 ए 4) और 2 ई 1 (सीवाईपी 2 ई 1) एंजाइमों की अभिव्यक्ति का आकलन किया जो साइटोक्रोम पी 450 परिवार से संबंधित हैं जिनकी विषहरण की प्रक्रिया के माध्यम से सेलुलर और दवा चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिकाहै।

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Protocol

इन प्रयोगों को करने के लिए नैतिक अनुमोदन (एसीए सेल बायोटेक जीएमबीएच /25 बी-5482.2-64-1) प्राप्त किया गया था और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में रक्त निष्कर्षण से पहले सभी दाताओं द्वारा सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए गए थे।

1. मानव परिधीय रक्त (पीबी) से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (एमएनसी) की तैयारी

  1. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रशिक्षित चिकित्सा कर्मियों की मदद से स्वस्थ दाताओं से 30 एमएल रक्त निकालें।
  2. बेकर-कोजिक एट अल.13 द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार घनत्व ढाल मीडिया का उपयोग करके पीबीएमएनसी को अलग करें। पाइपिंग द्वारा, प्लाज्मा और घनत्व ढाल मीडिया के बीच इंटरफेज परत को अलग करें और पृथक कोशिकाओं को धोने के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करें।
  3. एक गिनती कक्ष का उपयोग करें और मानक विधियों का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।

2. मानव जीपीआई-लंगर वाले ग्लाइकोप्रोटीन के साथ सक्रियण पर बहुराष्ट्रीय कंपनियों का विघटन

  1. पीबीएस/1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) में 6 x 106 मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को पॉलीस्टाइनिन ट्यूब (15 एमएल) में रखें और बेकर-कोजिक एट अल.13 के अनुसार 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  2. कमरे के तापमान पर 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पीबीएस / बीएसए को इस्कोव के संशोधित डलबेको के माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक है।
  3. बेकर-कोजिक एट अल.13 में वर्णित 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 15 एमएल पॉलीस्टाइनिन ट्यूबों में कोशिकाओं को विकसित करें। दिन 5 (डी 5) पर, प्रत्येक 15 एमएल ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ पूरक इस्कोव के माध्यम के 1-2 एमएल जोड़ें।

3. नए उत्पन्न विभेदित कोशिकाओं की छंटाई

  1. सेंट्रीफ्यूज ने 300 x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन को सुसंस्कृत किया और बेकर-कोजिक एट अल.13 के अनुसार एक बाँझ पिपेट के साथ एस्पिरेटेड परिणामी सुपरनैटेंट।
  2. ठंडे पीबीएस बफर (पीबीएस पीएच 7.2, 0.5% बीएसए, और 2 एमएम ईडीटीए) के 90 μL में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त पुन: निलंबित गोली और 10 μL CD45 सकारात्मक नैनो-आकार के चुंबकीय मोती जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  3. सेल सस्पेंशन को 2 एमएल पीबीएस बफर के साथ धोएं, इसे कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और कोशिकाओं में 500 μL पीबीएस बफर जोड़ें और अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें।
  4. पिपेट 500 μL प्री-कूल्ड पीबीएस बफर को स्तंभ में धोने और चुंबकीय स्टैंड का उपयोग करके चुंबकीय क्षेत्र में रखने के लिए।
  5. कॉलम पर रखी गई कोशिकाओं को धोएं, पीबीएस बफर के 500 μL के साथ दो बार और इसकोव के माध्यम में सीडी 45 नकारात्मक कोशिकाओं वाले प्रवाह-थ्रू को 10% एफबीएस के साथ पूरक करें।
  6. पुन: प्रोग्राम किए गए कक्षों की संख्या निर्धारित करने के लिए एक गिनती कक्ष का उपयोग करें।

