Summary
Unter Verwendung eines diätinduzierten Mausmodells der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) beschreiben wir den Einsatz neuartiger in vivo Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD, wobei der Schwerpunkt hauptsächlich auf dem hepatischen Gefäßnetzwerk liegt, da es maßgeblich an der NAFLD-bedingten Leberdysregulation beteiligt ist.
Abstract
Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist ein wachsendes globales Gesundheitsproblem, und die Auswirkungen der NAFLD werden durch den derzeitigen Mangel an wirksamen Behandlungen noch verstärkt. Erhebliche limitierende Faktoren, die die rechtzeitige und genaue Diagnose (einschließlich Grading) und Überwachung von NAFLD sowie die Entwicklung potenzieller Therapien behindern, sind die derzeitigen Unzulänglichkeiten bei der Charakterisierung der Struktur der hepatischen Mikroumgebung und der Bewertung des Krankheitsstadiums in raumzeitlicher und nicht-invasiver Weise. Unter Verwendung eines diätinduzierten NAFLD-Mausmodells untersuchten wir den Einsatz von in vivo Mikro-Computertomographie (CT)-Bildgebungsverfahren als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD, wobei wir uns hauptsächlich auf das hepatische Gefäßnetzwerk konzentrierten, da es maßgeblich an der NAFLD-bedingten Leberdysregulation beteiligt ist. Diese bildgebende Methodik ermöglicht eine longitudinale Analyse der Lebersteatose und der funktionellen Gewebeaufnahme sowie die Beurteilung des relativen Blutvolumens, des Pfortaderdurchmessers und der Dichte des Gefäßnetzwerks. Das Verständnis der Anpassungen des hepatischen Gefäßnetzwerks während der NAFLD-Progression und die Korrelation mit anderen Methoden zur Charakterisierung des Krankheitsverlaufs (Steatose, Entzündung, Fibrose) mit der vorgeschlagenen Methode kann den Weg für die Etablierung neuer, effizienterer und reproduzierbarer Ansätze für die NAFLD-Forschung an Mäusen ebnen. Es wird auch erwartet, dass dieses Protokoll den Wert präklinischer Tiermodelle für die Untersuchung der Entwicklung neuartiger Therapien gegen das Fortschreiten der Krankheit erhöht.
Introduction
Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine Stoffwechselerkrankung, von der etwa 25 % der Bevölkerung und >80 % der krankhaft adipösen Menschen betroffen sind1. Schätzungsweise ein Drittel dieser Personen entwickelt eine nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), die durch Lebersteatose, Entzündung und Fibrose gekennzeichnet ist2. NASH ist ein Krankheitsstadium mit einem signifikant höheren Risiko für die Entwicklung von Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (HCC)3,4. Aus diesem Grund ist NASH derzeit die zweithäufigste Ursache für Lebertransplantationen und wird voraussichtlich bald auch der wichtigste Prädiktor für Lebertransplantationen sein 5,6,7. Trotz ihrer Prävalenz und ihres Schweregrads gibt es keine krankheitsspezifische Therapie für NAFLD, und die bestehenden Behandlungen zielen nur darauf ab, krankheitsassoziierte Pathologien wie Insulinresistenz und Hyperlipidämie zu bekämpfen 5,6.
