Summary
Ved hjælp af en diætinduceret ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) musemodel beskriver vi brugen af nye in vivo mikrocomputertomografibilleddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til vurdering af progressionsstadierne af NAFLD, overvejende med fokus på det hepatiske vaskulære netværk på grund af dets betydelige involvering i NAFLD-relateret leverdysregulering.
Abstract
Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er et voksende globalt sundhedsproblem, og virkningen af NAFLD forværres af den nuværende mangel på effektive behandlinger. Betydelige begrænsende faktorer, der hindrer rettidig og nøjagtig diagnose (herunder klassificering) og overvågning af NAFLD samt udvikling af potentielle terapier, er de nuværende mangler i karakteriseringen af den hepatiske mikromiljøstruktur og scoringen af sygdomsstadiet på en rumlig tidsmæssig og ikke-invasiv måde. Ved hjælp af en diætinduceret NAFLD-musemodel undersøgte vi brugen af in vivo mikrocomputertomografi (CT) billeddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til at vurdere progressionsstadierne af NAFLD med overvejende fokus på det hepatiske vaskulære netværk på grund af dets betydelige involvering i NAFLD-relateret leverdysregulering. Denne billeddannelsesmetode muliggør langsgående analyse af leversteatose og funktionel vævsoptagelse samt evaluering af det relative blodvolumen, portalvenediameter og densitet af det vaskulære netværk. Forståelse af tilpasningerne af det hepatiske vaskulære netværk under NAFLD-progression og korrelering af dette med andre måder at karakterisere sygdomsprogressionen (steatose, inflammation, fibrose) ved hjælp af den foreslåede metode kan bane vejen for etablering af nye, mere effektive og reproducerbare tilgange til NAFLD-forskning i mus. Denne protokol forventes også at opgradere værdien af prækliniske dyremodeller til undersøgelse af udviklingen af nye terapier mod sygdomsprogression.
Introduction
Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er en metabolisk sygdom, der rammer ca. 25% af befolkningen og >80% af sygeligt overvægtige mennesker1. Det anslås, at en tredjedel af disse personer udvikler sig til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH), som er karakteriseret ved hepatisk steatose, betændelse og fibrose2. NASH er et sygdomsstadium med en signifikant højere risiko for udvikling af cirrose og hepatocellulært karcinom (HCC)3,4. Af denne grund er NASH i øjeblikket den næsthyppigste årsag til levertransplantation, og det forventes også snart at blive den vigtigste forudsigelse for levertransplantation 5,6,7. På trods af dens udbredelse og sværhedsgrad er der ingen sygdomsspecifik terapi tilgængelig for NAFLD, og de eksisterende behandlinger sigter kun mod at tackle sygdomsassocierede patologier såsom insulinresistens og hyperlipidæmi 5,6.
I de senere år har den patofysiologiske rolle og tilpasninger af endotelet og generelt af det vaskulære netværk af metaboliske væv, såsom fedtvæv og lever, fået større betydning i forskning, især under fedme og metabolisk dysregulering 7,8. Endotelet er et cellulært monolag, der linjer det vaskulære netværk internt og fungerer som en funktionel og strukturel barriere. Det bidrager også til forskellige fysiologiske og patologiske processer, såsom trombose, metabolittransport, inflammation og angiogenese 9,10. I tilfælde af leveren er det vaskulære netværk blandt andet karakteriseret ved tilstedeværelsen af højt specialiserede celler, defineret som lever sinusformede endotelceller (LSEC'er). Disse celler mangler en kældermembran og har flere fenestrae, hvilket muliggør lettere overførsel af substrater mellem blod og leverparenchyma. På grund af deres karakteristiske anatomiske placering og egenskaber har LSEC'er sandsynligvis en afgørende rolle i leverens patofysiologiske processer, herunder udvikling af leverbetændelse og fibrose under NAFLD / NASH. Faktisk bidrager de patologiske, molekylære og cellulære tilpasninger, som LSEC'er gennemgår i løbet af NAFLD, til sygdomsprogressionen11. Specifikt er den LSEC-afhængige hepatiske angiogenese, der finder sted under NAFLD, signifikant forbundet med udviklingen af inflammation og sygdommens progression til NASH eller endda HCC12. Desuden er fedmerelateret tidlig NAFLD karakteriseret ved udviklingen af insulinresistens i LSEC'er, som går forud for udviklingen af leverbetændelse eller andre avancerede NAFLD-tegn13.
Derudover er LSEC'er for nylig opstået som centrale regulatorer af hepatisk blodgennemstrømning og vaskulære netværkstilpasninger under leversygdom af flere ætiologier14,15. Faktisk er kronisk leversygdom karakteriseret ved fremtrædende intra-hepatisk vasokonstriktion og øget modstand mod blodgennemstrømning, hvilket bidrager til udviklingen af portalhypertension16. I tilfælde af NAFLD bidrager flere LSEC-relaterede mekanismer til dette fænomen. For eksempel er LSEC-specifik insulinresistens, som nævnt ovenfor, forbundet med reduceret insulinafhængig vasodilatation af levervaskulaturen13. Desuden bliver levervaskulaturen i løbet af sygdommen mere følsom over for vasokonstriktorer, hvilket yderligere bidrager til forringelse af leverblodgennemstrømningen og fører til fremkomsten af forskydningsstress, hvilket begge resulterer i en forstyrrelse af den sinusformede mikrocirkulation17. Disse fakta tyder på, at vaskulaturen er et centralt mål i leversygdom. Ikke desto mindre er begrænsende faktorer, der hindrer rettidig diagnose og overvågning af NAFLD / NASH samt udviklingen af potentielle terapier, manglerne i den konsekvente karakterisering af det hepatiske mikromiljø og (mikro) vaskulære struktur samt scoring af sygdomsstadiet på en rumlig tidsmæssig og ikke-invasiv måde.
