Summary
식이 유발 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술의 사용을 설명하며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞춥니다.
Abstract
비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 전 세계적으로 증가하는 건강 문제이며 NAFLD의 영향은 현재 효과적인 치료법의 부족으로 인해 더욱 악화되고 있습니다. NAFLD의 시기 적절하고 정확한 진단(등급 지정 포함) 및 모니터링과 잠재적 치료법의 개발을 방해하는 상당한 제한 요소는 간 미세 환경 구조의 특성화와 시공간 및 비침습적 방식으로 질병 단계의 채점의 현재 부적절함입니다. 식이 유도 NAFLD 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영(CT) 이미징 기술의 사용을 조사했으며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞췄습니다. 이 이미징 방법론을 통해 간 지방증 및 기능적 조직 흡수의 종단 분석은 물론 상대적인 혈액량, 문맥 직경 및 혈관 네트워크 밀도를 평가할 수 있습니다. NAFLD 진행 동안 간혈관 네트워크의 적응을 이해하고 이를 제안된 방법을 사용하여 질병 진행(지방증, 염증, 섬유증)을 특성화하는 다른 방법과 연관시키면 생쥐의 NAFLD 연구를 위한 새롭고 보다 효율적이며 재현 가능한 접근 방식을 확립하는 길을 열 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 질병 진행에 대한 새로운 치료법의 개발을 조사하기 위한 전임상 동물 모델의 가치를 업그레이드할 것으로 예상됩니다.
Introduction
비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 인구의 약 25%와 병적 비만인의 >80%에 영향을 미치는 대사성 질환입니다1. 이들 중 약 1/3은 간 지방증, 염증 및 섬유증을 특징으로 하는 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행된다2. NASH는 간경변 및 간세포 암종(HCC)의 발병 위험이 상당히 높은 질병 단계입니다.3,4. 이러한 이유로 NASH는 현재 간 이식의 두 번째로 흔한 원인이며 곧 간 이식의 가장 중요한 예측 인자 5,6,7가 될 것으로 예상됩니다. 유병률과 중증도에도 불구하고 NAFLD에 사용할 수 있는 질병 특이적 치료법은 없으며 기존 치료법은 인슐린 저항성 및 고지혈증과 같은 질병 관련 병리를 해결하는 것만을 목표로 합니다 5,6.
최근 몇 년 동안, 내피의 병태생리학적 역할과 적응, 그리고 일반적으로 지방 조직 및 간과 같은 대사 조직의 혈관 네트워크의 적응은 특히 비만 및 대사 조절 장애 동안 연구에서 더욱 중요해지고 있습니다 7,8. 내피는 내부적으로 혈관 네트워크를 둘러싸고 있는 세포 단층으로 기능적 및 구조적 장벽 역할을 합니다. 또한 혈전증, 대사 산물 수송, 염증 및 혈관 신생과 같은 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에 기여합니다 9,10. 간의 경우, 혈관 네트워크는 다른 특징들 중에서도 간 정현파 내피 세포 (LSEC)로 정의되는 고도로 전문화 된 세포의 존재를 특징으로합니다. 이 세포에는 기저막이 없고 여러 개의 회향부가 있어 혈액과 간 실질 사이의 기질을 더 쉽게 전달할 수 있습니다. 독특한 해부학적 위치와 특성으로 인해 LSEC는 NAFLD/NASH 동안 간 염증 및 섬유증의 발병을 포함하여 간의 병태생리학적 과정에서 중요한 역할을 할 가능성이 높습니다. 실제로, LSEC가 NAFLD 과정에서 겪는 병리학적, 분자적, 세포적 적응은 질병 진행에 기여한다11. 특히, NAFLD 동안 발생하는 LSEC 의존성 간 혈관 신생은 염증의 발병 및 NASH 또는 HCC12로의 질병 진행과 유의하게 관련이 있습니다. 게다가, 비만 관련 초기 NAFLD는 LSEC에서 인슐린 저항성의 발달을 특징으로 하며, 이는 간 염증 또는 기타 진행된 NAFLD 징후의 발병에 선행한다13.
또한, LSEC는 최근 여러 병인의 간 질환 동안 간 혈류 및 혈관 네트워크 적응의 중심 조절자로 부상했다14,15. 실제로 만성 간질환은 현저한 간내 혈관 수축과 혈류에 대한 저항성 증가를 특징으로 하며, 이는 문맥압항진증의 발병에 기여한다16. NAFLD의 경우 여러 LSEC 관련 메커니즘이 이러한 현상에 기여합니다. 예를 들어, LSEC 특이적 인슐린 저항성은 상기 언급된 바와 같이 간 맥관 구조의 인슐린 의존성 혈관 확장 감소와 관련이 있다13. 게다가, 질병이 진행되는 동안 간 혈관 구조는 혈관 수축 물질에 더 민감해져서 간 혈류의 손상에 더욱 기여하고 전단 응력의 출현으로 이어지며, 이는 둘 다 정현파 미세순환을 방해한다17. 이러한 사실은 맥관 구조가 간 질환의 핵심 표적임을 시사합니다. 그럼에도 불구하고 NAFLD/NASH의 적시 진단 및 모니터링과 잠재적 치료법의 개발을 방해하는 제한 요인은 간 미세 환경 및 (미세)혈관 구조의 일관된 특성화의 부적절함과 시공간 및 비침습적 방식으로 질병 단계의 점수 매기기.
