Summary
Le présent protocole illustre l’utilisation de composants disponibles dans le commerce pour générer un gradient thermique stable et linéaire. Un tel gradient peut ensuite être utilisé pour déterminer la limite thermique supérieure des organismes planctoniques, en particulier des larves d’invertébrés.
Abstract
Les limites thermiques et la largeur ont été largement utilisées pour prédire la répartition des espèces. Alors que la température mondiale continue d’augmenter, il est essentiel de comprendre comment la limite thermique change avec l’acclimatation et comment elle varie entre les stades de vie et les populations pour déterminer la vulnérabilité des espèces au réchauffement futur. La plupart des organismes marins ont des cycles de vie complexes qui comprennent les premiers stades planctoniques. Bien que la quantification de la limite thermique de ces petits stades de développement précoces (des dizaines à des centaines de microns) aide à identifier les goulots d’étranglement du développement, ce processus peut être difficile en raison de la petite taille des organismes cibles, de l’espace de banc et du coût de fabrication initial élevé. Ici, une configuration orientée vers de petits volumes (mL à des dizaines de mL) est présentée. Cette configuration combine des composants disponibles dans le commerce pour générer un gradient thermique stable et linéaire. Les spécifications de production de l’installation, ainsi que les procédures pour introduire et dénombrer les individus vivants par rapport aux individus morts et calculer la température létale, sont également présentées.
Introduction
La tolérance thermique est essentielle à la survie et au fonctionnement des organismes 1,2. Alors que la planète continue de se réchauffer en raison des émissions anthropiques de carbone, une attention croissante est accordée à la détermination et à l’application des limites thermiques3. Divers paramètres, tels que la mortalité, l’incapacité à se développer et la perte de mobilité, ont été utilisés pour déterminer les limites thermiques supérieure et inférieure4. Ces limites thermiques sont souvent considérées comme un indicateur de la niche thermique d’un organisme. Ces informations sont à leur tour utilisées pour identifier les espèces les plus vulnérables au réchauffement climatique, ainsi que pour prédire la répartition future des espèces et les interactions entre espèces qui en résultent 3,5,6,7. Cependant, la détermination des limites thermiques, en particulier pour les petits organismes planctoniques, peut être difficile.
Pour les organismes planctoniques, en particulier les stades larvaires des invertébrés marins, la limite thermique peut être déterminée par exposition chronique. L’exposition chronique est obtenue en élevant les larves à plusieurs températures pendant des jours ou des semaines et en déterminant la température à laquelle la survie des larves et/ou le taux de développement réduit 8,9,10. Cependant, cette approche prend beaucoup de temps et nécessite de grands incubateurs et de l’expérience dans l’élevage larvaire (voir la référence11 pour une bonne introduction à l’élevage de larves d’invertébrés marins).
Alternativement, l’exposition aiguë au stress thermique peut être utilisée pour déterminer les limites thermiques. Souvent, cette approche de détermination consiste à placer de petits flacons contenant des larves dans des bains secs à température contrôlée 12,13,14, à tirer parti des fonctions de gradient thermique dans les thermocycleurs PCR 15,16, ou à placer des flacons en verre / tubes microcentrifugeuses le long d’un gradient thermique généré par le chauffage et le refroidissement appliqués aux extrémités de grands blocs d’aluminium percés de trous dans lesquels les flacons s’adaptent parfaitement 17, 18,19. Les bains secs typiques génèrent une température unique; Par conséquent, plusieurs unités doivent être exploitées simultanément pour évaluer les performances dans une gamme de températures. Les thermocycleurs génèrent un gradient mais ne s’adaptent qu’à un petit volume d’échantillon (120 μL) et nécessitent des manipulations minutieuses. Semblables aux thermocycleurs, les gros blocs d’aluminium créent des gradients de température linéaires et stables. Les deux approches peuvent être couplées à une régression logistique ou probit pour calculer la température létale pour 50% de la population (LT50)12,20,21. Cependant, les blocs d’aluminium utilisés mesuraient ~100 cm de long; Cette taille nécessite un grand espace de laboratoire et l’accès à des fraiseuses spécialisées à commande numérique par ordinateur pour percer les trous. Avec l’utilisation de deux bains d’eau de qualité recherche pour maintenir la température cible, le coût financier de l’assemblage de l’installation est élevé.