Mikrocomputertomografi (CT) billeddannelse er i øjeblikket den guldstandard ikke-invasive billeddannelsesmetode til nøjagtigt at skildre anatomisk information i en levende organisme. Micro-CT og MR repræsenterer to komplementære billeddannelsesmetoder, der kan dække en lang række patologier og give enestående opløsning og detaljer i de afbildede strukturer og væv. Især mikro-CT er et meget hurtigt og præcist værktøj, der ofte bruges til at studere patologier som knoglesygdomme og tilhørende knogleoverfladeændringer18, vurdere udviklingen af lungefibrose over tid19, diagnosticere lungekræft og dens iscenesættelse20 eller endda undersøge tandpatologier21 uden nogen særlig forberedelse (eller ødelæggelse) af prøverne, der afbildes.
Billeddannelsesteknologien for mikro-CT er baseret på forskellige organers forskellige dæmpningsegenskaber med hensyn til interaktionen mellem røntgenstråler og stof. Organer med høje røntgendæmpningsforskelle er afbildet med høj kontrast i CT-billeder (dvs. lungerne ser mørke ud og knoglerne lyse). Organer med meget ens dæmpningsegenskaber (forskellige bløde væv) er udfordrende at skelne på CT-billeder22. For at løse denne begrænsning er specialiserede kontrastmidler baseret på jod, guld og vismut blevet grundigt undersøgt til in vivo-brug . Disse midler ændrer svækkelsesegenskaberne af det væv, hvori de akkumuleres, fjernes langsomt fra kredsløbet og muliggør ensartet og stabil opacifikation af hele vaskulærsystemet eller udvalgte væv23.
I human diagnostik anvendes CT-billeddannelse og sammenlignelige teknikker, såsom MR-afledt protondensitetsfedtfraktion, allerede til bestemmelse af leverfedtindhold24,25. I forbindelse med NAFLD er høj bløddelskontrast afgørende for nøjagtigt at skelne patologiske læsioner eller små kar. Til dette formål anvendes kontrastmidler, der giver forbedret kontrast mellem levervævets egenskaber. Sådanne værktøjer og materialer muliggør undersøgelse af flere leverkarakteristika og mulige patologiske udtryk, såsom arkitekturen og densiteten af det vaskulære netværk, lipidaflejring / steatose og funktionel vævsoptagelse / lipid (chylomicron) overførsel i leveren. Derudover kan leverens relative blodvolumen og portalvenediameter også evalueres. På meget kort scanningstid giver alle disse parametre forskellige og komplementære oplysninger om evaluering og progression af NAFLD, som kan bruges til at udvikle en ikke-invasiv og detaljeret diagnose.
I denne artikel giver vi en trinvis protokol til brug af nye in vivo mikro-CT-billeddannelsesteknikker som en ikke-invasiv metode til vurdering af progressionsstadierne af NAFLD. Ved hjælp af denne protokol kan den langsgående analyse af leversteatose og funktionel vævsoptagelse samt evalueringen af det relative blodvolumen, portalvenediameter og densitet af det vaskulære netværk udføres og anvendes i musemodeller af leversygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført af BIOEMTECHs personale i overensstemmelse med europæiske og nationale velfærdsbestemmelser og blev godkendt af nationale myndigheder (licensnummer EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). Alle eksperimenter blev designet og rapporteret i overensstemmelse med ARRIVE-retningslinjerne26. Musene blev købt fra Hellenic Pasteur Institute, Athen, Grækenland.
BEMÆRK: Dyrene blev opstaldet i individuelt ventilerede bure beriget med skinner og paprør i et rum ved 20-22 °C med en relativ luftfugtighed på 50-60 % og en 12 timers lys/mørk cyklus (lys 07:00-19:00). En kombination af en fedtfattig diæt (HFD) og majssirup med høj fructose (HFCS), et fruktose- og glukoseholdigt sødemiddel, der i vid udstrækning anvendes i moderne typer fedtberigede kostvaner, blev brugt til at fremkalde NAFLD som en anerkendt pålidelig model27,28,29,30. Ved 7-8 ugers alderen fik C57BL/6-hanmus ad libitum adgang til enten en normal kost (n = 2) med 10% kilokalorier fra fedt eller en HFD (n = 2) indeholdende 60% kilokalorier fra fedt suppleret med 5% HFCS i vand i 22 uger. Kropsvægten blev indhentet ugentligt ved hjælp af en digital vægt, og i forsøgsperioden blev dyrevelfærden overvåget på alternative dage ved hjælp af et scoreark. I slutningen af billeddannelsesprotokollen blev musene aflivet via cervikal dislokation.
1. Tilberedning af dyr
BEMÆRK: Billedbehandlingsprotokollen er opsummeret i figur 1.
- Bedøv musen med 3% -4% isofluran (i rumluft), og hold dens kropstemperatur ved hjælp af en dedikeret varmepude.
BEMÆRK: Fraværet af en pedaludtagningsrefleks skal bruges til at bekræfte tilstrækkelig anæstesidybde, før scanningen påbegyndes. - Påfør oftalmisk salve på dyrets øjne inden forsøg.
- Placer dyret i CT-scannerholderen, fastgør næsekeglen, og skift til 1,5% -3% isofluran (i rumluft) til vedligeholdelse.
