Summary
Behovet av nya metoder för att studera membrankontaktställen (MCS) har ökat på grund av ett ökande intresse för att studera dessa cellulära strukturer och deras komponenter. Här presenterar vi ett protokoll som integrerar tidigare tillgängliga mikroskopitekniker för att identifiera och kvantifiera intraorganella och interorganella proteinkomplex som finns vid MCS.
Abstract
Membrankontaktställen (MCS) är områden med nära membrannärhet som tillåter och reglerar det dynamiska utbytet av olika biomolekyler (dvs. kalcium och lipider) mellan de parallella organellerna utan att involvera membranfusion. MCS är viktiga för cellulär homeostas, och deras funktioner säkerställs av de inneboende komponenterna, som ofta existerar som multimera proteinkomplex. MCS involverar ofta det endoplasmatiska nätverket (ER), en viktig plats för lipidsyntes och cellulär kalciumlagring, och är särskilt viktiga för organeller, såsom mitokondrierna, som är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna. Under de senaste åren har MCS mellan ER och mitokondrier studerats i stor utsträckning, eftersom deras funktioner starkt påverkar cellulär metabolism/bioenergetik. Flera proteiner har börjat identifieras på dessa kontaktställen, inklusive membranbindningar, kalciumkanaler och lipidöverföringsproteiner, vilket ökar behovet av nya metoder och tekniska tillvägagångssätt för att studera dessa MCS-komponenter. Här beskriver vi ett protokoll som består av kombinerade tekniska tillvägagångssätt, som inkluderar proximitetsligeringsanalys (PLA), mitokondriefärgning och 3D-avbildningssegmentering, som möjliggör detektion av proteiner som är fysiskt nära (>40 nm) varandra och som finns på samma membran vid ER-mitokondrier MCS. Till exempel använde vi två ER-förankrade lipidöverföringsproteiner, ORP5 och ORP8, som tidigare har visat sig interagera och lokalisera vid ER-mitokondrier och ER-plasmamembran MCS. Genom att associera ORP5-ORP8 PLA med analys av cellavbildningsprogramvara var det möjligt att uppskatta avståndet mellan ORP5-ORP8-komplexet och fastställa att cirka 50 % av ORP5-ORP8 PLA-interaktionen sker vid ER-underdomäner i närheten av mitokondrier.
Introduction
Interorganellkommunikation är en definierande egenskap hos eukaryota celler. Ett sätt på vilket organeller kommunicerar är genom att bilda membrankontaktställen (MCS), som är nära membranoppositioner mellan två organeller som upprätthålls av strukturella och funktionella proteiner, såsom tjuder, lipidöverföringsproteiner och kalciumkanaler1. MCS kan etableras mellan liknande eller olika organeller, och de förmedlar utbytet av cellulära komponenter, vilket är viktigt för att upprätthålla cellulär homeostas. Hittills har flera MCS identifierats, inklusive endoplasmatiskt retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) och ER-lipiddroppar (LD) kontakter1. Bland dem är de som bildas mellan ER och mitokondrierna (MERCS) bland de mest studerade eftersom de är involverade i regleringen av flera cellulära funktioner, inklusive lipid- och kalciumhomeostas2. Eftersom mitokondrier till stor del är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna förlitar de sig på MERCS och deras molekylära beståndsdelar för att importera viktiga lipider eller lipidprekursorer från ER. Den icke-vesikulära transporten av dessa lipider över MERCs säkerställer upprätthållandet av korrekt mitokondriell lipidsammansättning, såväl som deras funktionella och strukturella integritet3.
Med tanke på den avgörande involveringen av MCS i olika cellulära funktioner har intresset för att ge en djupare förståelse för deras molekylära komponenter ökat kraftigt under de senaste åren. Flera typer av bildbaserade metoder har använts för att öka kunskapen om MCS. Bland dem har fluorescensprobbaserad proximitetsligeringsanalys (PLA) använts i stor utsträckning som en indikator på förekomsten av MCS genom att detektera interorganellprotein-proteininteraktioner (i ett detektionsområde på 40 nm) vid endogena nivåer4. Till exempel har MERCs visualiserats och kvantifierats genom att använda PLA mellan flera mitokondrier-ER-proteinpar, inklusive VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 och PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Även om denna teknik har använts för att detektera och kvantifiera interaktioner mellan organeller och proteiner som finns vid MCS 5,7,9,10,11, kombinerade de flesta studierna inte PLA med organellfärgning. Följaktligen har en kvantitativ metod som gör det möjligt att mäta närheten mellan PLA-interaktioner och associerade organeller ännu inte utvecklats. Således, när det gäller ER-proteiner, har deras interaktion inom membransubdomäner i kontakt med andra organeller hittills inte särskiljts från deras interaktion inom det utbredda ER-nätverket.