Par conséquent, ce travail vise à développer un moyen alternatif de générer un gradient de température stable et linéaire avec des pièces disponibles dans le commerce. Un tel produit doit avoir un faible encombrement et devrait pouvoir être facilement utilisé pour des expériences d’exposition à des contraintes thermiques aiguës pour les organismes planctoniques. Ce protocole est développé avec du zooplancton d’une taille de <1 mm en tant qu’organismes cibles, et il a donc été optimisé pour l’utilisation d’un tube microcentrifuge de 1,5 ou 2 mL. Les organismes de plus grande taille nécessiteront des contenants plus grands que les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL utilisés et des trous agrandis dans les blocs d’aluminium.
En plus de rendre l’appareil expérimental plus accessible, ce travail vise à simplifier le pipeline de traitement des données. Bien que les logiciels statistiques commerciaux fournissent des routines pour calculer LT50 en utilisant la régression logistique ou probit, le coût de licence n’est pas négligeable. Par conséquent, un script facile à utiliser qui repose sur le programme statistique open source R22 rendrait l’analyse des données plus accessible.
Ce protocole montre comment un bloc thermique compact peut être fabriqué avec des pièces disponibles dans le commerce et être appliqué à l’exposition du zooplancton (larves du Dendraster excentricus à un dollar des sables) à un stress thermique aigu pour déterminer leur limite thermique supérieure.
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Protocol
1. Fabrication du bloc thermique
- Branchez le bande-chauffe de 120 V et 100 W au rhéostat (voir le tableau des matériaux).
- Préparez le bloc d’aluminium de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 po x 5 po x 2 po) en perçant 60 trous dans une grille de 6 x 10 (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que les trous sont espacés de 2 cm d’un centre à l’autre dans les deux sens. Chacun doit avoir un diamètre de 1,1 cm et une profondeur de 4,2 cm (figure 1).
REMARQUE: Effectuez le perçage sur une fraiseuse ou une perceuse avec des forets en acier rapide. L’élément chauffant et l’élément de refroidissement ont tous deux été choisis pour couvrir autant que possible la surface de contact des surfaces de 15,2 cm x 5 cm. - Percez deux trous supplémentaires sur l’une des surfaces de 20,3 cm x 5 cm entre la 1re et la 2ecolonne et les 9eet 10e colonnes, en fonction de la taille des sondes du régulateur de température (voir le tableau des matériaux).
- Construisez un boîtier à partir de feuilles d’acrylique transparent de 1,2 cm (0,5 po) (voir le tableau des matériaux) pour maintenir les éléments en place et isoler le bloc chauffant terminé. Utilisez deux couches d’acrylique pour isoler la face arrière de l’élément chauffant (Figure 1).
- Dans l’assemblage final, appliquez de la pâte thermique (voir le tableau des matériaux) pour maximiser la conductance thermique de l’élément chauffant dans le bloc et du bloc à l’élément de refroidissement.
2. Détermination des réglages du gradient thermique
- Connectez le bain-marie / refroidisseur d’aquarium avec le tube Tygon (voir le tableau des matériaux). Isolez le tube avec de l’isolant de tuyau en mousse au besoin.
- Insérez la sonde du thermostat dans les trous situés sur le côté du bloc d’aluminium. Assurez-vous que la sonde 1 est positionnée près de l’élément chauffant.
- Placer les tubes de microcentrifugation remplis à ras bord (1,5 mL) d’eau du robinet dans tous les trous broyés (60 tubes au total).
- Allumez le régulateur de température et réglez la température d’arrêt du chauffage de la sonde 1 à 35-37 °C et de la sonde 2 à 21,5-22,5 °C.