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상은 현재 살아있는 유기체 내의 해부학적 정보를 정확하게 묘사하기 위한 표준 비침습적 영상 방법입니다. Micro-CT와 MRI는 광범위한 병리를 포괄할 수 있고 영상화된 구조와 조직에서 탁월한 해상도와 디테일을 제공할 수 있는 두 가지 보완적인 영상 방법을 나타냅니다. 특히 마이크로 CT는 매우 빠르고 정확한 도구로, 뼈 질환 및 관련 골 표면 변화18와 같은 병리를 연구하고, 시간 경과에 따른 폐 섬유증의 진행을 평가하며19, 폐암과 그 병기20를 진단하고, 심지어 치과 병리21를 검사하는 데에도 자주 사용되며, 영상화되는 샘플의 특별한 준비(또는 파괴)가 없다.
micro-CT의 이미징 기술은 X선과 물질의 상호 작용 측면에서 다양한 장기의 다양한 감쇠 특성을 기반으로 합니다. 높은 X선 감쇠 차이를 나타내는 장기는 CT 이미지에서 높은 대비로 묘사됩니다(즉, 폐는 어둡고 뼈는 밝게 나타남). 매우 유사한 감쇠 특성(다른 연조직)을 나타내는 장기는 CT 영상에서 구별하기 어렵다22. 이러한 한계를 해결하기 위해 요오드, 금 및 비스무트를 기반으로 하는 특수 조영제가 생체 내 사용을 위해 광범위하게 조사되었습니다. 이들 작용제는 축적된 조직의 감쇠 특성을 변화시키고, 순환계에서 서서히 제거되며, 전체 혈관계 또는 선택된 조직의 균일하고 안정적인 혼탁을 가능하게 한다23.
인간 진단에서 CT 영상 및 MRI 유래 양성자 밀도 지방 분율과 같은 유사한 기술은 이미 간 지방 함량24,25의 측정에 사용되고 있습니다. NAFLD의 맥락에서 높은 연조직 대비는 병리학적 병변이나 작은 혈관을 정확하게 구별하는 데 필수적입니다. 이를 위해, 간 조직 특성의 향상된 조영제를 제공하는 조영제가 활용된다. 이러한 도구와 재료를 사용하면 혈관 네트워크의 구조 및 밀도, 지질 침착/지방증, 간에서 기능적 조직 흡수/지질(유미미크론) 전달과 같은 여러 간 특성 및 가능한 병리학 발현을 연구할 수 있습니다. 또한 간 상대 혈액량과 문맥 직경도 평가할 수 있습니다. 매우 짧은 스캔 시간에 이러한 모든 매개변수는 NAFLD의 평가 및 진행에 대한 다양하고 보완적인 정보를 제공하며, 이는 비침습적이고 상세한 진단을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
이 기사에서는 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 마이크로 CT 이미징 기술을 사용하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여 간 지방증 및 기능적 조직 흡수의 종단 분석뿐만 아니라 상대 혈액량, 문맥 직경 및 혈관 네트워크의 밀도를 평가하여 간 질환의 마우스 모델에 적용하고 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 유럽 및 국가 복지 규정에 따라 BIOEMTECH의 직원에 의해 수행되었으며 국가 당국의 승인을 받았습니다(라이센스 번호 EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). 모든 실험은 ARRIVE 지침26을 준수하여 설계 및 보고되었습니다. 마우스는 그리스 아테네에 있는 그리스 파스퇴르 연구소에서 구입하였다.
참고: 동물들은 상대 습도가 50%-60%이고 12시간의 명암 주기(밝은 07:00 am-07:00 pm)로 20-22°C의 방에서 레일과 판지 튜브가 풍부한 개별 환기 케이지에 그룹 수용되었습니다. 고지방 식단(HFD)과 고과당 옥수수 시럽(HFCS)의 조합, 현대식 지방 강화 식단에 널리 사용되는 과당 및 포도당 함유 감미료는 NAFLD를 인정된 신뢰할 수 있는 모델로 유도하는 데 사용되었습니다 27,28,29,30. 7-8주령에 수컷 C57BL/6 마우스는 22주 동안 지방에서 킬로칼로리의 10%를 섭취하는 정상 식단(n = 2) 또는 22주 동안 물에 5% HFCS가 보충된 지방의 킬로칼로리 60%를 함유한 HFD(n = 2)에 임의로 접근할 수 있었습니다. 디지털 저울을 사용하여 매주 체중을 구하고, 실험 기간 동안 점수표를 사용하여 격일로 동물 복지를 모니터링했습니다. 이미징 프로토콜이 끝나면 마우스는 자궁 경부 탈구를 통해 안락사되었습니다.
1. 동물 준비
참고: 이미징 프로토콜은 그림 1에 요약되어 있습니다.
- 3%-4% 이소플루란(실내 공기)을 사용하여 마우스를 마취시키고 전용 가열 패드를 사용하여 체온을 유지합니다.
알림: 스캔을 시작하기 전에 충분한 마취 깊이를 확인하기 위해 페달 인출 반사가 없는 경우 사용해야 합니다. - 실험 전에 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
- CT 스캐너 크래들에 동물을 놓고 노즈 콘을 고정한 다음 유지 관리를 위해 1.5%-3% 이소플루란(실내 공기)으로 전환합니다.
알림: 페달 철수 반사가 없는 경우 마취 유지를 위한 적절한 비율의 이소플루란을 확인해야 합니다. - 마우스를 지속적으로 모니터링하십시오.
2. 사전 스캔 준비
참고: 이미징은 첫 번째 조영제가 순환계와 조직에서 적절하게 제거될 수 있도록 두 가지 실험 단계에서 수행됩니다. eXIA(첫 번째 조영제)는 아래 "이미징 워크플로" 섹션(섹션 3)에 설명된 대로 첫 번째 단계에서 투여되고 ExiTron(두 번째 조영제)은 두 번째 단계에서 투여됩니다.