BEMÆRK: Fraværet af pedaludtagningsrefleks skal anvendes til at bekræfte den passende procentdel isofluran til opretholdelse af anæstesi. - Overvåg musen kontinuerligt.
2. Forberedelse før scanning
BEMÆRK: Billeddannelse udføres i to eksperimentelle faser for at gøre det muligt at fjerne det første kontrastmiddel tilstrækkeligt fra cirkulationen og vævene. eXIA (første kontrastmiddel) administreres i første fase og ExiTron (andet kontraststof) i anden fase, som beskrevet i afsnittet "Imaging workflow" (afsnit 3) nedenfor.
- Lad kontrastmidlet (enten eXIA eller ExiTron, afhængigt af forsøgsfasen) nå stuetemperatur i 3 timer.
- Indstil følgende scanningsparametre på CT-scanneren: protokol med høj opløsning under 50 kVp rørspænding og en strøm på 460 μA, ikke-spiral, 720 fremspring/rotation, fire rotationer og 4 minutters anskaffelsestid.
3. Billedbehandling arbejdsgang
- Eksperimentel fase 1
- Volumenet af det første kontraststof, der skal indgives i en ufortyndet dosis på 6 μl/g legemsvægt, beregnes og klargøres for maksimal kontrast.
- Forbered halevenekateteret ved at fylde det op med saltvand og forbinde det til sprøjten fyldt med kontrastmidlet.
- Få en pre-kontrast helkropsscanning (WB) og leverbaseline.
- Sørg for, at der ikke er bobler eller blokeringer i sprøjten eller kateteret.
- Indsæt det fyldte kateter i halevenen, og administrer kontrastmidlet via en injektion, der udføres langsomt og manuelt med en varighed på 1-3 minutter (ikke som bolusinjektion). Der kan anvendes en sprøjtepumpe, når den er indstillet til den korrekte infusionshastighed.
BEMÆRK: Dyrets hale kan placeres i lunkent vand for at fremkalde vasodilatation og hjælpe med kateterindsættelsen - Få WB- og leverscanninger på forskellige tidspunkter, som angivet i tabel 1.
BEMÆRK: Hvis det ikke er muligt at opnå alle point, skal fokus placeres på 45 min efter injektion (PI), som er punktet for maksimal leveroptagelse, og 48 timers PI, hvilket er, når clearance opnås.
- Eksperimentel fase 2
- Musen klargøres igen som beskrevet i punkt 1 til administration af det andet kontraststof 10 dage efter den endelige aflæsning med det første kontrastmiddel (48 timer PI).
- Udfør trin 2.1-2.2.
- Volumenet af det andet kontraststof, der skal administreres, beregnes og klargøres i en ufortyndet dosis på 8 μl/g legemsvægt for maksimal kontrast.
- Forbered halevenekateteret ved at fylde det op med saltvand og forbinde det til sprøjten fyldt med kontrastmidlet.
- Få en WB og leverbaseline-scanning før kontrast for at evaluere det relative blodvolumen og leversteatose.
- Sørg for, at der ikke kan registreres nogen kontrast under scanningen som en indikation af den fuldstændige clearance af det første kontrastmiddel.
- Indsæt det fyldte kateter i halevenen, og administrer kontrastmidlet via en intravenøs injektion, der udføres langsomt og manuelt med en varighed på 1-3 minutter (ikke som bolusinjektion). Der kan anvendes en sprøjtepumpe, når den er indstillet til den korrekte infusionshastighed.
- Få WB- og leverscanninger på forskellige tidspunkter, som angivet i tabel 1.
BEMÆRK: WB-scanninger erhverves ved 10 min og 4 timers PI. Den betydelige tidsforskydning mellem dem giver mulighed for evaluering af sporstofbiofordelingen i kroppen såvel som dens relative clearance.
4. Dataudtræk og analyse
BEMÆRK: I denne protokol leveres dataudtræknings- og analysetrinnene baseret på en specifik billedbehandlingssoftware (se materialetabel). De beskrevne trin skal muligvis tilpasses, når du bruger anden software.
- Evaluering af hepatisk lipidaflejring/steatose.
BEMÆRK: Til evaluering af hepatisk steatose anvendes intet kontrastmiddel, og en sammenligning mellem kontrol og patologi udføres. På grund af relativt høje afvigelser i vævsdæmpningsegenskaber mellem forskellige mus normaliseres densitetsværdierne for leveren mod milten (fedtfrit væv) og fedtet (absolut fedtvæv) ifølge følgende ligning og som tidligere beskrevet25:
- For at udføre analysen skal du indlæse DICOM-filen fra prækontrastscanningen og justere bjælken / kontrasten for at se leveren, milten og hvidt fedtvæv (WAT) tydeligt.
- Åbn værktøjet Modelling Operator via rullemenuen på frontpanelet, og vælg 3D ROI Tool.
- Under 3D ROI-operatoren skal du vælge Tilføj ROI for at generere flere ROI'er (op til otte for hvert væv) for at udføre prøveudtagning i de områder, hvor leveren (helst i områderne af venstre mediale lap, højre mediale lap og venstre laterale lap) og milt synes klare uden tilsyneladende blodkar og fedt.
BEMÆRK: For WAT vælges ROI'er midt i det viscerale fedtvævsdepot. Anbefalede områder er vist i figur 2. Normaliseringsmetoder, der anvender lever/milt-forholdet og uden at inkludere WAT, kan også anvendes som tidligere fastslået31. - Under funktionen 3D Paint Mode og Erode/Dilate skal du vælge 2D og bruge den grænseflade, der vises, til at angive et navn og en farve for hvert investeringsafkast.