REMARQUE : Le thermostat proposé comporte deux prises qui fonctionnent indépendamment; Seule la sonde 1 est utilisée pour réguler la température chaude dans ce cas d’utilisation particulier. Par conséquent, réglez la température de la sonde 2 sur celle de la température basse. - Faites pivoter le rhéostat pour allumer l’élément chauffant et réglez-le à moyen.
- Allumez le bain-marie/refroidisseur d’aquarium et réglez la température du refroidisseur à 15 °C.
- Vérifiez que le bloc est chaud à une extrémité et refroidi à l’autre après 10 min.
ATTENTION : Les extrémités exposées de l’élément chauffant peuvent être chaudes ; Ne les touchez pas. - Vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugation à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K (voir le tableau des matériaux) toutes les 10 minutes par la suite. La température se stabilisera après ~60 min et apparaîtra linéaire (Figure 2).
- Ajustez les valeurs des points de terminaison en modifiant les paramètres du régulateur de température et du bain-marie selon vos besoins.
3. Exposition thermique et dénombrement vivant:mort
REMARQUE: L’étape 2 peut être omise une fois que les paramètres souhaités pour le gradient de température sont déterminés.
- Allumez le bain-marie et le chauffe-eau à recirculation et réglez-les à 15 °C et 37 °C, respectivement, pour générer un gradient de température de 19,5 °C à 37 °C.
- Pour s’assurer que le gradient thermique est linéaire, placer les tubes de microcentrifugation remplis à ras bord (1,5 mL) d’eau du robinet dans tous les trous broyés (60 tubes au total).
- Laissez le bloc de chaleur atteindre la température réglée en attendant 45-60 min. Vérifiez la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K pour voir si elle a atteint la température attendue. Notez ces températures.
- Si les organismes à l’étude mesurent > 500 μm et peuvent être facilement transférés d’un contenant à un autre (p. ex. un copépode), remplir un tube à microcentrifugeuses de 1,5 mL avec 750 μL d’eau de mer filtrée de 0,45 μm. Sinon, si les organismes à l’étude sont petits, remplissez un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec 250 μL d’eau de mer filtrée de 0,45 μm.
REMARQUE : Pour les données représentatives, les larves des dendrasters excentriques du dollar des sables, qui sont 2, 4 et 6 jours après la fécondation, ont été utilisées (voir le tableau des matériaux). La taille moyenne (± D.D., n = 15 pour chaque âge) de ces individus était de 152 ± 7 μm, 260 ± 17 μm et 292 ± 14 μm, respectivement. Étant donné que ces larves peuvent être facilement concentrées (étape 3.5), les tubes de microcentrifugeuses ont été remplis de 750 μL d’eau de mer filtrée. - Concentrer la culture des organismes de l’étude avec filtration inversée (c.-à-d. placer la maille dans le récipient contenant les organismes à l’étude et éliminer l’eau par le haut de la maille), de sorte que les organismes à l’étude restent dans le fond du bécher11.
REMARQUE : Un treillis de nylon de 30 μm a été utilisé pour les larves de sable étudiées (voir le tableau des matériaux). - Rincer l’échantillon animal concentré avec de l’eau de mer filtrée (p. ex., lors de la culture avec des aliments à base d’algues ou d’autres produits chimiques). Répétez la filtration inverse une fois de plus pour concentrer l’échantillon animal.
- Placez un nombre connu d’organismes individuels dans les tubes microcentrifugés à moitié remplis. Compter les petits organismes planctoniques au microscope à dissection (voir Tableau des matériaux) et les transférer avec des pipettes Pasteur en verre.
NOTE: Le nombre d’organismes à placer dépend de la taille; Pour les larves de sable de ~200 μm, 20 individus par tube de microcentrifugeuse étaient appropriés.
ATTENTION: Les pipettes en verre sont plus souhaitables que les pipettes en plastique car certains organismes planctoniques sont hydrophobes et collent aux surfaces en plastique. - Ajouter 0,45 μm d’eau de mer filtrée dans les tubes microcentrifugeuses contenant des animaux jusqu’à ce que le volume final soit de 1 mL.