Här beskriver vi ett protokoll för att detektera PLA-interaktioner mellan proteiner som finns i membranet i samma organell och för att analysera deras närhet till membranet i partnerorganellen vid MCS. Detta protokoll utvecklades baserat på två premisser: 1) tidigare studier som visar att, under överuttrycksförhållanden, ER-lipidöverföringsproteinerna ORP5 och ORP8 samlokaliseras och interagerar vid ER-mitokondrier och ER-PM MCS 12,13,14,15 och att ORP5 lokaliseras vid ER-LD-kontakter 16,17; 2) befintlig teknik, inklusive PLA, konfokalmikroskopi, organellmärkning och 3D-bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mitokondriell färgning och proximitetsligeringsanalys (PLA)
- Platta 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, bibehållna i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletterat med 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin och 1 % icke-essentiella aminosyror vid 37 °C med 5 % CO2, i 13 mm glastäckglas i1,5 i 24-brunnars plattor vid en utspädning som tillåter 75 % -90 % cellsammanflöde på dagen för ingreppet.
OBS: Värt att notera är att HeLa-celler kan genomgå ytterligare behandlingar, såsom siRNA-behandling och/eller DNA-plasmidtransfektion, före mitokondriell färgning och PLA. - Mitokondriell färgning
- Tvätta cellerna en gång i ett serumfritt medium som förvärmts till 37 °C. Inkubera cellerna med förvärmt serumfritt medium i 10 minuter vid 37 °C med 5 % CO2 °C.
- Bered 1 μM röd mitokondriell markör i förvärmt serumfritt medium.
- Inkubera cellerna med 500 μl mitokondriell markörlösning i 30 minuter vid 37 °C med 5 % CO2 . Under mitokondriell markörbehandling och följande steg i protokollet, håll cellerna på täckglas skyddade från ljus så mycket som möjligt.
- Efter inkubationen tvättas cellerna 1x i förvärmt serumfritt medium och 2x i 1x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Utför detta steg så snabbt som möjligt eftersom långa tvättsteg före fixering kan påverka mitokondriernas morfologi.
- Ta bort 1x PBS från täckglasen och fixera cellerna genom att inkubera dem i nyberedd 4% PFA (i 1x PBS) i 30 minuter vid rumstemperatur (i mörker) under kemikaliehuven. Tvätta 3 gånger i 2 minuter i 500 μL 1x PBS (med engångspipetter eller ett vakuumsystem anslutet till en pump).
- Ta bort 1x PBS och inkubera täckglasen med 500 μL 50mM NH4Cl i 15 minuter vid rumstemperatur (i mörker). Tvätta 1x i 2 minuter i 500 μL 1x PSB med ett vakuumsystem.
- Tvätta 3 gånger i 2 minuter i 500 μL blockeringsbuffert 1 (BB1, 1 % BSA, 0,1 % saponin i 1 x PBS) för ORP5-ORP8 PLA eller blockerande buffert 2 (BB2, 2 % BSA, 0,1 % normalt getserum, 0,1 saponin i 1x PBS) för ORP8-PTPIP51 PLA.
- Överför täckglasen från 24-hålsplattan till en fuktkammare. Efter att ha överfört täckglasen till kammaren, tillsätt 100 μL BB (BB1 eller BB2, beroende på vilka antikroppspar som används) för att undvika torrhet.
OBS: En fuktkammare skyddad från ljus kan enkelt och snabbt erhållas genom att slå in en petriskål (plast eller glas) i aluminiumfolie och lägga till några bitar våt pappershandduk i petriskålens periferi.