4. मानव हेपेटोसाइट्स की पीढ़ी के लिए ग्लास कवरलिप की तैयारी

  1. अलग ग्लास कवरलिप्स (14 मिमी) और उन्हें 10 मिनट के लिए नॉनियोनिक डिटर्जेंट में इनक्यूबेट करें। कांच कवरलिप्स को विआयनीकृत पानी में धोएं जब तक कि कोई बुलबुला न रह जाए और उन्हें 30 मिनट के लिए 1 एम एचसीएल में इनक्यूबेट करें (मार्चेंको एट अल.14 से अनुकूलित)।
  2. ग्लास कवरलिप्स को कम से कम 3 गुना विआयनीकृत पानी से धोएं और उन्हें कमरे के तापमान पर रात भर सुखाएं। एक उपयुक्त कंटेनर में आटोक्लेव सूखे ग्लास कवरलिप्स।

5. बीडी-पीएससी के 2 डी हेपेटिक भेदभाव के लिए बायोलामिनिन के साथ कोटिंग सेल कल्चर प्लेट्स

  1. 4 अच्छी प्लेटों में चिमटी की बाँझ जोड़ी के साथ आटोक्लेव ग्लास कवरलिप रखें और बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए यूवी लाइट चालू करें।
  2. बायोलेमिनिन के एलिकोट को पिघलाएं और प्रत्येक ग्लास कवर स्लिप में 5 μg / mL बायोलामिनिन के 120 μL जोड़ें। लेपित ग्लास कवरलिप्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  3. बायोलामिनिन की अधिकता को हटा दें और नीचे वर्णित हेपेटोसाइट भेदभाव माध्यम के 200 μL जोड़ें।

6. हेपेटोसाइट भेदभाव मीडिया की तैयारी

  1. 500 एमएल हेपेटोब्लास्ट नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (केएसआर)/डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) माध्यम बनाएं जिसमें 76.4% नॉकआउट डीएमईएम (केओ-डीएमईएम), 20% केएसआर, 0.5% एल-ग्लूटामाइन, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 0.1% β-मर्काप्टोथेनॉल, 1% डीएमएसओ, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप) शामिल हैं।
  2. 500 एमएल हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम तैयार करें जिसमें 1% एल-ग्लूटामाइन, 10 μM हाइड्रोकार्टिसोन 21-हेमिसुकिनेट सोडियम नमक (एचसीसी), और 1% पेन / स्ट्रेप शामिल हैं।
  3. स्टॉक से एलिकोट माध्यम और प्रत्येक मध्यम परिवर्तन के लिए 10 एनजी / एमएल और / या 20 एनजी / एमएल की अंतिम सांद्रता पर ताजा हेपेटोसाइट विकास कारक (एचजीएफ) और ऑनकोस्टेटिन एम (ओएसएम) जोड़ें।
    नोट: ऑनकोस्टेटिन एम साइटोकिन्स के इंटरल्यूकिन 6 समूह से संबंधित एक साइटोकिन है, जो हेमटोपोइजिस के साथ-साथ यकृत के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

7. बीडी-पीएससी से विभेदित यकृत कोशिकाओं की खेती

  1. बायोलेमिनिन के साथ लेपित 4-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 3 x 105 बीडी-पीएससीएस कोशिकाओं को डालें।
  2. इनक्यूबेटर में 4-वेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें। डीएमएसओ हेपेटोब्लास्ट माध्यम में 5 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें जो एंडोडर्मल भेदभाव का समर्थन करता है और हर दूसरे दिन माध्यम को बदलता है।
  3. दिन 5 पर हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम पर स्विच करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में अतिरिक्त 7-10 दिनों के लिए कोशिकाओंको कल्चर करें। हर 48 घंटे में माध्यम बदलें।