- Brug værktøjet Sphere maling ROI med en diameter på 8 pixel til manuelt at tegne 2D-ROI'erne.
- Udfør prøveudtagning ved at segmentere 2D-ROI'erne på interesseområderne ved hjælp af trådkorsværktøjet på tværplanet som vist i figur 3A.
- Klik på det valgte punkt på sagittal- og koronalplanet for at fuldføre segmenteringen af 2D ROI, som vist i figur 3B.
- Gentag processen til definition af resten af investeringsafkastet.
BEMÆRK: Ved prøveudtagning skal du undgå organgrænseregionerne, da dette kan introducere støj og påvirke pålideligheden af den beregnede Hounsfield-enhed (HU) værdi for hver ROI. - Når du er tilfreds med de segmenterede investeringsafkast, skal du gå til Navigation og vælge Vis tabel for at få vist kvantificeringstabellen, der indeholder de beregnede HU-værdier for hvert investeringsafkast.
BEMÆRK: Værdierne af interesse er angivet i kolonnen "Middelværdi", som indeholder de numeriske middelværdier for voxels (HU) indeholdt i ROI'erne for de interesserede organer. Notér værdierne af interesse, eller gem hele tabellen ved at vælge Eksportér tabel. - Beregn den gennemsnitlige HU for leveren, milten og WAT, og sæt værdierne i ovenstående ligning for at beregne procentdelen af leverfedt.
- Funktionel vævsoptagelse/overførsel af lipid (chylomicron) i leveren
BEMÆRK: Funktionel vævsoptagelse/lipidoverførsel (chylomicron) analyseres fra de erhvervede scanninger 45 min og 48 timer efter den første kontrastmiddelinfusion, baseret på en tidligere offentliggjort metode32. Kontrasten beregnes for de forskellige væv og tidspunkter ved hjælp af nedenstående ligning:
PV-organ t i er den gennemsnitlige pixelværdi i orglet på tidspunktet t i (fra 0 h til 48 timer), og PV-organ t0 er den gennemsnitlige pixelværdi i orglet i billedet uden kontrast.- For at udføre denne analyse skal du indlæse eXIA scan DICOM-filen og justere bjælken / kontrasten for at se leveren, milten og venstre ventrikel tydeligt.
- Få adgang til modelleringsoperatoren via værktøjets rullemenu på frontpanelet, og vælg 3D ROI-værktøj.
- Under 3D-ROI-operatoren skal du vælge Tilføj ROI for at segmentere flere ROI'er for leveren.
- Under funktionen 3D-malingstilstand og erodering/spile skal du bruge værktøjet Sphere paint ROI med en diameter på 8 pixels og -1 erodere.
BEMÆRK: Vælg flere ROI'er på udsnit, hvor hvert organ vises tydeligt. Undgå grænseregioner, da dette kan indføre støj og påvirke pålideligheden af den beregnede HU-værdi for hvert investeringsafkast. Dette vil resultere i prøveudtagning af flere 3D-ROI'er, som svarer til små organvolumener. - Brug den grænseflade, der vises, til at angive et navn og en farve for hvert investeringsafkast.
- Når du er tilfreds med de designede investeringsafkast, skal du gå til Navigation og vælge Vis tabel for at få vist kvantificeringstabellen, der indeholder de beregnede HU-værdier for hvert investeringsafkast.
BEMÆRK: Værdierne af interesse er angivet under kolonnen "Middelværdi", som viser de numeriske middelværdier for voxels (HU), der er inkluderet i ROI. Den gennemsnitlige HU-værdi af hvert organs ROI'er svarer til PV-organ ti. Notér værdierne af interesse, eller gem hele tabellen ved at vælge Eksportér tabel. - For at opnå PV-organ t0 gentages alle ovenstående trin ved hjælp af DICOM-filen før kontrast til beregning af den gennemsnitlige lysstyrke i leveren, milten og venstre ventrikel før injektionen af kontrastmiddel.
- Indsæt værdierne i ovenstående ligning for at udtrække den procentvise kontrast, der svarer til den funktionelle vævsoptagelse/lipidoverførsel (chylomicron).
- Arkitektur og tæthed af det hepatiske vaskulære netværk
BEMÆRK: Analysen af arkitekturen og densiteten af det hepatiske vaskulære netværk er baseret på en tidligere offentliggjort metode33 og udføres på leverscanninger opnået 10 min PI af det andet kontraststof.- For at udføre denne analyse skal du indlæse ExiTron scan DICOM-filen og justere bjælken / kontrasten for at se levervaskulærnetværket tydeligt.
- Få adgang til modelleringsoperatoren via værktøjets rullemenu på frontpanelet, og vælg 3D ROI-værktøj.
- Under 3D-ROI-operatoren skal du vælge Tilføj ROI for at generere et 3D-ROI for leveren.
- Under funktionen 3D-malingstilstand og eroder/spile skal du vælge 3D.
BEMÆRK: Brug værktøjet Kuglemalingsafkast med -1 erodere til at definere segmenteringslagene på tværs af koronalplanet. Diameteren på ROI-maleværktøjet skal justeres i henhold til hvert lag (for at tilføje/slette eventuelle ønskede/uønskede voxelvalg). Det anbefales, at levervolumenet oprindeligt defineres på tværs af koronalplanet, og derefter kan de tværgående og sagittale planer bruges til at korrigere ROI. Denne proces kræver præcision. Brugeren skal være meget forsigtig med ikke at inkludere andre væv, kar og knogler, når han segmenterer hvert ROI-lag, samtidig med at det sikres, at alle områder af leveren er inkluderet i det definerede ROI. Af denne grund er fortrolighed med leverens anatomiske grænser afgørende. - Når du er tilfreds med det resulterende lever-ROI, skal du udføre et snit for at fjerne alle voxels fra billeddataene, der ikke hører hjemme i det oprindeligt segmenterede lever-ROI. For dette skal du vælge lever-ROI fra ROI-vælgeren og klikke på ikonet Udfør klip . Denne operation fjerner baggrunden og efterlader leverens ROI uændret.