- Pour permettre aux organismes de se réchauffer progressivement à la température expérimentale souhaitée, placer les tubes de microcentrifugation avec les animaux, préparés à l’étape 3.7, dans le bloc thermique en partant de l’extrémité froide. Placer des paires de tubes microcentrifugeuses sur chaque rangée (12 tubes au total).
- Attendez 10 min.
- Déplacer les paires de tubes microcentrifugeuses insérées à l’étape 3.9 vers les trous percés adjacents à des températures plus chaudes. Placez des paires supplémentaires de tubes microcentrifugeuses dans chaque rangée à l’extrémité froide. Chaque rangée aura désormais quatre tubes. Attendez encore 10 minutes.
- Continuez à ajouter des tubes microcentrifugeuses avec les animaux en déplaçant leurs positions de l’extrémité la plus froide à l’extrémité plus chaude par paires. Attendez 10 minutes entre chaque quart de travail jusqu’à ce que le bloc de chaleur soit complètement rempli.
REMARQUE : Les étapes 3.9 à 3.12 sont considérées comme une phase d’accélération visant à augmenter graduellement la température ressentie par les organismes de l’étude. - Laissez les animaux incuber à la température désignée pendant 2 h. Cette étape est la phase d’exposition à température constante de l’expérience.
- Vérifiez la température des tubes microcentrifugeuses avec un thermocouple toutes les heures si la période d’incubation dépasse 2 h.
REMARQUE: Ajustez le temps d’incubation en fonction des besoins expérimentaux. Si l’incubation dure plus de 2 h, vérifier la température des tubes à intervalles réguliers avec un thermocouple en cas de défaillance imprévue de l’équipement. Pour minimiser les perturbations pour les organismes à l’étude, placez au hasard six tubes de microcentrifugation ou plus remplis uniquement d’eau de mer filtrée dans le bloc pour la surveillance de la température.
- Vérifiez la température des tubes microcentrifugeuses avec un thermocouple toutes les heures si la période d’incubation dépasse 2 h.
- À la fin de la période d’incubation, mesurer la température à l’intérieur de chaque tube de microcentrifugeuse à l’aide d’un thermocouple avec une électrode de type K. Notez ces températures.
- Retirez les 60 tubes de microcentrifugation contenant des animaux et placez-les dans des supports pré-étiquetés.
- Incuber les tubes (étape 3.14) à la température prédéterminée, telle que la température d’élevage, pendant 1 h, qui est la période de récupération.
REMARQUE : La période de rétablissement peut être propre à l’espèce. Pour le dollar de sable larvaire, la température d’élevage était de 18 °C, et l’échantillon a donc été placé dans une chambre environnementale. Consulter la documentation pertinente et/ou mener une expérience d’essai pour s’assurer que le nombre de morts vivants n’a pas été affecté par la durée de la période de récupération. Dans les données représentatives, le nombre d’animaux vivants après 1 h était le même qu’après 12 ou 24 h de récupération. - Pour énumérer la proportion de l’organisme à l’étude qui est vivant après l’exposition thermique, transférer le contenu d’un tube microcentrifuge individuel sur une boîte de Petri de 35 mm à l’aide d’une pipette en verre.
- Observez et notez le nombre relatif d’individus qui sont encore actifs (vivants) et ceux qui ont saisi la nage ou dissous (morts) au microscope à dissection. S’assurer que le nombre total de personnes observées est égal au nombre de personnes placées dans les tubes à l’étape 3.7. Vérifiez le côté des tubes microcentrifugeux et de la boîte de Petri pour les individus si les chiffres ne correspondent pas.
4. Calcul de LT50
- Générez un tableau de données au format CSV avec au moins les en-têtes suivants : variable de regroupement d’intérêt, température du tube en °C, nombre d’individus vivants et nombre d’individus morts.