8.3D स्फेरॉइड हेपेटिक भेदभाव

  1. गिनती कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  2. सेंट्रीफ्यूज बीडी-डिफरेंटेड सेल सस्पेंशन कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर। 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर केएसआर / डीएमएसओ माध्यम में सतह पर तैरने वाले और पुन: निलंबित बीडी-विभेदित कोशिकाओं को हटा दें।
  3. एकल-सेल निलंबन सुनिश्चित करने और किसी भी अतिरिक्त मलबे को हटाने के लिए कोशिकाओं को 40 μm सेल छन्नी के माध्यम से पास करें।
  4. एक गिनती कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और प्रति अच्छी तरह से आवश्यक मात्रा को वितरित करने के लिए प्रत्येक सेल सीडिंग घनत्व के लिए पर्याप्त मात्रा तैयार करें। 4000 कोशिकाओं के कम सीडिंग घनत्व के लिए 1 x 106 कोशिकाओं के शीर्ष सीडिंग के साथ एक ढाल तैयार करें।
  5. डीएमएसओ माध्यम के 100 μL को 96 अच्छी तरह से कम अटैचमेंट प्लेटों में वितरित करें और सेल सीडिंग कमजोर पड़ने के 100 μL जोड़ें।
  6. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर कम अटैचमेंट प्लेट रखें और उन्हें 5 दिनों के लिए कल्चर करें।
  7. बीज बोने के बाद 3-4 दिनों से माध्यम का 50% बदलें जब स्फेरॉइड पर्याप्त रूप से कॉम्पैक्ट होते हैं।
  8. दिन 5 पर, माध्यम को हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम में बदलें और आगे की परिपक्वता के लिए अतिरिक्त 7-10 दिनों के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें। हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।

9. नए उत्पन्न 2 डी यकृत कोशिका संस्कृतियों का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण

  1. 4, 8, 15 और 24 दिनों के लिए ऊपर वर्णित भेदभाव विधि के अनुसार कोशिकाओं को कल्चर करें और मीडिया को हटा दें।
  2. 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड से युक्त प्री-वार्मेड फिक्सेटिव के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिक्सेटिव को छोड़ दें और कोशिकाओं को 2x को पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए धो लें। तुरंत 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान जोड़ें और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्थिर करें। पीबीएस के साथ 2x धो लें।
  3. पीबीएस और 5% बीएसए से बने ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए रॉकर प्लेट पर रखें।
  4. कमजोर पड़ने में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें 1% बीएसए / पीबीएस निम्नानुसार है: एल्ब्यूमिन (एएलबी) 1: 50, अल्फा -1 फेटोप्रोटीन (एएफपी) 1: 250, साइटोकेराटिन 18 (सीके 18) 1: 50, हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ 4) 1: 1000 और ट्रांसथायरेटिन (टीटीआर) 1: 50। प्रति अच्छी तरह से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 μL का उपयोग करें।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। फिर एंटीबॉडी समाधान को छोड़ दें, कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए धोएं, और वॉश स्टेप 3 एक्स दोहराएं।
  6. कमजोर पड़ने वाले बफर में निम्नलिखित द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें: खरगोश विरोधी चिकन आईजीजी (टेक्सास लाल) 1: 1000, बकरी विरोधी माउस आईजीजी (488) 1: 1000, और बकरी विरोधी खरगोश (488) 1: 500। प्रति अच्छी तरह से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 μL का उपयोग करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  7. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए DAPI युक्त बढ़ते मीडिया के साथ कवरलिप्स को माउंट करें।

10. नवगठित यकृत स्फेरॉइड का जीवित धुंधलापन

  1. स्फेरॉइड को न छूते हुए कल्चर मीडिया को सावधानीपूर्वक छोड़ दें, 0.1% ट्राइटन एक्स -100 समाधान के साथ ताजा बने पीबीएस जोड़ें, और कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. 5 मिनट के लिए धीरे-धीरे पाइप करके माध्यम के साथ स्फेरॉइड को धोएं, 2x दोहराएं।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी एएलबी (1:50), एएफपी (1:250), सीके18 (1:50), सीवाईपी2ई1 (1:200), और सीवाईपी3ए4 (1:200) के साथ तैयार स्फेरॉइड को पीबीएस में तैयार किया जाता है, जिसमें 1% बीएसए के साथ 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए होता है। प्रति अच्छी तरह से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 μL का उपयोग करें।
  4. सावधानी से अतिरिक्त एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और स्फेरॉइड को मध्यम 3x से धो लें।
  5. 1% बीएसए में पीबीएस में बकरी विरोधी खरगोश (488) के लिए 1: 1000 और 1: 500 के कमजोर पड़ने पर बकरी एंटी-माउस आईजीजी (Cy3), बकरी एंटी-माउस आईजीजी (488), और खरगोश एंटी-चिकन आईजीजी (टेक्सास रेड) संबंधित द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें। प्रति कुएं 50 μL एंटीबॉडी कमजोर पड़ने का उपयोग करें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सावधानी से 3x को मध्यम से धोएं और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी करने से पहले प्लेट को इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर छोड़ दें।

11. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्फेरॉइड की परीक्षा

  1. उपयोग से 10 मिनट पहले फ्लोरेसेंस प्रकाश स्रोत पर स्विच करें, कंप्यूटर चालू करें और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. 4x आवर्धन के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करें, सही स्केल बार का चयन करने के लिए टूलबार में बटन 4x पर क्लिक करें, फिर स्टेज सेंटर प्लेट पर 96-वेल प्लेट रखें।
  3. एलईडी प्रकाश स्रोत को चालू करें, ब्राइटफील्ड फ़िल्टर का उपयोग करें, और एक्स-वाई-अक्ष चरण समायोजन नॉब का उपयोग करके प्लेट को अच्छी तरह से रखें।
  4. कैमरा लाइट पथ में बदलें, स्क्रीन पर छवि की कल्पना करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में लाइव बटन पर क्लिक करें, और सुनिश्चित करें कि स्फेरॉइड एक्स-वाई-एक्सिस नॉब्स का उपयोग करके केंद्रित है और मोटे / ठीक फोकस नॉब का उपयोग करके फोकस कर रहा है।
    नोट: लाइव स्टेनिंग लगाने के बाद स्फेरॉइड का आकार स्थिर रहता है।
  5. टूलबार में ब्राइटफील्ड अवलोकन विधि चुनें, एक्सपोज़र सेटिंग्स को स्वचालित रूप से रखें, और तस्वीर लेने के लिए कैमरा नियंत्रण कक्ष में स्नैपशॉट बटन पर क्लिक करें। फिर रुचि के फ़ोल्डर में उपयुक्त नाम का उपयोग करके चित्र को .vsi फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  6. एलईडी लाइट को बंद करने के लिए परिवेश प्रकाश परिरक्षण प्लेट रखें, बी-उत्तेजना के लिए फ़िल्टर में परिवर्तन करें, टूलबार में 488 अवलोकन विधि चुनें, शटर खोलें, बटन स्नैपशॉट पर क्लिक करके एक तस्वीर लें, शटर बंद करें, फिर ऊपर वर्णित फ़ाइल सहेजें।
  7. उपयुक्त अवलोकन विधि (टेक्सास लाल या सीवाई 3) का उपयोग करके जी-उत्तेजना के लिए एक फिल्टर के साथ इसे दोहराएं। फिर ब्याज के प्रत्येक कुएं के लिए पूरी प्रक्रिया को दोहराएं।
  8. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस करें और इसे ऊपर वर्णित के रूप में कल्चर करें।

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Representative Results

हमने दो-चरणीय प्रोटोकॉल लागू करके मानव बीडी-पीएससी को एंडोडर्म / यकृत पूर्वज कोशिकाओं और हेपेटोसाइट्स में सफलतापूर्वक विभेदित किया। यकृत विभेदन प्रक्रिया के दौरान रूपात्मक परिवर्तन चित्रा 1 में दिखाए गए हैं। बीडी-पीएससी तीन अलग-अलग चरणों से गुजरने वाले हेपेटोसाइट्स में अंतर करते हैं। पहला चरण एंडोडर्मल कोशिकाओं एल 4 में भेदभाव का प्रतिनिधित्व करता है, दूसरा, यकृत पूर्वज कोशिकाओं (हेपेटोब्लास्ट) एल 8 में भेदभाव, एक विशिष्ट बहुभुज आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करता है, और तीसरा, हेपेटोसाइट्स एल 15-एल 24 की परिपक्वता।