In den letzten Jahren haben die pathophysiologische Rolle und Anpassungen des Endothels und allgemein des vaskulären Netzwerks von Stoffwechselgeweben, wie dem Fettgewebe und der Leber, in der Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen, insbesondere bei Adipositas und metabolischer Dysregulation 7,8. Das Endothel ist eine zelluläre Monoschicht, die das Gefäßnetzwerk intern auskleidet und als funktionelle und strukturelle Barriere fungiert. Es trägt auch zu verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen bei, wie z. B. Thrombosen, Metabolitentransport, Entzündungen und Angiogenese 9,10. Im Falle der Leber zeichnet sich das Gefäßnetzwerk unter anderem durch das Vorhandensein hochspezialisierter Zellen aus, die als sinusförmige Endothelzellen der Leber (LSECs) bezeichnet werden. Diesen Zellen fehlt eine Basalmembran und sie haben mehrere Fenestrae, was den Transfer von Substraten zwischen Blut und Leberparenchym erleichtert. Aufgrund ihrer charakteristischen anatomischen Lage und Eigenschaften spielen LSECs wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei den pathophysiologischen Prozessen der Leber, einschließlich der Entwicklung von Leberentzündungen und Fibrose während NAFLD/NASH. Tatsächlich tragen die pathologischen, molekularen und zellulären Anpassungen, die LSECs im Verlauf der NAFLD durchlaufen, zum Fortschreiten der Krankheit bei11. Insbesondere die LSEC-abhängige hepatische Angiogenese, die während der NAFLD stattfindet, ist signifikant mit der Entwicklung von Entzündungen und dem Fortschreiten der Krankheit zu NASH oder sogar HCC12 verbunden. Darüber hinaus ist die Adipositas-bedingte frühe NAFLD durch die Entwicklung einer Insulinresistenz in LSECs gekennzeichnet, die der Entwicklung einer Leberentzündung oder anderer fortgeschrittener NAFLD-Anzeichen vorausgeht13.
Darüber hinaus haben sich LSECs in jüngster Zeit als zentrale Regulatoren des Leberblutflusses und der Anpassungen des Gefäßnetzwerks während Lebererkrankungen verschiedener Ätiologien herausgestellt14,15. In der Tat ist eine chronische Lebererkrankung durch eine ausgeprägte intrahepatische Vasokonstriktion und eine erhöhte Resistenz gegen den Blutfluss gekennzeichnet, die zur Entwicklung einer portalen Hypertonie beitragen16. Im Falle der NAFLD tragen mehrere LSEC-bezogene Mechanismen zu diesem Phänomen bei. Zum Beispiel ist eine LSEC-spezifische Insulinresistenz, wie oben erwähnt, mit einer reduzierten insulinabhängigen Vasodilatation des Lebergefäßsystems verbunden13. Außerdem wird das Lebergefäßsystem im Laufe der Erkrankung empfindlicher gegenüber Vasokonstriktoren, was weiter zu einer Beeinträchtigung des Leberblutflusses beiträgt und zur Entstehung von Scherstress führt, die beide zu einer Störung der sinusförmigen Mikrozirkulation führen17. Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass das Gefäßsystem ein wichtiges Ziel bei Lebererkrankungen ist. Limitierende Faktoren, die die rechtzeitige Diagnose und Überwachung von NAFLD/NASH sowie die Entwicklung potenzieller Therapien behindern, sind jedoch die Unzulänglichkeiten bei der konsistenten Charakterisierung der hepatischen Mikroumgebung und der (mikro)vaskulären Struktur sowie der Bewertung des Krankheitsstadiums in raumzeitlicher und nicht-invasiver Weise.
Die Mikro-Computertomographie (CT) ist derzeit der Goldstandard unter den nicht-invasiven Bildgebungsverfahren, um anatomische Informationen innerhalb eines lebenden Organismus genau darzustellen. Mikro-CT und MRT stellen zwei komplementäre Bildgebungsverfahren dar, die ein breites Spektrum von Pathologien abdecken können und eine außergewöhnliche Auflösung und Detailgenauigkeit in den abgebildeten Strukturen und Geweben bieten. Insbesondere die Mikro-CT ist ein sehr schnelles und genaues Instrument, das häufig zur Untersuchung von Pathologien wie Knochenerkrankungen und damit verbundenen Knochenoberflächenveränderungen18, zur Beurteilung des Fortschreitens der Lungenfibrose im Laufe der Zeit19, zur Diagnose von Lungenkrebs und seinem Staging20 oder sogar zur Untersuchung von Zahnpathologien21 verwendet wird, ohne dass eine spezielle Präparation (oder Zerstörung) der abgebildeten Proben erforderlich ist.