- 조영제(실험 단계에 따라 eXIA 또는 ExiTron)가 3시간 동안 실온에 도달할 때까지 기다립니다.
- CT 스캐너에서 50kVp 튜브 전압 및 460μA 전류, 비나선형, 720회 돌출/회전, 4회전 및 4분 획득 시간에서 고분해능 프로토콜과 같은 스캐닝 매개변수를 설정합니다.
3. 이미징 워크플로
- 실험 단계 1
- 최대 조영제를 위해 체중 6μL/g의 희석되지 않은 용량으로 투여할 첫 번째 조영제의 부피를 계산하고 준비합니다.
- 꼬리 정맥 카테터를 식염수로 채우고 조영제로 채워진 주사기에 연결하여 준비합니다.
- 조영 전 전신(WB) 및 간 기준선 스캔을 획득합니다.
- 주사기 또는 카테터에 기포나 막힘이 없는지 확인하십시오.
- 미리 채워진 카테터를 꼬리 정맥에 삽입하고 1-3분 동안 천천히 수동으로 수행되는 주사를 통해 조영제를 투여합니다(일시 주사가 아님). 주사기 펌프는 적절한 주입 속도로 설정하면 사용할 수 있습니다.
참고: 동물의 꼬리를 미지근한 물에 넣어 혈관 확장을 유도하고 카테터 삽입을 도울 수 있습니다 - 표 1에 표시된 대로 서로 다른 시점에서 WB 및 간 스캔을 획득합니다.
참고: 모든 지점을 획득할 수 없는 경우 최대 간 흡수 지점인 주사 후 45분(PI)과 클리어런스에 도달하는 48시간 PI에 초점을 맞춰야 합니다.
- 실험 단계 2
- 제1 조영제(48 h PI)로 최종 판독한 후 10일 후에 제2 조영제를 투여하기 위해 섹션 1에 기재된 바와 같이 마우스를 다시 준비한다.
- 2.1-2.2단계를 수행합니다.
- 최대 조영제를 위해 체중 8μL/g의 희석되지 않은 용량으로 투여할 두 번째 조영제의 부피를 계산하고 준비합니다.
- 꼬리 정맥 카테터를 식염수로 채우고 조영제로 채워진 주사기에 연결하여 준비합니다.
- 상대 혈액량과 간 지방증을 평가하기 위해 사전 조영 WB 및 간 기준선 스캔을 획득합니다.
- 첫 번째 조영제의 완전한 제거를 나타내는 표시로 스캔에서 조영제가 감지되지 않는지 확인하십시오.
- 미리 채워진 카테터를 꼬리 정맥에 삽입하고 1-3분 동안 천천히 수동으로 수행되는 정맥 주사를 통해 조영제를 투여합니다(일시 주사가 아님). 주사기 펌프는 적절한 주입 속도로 설정하면 사용할 수 있습니다.
- 표 1에 표시된 대로 서로 다른 시점에서 WB 및 간 스캔을 획득합니다.
참고: WB 스캔은 10분 4시간 PI에 획득됩니다. 그들 사이의 상당한 시간 경과는 신체의 추적자 생체 분포와 상대적 클리어런스를 평가할 수 있습니다.
4. 데이터 추출 및 분석
참고: 이 프로토콜에서는 특정 이미징 처리 소프트웨어( 재료 표 참조)를 기반으로 하는 데이터 추출 및 분석 단계가 제공됩니다. 설명된 단계는 다른 소프트웨어를 사용할 때 조정해야 할 수 있습니다.
- 간 지질 침착/지방증의 평가.
참고: 간 지방증의 평가를 위해 조영제를 사용하지 않고 대조군과 병리를 비교합니다. 상이한 마우스들 사이의 조직 감쇠 특성의 상대적으로 높은 편차로 인해, 밀도 값은 비장 (무 지방 조직) 및 지방 (절대 지방 조직)에 대해 하기 식에 따라 그리고 앞서 기술된 바와 같이 표준화된다25:
- 분석을 수행하려면 DICOM 로드 file 조영 전 스캔의 경우 간, 비장 및 백색 지방 조직(WAT)이 명확하게 보이도록 막대/대비를 조정합니다.
- 전면 패널의 도구 풀다운 메뉴를 통해 Modelling Operator 도구에 액세스하고 3D ROI 도구를 선택합니다.
- 3D ROI 연산자에서 ROI 추가를 선택하여 여러 ROI(각 조직에 대해 최대 8개)를 생성하여 간(가급적이면 왼쪽 내측엽, 오른쪽 내엽 및 왼쪽 외측엽 영역)과 비장이 뚜렷한 혈관과 지방 없이 선명하게 보이는 영역에서 샘플링을 수행합니다.
참고: WAT의 경우 ROI는 내장 지방 조직 저장소의 중간에서 선택됩니다. 권장 영역은 그림 2에 나와 있습니다. WAT를 포함하지 않고 간/비장 비율을 사용하는 정규화 방법도 이전에 확립된 바와 같이 적용될 수 있다(31). - 3D 페인트 모드 및 침식/확장 기능에서 2D를 선택하고 표시되는 인터페이스를 사용하여 각 ROI의 이름과 색상을 지정합니다.
- 지름이 8픽셀인 구 페인트 ROI 도구를 사용하여 2D ROI를 수동으로 그립니다.
- 그림 3A와 같이 횡단면에서 Cross Hair 도구를 사용하여 관심 영역에서 2D ROI를 분할하여 샘플링을 수행합니다.
- 그림 3B와 같이 시상면과 관상면(sagittal and coronal plane)에서 선택한 점을 클릭하여 2D ROI의 분할을 완료합니다.
- 나머지 ROI를 정의하는 프로세스를 반복합니다.