- Proximity-ligeringsanalys (PLA)
OBS: PLA-protokollet följer tillverkarens instruktioner med små ändringar.- Inkubation av primära antikroppar
- Bered den primära antikroppslösningen. Späd kanin anti-ORP5 (1:150) plus mus anti-ORP8 (1:200) i BB1, mus anti-ORP8 (1:200) plus kanin anti-PTPIP51 (1:200) i BB2 och kanin anti-ORP5 (1:150) plus mus anti-PTPIP51 (1:200) i BB1. Bered (minst) 40 μl primär antikroppslösning per täckglas (t.ex. 0,27 μl kanin-anti-ORP5, 0,2 μl mus anti-ORP8, 39,53 μl BB1).
- Ta bort BB från föregående tvätt (steg 1.2.8) med hjälp av ett vakuumsystem och tillsätt 40 μL primär antikroppslösning till täckglasen. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur i en fuktkammare skyddad från ljus.
- Tvätta täckglasen 3 gånger i 5 minuter med 100 μL av motsvarande BB med hjälp av vakuumsystemet.
- Inkubation av PLA-sond
- Förbered PLA-sondernas arbetslösning. Späd kanin PLUS (1:5) och mus MINUS (1:5) PLA-sonder i BB och blanda. För varje täckglas, förbered (minst) 40 μl PLA-sondlösning (t.ex. 8 μL kanin PLUS PLA-sond, 8 μL mus MINUS PLA-sond, 24 μL BB). Låt PLA-sondlösningen sitta i 20 minuter i rumstemperatur före användning.
- Ta bort BB från täckglasen (från steg 1.3.2) med hjälp av ett vakuumsystem och tillsätt 40 μL PLA-sondlösning till täckglasen. Inkubera i 1 timme vid 37 °C i en fuktkammare skyddad från ljuset.
- Tvätta täckglasen 2 gånger i 5 minuter i 100 μL 1x tvättbuffert A i rumstemperatur.
- Ligatur
- Späd 5x ligeringsbuffert till 1:5 i ultrarent vatten och blanda. För varje täckglas, förbered (minst) 40 μL ligeringslösning (8 μL 5x ligeringsbuffert, 31 μL ultrarent vatten).
- Tillsätt ligaset (1 E/μL, medföljer i PLA-satsen) till 1x ligeringsbufferten som beretts i föregående steg vid en utspädning på 1:40 och blanda.
- Ta bort 1x tvättbuffert A från täckglasen (från steg 1.3.4) med hjälp av ett vakuumsystem, tillsätt 40 μL ligaslösning till täckglasen och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i en fuktkammare skyddad från ljuset.
- Tvätta täckglasen 2 gånger i 2 minuter i 100 μL 1x tvättbuffert A i rumstemperatur med hjälp av vakuumsystemet.
- Polymerisation
- Späd 5x förstärkningsbuffert 1:5 i ultrarent vatten och blanda. För varje täckglas, förbered (minst) 40 μL amplifieringslösning (8 μL 5x amplifieringsbuffert, 31.5 μL ultrarent vatten).
- Tillsätt polymeraset (10 E/μL, medföljer PLA-satsen) till 1x-polymerisationsbufferten som framställdes i föregående steg vid en utspädning på 1:80 och blanda.
- Ta bort 1x tvättbuffert A från täckglasen (från steg 1.3.6) med hjälp av ett vakuumsystem, tillsätt 40 μL polymeraslösning till täckglasen och inkubera i 1 timme och 40 minuter vid 37 °C i en fuktkammare skyddad från ljuset.
- Ta bort polymeraslösningen från täckglasen och tvätta 2 gånger i 10 minuter i 100 μL 1x tvättbuffert B i rumstemperatur i en fuktkammare skyddad från ljuset.
- Tvätta täckglasen 1 gång i 1 minut i 100 μL 0.001 x tvättbuffert B i rumstemperatur i en fuktkammare skyddad från ljuset.
- Montera täckglasen på glasskivor för mikroskopi med hjälp av monteringsmedium med DAPI (koncentration mellan 1,6-0,4 μg/ml). Försegla med nagellack.
- Inkubation av primära antikroppar
2. Bildinsamling
- Observera PLA-resultaten och ta bilder med fluorescenskonfokalmikroskopi med ett 63x oljenedsänkningsobjektiv med hjälp av den medföljande programvaran.
- Ställ in fluorescensexcitationen med en 405 nm laserdiod eller en laser med vitt ljus och samla in spektralfönstren med GaAsP PMT eller hybriddetektorer. Vid varje fokalplan (som spänner över 300 nm) erhåller du fluorescenssignalerna för PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) och mitokondrier (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).