BEMÆRK: Selvom fortryd/gentag-funktionerne gælder for alle de handlinger, der udføres under 3D-ROI-værktøjet, kan handlingen med at skære et investeringsafkast ikke fortrydes. Så før denne handling kan brugeren overveje at gemme det oprindelige lever-ROI i DICOM-format. - Den resulterende lever-ROI inkluderer det vaskulære netværk og det omgivende væv, som skal fjernes. For dette skal du nulstille leverens ROI ved at klikke på knappen Nulstil ROI kost.
- Brug grænsefladen, der ser ud til at overføre alle pixels i leverens ROI til baggrunden.
BEMÆRK: Leverens ROI vil stadig eksistere efter denne operation, men den vil ikke længere indeholde nogen voxels. - Hvis du vil segmentere leverens ROI igen, så den kun indeholder vaskulære pixels, skal du gå til Segmenteringsalgoritmer angivet med tryllestavsikonet og vælge Tilsluttet tærskelværdi.
- Definer ROI som Output og baggrunden som Input fra inputrullemenuen, før du anvender tærskelværdi.
- Indstil tærsklerne ved at klikke på ikonerne Min og Max til venstre for hvert tærskelfelt for at udfylde maksimum- og minimumsværdier og hente det vaskulære netværk.
BEMÆRK: Kun pixels inden for det valgte interval medtages i det resulterende investeringsafkast. Justering af tærskelværdierne mellem forskellige dyr sikrer, at de samme anatomiske regioner tages i betragtning med hensyn til den nøjagtige mængde kontrastmiddel, der injiceres i hvert dyr. Dette er konstant blandt de valgte væv, selvom de numeriske værdier ikke er identiske. - Brug trådkorsværktøjet til at klikke på et punkt, hvor det vaskulære netværk ser klart ud, og klik på Anvend for at udføre segmenteringen.
- Aktivér fremviseren til maksimal intensitetsprojicering (MIP).
- Evaluer det resulterende lever-ROI med hensyn til, hvor klart det vaskulære netværk vises i MIP-visningen.
- Hvis vævet forbliver i dele af leverens ROI, gentages trin 4.3.5-4.3.11 ved at justere Min-tærskelværdien, indtil det segmenterede lever-ROI tydeligt repræsenterer det vaskulære netværk.
- Når du er tilfreds med det resulterende lever-ROI, skal du generere kvantificeringstabellen, der indeholder det beregnede lever-ROI-volumen i kubikmillimeter.
BEMÆRK: Værdierne af interesse er angivet i kolonnen "mm3", som indeholder den numeriske volumenværdi af voxels (HU) indeholdt i leverens ROI. Notér værdierne af interesse, eller gem hele tabellen ved at vælge Eksportér tabel.
- Leverens relative blodvolumen
BEMÆRK: Til måling af leverens relative blodvolumen (rBV), som korrelerer signifikant med mængden af nydannede blodkar under fibroseprogression, anvendes prækontrastscanninger og scanninger 4 timer efter den anden injektion af kontrastmiddel. Analysen udføres som tidligere beskrevet34.- For at udføre denne analyse skal du indlæse ExiTron-scannings-DICOM-filen og justere bjælken/kontrasten.
BEMÆRK: Deaktiver MIP-fremviseren: Under Indstillinger skal du markere afkrydsningsfeltet for at deaktivere MIP-fremviseren ved indlæsning. For store datasæt kan dette forbedre indlæsningshastigheden. - Få adgang til modelleringsoperatoren via værktøjets rullemenu på frontpanelet, og vælg 3D ROI-værktøj. Dette værktøj giver avancerede muligheder for at tegne, visualisere, gemme og kvantificere både 2D- og 3D-regioner.
- Under 3D-ROI-operatoren skal du vælge Tilføj ROI og segmentere to ROI'er: en for leveren og en for et stort blodkar.
- Under funktionen 3D-malingstilstand og eroder/spile skal du vælge 2D.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge Sphere maling ROI-værktøjet med en diameter på 8-10 pixels til leveren og 4-6 pixels til blodkarret. Malerværktøjets diameter kan dog justeres afhængigt af, hvor lille det område, der skal vælges, er. - Brug den grænseflade, der vises, til at angive et navn og en farve for hvert investeringsafkast.
BEMÆRK: Vælg to til fem udsnit af centrale dele af de interessante væv, og definer segmenteringslagene for at generere 2D-ROI'er for hvert væv. Når du vælger områderne på hver skive, skal du undgå organgrænseregionerne, som vist i figur 4, da dette kan indføre støj og påvirke pålideligheden af den beregnede HU-værdi for hvert investeringsafkast. - Når du er tilfreds med de designede investeringsafkast, skal du gå til Navigation og vælge Vis tabel for at få vist kvantificeringstabellen, der indeholder de beregnede HU-værdier for hvert investeringsafkast.
BEMÆRK: Værdierne af interesse er angivet under kolonnen "Middelværdi", som viser de numeriske middelværdier for voxels (HU), der er inkluderet i ROI. Notér værdierne af interesse, eller gem hele tabellen ved at vælge Eksportér tabel. - Gentag alle trin for DICOM-filen før kontrast for at opnå leverens gennemsnitlige lysstyrke før injektionen af kontrastmidlet. Til dette skal du kun udføre trin 4.4.2-4.4.5 for leveren.