चित्रा 2 में प्रस्तुत बीडी-पीएससी के यकृत भेदभाव की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण किया गया था। मानव यकृत पूर्वज मार्कर की मजबूत अभिव्यक्ति, जैसे अल्फा-फेटोप्रोटीन (एएफपी), भ्रूण सीरम में एक प्रमुख प्लाज्मा प्रोटीन जिसकी एकाग्रता वयस्क जीवों में बहुत कम है और इसलिए हेपेटोसाइट्स के अग्रदूत15 और ट्रांसथायरेटिन (टीटीआर) के लिए एक मार्कर के रूप में माना जाता है, जो एक प्रमुख थायरॉयड-हार्मोन बाइंडिंग प्रोटीन है जो रक्तप्रवाह से मस्तिष्क तक थायरोक्सिन को परिवहन में शामिल है। एल 4 से एल 8 पर यकृत भेदभाव प्रक्रिया के पहले चरण में कोशिकाओं में पाए जाते हैं। हालांकि, एल 15 में उनकी अभिव्यक्ति कम हो जाती है, जबकि एल्ब्यूमिन (एएलबी) की अभिव्यक्ति, मुख्य रूप से यकृत द्वारा उत्पादित सबसे प्रचुर मात्रा में प्लाज्मा प्रोटीन और यकृत भेदभाव के लिए पूरी तरह से महत्वपूर्ण है, साथ ही हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4 अल्फा (एचएनएफ -4), एक हेपेटोसाइट्स प्रतिलेखन कारक जो यकृत-विशिष्ट जीन17 की अभिव्यक्ति में शामिल है  सबसे पहले एल 4 पर दिखाई देता है, परिपक्वता समय एल 15-एल 24 के दौरान एक मजबूत और स्थिर अभिव्यक्ति तक पहुंचने वाले भेदभाव समय एल 4-एल 15 में बढ़ता है।

साइटोकेराटिन 18 (सीके 18) एक साइटोस्केलेटल प्रोटीन है, जो यकृत18 में व्यक्त मध्यवर्ती फिलामेंट के प्रमुख घटकों में से एक है। परिणाम बताते हैं कि, जैसा कि अपेक्षित था, सीके 18 अभिव्यक्ति परिपक्व हेपेटोसाइट्स (एल 15-एल 24) के साथ संबंधित है, और यह हेपेटोसाइट पूर्वज कोशिकाओं में व्यक्त नहीं किया जाता है।

2 डी संस्कृतियों में हेपेटोसाइट भेदभाव के लिए अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटोकॉल बीडी-पीएससी से शुरू होने वाली यकृत 3 डी संस्कृतियों की इंजीनियरिंग को सक्षम बनाता है।

हम यहां प्रदर्शित करते हैं कि हेपेटोसाइट प्रेरण / परिपक्वता माध्यम युक्त कम अनुलग्नक प्लेटों में इन कोशिकाओं का सहज एकत्रीकरण स्फेरॉइड गठन शुरू करता है। विकास ट्रैक के बाद एल 2, एल 4 और एल 7 पर इमेजिंग कोशिकाएं थीं। (चित्र 3A) स्फेरॉइड वॉल्यूम और कोशिकाओं की चर संख्या के बीच एक सुसंगत सहसंबंध है, जैसा कि चित्रा 3 बी में प्रस्तुत किया गया है।

यकृत एक अंग है जिसमें मानव शरीर की अधिकांश दवाएं चयापचय हो जाती हैं। साइटोक्रोम पी 450 एंजाइमों (मोनोऑक्सीजिनेस) का एक सुपरफैमिली है जो दवा और सेलुलर चयापचय, ज़ेनोबायोटिक्स के विषहरण और होमियोस्टैसिस की प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण महत्व के हैं। बीडी-पीएससी व्युत्पन्न हेपेटिक स्फेरॉइड की संभावित कार्यात्मक गतिविधि का आकलन करने के लिए, हमने सीवाईपी 3 ए 4 और सीवाईपी 2 ई 1, सीवाईपी 3 और सीवाईपी 2 परिवारों19 जैसे दवा-चयापचय एंजाइमों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया।