알림: 샘플링할 때 장기 경계 영역을 피하면 노이즈가 발생하고 각 ROI의 계산된 Hounsfield 단위(HU) 값의 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다. - 분할된 ROI가 만족스러우면 탐색으로 이동하고 테이블 표시를 선택하여 각 ROI에 대해 계산된 HU 값이 포함된 정량화 테이블을 표시합니다.
참고: 관심 있는 값은 관심 기관에 대한 ROI에 포함된 복셀(HU)의 수치 평균값을 포함하는 "평균" 열에 나열됩니다. 관심 있는 값을 기록하거나 테이블 내보내기를 선택하여 전체 테이블을 저장합니다. - 간, 비장 및 WAT의 평균 HU를 계산하고 값을 위의 방정식에 대입하여 간 지방의 백분율을 계산합니다.
- 간에서 기능적 조직 흡수/지질(유미미크론) 전달
참고: 기능적 조직 흡수/지질(유미미크론) 전달은 이전에 발표된 방법32에 따라 첫 번째 조영제 주입 후 45분 및 48시간에 획득한 스캔에서 분석됩니다. 대비는 아래 방정식을 사용하여 다른 조직과 시점에 대해 계산됩니다.
PV 기관 ti는 시간 ti(0h에서 48h까지의 범위)에서 기관 내의 평균 픽셀 값이고, PV 기관t0는 콘트라스트가 없는 이미지 내의 기관 내의 평균 픽셀 값이다.- 이 분석을 수행하려면 eXIA 스캔 DICOM 파일을 로드하고 막대/대비를 조정하여 간, 비장 및 좌심실을 명확하게 볼 수 있습니다.
- 전면 패널의 도구 풀다운 메뉴를 통해 Modelling Operator에 액세스하고 3D ROI 도구를 선택합니다.
- 3D ROI 연산자에서 ROI 추가를 선택하여 간에 대한 여러 ROI를 세그먼트화합니다.
- 3D 페인트 모드 및 침식/팽창 기능에서 지름이 8픽셀이고 침식이 -1인 구 페인트 ROI 도구를 사용합니다.
참고: 각 장기가 명확하게 나타나는 슬라이스에서 여러 ROI를 선택합니다. 경계 지역은 노이즈를 유발하고 각 ROI의 계산된 HU 값의 신뢰성에 영향을 줄 수 있으므로 피하십시오. 그 결과 작은 장기 부피에 해당하는 여러 3D ROI가 샘플링됩니다. - 표시되는 인터페이스를 사용하여 각 ROI의 이름과 색상을 지정합니다.
- 설계된 ROI가 만족스러우면 탐색으로 이동하고 테이블 표시를 선택하여 각 ROI에 대해 계산된 HU 값이 포함된 정량화 테이블을 표시합니다.
참고: 관심 있는 값은 ROI에 포함된 복셀(HU)의 숫자 평균값을 표시하는 "평균" 열 아래에 나열됩니다. 각 장기의 ROI의 평균 HU 값은 PV 기관 ti에 해당합니다. 관심 있는 값을 기록하거나 테이블 내보내기를 선택하여 전체 테이블을 저장합니다. - PV 기관 t0을 얻으려면 조영제 주입 전에 간, 비장 및 좌심실의 평균 밝기를 계산하기 위해 사전 조영제 DICOM 파일을 사용하여 위의 모든 단계를 반복합니다.
- 위의 방정식에 값을 삽입하여 기능성 조직 흡수/지질(유미미크론) 전달에 해당하는 백분율 대비를 추출합니다.
- 간혈관 네트워크의 구조와 밀도
참고: 간혈관 네트워크의 구조와 밀도 분석은 이전에 발표된 방법론을 기반으로 합니다33 및 제2 조영제의 10분 PI를 얻은 간 스캔에 대해 수행된다.- 이 분석을 수행하려면 ExiTron 스캔 DICOM 파일을 로드하고 막대/대비를 조정하여 간 혈관 네트워크를 명확하게 볼 수 있습니다.
- 전면 패널의 도구 풀다운 메뉴를 통해 Modelling Operator 에 액세스하고 3D ROI 도구를 선택합니다.
- 3D ROI 연산자에서 ROI 추가를 선택하여 간에 대한 3D ROI를 생성합니다.
- 3D 페인트 모드 및 침식/확장 기능에서 3D를 선택합니다.
참고: -1 erode와 함께 Sphere paint ROI 도구를 사용하여 관상 평면을 가로지르는 분할 레이어를 정의합니다. ROI 페인팅 도구의 지름은 각 레이어에 따라 조정해야 합니다(원하는/원하지 않는 복셀 선택 항목을 추가/삭제하기 위해). 간 부피는 처음에 관상면을 가로질러 정의한 다음 횡방향 및 시상면을 사용하여 ROI를 보정할 수 있습니다. 이 프로세스에는 정밀도가 필요합니다. 사용자는 각 ROI 층을 분할할 때 다른 조직, 혈관 및 뼈를 포함하지 않도록 매우 주의해야 하며 간의 모든 영역이 정의된 ROI에 포함되도록 해야 합니다. 이러한 이유로 간의 해부학 적 경계를 숙지하는 것이 중요합니다. - 결과적인 간 ROI가 만족스러우면 초기에 분할된 간 ROI에 속하지 않는 모든 복셀을 이미지 데이터에서 제거하기 위해 절단을 수행합니다. 이를 위해 ROI 선택기에서 간 ROI를 선택하고 컷 수행 아이콘을 클릭합니다. 이 작업은 배경을 제거하고 간 ROI를 변경하지 않고 그대로 둡니다.