3. Bildbehandling och bedömning av PLA-punkter associerade med mitokondrier
- Bearbeta de konfokala bilderna med hjälp av en programvara för bildanalys som genererar avståndskartor mellan de cellulära komponenterna. Följ stegen nedan för att generera 3D-rekonstitutioner av PLA-punkter och det mitokondriella nätverket och för att få tillgång till avståndet mellan dem med hjälp av cellavbildningsprogram (figur 1).
- Installation av 3D-avståndskarttillägget
- Installera både programvarupaketet för cellanalys med XT-alternativet och MATLAB-programvaran eller bara en MATLAB-kompilatorkörning (MRC), som kan laddas ner fritt från webbplatsen.
- Ställ in cellanalysprogrammet för att starta MATLAB när en XTension startas enligt följande: från alternativet Imaris (Mac OS X) eller Redigera-menyn (Windows), välj Inställningar, ändra till panelen Anpassade verktyg och ställ sedan in sökvägen:
C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe för Windows eller/Program/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab för Mac OS X.
- Importera bilderna till programvaran
- Konvertera de konfokala stackbilderna till en . IMS-fil, antingen direkt via Arena-sektionen eller med hjälp av den fristående File Converter som tillåter batchkonvertering.
- Efter importen kontrollerar du att bilderna är korrekt kalibrerade. Klicka på Redigera > bildegenskaper > bildgeometri och kontrollera att voxelstorleken motsvarar i X och Y den pixelstorlek som förväntas för den faktiska bilden (se bildkalibrering i insamlingsprogrammet) och att voxelstorleken i Z motsvarar det steg som mikroskopet använder för att generera Z-stacken. Om värdena inte är korrekta, ändra dem för att säkerställa en korrekt uppskattning av avstånden i följande steg.
- Justera kontrasten för de olika kanalerna i menyn Skärmjustering genom att klicka på Redigera > Visa visningsjustering. Justera varje kanal oberoende för att optimera visningen av varje färg. Detta steg påverkar inte direkt bildvärdena men är viktigt för att ställa in exakta tröskelvärden eller upptäcka svaga objekt.
- Begränsa analysen till en enskild cell genom att beskära bilden med alternativen Redigera > Beskär 3D. Om du vill analysera en annan cell i samma synfält öppnar du samma bild igen och beskär den på olika sätt.
- ORP5-ORP8 punktdetektering
- Detektera PLA-signalerna som genereras på platsen för ORP5- och ORP8-interaktion genom att klicka på alternativet Lägg till nya fläckar , vilket skapar en ny uppsättning objekt och öppnar guiden för punktdetektering.
- Välj den kanal som punktdetekteringen ska utföras på.
- Justera den uppskattade XY-diametern (intervallet måste anpassas om objektstorleken skiljer sig åt) för att hjälpa punktdetekteringsalgoritmen att hitta de objekt som är av intresse. Observera att om det valda värdet är för högt kommer de närliggande föremålen att smälta samman. Om värdet är för litet kan en signal betraktas som flera objekt, eller så kan avvikande signaler upptäckas.
- Klicka på Bakgrundssubtraktion för att ta bort bildbakgrunden före punktdetektering för att förbättra den lokala kontrasten runt objekten av intresse.
- Justera tröskelvärdet för punktdetektering genom att behålla kvaliteten (intensiteten i objektets centrum) som tröskelparameter och programvarans automatiska tröskelvärde, eller ändra det här värdet något för att identifiera alla objekt. När punktidentifieringen är klar sparar du detekteringsparametrarna och återanvänder dem för att bearbeta andra bilder.
- Detektering av mitokondriella nätverk
- Identifiera det mitokondriella nätverket för att generera en ytåtergivning genom att klicka på Lägg till nya ytor för att skapa ett nytt objekt och öppna guiden för ytidentifiering.
- Välj den kanal som ytskapandet ska utföras på.
- Använd ett Gaussiskt filter för att få en jämnare yta genom att klicka på kryssrutan Utjämna och genom att ange ett tröskelvärde som anger de minsta detaljerna som kan observeras på ytan.
- Utför en bakgrundssubtraktion för att förstärka de lokala kontrasterna och för att hjälpa till med tröskelsteget.