Die bildgebende Technologie der Mikro-CT basiert auf den unterschiedlichen Dämpfungseigenschaften verschiedener Organe in Bezug auf die Wechselwirkung von Röntgenstrahlen mit Materie. Organe mit hohen Röntgenabschwächungsunterschieden werden in CT-Bildern kontrastreich dargestellt (d.h. die Lunge erscheint dunkel und die Knochen hell). Organe, die sehr ähnliche Dämpfungseigenschaften aufweisen (unterschiedliche Weichteile), sind auf CT-Bildern schwer zu unterscheiden22. Um dieser Einschränkung zu begegnen, wurden spezielle Kontrastmittel auf Basis von Jod, Gold und Wismut für den In-vivo-Einsatz ausgiebig untersucht. Diese Mittel verändern die Dämpfungseigenschaften der Gewebe, in denen sie sich ansammeln, werden langsam aus dem Kreislauf ausgeschieden und ermöglichen die gleichmäßige und stabile Trübung des gesamten Gefäßsystems oder ausgewählter Gewebe23.
In der Humandiagnostik werden zur Bestimmung des Leberfettgehalts bereits CT-Bildgebung und vergleichbare Techniken, wie z.B. die MRT-abgeleitete Protonendichte-Fettfraktion, eingesetzt24,25. Im Zusammenhang mit der NAFLD ist ein hoher Weichteilkontrast unerlässlich, um pathologische Läsionen oder kleine Gefäße genau zu unterscheiden. Zu diesem Zweck werden Kontrastmittel eingesetzt, die einen verbesserten Kontrast der Lebergewebeeigenschaften bieten. Solche Werkzeuge und Materialien ermöglichen die Untersuchung mehrerer Lebermerkmale und möglicher pathologischer Ausprägungen, wie z. B. die Architektur und Dichte des vaskulären Netzwerks, die Lipidablagerung/Steatose und die funktionelle Gewebeaufnahme/den Lipidtransfer (Chylomikron) in der Leber. Zusätzlich können auch das relative Blutvolumen der Leber und der Durchmesser der Pfortader beurteilt werden. In sehr kurzer Scanzeit liefern all diese Parameter unterschiedliche und komplementäre Informationen über die Beurteilung und den Verlauf der NAFLD, die zur Entwicklung einer nicht-invasiven und detaillierten Diagnose verwendet werden können.
In diesem Artikel stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz neuartiger In-vivo-Mikro-CT-Bildgebungstechniken als nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Progressionsstadien der NAFLD zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die longitudinale Analyse der Lebersteatose und der funktionellen Gewebeaufnahme sowie die Bewertung des relativen Blutvolumens, des Pfortaderdurchmessers und der Dichte des Gefäßnetzwerks durchgeführt und in Mausmodellen für Lebererkrankungen angewendet werden.
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Protocol
Alle Verfahren wurden von den Mitarbeitern von BIOEMTECH in Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Tierschutzbestimmungen durchgeführt und von den nationalen Behörden genehmigt (Lizenznummer EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alle Experimente wurden unter Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien26 konzipiert und berichtet. Die Mäuse wurden vom Hellenic Pasteur Institute in Athen, Griechenland, gekauft.
HINWEIS: Die Tiere wurden in einzeln belüfteten Käfigen, die mit Schienen und Pappröhren angereichert waren, in einem Raum bei 20-22 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50%-60% und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht 07:00-19:00 Uhr) untergebracht. Eine Kombination aus einer fettreichen Diät (HFD) und Maissirup mit hohem Fruktosegehalt (HFCS), einem fruktose- und glukosehaltigen Süßstoff, der in modernen Arten von fettangereicherten Diäten weit verbreitet ist, wurde verwendet, um NAFLD als anerkanntes zuverlässiges Modell zu induzieren27,28,29,30. Im Alter von 7-8 Wochen erhielten männliche C57BL/6-Mäuse ad libitum Zugang entweder zu einer normalen Diät (n = 2) mit 10 % Kilokalorien aus Fett oder zu einer HFD (n = 2) mit 60 % Kilokalorien aus Fett, ergänzt mit 5 % HFCS in Wasser für 22 Wochen. Das Körpergewicht wurde wöchentlich mit Hilfe einer digitalen Waage ermittelt, und während des Versuchszeitraums wurde das Tierwohl an abwechselnden Tagen anhand eines Score-Bogens überwacht. Am Ende des Bildgebungsprotokolls wurden die Mäuse durch Zervixluxation euthanasiert.
