膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。
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方法論記事
近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量
この記事について
サマリー
要約
膜接触部位(MCS)は、膜融合を伴うことなく、並置された細胞小器官間の多様な生体分子(すなわち、カルシウムおよび脂質)の動的交換を可能にし、調節する、膜が近接する領域である。MCSは細胞の恒常性維持に不可欠であり、その機能は多量体タンパク質複合体として存在することが多い常在成分によって保証されています。MCSは、脂質合成と細胞カルシウム貯蔵の主要な部位である小胞体(ER)に関与することが多く、古典的な小胞体輸送経路から除外されているミトコンドリアなどの細胞小器官にとって特に重要です。ここ数年、ERとミトコンドリアの間のMCSは、その機能が細胞の代謝/生体エネルギーに強く影響するため、広く研究されてきました。これらの接触部位では、膜テザー、カルシウムチャネル、脂質移動タンパク質など、いくつかのタンパク質が同定され始めており、これらのMCS成分を研究するための新しい方法論と技術的アプローチの必要性が高まっています。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、ミトコンドリア染色、3Dイメージングセグメンテーションなど、互いに物理的に近く(>40 nm)、ER-ミトコンドリアMCSの同じ膜上に存在するタンパク質の検出を可能にする、組み合わせた技術的アプローチで構成されるプロトコルについて説明します。例えば、ERミトコンドリアと小胞体原形質膜MCSで相互作用し、局在することが以前に示されている2つのERアンカー脂質伝達タンパク質、ORP5とORP8を使用しました。ORP5-ORP8 PLAを細胞イメージングソフトウェア解析と関連付けることにより、ORP5-ORP8複合体のミトコンドリア表面からの距離を推定し、ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がミトコンドリアに近接する小胞体サブドメインで発生していると判断することができました。
概要
オルガネラ間コミュニケーションは真核細胞の決定的な特徴です。オルガネラが通信する1つの方法は、テザー、脂質移動タンパク質、カルシウムチャネルなどの構造的および機能的タンパク質によって維持される2つのオルガネラ間の密接な膜対抗である膜接触部位(MCS)を形成することです1。MCSは、類似または異なる細胞小器官間で確立することができ、それらは細胞の恒常性を維持するために重要な細胞成分の交換を媒介する。現在までに、小胞体(ER)-ミトコンドリア、小胞体-原形質膜(PM)、および小胞体-脂肪滴(LD)接触を含むいくつかのMCSが同定されています1。その中で、ERとミトコンドリアの間に形成されるもの(MERCS)は、脂質やカルシウムの恒常性を含むいくつかの細胞機能の調節に関与しているため、最も研究されています2。ミトコンドリアは古典的な小胞輸送経路からほとんど除外されているため、ERから主要な脂質または脂質前駆体を輸入するために、MERCSとその分子成分に依存しています。MERCSを介したこれらの脂質の非小胞輸送は、適切なミトコンドリア脂質組成の維持、ならびにそれらの機能的および構造的完全性を保証します3。
さまざまな細胞機能へのMCSの重要な関与を考えると、それらの分子成分のより深い理解を提供す....
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プロトコル
1.ミトコンドリア染色および近接ライゲーションアッセイ(PLA)
- プレート 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa細胞を、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を5%CO2を含む37°Cで添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持し、手順当日に75%〜90%の細胞コンフルエントを可能にする希釈で、1.5ウェルプレート中の1.5mmガラスカバーガラスに入れます。
注:HeLa細胞は、ミトコンドリア染色およびPLAの前に、siRNA処理および/またはDNAプラスミドトランスフェクションなどの追加の処理に提出することができます。 - ミトコンドリア染色
- 細胞を37°Cで予め温めた無血清培地で一度洗浄する。 細胞を予め温めた無血清培地で、5%CO2で37°Cで10分間インキュベートします。
- あらかじめ温めた無血清培地で1 μMの赤色ミトコンドリアマーカーを調製します。
- 細胞を500 μLのミトコンドリアマーカー溶液とともに、5%CO2を含む37°Cで30分間インキュベートします。ミトコンドリアマーカー治療およびプロトコルの次のステップの間、カバーガラス上の細胞を可能な限り光から保護してください。
- インキュベーション後、予め....
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結果
上記のプロトコルを用いて、2つのERアンカー脂質転移タンパク質であるORP5とORP8の相互作用部位を検出し、他の細胞小器官、特にミトコンドリアと接触している小胞体膜サブドメインでの発生を評価しました。そのために、HeLa細胞のミトコンドリアネットワークを赤色のミトコンドリアマーカーで染色し、免疫蛍光法で特異性を試験した一次抗体抗ORP5および抗ORP8を用いて固定した後、ORP5-ORP8 PLAグリーンスポットを検出した15。共焦点画像は、HeLa細胞における内因性ORP5-ORP8 PLA相互作用が、網状ER、皮質ER、および一般にミトコンドリア関連小胞体膜(MAM;図2A)。MAMsで生じるORP5-ORP8 PLA相互作用を定量化するために、ミトコンドリアからの各PLAスポットの距離を3D画像解析を用いて評価した。380 nmの距離閾値を使用して、3Dイメージング分析により、内因性ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がMAMで検出されたことが明らかになりました(図2A
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ディスカッション
このプロトコルは、MCS、特にMERCSにおけるオルガネラ間タンパク質PLA相互作用を同定および定量するために設計されました。このプロトコルの目新しさは、PLAと複数の細胞小器官の標識、共焦点顕微鏡、および3D画像分析を組み合わせて、同じ膜(この場合はミトコンドリア膜(MAM)またはMAMとLDに近接するER膜内)に存在する2つのタンパク質間のPLA相互作用を局在化および定量化することです。このプロトコルは、特定のMERCSだけでなく他のMCSでも局在する可能性のあるタンパク質を検証するためのツールとして使用できます。
2006年の開発以来、ERとミトコンドリアタンパク質の間のPLAは、MERCSの定量に広く使用されています7、9、10、11。ただし、細胞内のMERCS存在量の指標としてのPLAの使用は、高分解能アプローチによっ.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD)、ATIP-Avenir Program、Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548)、Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527)、I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope、ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/サクレー植物科学)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1X ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| 塩化アンモニウム (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma | A7906 | |
| 円形ガラスカバースリップ 13mm no. 1.5 | 寒天培 | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | 赤色ミトコンドリアマーカー |
| 共焦点倒立顕微鏡 SP8-X | ライカ | DMI 6000 | |
| コーニング Costar TC処理 24ウェルプレート | メルク | CLS3526 | |
| Duolink In Situ 検出試薬 グリーン | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ 封入剤 DAPI付き | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA プローブ アンチマウス MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA プローブ 抗ウサギ PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ 洗浄バッファー、蛍光 | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | 無血清培地 |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | 細胞イメージングソフトウェア |
| インキュベーター UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| 顕微鏡スライド StarFrost (3" x 1") | Knittel Glass | ||
| マウス抗ORP8 | サンタクルス | 134409 | |
| パラホルムアルデヒド(PFA) | Sigma | P6148 | |
| ウサギ抗ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| 超高純度蒸留水、DNase/RNase フリー | Invitrogen | 10977-035 |
参考文献
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Bi....
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