- Justera tröskeln för att detektera det mitokondriella nätverket baserat på signalens intensitet. Om det är svårt att ställa in tröskeln korrekt rekommenderas att du går tillbaka till föregående steg för att justera graden av jämnhet och bakgrundssubtraktion.
- Applicera vid behov ett filter på ytan för att ta bort små rester som härrör från tröskeln. Det gör du genom att välja filtret Antal voxlar i fönstret klassificera yta och leka med de övre och nedre tröskelvärdena för att endast behålla de objekt som är av intresse. När du har skapat ytan sparar du parametrarna för att skapa dem och återanvänder dem för att bearbeta andra bilder.
- Generering av 3D-avståndskartan runt mitokondrierna
- Generera en avståndskarta utanför den mitokondriella ytan som tidigare skapats enligt följande. Välj mitokondrieytan i scenträdsrutan. Klicka på Bildbehandling > ytors funktion > avståndstransformation. Detta anropar en Matlab XTension som ber användaren att välja om kartan ska beräknas utanför eller inuti objektytan.
- Välj Outside Surface Object för att mäta avståndet mellan PLA-punkterna och mitokondriernas yta. När avståndskartan har genererats visas den som en ny kanal i displayjusteringspanelen. I den här kanalen har varje pixel ett värde som motsvarar avståndet till närmaste mitokondrier.
- Extraktion av objektens avstånd från närmaste mitokondrie
- För att mäta avståndet från varje punkt till den närmaste mitokondrien och för att identifiera och visualisera de närmaste, välj de punkter som tidigare genererats i scenträdsrutan.
- I statistiken och den detaljerade loggen väljer du Specifika värden (för att få en mätning för varje plats). Välj Mittintensitet Ch=X (där X motsvarar numret på avståndskartkanalen). Detta kommer att mäta värdet på varje punktcentrum, vilket motsvarar dess avstånd till närmaste mitokondri, på avståndskartan.
- Exportera data som en .csv -fil genom att klicka på diskettikonen längst ner till vänster i fönstret.
- Om du vill extrahera en delpopulation av fläckar baserat på deras avstånd till mitokondrier markerar du fläckarna i scenträdet och klickar på fliken Filter .
- I det här fönstret lägger du till ett nytt filter baserat på mittintensiteten Ch=X och extraherar fläckarna mindre än 380 nm från mitokondrierna genom att ställa in det nedre tröskelvärdet till 0 μm och det övre tröskelvärdet till 0,380 μm.
OBS: Tröskelvärdet på 380 nm uppskattades baserat på en PLA-reaktion inklusive associationen mellan de primära och sekundära antikropparna (30 nm) plus hälften av hela bredden vid halva maximum (FWHM) av PLA-förstärkningssignalerna (350 nm). - Om du vill fokusera på de markerade fläckarna, och t.ex. ge dem en distinkt färg, utför du ett dupliceringssteg genom att trycka på knappen Duplicera markering till nya fläckar .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det ovan beskrivna protokollet detekterade vi interaktionsställena för två ER-förankrade lipidöverföringsproteiner, ORP5 och ORP8, och bedömde deras förekomst vid ER-membransubdomäner i kontakt med andra organeller, i synnerhet med mitokondrierna. För detta färgades det mitokondriella nätverket i HeLa-celler med en röd mitokondriell markör, och ORP5-ORP8 PLA gröna fläckar detekterades efter fixering med de primära antikropparna anti-ORP5 och anti-ORP8, vars specificitet tidigare testats med immunofluorescens15. Konfokala bilder visade att endogena ORP5-ORP8 PLA-interaktioner i HeLa-cellerna inträffade i det retikulära ER, kortikala ER och i ER-subdomäner i nära kontakt med mitokondrier, vanligen kallade mitokondrier-associerade ER-membran (MAMs; Figur 2A). För att kvantifiera ORP5-ORP8 PLA-interaktioner som sker vid MAMs utvärderades avståndet mellan varje PLA-punkt och mitokondrier med hjälp av 3D-bildanalys. Med hjälp av en avståndströskel på 380 nm visade 3D-avbildningsanalys att cirka 50 % av endogena ORP5-ORP8 PLA-interaktioner detekterades vid MAM (Figur 2A,B). De övriga 50 % av interaktionerna fördelades mellan kortikal och retikelER 15. För att validera specificiteten hos PLA utfördes