NOTE : Pour les données représentatives, la variable de regroupement d’intérêt est remplacée par l’âge puisque l’objectif est de comparer entre les groupes d’âge. - Pour adapter les données à la régression logistique, utilisez un modèle linéaire généralisé avec une distribution binomiale. Le fichier de codage supplémentaire 1 montre un exemple de script utilisant le logiciel open source R22.
- Pour déterminer la limite thermique supérieure médiane (LT 50), calculez la valeur prédictive (c.-à-d. la température) à laquelle50 % des individus ont survécu. Le fichier de codage supplémentaire 2 montre un exemple de script utilisant la fonction dose.p du MASS23 dans R22.
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Representative Results
Le but de ce protocole est de déterminer la limite thermique supérieure du zooplancton. Pour ce faire, un gradient thermique stable et linéaire est nécessaire. La configuration proposée a pu générer un gradient thermique allant de 14 °C à 40 °C en réglant la température du bain-marie à 8 °C et le chauffage à 39 °C (figure 2A). Le gradient de température peut être réduit et décalé en modifiant les valeurs finales. Un gradient thermique avec une plage plus étroite (19 °C à 37 °C) a également été généré en réglant le chauffage à 37 °C et le bain-marie à 15 °C. La température dans le bloc se stabilise dans les 45 minutes à 1 heure suivant la configuration (Figure 2B).
Pour illustrer l’application de ce protocole au zooplancton, on a examiné la modification de la limite thermique supérieure, indiquée par LT50, par ontogenèse chez les larves du dollar des sables (Dendraster excentricus). Les dollars des sables gravides ont été obtenus commercialement (voir le tableau des matériaux). La libération de gamètes a été induite par l’injection de 0,5 à 1 mL de chlorure de potassium 0,35 M. Les œufs collectés ont été rincés à travers un treillis de nylon de 63 μm avec de l’eau de mer filtrée de 0,45 μm. Le sperme a été recueilli sec et conservé sur la glace. Les ovules ont été fécondés à ~104 spermatozoïdes par mL. Des cultures de jardin communes ont été créées avec des gamètes de trois mâles et de trois femelles à cinq individus par mL. Ces cultures larvaires ont été conservées dans de l’eau de mer filtrée avec une salinité de 32 psu à 18 ° C sous un cycle lumière:obscurité de 12:12 avec un changement complet de l’eau tous les deux jours.
Au fur et à mesure que les larves de sables se développaient, la limite thermique supérieure est passée de 28,6 °C (± 0,02 °C S.E) 2 jours après la fécondation à 28,8 °C (± 0,02 °C S.E) 4 jours après la fécondation et à 29,3 °C (± 0,02 °C S.E) 6 jours après la fécondation (figure 3). Ces limites thermiques supérieures suggèrent que les dollars de sable vivent dans leur limite thermique pendant la température moyenne de la surface de la mer en été de ~ 20 ° C ou moins le long de la côte du Pacifique. Cependant, avec l’augmentation de la fréquence et de l’intensité des vagues de chaleur marines, la température maximale continue d’augmenter. Un pic de température de 26,4 °C a été enregistré dans le sud de la baie de Californie en août 2018 (Fumo et al.24). Étant donné que cette espèce se reproduit au printemps et en été, la survie de son stade précoce de vie est susceptible de diminuer pendant ces événements extrêmes. La survie prévue diminuerait de 10 % lorsque la température atteindrait 26,5 °C.
Les comparaisons par paires utilisant le test de rapport mis au point par Wheeler et coll.25 suggèrent que la température létale médiane était significativement différente entre les trois groupes d’âge (p < 0,001). Les stades précoces (gastrula et prismes précoces âgés de 2 jours) étaient plus sensibles au stress thermique que les larves plus âgées. Cette observation suggère que la limite thermique déduite d’un seul point temporel de développement n’est pas représentative de cette espèce tout au long de son cycle biologique.