1. Zubereitung von Tieren
HINWEIS: Das Bildgebungsprotokoll ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
- Betäuben Sie die Maus mit 3%-4% Isofluran (in Raumluft) und halten Sie ihre Körpertemperatur mit einem speziellen Heizkissen.
HINWEIS: Das Fehlen eines Pedalrückzugsreflexes muss verwendet werden, um eine ausreichende Anästhesietiefe zu bestätigen, bevor der Scan eingeleitet wird. - Tragen Sie vor dem Experiment eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf.
- Legen Sie das Tier in die Halterung des CT-Scanners, befestigen Sie den Nasenkonus und wechseln Sie zur Wartung zu 1,5 % bis 3 % Isofluran (in der Raumluft).
HINWEIS: Das Fehlen eines Pedalrückzugsreflexes muss verwendet werden, um den geeigneten Prozentsatz an Isofluran für die Aufrechterhaltung der Anästhesie zu bestätigen. - Überwachen Sie die Maus kontinuierlich.
2. Vorbereitung vor dem Scannen
HINWEIS: Die Bildgebung wird in zwei experimentellen Phasen durchgeführt, damit das erste Kontrastmittel ausreichend aus dem Kreislauf und dem Gewebe entfernt werden kann. eXIA (erstes Kontrastmittel) wird in der ersten Phase und ExiTron (zweites Kontrastmittel) in der zweiten Phase verabreicht, wie im Abschnitt "Bildgebungs-Workflow" (Abschnitt 3) unten beschrieben.
- Lassen Sie das Kontrastmittel (je nach Versuchsphase entweder eXIA oder ExiTron) 3 h Raumtemperatur erreichen.
- Stellen Sie die folgenden Scanparameter am CT-Scanner ein: hochauflösendes Protokoll unter 50 kVp Röhrenspannung und einem Strom von 460 μA, nicht spiralförmig, 720 Projektionen/Umdrehungen, vier Umdrehungen und 4 Minuten Erfassungszeit.
3. Imaging-Arbeitsablauf
- Experimentelle Phase 1
- Berechnen und bereiten Sie das Volumen des ersten Kontrastmittels vor, das in einer unverdünnten Dosis von 6 μl/g Körpergewicht verabreicht werden soll, um einen maximalen Kontrast zu erzielen.
- Bereiten Sie den Schwanzvenenkatheter vor, indem Sie ihn mit Kochsalzlösung füllen und an die mit dem Kontrastmittel gefüllte Spritze anschließen.
- Führen Sie einen Ganzkörper- (WB) und Leber-Baseline-Scan vor dem Kontrastmittel durch.
- Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen oder Verstopfungen in der Spritze oder im Katheter befinden.
- Führen Sie den vorgefüllten Katheter in die Schwanzvene ein und verabreichen Sie das Kontrastmittel über eine langsam und manuell durchgeführte Injektion mit einer Dauer von 1-3 Minuten (nicht als Bolusinjektion). Eine Spritzenpumpe kann verwendet werden, wenn sie auf die entsprechende Infusionsrate eingestellt ist.
HINWEIS: Der Schwanz des Tieres kann in lauwarmes Wasser gelegt werden, um eine Vasodilatation zu induzieren und das Einführen des Katheters zu erleichtern - Erfassen Sie WB- und Leberscans zu unterschiedlichen Zeitpunkten, wie in Tabelle 1 angegeben.