ORP5-ORP8 PLA-experiment antingen i celler som behandlades med ORP5-riktade och ORP8-riktade siRNA (negativ kontroll) eller i celler som samuttryckte ORP5 och ORP8 (positiv kontroll). ORP5 och ORP8 nedreglering inducerade en massiv minskning av det totala antalet PLA-signaler (vid MAMs, vid retikulära ER och vid kortikala ER; Figur 2A,C), medan deras samtidiga överuttryck resulterade i en ökning av PLA (Figur 2A,C), vilket bekräftar specificiteten hos ORP5-ORP8 PLA. Intressant nog var dock andelen ORP5-ORP8 PLA-interaktioner som inträffade vid MAMs i celler som samuttryckte ORP5 och ORP8 liknande den som observerades i celler där dessa proteiner uttrycktes på endogena nivåer (Figur 2B), vilket stöder deras existens som ett komplex vid MAMs. För att ytterligare bekräfta förekomsten av ORP5 och ORP8 vid ER-membransubdomäner i nära kontakt med mitokondrier, utfördes ytterligare kvantitativa PLA-analyser mellan ORP5 eller ORP8 och det yttre mitokondriella membranproteinet PTPIP51, en känd bindningspartner till ORP5 och ORP813. PLA-signaler detekterades i både ORP5-PTPIP51 och ORP8-PTPIP51-par, och deras genomsnittliga antal liknade ORP5-ORP8 PLA-paret, vilket bekräftar ORP5- och ORP8-lokalisering vid ER-mitokondrier MCS (figur 3).
Slutligen, i de senaste arbetena från vårt labb, genom att använda ett liknande tillvägagångssätt i HeLa-celler transfekterade med PHPLCd-RFP eller mcherry-PLN1 för att markera PM respektive LD, kunde vi analysera förekomsten av ORP5-ORP8 PLA-interaktioner vid ER-PM-kontakter och identifiera ett trevägskontaktställe mellan mitokondrier, ER och LDs (Figur 4)15, 17. veckor
Figur 1: Arbetsflöde för identifiering av PLA-signaler i närheten av mitokondrierna. Först segmenteras de konfokala stackarna för att identifiera PLA-fokusen (fläckar) och det mitokondriella nätverket (ytor). Sedan beräknas 3D-avståndskartor mot utsidan av ytorna (mitokondrier), vilket gör det möjligt att mäta avståndet mellan varje punkt och närmaste mitokondri. Slutligen klassificeras PLA-fläckar i två populationer (röd och grön) baserat på en närhetströskel på 380 nm som fastställts baserat på detektionssystemets precision. Denna siffra har modifierats från Monteiro-Cardoso et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder av ORP5-ORP8-komplexet uttryckta på endogena nivåer lokaliserade vid ER-mitokondriekontakter. (A) ORP5-ORP8 PLA konfokalserie och respektive 3D-rekonstitutioner. Skalstaplar: 10 μm och 2 μm (förstorade bilder). (B) Kvantifiering av ORP5-ORP8 PLA-foci i nära kontakt med mitokondrier. Endo, n = 33 celler, och Overexp ORP5+ORP8, n = 27 celler. Data presenteras som medelvärde ± SEM (medelvärdets medelvärde). Denna bild har modifierats från Monteiro-Cardoso et al.15. (C) Kvantifiering av totala ORP5-ORP8 PLA-fokus. Endo, n = 38 celler, siORP5+siORP8, n = 38 celler och Overexp ORP5+ORP8, n = 35 celler. Data presenteras som medelvärde ± SEM (medelvärdets medelvärde). Denna bild har modifierats från Monteiro-Cardoso et al.15. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av PLA-signaler mellan ORP5 eller ORP8 med mitokondrieproteinet PTPIP51. (A) Konfokalserier användes för att generera 3D-rekonstitutioner och avståndskartor för att bekräfta att ORPR5- eller ORP8 PLA-interaktioner med PTPIP51 inträffa vid ER-mitokondriernas nära kontakter. Skalstaplar: 10 μm och 2 μm (förstorade bilder). (B) PTPIP51 immunofluorescenskonfokala bilder (single focal plane) i kontroll- och HeLa-celler behandlade med siRNA-riktade PTPIP51. Skalstaplar: 10 μm och 2 μm (förstorade bilder). (C) ORP5-PTPIP51 och ORP8-PTPIP51 PLA-konfokala bilder i kontroll och HeLa-celler behandlade med siRNA-riktade PTPIP51. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på 3D-rekonstruktioner som används för att lokalisera ORP5-ORP8 PLA-komplexet vid ER-PM- och ER-mitokondrier-LD-kontakter. (A) Konfokalbild och respektive 3D-rekonstituering av en HeLa-cell med ORP5-ORP8 PLA, representerad av de gröna fläckarna, PM markerad med PHPLCd-RFP, representerad av den röda blodkroppen, och mitokondrier markerade med Mito-BFP, representerade av blå ytor. Vänster och mittersta bilder: representation av hela HeLa-cellen. Höger bild: representation av ett zoomat område inuti cellen. (B) Konfokalbild och respektive 3D-rekonstituering av ett inzoomat område av en HeLa-cell med ORP5-ORP8 PLA, representerad av de gröna fläckarna, LDs markerade med mCherry-PLN1, representerade av de röda ytorna, och Mito-BFP, representerad av de blå ytorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll utformades för att identifiera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan organellproteiner vid MCS, särskilt vid MERCS. Det nya med protokollet är att det kombinerar PLA med märkning av flera organeller, konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys för att lokalisera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan två proteiner som finns i samma membran, i detta fall inom ER-membranet i närheten av mitokondriemembranet (MAM) eller med MAM och LD samtidigt. Detta protokoll kan användas som ett verktyg för att validera proteiner som potentiellt lokaliseras vid specifika MERCS men också vid andra MCS.
Sedan utvecklingen 2006 har PLA mellan ett ER och ett mitokondriellt protein använts i stor utsträckning för att kvantifiera MERCs 7,9,10,11. Användningen av PLA som en indikator på MERCS-överflöd i celler måste dock verifieras noggrant med högupplösta metoder. Till exempel förändrar ablationen av SAM50, ett mitokondriellt protein som inte påverkar förekomsten av MERCS (som kvantifierats med elektronmikroskopi)15, inte heller PLA-interaktioner mellan ER-proteinet ORP8 och mitokondrieproteinet TOM20, men det minskar PLA-interaktioner mellan ORP8 och mitokondrieproteinet Metaxin2 utan att minska deras uttrycksnivåer 15. Dessa resultat återspeglar att PLA-interaktioner kan vara specifika för det proteinpar som används i analysen och inte kan användas som den enda parametern för att bedöma förekomsten av MERCS.
Icke desto mindre är PLA en beprövad känslig metod för att detektera in situ endogena proteininteraktioner. Till skillnad från andra fluorescerande sondbaserade detektionsmetoder, inklusive split-GFP och FRET, eller högupplösta avbildningsmetoder, kräver PLA inte överuttryck av märkta proteiner, vilket undviker inneboende experimentella artefakter, såsom förändring av de fysiska egenskaperna hos de riktade organellerna15. Detektion av proteininteraktioner med PLA erbjuder också fördelar i förhållande till andra immundetektionsmetoder, såsom co-immunoprecipitation med western blot. Medan PLA tillåter kvantifiering av enstaka fluorescensfläckar på encellsnivå, kräver co-immunoprecipitation en stor mängd biologiskt material och tillåter endast relativ kvantifiering av proteinet som extraherats från en pool av heterogena celler, för vilka en lämplig belastningskontroll är svår att erhålla15. Den ytterligare fördelen med användningen av PLA i kombination med organellfärgning och konfokalmikroskopi jämfört med co-immunoprecipitering är att det första tillvägagångssättet möjliggör lokalisering av proteininteraktioner på subcellulär nivå.
Å andra sidan är de framträdande nackdelarna med detta protokoll förknippade med PLA-detektionsområdet på cirka 40 nm, vilket är större än MERCS, och med den maximala upplösningen som uppnås med konfokalmikroskopi på cirka 250 nm, vilket gör det svårt att entydigt identifiera kontaktställen. Här användes dock ett tröskelvärde på 380 nm för att uppskatta PLA-fläckarna associerade med mitokondrieytor baserat på storleken på PLA-reaktionen, inklusive associationen av de primära och sekundära antikropparna (30 nm) plus hälften av FWHM för PLA-förstärkningssignalerna (350 nm). En annan begränsning med PLA är relaterad till det faktum att den endast kan användas i fasta prover, och förvärvet av en distinkt, specifik och kvantifierbar PLA-signal kräver tillgång till antikroppar som är mycket specifika för proteinet av intresse15. Dessutom kräver 3D-bildanalys för avståndsuppskattning specifik programvara som kanske inte är lättillgänglig i alla laboratorier.