- De gennemsnitlige HU-værdier for hvert væv beregnes på de ækvivalente tidspunkter, og de opnåede værdier indsættes i nedenstående ligning:
BEMÆRK: Et stort blodkar efter injektion af kontrastmiddel betragtes som 100% rBV, og leveren, før administration af kontrastmiddel, betragtes som 0% rBV.
- For at udføre denne analyse skal du indlæse ExiTron-scannings-DICOM-filen og justere bjælken/kontrasten.
- Portal vene diameter
BEMÆRK: For portalvenediametermålingerne analyseres de samme scanninger, der bruges til hepatisk rBV-målingerne som tidligere beskrevet35.- Indlæs ExiTron scan DICOM-filen, og juster bjælken/kontrasten.
- Find de tværgående planer på tre til fire skiver over krydset mellem de overlegne mesenteriske og miltårer (figur 5).
- Brug linealværktøjet til at måle den nøjagtige afstand mellem to punkter (dvs. diameteren af det cirkulære veneområde).
BEMÆRK: Afstanden ekstraheres på billedet, men man kan også gå til Navigation og vælge Vis tabel for at få vist kvantificeringstabellen, der indeholder den beregnede afstand eller vælge Eksporter tabel for at gemme resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne repræsentative undersøgelse indikerede mikro-CT-billeddannelse uden kontrastmiddel en højere procentdel af leverfedt hos mus med NAFLD sammenlignet med kontroller (tabel 2), hvilket bekræftede patologien. Ved anvendelse af ExiTron-kontrastmidlet og hepatisk vaskulær netværksarkitektur og densitetsanalyse beskrevet ovenfor blev den totale volumentæthed af det hepatiske vaskulære netværk fundet at være højere hos mus med NAFLD sammenlignet med raske kontroller (figur 6, tabel 2). Mus med NAFLD havde også en større portalvenediameter sammenlignet med kontrolmus (tabel 2), en strukturel ændring forbundet med portalhypertension under leversygdom34,36,37. Tilsvarende blev lever-rBV hos dyr med NAFLD beregnet til at være højere sammenlignet med raske kontroller (tabel 2).
Desuden indikerede analysen af analysen af analysen af den funktionelle vævsoptagelse en højere akkumulering og langsommere clearance af eXIA-kontrastmidlet hos mus med NAFLD sammenlignet med raske kontroller (figur 7). Disse resultater tyder på, at steatotiske hepatocytter sandsynligvis gennemgår høje niveauer af cellulær endocytose og distribution, selvom de ledsages af reduceret metabolisk katabolisme eller clearance / sekretion. Samlet set stemmer dette fund overens med fænotypen for reduceret levermetabolisk aktivitet, som forventet i tilfælde af fedtinfiltration/NAFLD38,39.
Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsprotokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative billeder, der fremhæver de foreslåede områder, der bruges til at udføre prøveudtagning til segmentering af 2D-ROI for leveren (rød), milten (grøn) og WAT (blå). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativt eksempel på segmentering af et 2D ROI til beregning af steatose . (A) Trådkorsværktøjet bruges til at vælge et 2D-investeringsafkast på et ønsket område af leveren på tværplanet. (B) Processen gentages på sagittale og koronale planer for at fuldføre segmenteringen af 2D ROI. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentativt eksempel på et segmenteringslag til generering af et 2D-lever-ROI. Centrale dele af organet vælges manuelt og undgår grænseregionerne for at fjerne støj. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: 2D aksialt område. Repræsentative eksempler på det 2D aksiale område af de forskellige skiver, der er valgt til at måle portalvenens diameter hos mus med NAFLD og sunde kontroller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Hepatisk vaskulær netværksarkitektur. Repræsentative ekstraherede billeder af den hepatiske vaskulære netværksarkitektur, som vist gennem CT-segmentering, opnået fra en kontrolmus (176,9 mm 3) og en mus med NAFLD (390,3 mm3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Gennemsnitlige kontrastværdier. Grupperede data, der viser de gennemsnitlige kontrastværdier, som repræsenterer optagelsen af levervæv over 48 timer efter injektion af eXIA hos mus med NAFLD (n = 2) og raske kontroller (n = 2). Alle grupperede data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| ExiA | ExiTron | |||
| Tidspunkt | Helkropsscanning | Leverscanning | Helkropsscanning | Leverscanning |
| Før kontrast | X | X | X | X |
| 10 min PI | - | - | - | X |
| 15 min PI | O | O | - | - |
| 45 min PI | X | X | - | - |
| 2 timers PI | O | O | - | - |
| 4 timers PI | - | - | X | X |
| 24 timers PI | O | O | - | - |
| 48 timers PI | X | X | - | - |
Tabel 1: Tidspunkter for CT-scanningerne. De passende tidspunkter for hele kroppen og leverscanninger erhvervet før og efter injektion (PI) af kontrastmidlerne. X angiver obligatoriske scanninger, - angiver ingen scanninger, og O angiver valgfrie (anbefalede, men ikke obligatoriske) scanninger.