Figure 1: Schéma étiqueté du bloc thermique. (A) Vue de dessus de la configuration avec tous les composants connectés. (B, D) Placement et connexions pour les bornes de chauffage. (C,E) Mise en place de l’échangeur de chaleur (élémenet de refroidissement) et des tubes associés au bain-marie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Variations de température dans le bloc thermique sur 1 h avec des extrémités réglées à 15 et 37 °C . (A) Un gradient linéaire a été obtenu en 1 h. La modification des paramètres des points de terminaison varie la plage de température, et la plage la plus large était de 14 °C à 40 °C. (B) La différence de température entre les rangées répliquées était négligeable (<0,8 °C); les données de deux lignes répliquées ont été tracées pour chaque paramètre en (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Survie des larves de dollars des sables (Dendraster excentricus) dans une plage de température de 19 à 37 °C jusqu’à l’ontogenèse (2, 4 et 6 jours après la fécondation [dpf]). Chaque référence représente la proportion de larves qui ont survécu à une incubation de 2 heures à la température spécifique suivie d’une période de récupération de 1 heure. Une régression logistique a été réalisée à l’aide du modèle linéaire généralisé avec distribution binomiale dans le logiciel statistique R. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Un script R pour générer des courbes logistiques pour l’ensemble de données avec un exemple pas à pas. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 2 : Un script R pour générer des estimations LT50 . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce protocole fournit une approche accessible et personnalisable pour déterminer les limites thermiques des petits organismes planctoniques lors d’une exposition thermique aiguë. La conception à 10 trous et les paramètres de température flexibles, contrôlés par le bain-marie à l’extrémité inférieure et le chauffage à l’extrémité supérieure, permettent de déterminer LT50 avec précision. En utilisant cette approche, une différence dans la limite thermique de <1 °C a pu être détectée (Figure 3). Cette approche permet de déterminer rapidement les limites thermiques (en heures) pour une variété d’espèces, et les valeurs résultantes ont été appliquées à plusieurs modèles de distribution d’espèces 2,21. Cependant, il est important de noter que l’exposition aiguë fournit probablement une estimation différente de la tolérance thermique par rapport à l’exposition chronique 8,26.
L’un des principaux avantages de la conception actuelle est que 10 traitements thermiques et six répétitions sont inclus dans un faible encombrement (20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm). Les publications précédentes utilisant une approche de gradient thermique similaire pour déterminer les limites thermiques utilisaient des barres d’aluminium plus grandes (180 cm x 10 cm x 6 cm en 27, 91 cm × 25 cm × 15 cm en 10 et 60 cm x20 cm en 17). Alors que les bains secs qui retiennent une seule température sont plus petits (par exemple, 18,5 cm x 18,5 cm x 2,5 cm) et offrent plusieurs répétitions, plusieurs unités (plus de quatre) sont nécessaires pour générer une courbe de performance qui inclut plusieurs températures, ou les expériences doivent être répétées au fil du temps, ce qui pourrait introduire des facteurs de confusion. La conception du bloc de chaleur réduit à la fois le coût de fabrication et les besoins en espace. La fabrication peut être complétée avec une perceuse, ou les chercheurs sans accès immédiat à une fraiseuse pourraient opter pour des services d’usinage CNC commerciaux. L’utilisation de pièces disponibles dans le commerce contrôle davantage le coût de fabrication. Si l’on peut utiliser un bain-marie de chauffage / refroidissement existant ou des refroidisseurs d’aquarium, le coût restant des pièces s’élève à moins de 350 $. Sinon, des refroidisseurs d’aquarium pour un aquarium de 10 gallons (~ 35 L) peuvent être achetés pour < 150 $.
La conception actuelle peut être modifiée pour répondre aux besoins du chercheur. Si les organismes cibles sont de plus grande taille, les flacons à scintillation sont de bons contenants alternatifs, et des trous plus grands seraient nécessaires. Cela dit, le bloc d’aluminium est amovible dans la conception actuelle, de sorte que plusieurs blocs peuvent être fabriqués et échangés pour répondre aux besoins expérimentaux. Si le but de l’expérience est de déterminer une limite thermique inférieure ou de se concentrer sur les organismes polaires, il est plus approprié de placer des blocs d’eau de refroidissement aux deux extrémités du bloc d’aluminium principal.