कोडीन, साइक्लोस्पोरिन ए, एरिथ्रोमाइसिन, एसिटामिनोफेन और डायजेपाम के साथ-साथ कई स्टेरॉयड और कार्सिनोजेन्स सहित आज उपयोग की जाने वाली अधिकांश दवाएं सीवाई 3 ए 4 एंजाइम20 की गतिविधि के कारण चयापचय की जाती हैं। CYP2E1 एथिलीन ग्लाइकोल, बेंजीन, कार्बन टेट्राक्लोराइड जैसे अंतर्जात सब्सट्रेट्स के चयापचय में शामिल है, और विशेष रूप से नाइट्रोसामाइन21 जैसे सबसे महत्वपूर्ण अत्यधिक म्यूटाजेनिक यौगिक।

डी 14 में प्रोटोकॉल के अनुसार बनने और विभेदित स्फेरॉइड, इन दो एंजाइमों के एंटीबॉडी के साथ जीवित रहते हैं, बीडी-पीएससी व्युत्पन्न स्फेरॉइड की संभावित यकृत कार्यात्मक गतिविधि को प्रकट करते हैं (चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: हेपेटिक जैसी कोशिकाओं के लिए बीडी-पीएससी का भेदभाव। बीडी-पीएससी के यकृत विभेदन में रूपात्मक परिवर्तनों के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ एंडोडर्मल एल 4, या बहुभुज आकार एल 8 आकृति विज्ञान दिखाते हैं जो अंततः एल 15 से एल 24 पर परिपक्वता की स्थिति तक पहुंचते हैं। स्केल पट्टियाँ: ऊपरी पंक्ति 50 μm, निचली पंक्ति 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हेपेटिक कोशिकाओं की ओर बीडी-पीएससी पुन: भेदभाव का इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण। हेपेटोसाइट्स पूर्वज और हेपेटोसाइट्स विशिष्ट मार्कर 2 डी संस्कृतियों में बीडी-पीएससी के यकृत भेदभाव के दौरान व्यक्त किए जाते हैं। एल 4 से एल 8 के दिनों में, माइक्रोग्राफ एंडोडर्म / हेपेटिक पूर्वज एएफपी और टीटीआर की अभिव्यक्ति में कमी दिखाते हैं, जबकि उनकी अभिव्यक्ति एल 8-एल 24 से गायब हो गई। हेपेटोसाइट्स एएलबी और एचएनएफ मार्करों की अभिव्यक्ति एल 4 पर उत्पन्न होती है और परिपक्वता के दौरान बढ़ती है, जबकि सीके 18 की अभिव्यक्ति एल 15 पर पहले दिखाई दी, जो एल 24 पर अधिकतम तक पहुंच गई। ग्राफ़ L4-L15 के लिए स्केल सलाखों: 50 μm और L24: 20 μm के लिए। नियंत्रण अनुपूरक चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: बीडी-पीएससी के यकृत विभेदन पर 3डी स्फेरॉइड का गठन( ए) 1 x 106 से 4000 कोशिकाओं से शुरू होने वाले बीडी-पीएससी की परिवर्तनीय सेल संख्याओं को कम अटैचमेंट प्लेटों में बीज दिया गया था, और प्रोटोकॉल में बताए गए दो-चरण प्रक्रिया के अनुसार भेदभाव किया गया था। 3 डी मानव यकृत स्फेरॉइड की पीढ़ी को अलग-अलग समय बिंदुओं पर चित्रित किया गया था, संस्कृति समय अवधि के दौरान प्रत्येक समय प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट छवियां दिखाई गई हैं। स्केल बार: 200 μm. (B) प्रत्येक आकार के लिए कम से कम 4 हेपेटिक स्फेरॉइड के व्यास को माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके L4 पर मापा गया था और वॉल्यूम की गणना की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन दिखाती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हेपेटोसाइट कार्यात्मक मार्कर बीडी-पीएससी-व्युत्पन्न यकृत स्फेरॉइड में व्यक्त किए जाते हैं। बीडी-पीएससी को हेपेटोसाइट्स में विभेदित किया गया था। साइटोक्रोम पी 450 परिवार के सदस्यों एएलबी, एएफपी, सीके 18, और सीवाईपी 2 ई 1 और सीवाईपी 3 ए 4 के एंटीबॉडी का उपयोग करके एल 14 में जीवित कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण किया गया था। स्केल पट्टी: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: बीडी-पीएससी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए नकारात्मक नियंत्रण यकृत कोशिकाओं के प्रति पुन: भेदभाव। हेपेटोसाइट्स पूर्वज और हेपेटोसाइट्स विशिष्ट मार्कर 2 डी संस्कृतियों में बीडी-पीएससी के यकृत भेदभाव के दौरान व्यक्त किए जाते हैं। स्केल पट्टी: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यकृत मानव शरीर में कई आवश्यक जैविक कार्यों के साथ एक प्रमुख अंग है, जैसे मेटाबोलाइट्स का विषहरण। सिरोसिस और / या वायरल हेपेटाइटिस जैसी गंभीर जिगर विफलताओं के कारण, दुनिया भर में प्रति वर्ष लगभग 2 मिलियन मौतें होती हैं। यकृत प्रत्यारोपण दुनिया भर में ठोस अंग प्रत्यारोपण में दूसरे स्थान पर है, लेकिन वर्तमान आवश्यकता का केवल 10% पूराकिया जाता है।