참고: 실행 취소/다시 실행 기능은 3D ROI 도구에서 수행되는 모든 작업에 적용할 수 있지만 ROI 절단 작업은 실행 취소할 수 없습니다. 따라서 이 작업을 수행하기 전에 사용자는 초기 간 ROI를 DICOM 형식으로 저장하는 것을 고려할 수 있습니다. - 결과 간 ROI에는 제거해야 하는 혈관 네트워크와 주변 조직이 포함됩니다. 이를 위해 ROI 빗 자루 재설정 버튼을 클릭하여 간 ROI를 재설정하십시오.
- 간 ROI의 모든 픽셀을 배경으로 전송하는 것으로 나타나는 인터페이스를 사용합니다.
참고: 간 ROI는 이 수술 후에도 계속 존재하지만 더 이상 복셀을 포함하지 않습니다. - 혈관 관련 픽셀만 포함하도록 간 ROI를 다시 분할하려면 마술 지팡이 아이콘으로 표시된 분할 알고리즘 으로 이동하여 연결된 임계값을 선택합니다.
- 임계값을 적용하기 전에 입력 드롭다운 메뉴에서 ROI를 Output 으로 정의하고 배경을 Input 으로 정의합니다.
- 각 임계값 필드 왼쪽에 있는 최소 및 최대 아이콘을 클릭하여 임계값을 설정하여 최대값과 최소값을 채우고 혈관망을 얻습니다.
참고: 선택한 범위 내의 픽셀만 결과 ROI에 포함됩니다. 서로 다른 동물 사이의 역치를 조정하면 각 동물에 주입되는 조영제의 정확한 양과 관련하여 동일한 해부학적 영역이 고려됩니다. 이는 선택된 조직들 사이에서 일정하며, 수치가 동일하지 않더라도 상수이다. - Cross Hair 도구를 사용하여 혈관 네트워크가 선명하게 나타나는 지점을 클릭하고 Apply를 클릭하여 분할을 수행합니다.
- 최대 강도 프로젝션(MIP) 뷰어를 활성화합니다.
- MIP 보기에서 혈관 네트워크가 얼마나 명확하게 나타나는지에 대한 결과 간 ROI를 평가합니다.
- 조직이 간 ROI의 일부에 남아 있는 경우 분할된 간 ROI가 혈관 네트워크를 명확하게 나타낼 때까지 최소 임계값을 조정하여 4.3.5-4.3.11단계를 반복합니다.
- 결과 간 ROI가 만족스러우면 계산된 간 ROI 부피(입방 밀리미터)를 포함하는 정량화 테이블을 생성합니다.
참고: 관심 있는 값은 간 ROI에 포함된 복셀(HU)의 숫자 부피 값을 포함하는 "mm3" 열에 나열됩니다. 관심 있는 값을 기록하거나 테이블 내보내기를 선택하여 전체 테이블을 저장합니다.
- 간 상대 혈액량
참고: 섬유증 진행 동안 새로 형성된 혈관의 양과 유의미한 상관관계가 있는 간 상대 혈액량(rBV) 측정을 위해 조영 전 스캔 및 두 번째 조영제 주입 후 4시간 스캔이 사용됩니다. 분석은 앞서 기술한 바와 같이 수행된다(34).- 이 분석을 수행하려면 ExiTron 스캔 DICOM 파일을 로드하고 막대/대비를 조정합니다.
참고: MIP 뷰어 비활성화: 기본 설정에서 MIP 뷰어를 비활성화하는 확인란을 선택합니다. 큰 데이터 세트의 경우 로딩 속도를 향상시킬 수 있습니다. - 전면 패널의 도구 풀다운 메뉴를 통해 Modelling Operator 에 액세스하고 3D ROI 도구를 선택합니다. 이 도구는 2D 및 3D 영역을 모두 그리고, 시각화하고, 저장하고, 정량화하기 위한 고급 옵션을 제공합니다.
- 3D ROI 연산자에서 ROI 추가를 선택하고 간과 큰 혈관에 대한 ROI의 두 가지 ROI를 분할합니다.
- 3D 페인트 모드 및 침식/팽창 기능에서 2D를 선택합니다.
알림: 간은 직경이 8-10픽셀, 혈관은 4-6픽셀인 Sphere 페인트 ROI 도구를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 페인트 도구 직경은 선택할 영역이 얼마나 작은지에 따라 조정할 수 있습니다. - 표시되는 인터페이스를 사용하여 각 ROI의 이름과 색상을 지정합니다.
참고: 관심 있는 조직의 중앙 부분 중 2-5개 슬라이스를 선택하고 분할 레이어를 정의하여 각 조직에 대한 2D ROI를 생성합니다. 각 슬라이스의 영역을 선택할 때 그림 4와 같이 장기 경계 영역을 피하면 노이즈가 발생하고 각 ROI의 계산된 HU 값의 신뢰성에 영향을 줄 수 있습니다. - 설계된 ROI가 만족스러우면 탐색으로 이동하고 테이블 표시를 선택하여 각 ROI에 대해 계산된 HU 값이 포함된 정량화 테이블을 표시합니다.
참고: 관심 있는 값은 ROI에 포함된 복셀(HU)의 숫자 평균값을 표시하는 "평균" 열 아래에 나열됩니다. 관심 있는 값을 기록하거나 테이블 내보내기를 선택하여 전체 테이블을 저장합니다. - 조영제 주입 전 간의 평균 밝기를 얻기 위해 사전 조영제 DICOM 파일에 대해 모든 단계를 반복합니다. 이를 위해 간에만 4.4.2-4.4.5 단계를 수행하십시오.
- 동등한 시점에서 각 조직에 대한 평균 HU 값을 계산하고 얻은 값을 아래 방정식에 삽입합니다.