HINWEIS: Wenn die Erfassung aller Punkte nicht möglich ist, sollte der Fokus auf 45 Minuten nach der Injektion (PI) gelegt werden, was der Punkt der maximalen Leberaufnahme ist, und 48 Stunden PI, wenn die Clearance erreicht ist.
- Experimentelle Phase 2
- Bereiten Sie die Maus erneut wie in Abschnitt 1 beschrieben für die Verabreichung des zweiten Kontrastmittels 10 Tage nach der endgültigen Befundung mit dem ersten Kontrastmittel (48 h PI) vor.
- Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.2 aus.
- Berechnen und bereiten Sie das Volumen des zweiten Kontrastmittels vor, das in einer unverdünnten Dosis von 8 μl/g Körpergewicht verabreicht werden soll, um einen maximalen Kontrast zu erzielen.
- Bereiten Sie den Schwanzvenenkatheter vor, indem Sie ihn mit Kochsalzlösung füllen und an die mit dem Kontrastmittel gefüllte Spritze anschließen.
- Führen Sie einen WB- und Leber-Baseline-Scan vor dem Kontrastmittel durch, um das relative Blutvolumen und die Lebersteatose zu bewerten.
- Stellen Sie sicher, dass im Scan kein Kontrast erkennbar ist, der auf die vollständige Clearance des ersten Kontrastmittels hinweist.
- Führen Sie den vorgefüllten Katheter in die Schwanzvene ein und verabreichen Sie das Kontrastmittel über eine intravenöse Injektion, die langsam und manuell mit einer Dauer von 1-3 Minuten (nicht als Bolusinjektion) durchgeführt wird. Eine Spritzenpumpe kann verwendet werden, wenn sie auf die entsprechende Infusionsrate eingestellt ist.
- Erfassen Sie WB- und Leberscans zu unterschiedlichen Zeitpunkten, wie in Tabelle 1 angegeben.
HINWEIS: WB-Scans werden nach 10 Minuten und 4 Stunden PI aufgenommen. Die signifikante Zeitspanne zwischen ihnen ermöglicht die Bewertung der Tracer-Bioverteilung im Körper sowie deren relative Clearance.
4. Datenextraktion und -analyse
HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Datenextraktions- und Analyseschritte bereitgestellt, die auf einer speziellen Bildverarbeitungssoftware basieren (siehe Materialtabelle). Die beschriebenen Schritte müssen ggf. angepasst werden, wenn unterschiedliche Software verwendet wird.
- Evaluierung der hepatischen Lipidablagerung/Steatose.
HINWEIS: Für die Beurteilung der Lebersteatose wird kein Kontrastmittel verwendet, und es wird ein Vergleich zwischen Kontrolle und Pathologie durchgeführt. Aufgrund relativ hoher Abweichungen in den Gewebedämpfungseigenschaften zwischen verschiedenen Mäusen werden die Dichtewerte für die Leber gegen die Milz (fettfreies Gewebe) und das Fett (absolutes Fettgewebe) nach der folgenden Gleichung und wie zuvor beschrieben25 normiert:
- Um die Analyse durchzuführen, laden Sie die DICOM-Datei des Vorkontrastscans und passen Sie den Balken/Kontrast so an, dass Leber, Milz und weißes Fettgewebe (WAT) deutlich zu sehen sind.
- Greifen Sie über das Pulldown-Menü auf der Vorderseite auf das Werkzeug-Operator-Werkzeug zu und wählen Sie 3D-ROI-Werkzeug.
- Wählen Sie unter dem 3D-ROI-Operator die Option ROI hinzufügen aus, um mehrere ROIs (bis zu acht für jedes Gewebe) zu generieren, um Proben in den Bereichen durchzuführen, in denen die Leber (vorzugsweise in den Bereichen des linken Mittellappens, des rechten Mittellappens und des linken Seitenlappens) und die Milz frei erscheinen, ohne sichtbare Blutgefäße und Fett.