Noterbart är att några av de nackdelar som nämns ovan kan åtgärdas genom att använda nyligen tillgänglig teknik. Till exempel kan konventionell konfokalmikroskopi ersättas med avbildningstekniker med högre upplösning, såsom Airyscan eller strukturerad belyst mikroskopi (SIM)17, och bristen på bra primära antikroppar för de proteiner som är av intresse kan övervinnas genom att stabilt märka endogena proteiner med hjälp av CRISPR-Cas9-tekniken18. Slutligen kan kvaliteten och specificiteten hos antikropparna och PLA-signalerna verifieras med hjälp av följande kontroller: 1) testning av de primära antikropparna med immunofluorescens och western blot i kontrollceller och i celler där proteinet av intresse har utarmats eller överuttryckts; 2) utföra PLA i celler där ett eller båda proteinerna av intresse har utarmats; 3) utföra PLA i celler som samuttrycker de proteiner som är av intresse; 4) utföra PLA samtidigt som båda antikropparna utelämnas för de proteiner som är av intresse; 5) utföra PLA med endast en av de två antikropparna för de proteiner som är av intresse; 6) utföra PLA med inkubation med samma IgG som den art från vilken de primära antikropparna genererades. För att bedöma deras specificitet testades antikropparna som användes i detta protokoll med immunofluorescens och western blot i kontrollceller och i celler som behandlades med siRNA riktade mot ORP5 15, ORP8 15 eller PTPIP51 (Figur 3B och Guyard et al.17). Dessutom har anti-ORP5- och anti-ORP8-specificiteten bedömts i celler som uttrycker EGFP-taggad ORP5 eller ORP8 genom att utvärdera Pearsons koefficient mellan antikroppsdetektionssignalen och EGFP-signalen15. Specificiteterna för anti-ORP5 15, anti-ORP8 15 och anti-PTPIP51 (Figur 1 och Figur 3C) antikroppar analyserades vidare i celler där dessa proteiner var utarmade, vilket ledde till en minskning av PLA-signaler. Observera att den antikroppskoncentration som är lämplig för immunofluorescensfärgning vanligtvis också är lämplig för PLA; Beroende på vilka antikroppar som används kan dock vissa justeringar i den blockerande lösningen och/eller av antikroppskoncentrationerna göras för att förbättra PLA-färgningen. ORP5-ORP8 och ORP8-PTPIP51 PLA-färgningen förbättrades efter justering av blockeringslösningen. För att få högkvalitativ mitokondriell och PLA-färgning är det viktigt att få högkvalitativa konfokala bilder med låga bakgrundssignaler, vilket är viktigt för att underlätta 3D-modulering. Till exempel konfokala bilder med höga justeringar av bakgrundspåverkanströskeln och följaktligen påverkar noggrannheten i 3D-moduleringen av det mitokondriella nätverket eller PLA.
Sammanfattningsvis möjliggör protokollet som presenteras här lokalisering och kvantifiering av PLA-proteininteraktioner vid specifika MERCS-subdomäner (interaktioner mellan proteiner lokaliserade i cis inom samma membran som är engagerade i MCS eller mellan proteiner lokaliserade i trans inom de juxtaposerade membranen) genom att använda multicellulär organellmärkning och generera avståndskartor i 3D-rekonstruerade konfokala bilder. Även om de procedurer som beskrivs här är tekniskt enkla och relativt snabba jämfört med andra metoder för att detektera proteininteraktioner vid MERCS, är de erhållna uppgifterna mycket reproducerbara. Dessutom är detta protokoll lika mångsidigt som de antikroppar som finns tillgängliga för de proteiner som är av intresse och som de markörer som finns tillgängliga för att färga organellerna. Därför kan den appliceras på ett brett spektrum av proteinpar och flera organeller och MCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) och Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
References
- Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
- Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
- Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
- Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
- Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
- Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
- Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
- Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
- Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
- Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
- Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
- Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
- Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
- Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
- Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