प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स (पीएचएच) का उपयोग अक्सर यकृत विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इन कोशिकाओं को उनके विशिष्ट कार्यों को बनाए रखते हुए थोड़े समय के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इसके अलावा, एक एकल दाता से उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या सीमित है, इसके अलावा, इन कोशिकाओं को संस्कृति में विस्तारित नहीं किया जा सकता है, इसलिए, दाता पीएचएच की कमी हेपेटोटॉक्सिसिटी अध्ययन के लिए मुख्य बाधा बनी हुई है। पीएससी मानव ऊतकों के नवीकरण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं और 3 डी यकृत संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै।

2 डी की तुलना में लिवर 3 डी संस्कृति प्रणाली कई फायदे दिखाती है। विवो प्रक्रियाओं में कम विभेदन समय और सटीक नकल दवा-प्रेरित विषाक्तता पर अधिक सटीक अध्ययन, यकृत देयता की बेहतर भविष्यवाणी, और अधिकलागत प्रभावी हैं। उनकी ऑटोलॉगस विशेषता के कारण यकृत स्फेरॉइड संस्कृतियां प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स (पीएचएच) पर उनके उपयोग से संबंधित नुकसान को दरकिनार करने पर एक बड़ा लाभ हो सकती हैं और दवा विषाक्तता के परीक्षण में आवेदन के लिए एक स्वर्ण मानक बन सकती हैं और पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित भविष्य का अनुप्रयोग है।

हमने यहां प्रदर्शित किया है कि स्थिर-राज्य परिधीय रक्त से उत्पन्न बीडी-पीएससी को स्थिर एल्बुमिन स्राव और हेपेटोसाइट मार्करों को व्यक्त करने वाले फेनोटाइपिक स्थिरता के साथ एंडोडर्मल / हेपेटोसाइट पूर्वजों / परिपक्व हेपेटोसाइट्स में सफलतापूर्वक विभेदित किया जा सकता है। इसके अलावा, इंजीनियर 3 डी मानव हेपेटोसाइट स्फेरॉइड संस्कृतियां सीवाईपी 3 ए 4 और सीवाईपी 2 ई 1 जैसे साइटोक्रोम पी 450 से संबंधित एंजाइमों को व्यक्त करके संभावित कार्यात्मक गतिविधि का प्रदर्शन करती हैं।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम रीप्रोग्रामिंग प्रक्रिया के लिए अच्छी गुणवत्ता और ताजा मानव बहुराष्ट्रीय कंपनियों की संख्या प्राप्त करना है। जमे हुए बहुराष्ट्रीय कंपनियों के उपयोग के परिणामस्वरूप पुन: प्रोग्राम किए गए कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है।

हमने इम्यूनोमैग्नेटिक सॉर्टिंग लागू करने के साथ और बिना सक्रिय पीबीएमएनसी संस्कृतियों का उपयोग करके मानव यकृत स्फेरॉइड को इंजीनियर किया है जो परिपक्व रक्त कोशिकाओं से पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं को अलग करता है। इन दो विधियों का उपयोग करने में मामूली अंतर शुद्ध पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं का उपयोग करते समय 3 डी संरचना के उच्च घनत्व पर निर्भर करता है। हेपेटोसाइट मार्करों की अभिव्यक्ति दोनों सेल संस्कृति तैयारी में सुसंगत रहती है।