참고: 조영제 주사 후 큰 혈관은 100% rBV로 간주되고 조영제 투여 전의 간은 0% rBV로 간주됩니다.
- 이 분석을 수행하려면 ExiTron 스캔 DICOM 파일을 로드하고 막대/대비를 조정합니다.
- 문맥 직경
참고: 문맥 직경 측정의 경우, 간 rBV 측정에 사용된 것과 동일한 스캔이 이전에 설명된 대로 분석됩니다35.- ExiTron 스캔 DICOM 로드 file, 막대/대비를 조정합니다.
- 상부 장간막과 비장 정맥의 접합부 위에 3-4 개의 슬라이스의 횡단면을 찾습니다 (그림 5).
- 눈금자 도구를 사용하여 두 점 사이의 정확한 거리(즉, 원형 정맥 영역의 직경)를 측정합니다.
참고: 이미지는 거리가 추출되지만 탐색 으로 이동하여 테이블 표시를 선택하여 계산된 거리가 포함된 정량화 테이블을 표시하거나 테이블 내보내기 를 선택하여 결과를 저장할 수도 있습니다.
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Representative Results
이 대표적인 연구에서 조영제가 없는 마이크로 CT 영상은 대조군에 비해 NAFLD가 있는 마우스에서 간 지방 비율이 더 높은 것으로 나타났으며(표 2), 병리를 확인했습니다. 위에서 설명한 ExiTron 조영제와 간혈관 네트워크 구조 및 밀도 분석을 사용하여 간혈관 네트워크의 총 부피 밀도는 건강한 대조군에 비해 NAFLD가 있는 마우스에서 더 높은 것으로 나타났습니다(그림 6, 표 2). NAFLD를 가진 마우스는 또한 대조군 마우스에 비해 더 큰 문맥 직경을 가졌으며(표 2), 간 질환 동안 문맥압항진과 관련된 구조적 변화34,36,37. 유사하게, NAFLD를 가진 동물의 간 rBV는 건강한 대조군에 비해 더 높은 것으로 계산되었습니다(표 2).
또한, 기능적 조직 흡수 분석의 분석은 건강한 대조군에 비해 NAFLD가 있는 마우스에서 eXIA 조영제의 축적이 더 높고 제거율이 더 느린 것으로 나타났습니다(그림 7). 이러한 결과는 지방성 간세포가 높은 수준의 세포 세포내이입 및 분포를 겪을 가능성이 있지만 대사 이화작용 또는 제거/분비 감소를 동반할 가능성이 있음을 시사합니다. 전반적으로, 이 발견은 지방 침윤/NAFLD38,39의 경우 예상되는 바와 같이 감소된 간 대사 활동의 표현형과 일치합니다.
그림 1: 실험 프로토콜의 개요를 보여주는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 간(빨간색), 비장(녹색) 및 WATT(파란색)에 대한 2D ROI를 분할하기 위해 샘플링을 수행하는 데 사용되는 제안된 영역을 강조하는 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 지방증 계산을 위한 2D ROI 분할의 대표적인 예. (A) Cross Hair 도구는 횡단면에서 원하는 간 영역에서 2D ROI를 선택하는 데 사용됩니다. (B) 이 프로세스는 2D ROI의 분할을 완료하기 위해 시상 및 관상 평면에서 반복됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 2D 간 ROI를 생성하기 위한 분할 계층의 대표적인 예. 오르간의 중앙 부분은 수동으로 선택되어 경계 영역을 피하여 소음을 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 2D 축 영역. NAFLD 및 건강한 대조군이 있는 마우스에서 문맥 직경을 측정하기 위해 선택된 상이한 슬라이스의 2D 축 영역의 대표적인 예이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 간 혈관 네트워크 아키텍처. CT 분할을 통해 나타난 바와 같이 간혈관 네트워크 구조의 대표적인 추출 이미지는 대조군 마우스(176.9 mm3) 및 NAFLD가 있는 마우스(390.3mm3)로부터 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 평균 명암비 값. NAFLD가 있는 마우스(n = 2) 및 건강한 대조군(n = 2)에서 eXIA 주사 후 48시간 동안 간 조직 흡수를 나타내는 평균 대조 값을 보여주는 그룹화된 데이터. 그룹화된 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 엑시아(ExiA) | 엑시트론 | |||
| 시점 | 전신 스캔 | 간 스캔 | 전신 스캔 | 간 스캔 |
| 사전 대비 | X | X | X | X |
| 10분 PI | - | - | - | X |
| 15분 PI | O | O | - | - |
| 45분 PI | X | X | - | - |
| 2시간 PI | O | O | - | - |
| 4시간 PI | - | - | X | X |
| 24시간 PI | O | O | - | - |
| 48 시간 PI | X | X | - | - |
표 1: CT 스캔 시점. 전신 및 간 스캔의 적절한 시점은 조영제의 주입 전후(PI)를 획득했습니다. X는 필수 검사를 나타내고, -는 검사가 없음을 나타내고, O는 선택적(권장되지만 필수는 아님) 검사를 나타냅니다.
| 대조군(n = 1–2) | NAFLD (n = 1–2) | |
| % 간 지방 | 2.4 ± 1.5% | 18.4 ± 3.1% |
| 간 혈관 네트워크 용적 | 176.9 밀리미터3 | 390.3 밀리미터3 |
| 문맥 직경 | 1.1 밀리미터 | 1.4 밀리미터 |
| 간 상대 혈액량 | ~54% | ~79% |
표 2: NAFLD가 있는 마우스와 건강한 대조군 간의 간 지방 비율, 간 혈관 네트워크 부피, 문맥 직경 및 간 상대 혈액량의 차이를 나타내는 대표적인 결과.