À l’instar d’autres études sur le zooplancton, le protocole actuel n’inclut pas de phase de refroidissement progressif20,27. Les chercheurs peuvent envisager de retirer les tubes de microcentrifugeuses par paires et de les déplacer vers le bas du gradient de température (c.-à-d. inverser les étapes 3.9-3.12) pour obtenir un refroidissement progressif si leurs organismes d’étude sont sensibles à une baisse soudaine de la température.
L’utilité de cette configuration peut être diminuée par plusieurs facteurs, à savoir le choix (1) des réglages de température du point final, (2) de la durée d’exposition et de récupération, et 3) de la métrique utilisée pour déterminer l’état binomial (vivant vs mort; développé vs non développé). Pour remédier à ces limites potentielles, des tests préliminaires sont fortement recommandés.
Étant donné que la régression logistique suppose une distribution binomiale, les critères d’évaluation avec une survie et une mortalité de 100 % sont préférés. Pour les organismes marins, une plage de départ raisonnable serait la température annuelle moyenne à la surface de la mer du site de collecte plus 10-15 °C. On peut alors réduire la plage de température étudiée après un tel essai initial, car plus la différence de température entre les trous est petite, plus l’estimation LT50 est affinée.
La durée de l’exposition et du rétablissement est propre à l’espèce. Par exemple, Kuo et al.27 ont permis aux buccins juvéniles (Nucella canaliculata) de se rétablir pendant 24 heures, tandis que Hammond et al.28 ont permis aux larves d’oursins pourpres (Stronglylocentrotus purprtaus) de se rétablir pendant 1 h. On pourrait effectuer une courte expérience pour déterminer si le nombre de morts vivants diffère entre les périodes de récupération. Selon la définition de l’état binomial choisi (par exemple, vivant ou mort), le temps de récupération peut ne pas être nécessaire. Si le but de l’expérience est de tester si les processus de développement, tels que le clivage et la gastrulation, se produisent dans une gamme de températures. En d’autres termes, l’état binomial utilisé dans le modèle serait développé par rapport à non développé 8,19,21. Des fixateurs tels que le paraformaldéhyde à 4% doivent être ajoutés aux échantillons pendant la période d’exposition thermique sans aucun temps de récupération.
Pour assurer un comptage et une détermination précis de l’état binomial (vivant ou mort; développé ou non développé), il est conseillé de compter les échantillons après le temps de récupération dans un ordre aléatoire afin d’éviter les biais potentiels de l’observateur. S’il y a suffisamment de personnel, différents chercheurs pourraient compter les lignes répliquées et comparer leurs résultats. Alternativement, les individus peuvent compter à plusieurs reprises un petit sous-ensemble des échantillons et vérifier si les chiffres sont cohérents.
Une autre limitation potentielle est l’absence d’estimation des erreurs de la LT50 à partir d’échantillons indépendants29. La méthode actuelle d’analyse des données fournit un intervalle de confiance de 95 % le long de la courbe logistique ajustée (fichier de codage supplémentaire 1) et une erreur-type de la LT50 (fichier de codage supplémentaire 2). Ces limites d’erreur sont générées par le processus d’ajustement de la courbe, et non par de multiples mesures d’individus de la population échantillonnée. Étant donné que la conception actuelle du bloc thermique comporte six rangées, on peut ajuster les données de chaque rangée pour générer six estimations LT50 et obtenir les estimations d’erreur basées sur l’observation.
En résumé, une approche accessible pour déterminer les limites thermiques aiguës qui peuvent être appliquées à une grande variété de zooplancton est présentée. Cette configuration peut être utilisée pour déterminer les limites thermiques de divers organismes et pour identifier les stades de développement vulnérables. Cette information peut aider à améliorer la prévision de la performance des organismes et des interactions potentielles entre les communautés face au changement climatique mondial.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le Faculty Research Fund du Swarthmore College [KC] et la bourse de recherche d’été Robert Reynolds et Lucinda Lewis '70 pour BJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