| Kontrol (n = 1–2) | NAFLD (n = 1–2) | |
| % Leverfedt | 2.4 ± 1,5% | 18,4 ± 3,1% |
| Hepatisk vaskulært netværksvolumen | 176,9 mm3 | 390,3 mm3 |
| Portal vene diameter | 1,1 mm | 1,4 mm |
| Leverens relative blodvolumen | ~54% | ~79% |
Tabel 2: Repræsentative resultater, der indikerer forskelle i procentdelen af leverfedt, levervaskulært netværksvolumen, portalvenediameter og leverrelativ blodvolumen mellem mus med NAFLD og raske kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende anbefalede metode til NAFLD-diagnose og iscenesættelse hos mennesker er leverbiopsi, som rummer risikoen for blødningskompleksitet samt prøveudtagningsunøjagtigheder40. Tværtimod, i dyremodeller udføres en sådan diagnose ved histologi post mortem, selvom protokoller for overlevelsesdygtig leverbiopsi nu er tilgængelige og anbefales, når undersøgelsesdesignet tillader41. Anvendelsen af post mortem histologi betyder, at et stort antal dyr er forpligtet til at undersøge udviklingen af denne sygdom. Som sådan kan en undersøgelse ikke udføres på det samme dyr, mens sygdommen skrider frem; Variabiliteten forventes også at være højere, når man sammenligner prøver opnået på forskellige tidspunkter fra forskellige dyr. I denne artikel leverer vi en innovativ, ikke-invasiv in vivo mikro-CT-tilgang, der anvendes i en etableret eksperimentel dyremodel af NAFLD, der muliggør langsgående evaluering af sygdomsprogression gennem kvantificering af funktionelle parametre, nemlig leversteatose og funktionel vævsoptagelse, det relative blodvolumen, portalvenediameteren og densiteten af det vaskulære netværk, i samme dyr.
Micro-CT-billeddannelse er i øjeblikket den guldstandard ikke-invasive billeddannelsesmetode til nøjagtigt at skildre anatomisk information i en levende organisme. Micro-CT har evnen til at nå en høj rumlig opløsning og repræsenterer dermed et værdifuldt værktøj til at studere meget fine detaljer i en lang række patologier. Desuden er det et hurtigt og pålideligt værktøj til at studere sygdomsprogression over tid21,22,23,24 ved at udnytte røntgenstrålernes iboende egenskaber uden at forstyrre integriteten af den afbildede prøve. En stor fordel ved denne teknik i dyreforsøg er evnen til at anvende en kombination af udvalgte kontrastmidler administreret uden komplicerede præparater (ikke-invasiv). Dette gør det muligt at ekstrahere flere parametre fra det samme dyr, der scannes i længderetningen under sygdommens progression, hvilket sikrer maksimal output og overholdelse af ARRIVE-retningslinjerne og 3Rs26. Desuden giver mikro-CT-scannere billeder i høj opløsning på meget korte optagelsestider (med scanningsvarighed på blot et par minutter eller mindre), hvor fortolkningen af resultaterne i 2D- og 3D-formater er relativt let (især når der bruges brugervenlig software, som foreslået her).
Alle scanningerne beskrevet i denne protokol blev udført på en lille gnaver-CT-scanner (se materialetabel). CT-systemet udfører en spiralscanning, og det kan give billeder med 100 μm opløsning. Den arbejder mellem 35-80 kVp og 10-500 μA rørstrøm. CT-dataindsamlingerne varer 7-10 minutter pr. scanning og rekonstrueres gennem en billedrumsrekonstruktionsalgoritme (ISRA) ved 100 μm rumlig opløsning. CT-billeddannelse udføres ved hjælp af følgende parametre: i) protokol med høj opløsning ved 50 kVp til WB-scanninger og ii) lokal multirotationsscanning med høj opløsning ved 50 kVp til lokale leverscanninger. Alle parametre konfigureres i scanningsenhedens software (se materialetabellen), der følger med systemet, ved at følge instruktionerne på brugergrænsefladen. Rekonstruktionen udføres gennem en Feldkamp, Davis og Kress (FDK) algoritme med en voxelstørrelse på 0,1 mm. CT-artefakter minimeres ved periodisk at kalibrere detektorerne og vedligeholde systemet godt gennem passende tjenester. Hvis der forekommer artefakter, kan den problematiske detektor, der forårsager ringartefakten, annulleres eksternt, og billedet korrigeres.
Den beskrevne tekniske protokol blev optimeret ved hjælp af kontrastmidlerne eXIA og ExiTron, som blev valgt på grund af deres specielle formuleringer og tidsmæssige biokinetik i de forskellige væv. eXIA er et fuldt biologisk nedbrydeligt kontrastmiddel, der indeholder 160 mg / ml jod som et røntgendæmpningsmiddel. Når det er injiceret intravenøst, viser dette kontrastmiddel blodets opholdstid (med en clearance halveringstid på >30 min) og optages derefter af metabolisk aktive organer såsom lever, milt, myokardium og brunt fedtvæv. Det første kontraststof er derfor egnet til ikke-invasiv in vivo-påvisning af lever- og miltabnormiteter, myokardieinfarkt og kardiomyopati samt til identifikation og kvantificering af aktivt brunt fedtvæv. ExiTron er et jordalkalimetalbaseret nanopartikelkontrastmiddel med ~12.000 HU ufortyndet densitet42, som er specielt formuleret til præklinisk CT-billeddannelse. Ved intravenøs injektion cirkulerer det andet kontrastmiddel i blodbanen, og det optages af cellerne i retikuloendotelsystemet43, herunder makrofager i leveren.