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Discussion
인간의 NAFLD 진단 및 병기 결정에 현재 권장되는 방법은 간 생검으로, 출혈 복잡성의 위험이 있을 뿐만 아니라 샘플링 부정확성40. 반대로, 동물 모델에서 이러한 진단은 사후 조직학에 의해 수행되지만, 생존 가능한 간 생검에 대한 프로토콜이 현재 이용 가능하고 연구 설계가 허용 할 때 권장된다41. 사후 조직학의 사용은 이 질병의 진행을 조사하기 위해 많은 수의 동물이 필요하다는 것을 의미합니다. 따라서 질병이 진행되는 동안 동일한 동물에서 연구를 수행할 수 없습니다. 다른 동물로부터 상이한 시점에서 얻은 샘플을 비교할 때 가변성은 또한 더 높을 것으로 예상된다. 이 기사에서 우리는 NAFLD의 확립된 실험 동물 모델에 적용된 혁신적이고 비침습적인 생체 내 마이크로 CT 접근 방식을 제공하여 기능적 매개변수, 즉 간 지방증 및 기능적 조직 흡수, 상대 혈액량, 문맥 직경 및 혈관 네트워크의 밀도, 같은 동물에서.
Micro-CT 이미징은 현재 살아있는 유기체 내의 해부학적 정보를 정확하게 묘사하기 위한 표준 비침습적 이미징 방법입니다. Micro-CT는 높은 공간 분해능에 도달할 수 있는 기능을 갖추고 있어 광범위한 병리학에서 매우 미세한 세부 사항을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 또한, 이미징된 샘플의 무결성을 방해하지 않으면서 X선의 고유한 특성을 활용하여 시간 21,22,23,24 경과에 따른 질병 진행을 연구하는 빠르고 신뢰할 수 있는 도구입니다. 동물 연구에서 이 기술의 한 가지 주요 이점은 복잡한 제제 없이 투여되는 선택된 조영제의 조합을 사용할 수 있다는 것입니다(비침습적). 이를 통해 질병이 진행되는 동안 세로로 스캔한 동일한 동물에서 여러 매개변수를 추출할 수 있어 ARRIVE 지침 및 3Rs26을 최대한 준수하고 결과를 보장할 수 있습니다. 또한 마이크로 CT 스캐너는 매우 짧은 획득 시간(스캔 시간이 몇 분 이하)으로 고해상도 이미지를 제공하며, 2D 및 3D 형식으로 결과를 해석하는 것이 비교적 쉽습니다(특히 여기에 제안된 대로 사용자 친화적인 소프트웨어를 사용할 때).
이 프로토콜에 설명된 모든 스캔은 작은 설치류 CT 스캐너에서 수행되었습니다( 재료 표 참조). CT 시스템은 나선형 스캔을 수행하며 100μm 해상도의 이미지를 제공할 수 있습니다. 35-80kVp 및 10-500μA 튜브 전류 사이에서 작동합니다. CT 데이터 수집은 스캔당 7-10분 동안 지속되며 100μm 공간 해상도에서 이미지 공간 재구성 알고리즘(ISRA)을 통해 재구성됩니다. CT 영상은 i) WB 스캔을 위한 50kVp의 고해상도 프로토콜 및 ii) 국소 간 스캔을 위한 50kVp의 고해상도 다중 회전 로컬 스캔과 같은 매개변수를 사용하여 수행됩니다. 모든 매개변수는 사용자 인터페이스의 지침에 따라 시스템과 함께 제공된 스캐닝 장치 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 설정됩니다. 재구성은 복셀 크기가 0.1mm인 FDK(Feldkamp, Davis, and Kress) 알고리즘을 통해 수행됩니다. CT 아티팩트는 검출기를 주기적으로 보정하고 적절한 서비스를 통해 시스템을 잘 유지 관리함으로써 최소화됩니다. 아티팩트가 발생하면 링 아티팩트를 유발하는 문제가 있는 감지기를 원격으로 취소하고 이미지를 수정할 수 있습니다.
설명된 기술 프로토콜은 eXIA 및 ExiTron 조영제를 사용하여 최적화되었으며, 이는 다양한 조직에서 특수 제형 및 시간적 생체 동태학으로 인해 선택되었습니다. eXIA는 X선 감쇠제로 160mg/mL 요오드를 함유한 완전 생분해성 조영제입니다. 일단 정맥 주사되면,이 조영제는 혈액 체류 시간 (>30 분의 클리어런스 반감기)을 보여주고 간, 비장, 심근 및 갈색 지방 조직과 같은 대사 활성 기관에 의해 흡수됩니다. 따라서 제1 조영제는 간 및 비장 이상, 심근경색 및 심근병증의 비침습적 생체 내 검출뿐만 아니라 활성 갈색 지방 조직을 식별하고 정량화하는 데 적합합니다. ExiTron은 ~12,000HU의 희석되지 않은 밀도42의 알칼리 토금속 기반 나노입자 조영제로, 전임상 CT 영상을 위해 특별히 제조되었습니다. 정맥내 주사시, 제2 조영제는 혈류에서 순환하고, 간 내의 대식세포를 포함하는 망상내피계(43)의 세포에 의해 흡수된다.