पीएचएच की सीमित उपलब्धता के कारण, विधि संभावित रूप से विट्रो में यकृत समारोह का अध्ययन करने के लिए ऑटोलॉगस ताजा हेपेटोसाइट्स के जैविक रूप से प्रासंगिक निकटतम विकल्प का प्रतिनिधित्व करती है, जैसे कि ज़ेनोबायोटिक चयापचय और यकृत विषाक्तता, मेजबान-रोगज़नक़ हस्तक्षेप, और सामान्य रूप से सेल जीव विज्ञान। ऑटोलॉगस और गैर-टेराटोजेनिक होने के दौरान पुनर्योजी चिकित्सा में बीडी-पीएससी का उपयोग करने की संभावना हमारी प्रयोगशाला में आगे के अध्ययन का विषय है।

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Disclosures

संबंधित लेखक ने घोषणा की कि वह नोवेल ह्यूमन जीपीआई-लिंक्ड प्रोटीन से संबंधित पेटेंट धारक है। उन्होंने एसीए सेल बायोटेक जीएमबीएच के साथ सह-स्थापना और काम किया। अन्य लेखकों ने घोषणा की कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक ओक्साना और जॉन ग्रीनक्रे द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता के लिए विशेष रूप से आभारी हैं। इस काम को एसीए सेल बायोटेक जीएमबीएच हीडलबर्ग, जर्मनी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin antibody Sigma-Aldrich SAB3500217 produced in chicken
Albumin Fraction V Carl Roth GmbH+Co. KG T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein Proteintech Germany GmbH 14550-1-AP rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN BioLamina  LN111-02 human recombinant
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell Strainer pluriSelect 43-10040-40
CellSens  Olympus imaging software
Centrifuge tubes 50 mL  Greiner Bio-One 210270
CEROplate 96 well OLS OMNI Life Science 2800-109-96
CKX53  Olympus
Commercially available detergent Procter & Gamble nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody Proteintech Germany GmbH 19937-1-AP rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4  Proteintech Germany GmbH 67110-1-lg mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18 DakoCytomation M7010 mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML
DPBS Thermo Fisher Scientific 14040091
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm R. Langenbrinck 01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco Thermo Fisher Scientific 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde 25% Sigma-Aldrich G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3 Antibodies online ABIN1673767 polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488 Antibodies online ABIN1889284 polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A-11008
HCl Sigma-Aldrich 30721-1LGL
HepatoZYME-SFM  Thermo Fisher Scientific 17705021 hepatocyte maturation medium
HGF Thermo Fisher Scientific PHG0324 human recombinant
HNF4α antibody Sigma-Aldrich ZRB1457-25UL clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) Biomol Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco Fisher Scientific A3181501 KSR
KnockOut DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12660012 Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303 magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco Thermo Fisher Scientific 11140035
Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 50mM
MiniMACS columns Miltenyi 130-042-201
Nunclon Multidishes Sigma-Aldrich D6789 4 well plates
Oncostatin M Thermo Fisher Scientific PHC5015 human recombinant
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS sterile Carl Roth GmbH+Co. KG 9143.2
Penicillin/Streptomycin Biochrom GmbH A2213 10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile Greiner Bio-One 188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red Antibodies online ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM Carl Roth GmbH+Co. KG 9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI Carl Roth GmbH+Co. KG HP20.1
Roti Sep 1077 human Carl Roth GmbH+Co. KG 0642.2
Transthyretin antibody  Sigma-Aldrich SAB3500378 produced in chicken
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific HFH10 1%

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References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 191
लिवर रोग अध्ययन के लिए परिधीय रक्त से मानव यकृत स्फेरॉइड
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Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V., Becker-Kojić, Z. A. Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies. J. Vis. Exp. (191), e64703, doi:10.3791/64703 (2023).

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