Der er visse begrænsninger forbundet med den foreslåede metode. For at denne protokol skal lykkes, skal der ikke detekteres noget CT-signal fra det første kontrastmiddel før administration af det andet kontrastmiddel. Den tidsramme, der foreslås i denne protokol, blev valgt efter optimeringseksperimenter (og baseret på andre undersøgelser)44, hvilket antydede, at det første kontrastmiddel har langsom clearance. Da det andet kontraststof har en endnu langsommere clearancepå 45,46, skal det indgives som nummer to efter fuldstændig clearance af det første kontraststof. Faktisk har vi identificeret clearance af det første kontrastmiddel til at være tilfredsstillende efter 12 dages injektion. Afhængigt af varigheden af den anvendte dyremodel kan denne tidsskala gøre det muligt at sammenligne to tidspunkter, hvor leversygdommen kan have udviklet sig. I betragtning af at den fodringsprotokol, der anvendes her, tager 22 uger, forventes et tidsforløb på 12 dage ikke at forårsage væsentlige ændringer i sygdomsprogressionen. Eksperimentatoren skal udføre passende validering og optimering, før den foreslåede billeddannelsesprotokol justeres. Man skal også vurdere cost-benefit-analysen af progressions- og billedsignalet, før man ændrer typen og koncentrationen af de anvendte kontrastmidler samt tidsrammen for administrationen.
Desuden kan begge kontraststoffer kun tolereres op til et bestemt samlet administrationsvolumen, før de når toksiske niveauer for dyret43. På grund af det faktum, at der kræves et maksimalt kontrastmiddelvolumen for at sikre optimal kontrast i kombination med midlernes langsomme clearance hastighed, foreslås en engangsinjektion til denne analyse. Gentagen administration af disse eller andre egnede alternative kontraststoffer kan også anvendes til forskellige forsøg, så længe det samlede volumen af kontrastmidlet forbliver under den anbefalede grænse på et givet tidspunkt. Et andet krav til vellykket billeddannelse ved hjælp af denne mikro-CT-protokol er korrekt administration af kontrastmidlerne. Som anført i protokollen bør eksperimentatoren sikre en langsom infusion af midlet ved den passende dosis direkte ind i blodbanen gennem venen uden bobler. Hvis du ikke gør det, kompromitteres billedopløsningen og outputtene. Derfor reducerer valget af en optimal dosering og passende administrationsmetoder (infusion og varighed mellem forskellige midler) risikoen for toksicitet og de tilknyttede begrænsninger i CT-billeddannelsen.
Ved scanning på flere tidspunkter skal man være opmærksom på at holde anæstesivarigheden så kort som muligt. Da CT-scanning kun tager et par minutter at gennemføre, kan anæstesien vendes mellem nogle scanninger for at minimere risikoen forbundet med langvarig anæstesivarighed. Gentagne anæstesiinduktioner har også risici. Men at placere dyrene på en opvarmet pude mellem scanninger og sikre tilstrækkelig hydrering hjælper med genopretning og vedligeholdelse af fysiologi. Desuden er eksponeringen for ioniserende stråling fra røntgenstråler tilstrækkelig til at påvirke organ- og cellebiologien, hvilket gør dette potentielt skadeligt for dyrene og følgelig resulterer i partiske og vildledende forsøgsdata22. Da den forventede dosis, der skal leveres pr. scanning, er ca. 385 mGy, kan mus, der modtager flere scanninger i løbet af undersøgelsen, modtage op til 1,8 Gy eller mere. Dette er en betydelig strålingsdosis for mus, der kan have potentielt skadelige virkninger på deres vævsbiologi. Dette er især bekymrende, da en stigning i dosis er nødvendig, når den isotropiske voxelafstand reduceres, samtidig med at den samme billedkvalitetopretholdes 22.
Med hensyn til billedefterbehandling ved hjælp af den anbefalede software (se materialetabel) oprettes segmenteringsmasker ved hjælp af en blanding af regionsvoksende og tærskelværktøjer, og dette er det mest tidskrævende trin i analysen. I nogle tilfælde skal manuelle modifikationer af de opnåede segmenteringer udføres ved anvendelse af en udjævningsmetode. For at optimere det ønskede netværks kantbevarende og støjreducerende egenskaber anbefaler vi et Gaussisk filter med en værdi på 0,3. Repræsentative billeder af et sådant vaskulært netværk er vist i figur 6 (efterbehandlet ved hjælp af en DICOM-medicinsk billedfremviser med åben adgang). Den vigtigste begrænsning med hensyn til måling af det vaskulære netværk er, at softwaren ikke har evnen til nøjagtigt at adskille det valgte definerede ROI (som repræsenterer leverens vaskulære netværk) fra baggrunden (som repræsenterer det omgivende levervæv); Derfor skal den passende tærskel vælges gennem forsøg og fejl. Indledningsvis definerer brugeren en lavere tærskelværdi på 600 HU og maksimalt 10.000 HU. Hvis det ekstraherede vaskulære netværk og adskillelsen fra det omgivende væv ikke er acceptabelt, justeres den lavere værdi via forsøg og fejl efter trinvise ændringer på 50-100 HU. Processen gentages af brugeren, indtil det vaskulære netværk er tilstrækkeligt adskilt fra vævet.
Afslutningsvis kan forståelse af tilpasningerne af det hepatiske vaskulære netværk under NAFLD-progression og korrelering af dem med andre metoder til sygdomskarakterisering ved hjælp af den foreslåede metode bane vejen for etablering af nye, mere effektive og reproducerbare tilgange til NAFLD-forskning i mus. Denne protokol forventes også at opgradere værdien af prækliniske dyremodeller til undersøgelse af udviklingen af nye terapier mod sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Dette arbejde blev støttet af Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 til A.C.). Anna Hadjihambi er finansieret af The Roger Williams Institute of Hepatology, Foundation for Liver Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