제안된 방법론과 관련된 특정 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜이 성공하려면 두 번째 조영제를 투여하기 전에 첫 번째 조영제에서 CT 신호가 감지되지 않아야 합니다. 이 프로토콜에서 제안된 시간 프레임은 최적화 실험(및 다른 연구를 기반으로 함)44에 따라 선택되었으며, 이는 첫 번째 조영제가 느린 제거율을 가지고 있음을 시사했습니다. 제2 조영제는 훨씬 더 느린 제거율(45,46)을 가지므로, 제1 조영제의 완전한 제거율에 이어 제2 조영제를 투여해야 한다. 실제로, 우리는 주사 12일 후 만족스러운 첫 번째 조영제의 제거율을 확인했습니다. 사용 된 동물 모델의 지속 기간에 따라이 시간 척도를 통해 간 질환이 진행되었을 수있는 두 시점을 비교할 수 있습니다. 여기에 사용된 수유 프로토콜이 22주가 걸린다는 점을 고려할 때 12일의 시간 경과는 질병 진행에 큰 변화를 일으키지 않을 것으로 예상됩니다. 실험자는 제안된 이미징 프로토콜을 조정하기 전에 적절한 검증 및 최적화를 수행해야 합니다. 또한 사용된 조영제의 유형과 농도, 투여 기간을 변경하기 전에 진행 및 영상 신호의 비용-편익 분석을 평가해야 합니다.
추가적으로, 두 조영제는 동물에 대한 독성 수준에 도달하기 전에 투여의 특정 총 부피까지만 허용될 수 있다43. 최적의 조영제를 보장하기 위해 최대 조영제 부피가 필요하기 때문에 제제의 느린 제거율과 함께 이 분석을 위해 일회성 주입이 제안됩니다. 이들 또는 다른 적절한 대체 조영제의 반복 투여는 또한 조영제의 총 부피가 임의의 주어진 시점에서 권장 한계 미만으로 유지되는 한 상이한 실험에 사용될 수 있다. 이 마이크로 CT 프로토콜을 사용한 성공적인 이미징을 위한 또 다른 요구 사항은 조영제의 올바른 투여입니다. 프로토콜에 명시된 바와 같이, 실험자는 기포없이 정맥을 통해 혈류에 직접 적절한 용량으로 약제를 천천히 주입해야합니다. 그렇게 하지 않으면 이미징 해상도와 출력이 손상됩니다. 따라서 최적의 용량과 적절한 투여 방법(서로 다른 제제 간의 주입 및 지속 시간)을 선택하면 CT 영상에서 독성 및 관련 제한의 위험을 줄일 수 있습니다.
여러 시점에서 스캔하는 경우 마취 기간을 가능한 한 짧게 유지하는 데 주의를 기울여야 합니다. CT 스캔은 완료하는 데 몇 분 밖에 걸리지 않기 때문에 일부 스캔 사이에 마취를 반대로 하여 마취 기간 연장과 관련된 위험을 최소화할 수 있습니다. 반복적인 마취 유도도 위험이 있습니다. 그러나 스캔 사이에 가열 패드에 동물을 놓고 충분한 수분 공급을 보장하면 회복과 생리학 유지에 도움이 됩니다. 또한, X선에 의해 방출되는 전리 방사선에 대한 노출은 장기 및 세포 생물학에 영향을 미치기에 충분하며, 이는 동물에게 잠재적으로 해로울 수 있으며, 결과적으로 편향되고 오해의 소지가 있는 실험 데이터를 초래한다22. 스캔 당 전달 될 것으로 예상되는 선량은 약 385mGy이므로 연구 중에 여러 번 스캔을받는 마우스는 최대 1.8Gy 이상을받을 수 있습니다. 이것은 조직 생물학에 잠재적으로 해로운 영향을 미칠 수 있는 생쥐에게 상당한 방사선량입니다. 이는 동일한 이미지 품질을 유지하면서 등방성 복셀 간격을 감소시킬 때 선량의 증가가 필요하기 때문에 특히 우려된다(22).
권장 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용한 이미지 후처리 측면에서 분할 마스크는 영역 성장 및 임계값 도구를 혼합하여 생성되며 이는 분석에서 가장 시간이 많이 소요되는 단계입니다. 경우에 따라 얻은 분할의 수동 수정은 평활 방법을 사용하여 수행해야 합니다. 원하는 신경망의 가장자리 보존 및 잡음 감소 속성을 최적화하려면 값이 0.3인 가우스 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 혈관 네트워크의 대표 영상은 도 6 에 도시되어 있다(오픈 액세스 DICOM 의료 영상 뷰어를 사용하여 후처리됨). 혈관 네트워크 측정 측면에서 주요 한계는 소프트웨어가 선택된 정의된 ROI(간의 혈관 네트워크를 나타냄)를 배경(주변 간 조직을 나타냄)에서 정확하게 분리할 수 있는 기능이 없다는 것입니다. 따라서 시행착오를 통해 적절한 임계값을 선택해야 합니다. 처음에 사용자는 600HU의 낮은 임계값과 최대 10,000HU를 정의합니다. 추출된 혈관 네트워크와 주변 조직으로부터의 분리가 허용되지 않는 경우 50-100HU의 단계적 변화에 따라 시행착오 를 통해 더 낮은 값을 조정합니다. 이 과정은 혈관 네트워크가 조직으로부터 충분히 분리될 때까지 사용자에 의해 반복된다.
결론적으로, NAFLD 진행 동안 간혈관 네트워크의 적응을 이해하고 제안된 방법을 사용하여 다른 질병 특성화 방법과 연관시키면 생쥐의 NAFLD 연구를 위한 새롭고 보다 효율적이며 재현 가능한 접근 방식을 확립하는 길을 열 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 질병 진행에 대한 새로운 치료법의 개발을 조사하기 위한 전임상 동물 모델의 가치를 업그레이드할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
그림 1 은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다. 이 작업은 그리스 연구 및 혁신 재단(#3222 to A.C.)의 지원을 받았습니다. Anna Hadjihambi는 간 연구 재단 인 Roger Williams Institute of Hepatology에서 자금을 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
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