HINWEIS: Bei WAT werden ROIs in der Mitte des viszeralen Fettgewebedepots ausgewählt. Die empfohlenen Bereiche sind in Abbildung 2 dargestellt. Normalisierungsmethoden unter Verwendung des Leber-Milz-Verhältnisses und ohne Berücksichtigung von WAT können auch wie zuvor festgelegt angewendet werden31. - Wählen Sie unter dem 3D-Malmodus und der Funktion " Erodieren/Erweitern " die Option " 2D" aus, und verwenden Sie die angezeigte Benutzeroberfläche, um einen Namen und eine Farbe für jede ROI anzugeben.
- Verwenden Sie das ROI-Werkzeug "Kugel malen " mit einem Durchmesser von 8 Pixeln, um die 2D-ROIs manuell zu zeichnen.
- Führen Sie Stichproben durch, indem Sie die 2D-ROIs in den interessierenden Bereichen mit dem Fadenkreuz-Werkzeug auf der Querebene segmentieren, wie in Abbildung 3A dargestellt.
- Klicken Sie auf den ausgewählten Punkt in der sagittalen und koronalen Ebene, um die Segmentierung des 2D-ROI abzuschließen, wie in Abbildung 3B dargestellt.
- Wiederholen Sie den Vorgang, um die restlichen ROIs zu definieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Abtastung die Orgelrandbereiche, da dies zu Rauschen führen und die Zuverlässigkeit des berechneten Hounsfield-Einheitenwerts (HU) jedes ROI beeinträchtigen kann. - Wenn Sie mit den segmentierten ROIs zufrieden sind, gehen Sie zur Navigation und wählen Sie Tabelle anzeigen , um die Quantifizierungstabelle mit den berechneten HU-Werten für jeden ROI anzuzeigen.
HINWEIS: Die interessierenden Werte sind in der Spalte "Mittelwert" aufgeführt, die die numerischen Mittelwerte der Voxel (HU) enthält, die in den ROIs für die interessierenden Organe enthalten sind. Notieren Sie sich die gewünschten Werte, oder speichern Sie die gesamte Tabelle, indem Sie Tabelle exportieren auswählen. - Berechnen Sie die durchschnittliche HU für Leber, Milz und WAT und setzen Sie die Werte in die obige Gleichung ein, um den Prozentsatz des Leberfetts zu berechnen.
- Funktionelle Gewebeaufnahme/Lipidtransfer (Chylomikron) in der Leber
HINWEIS: Die funktionelle Gewebeaufnahme/der Lipidtransfer (Chylomikron) wird anhand der erworbenen Scans 45 Minuten und 48 Stunden nach der ersten Kontrastmittelinfusion analysiert, basierend auf einer zuvor veröffentlichten Methode32. Der Kontrast wird für die verschiedenen Gewebe und Zeitpunkte anhand der folgenden Gleichung berechnet:
PV-Organt i ist der durchschnittliche Pixelwert im Organ zum Zeitpunkt t i (im Bereich von 0 h bis 48 h), und PV-Organ t0 ist der durchschnittliche Pixelwert im Organ im Bild ohne Kontrast.- Um diese Analyse durchzuführen, laden Sie die eXIA-Scan-DICOM-Datei und passen Sie den Balken/Kontrast so an, dass Leber, Milz und linker Ventrikel deutlich zu sehen sind.
- Greifen Sie über das Werkzeug-Pulldown-Menü auf der Vorderseite auf den Modellierungsoperator zu und wählen Sie 3D-ROI-Werkzeug aus.
- Wählen Sie unter dem 3D-ROI-Operator die Option ROI hinzufügen aus, um mehrere ROIs für die Leber zu segmentieren.
- Verwenden Sie im 3D-Malmodus und in der Funktion "Erodieren/Erweitern" das ROI-Werkzeug "Kugel malen " mit einem Durchmesser von 8 Pixeln und −1 Erodieren.
HINWEIS: Wählen Sie mehrere ROIs für Slices aus, bei denen jedes Organ deutlich angezeigt wird. Vermeiden Sie Grenzregionen, da dies zu Rauschen führen und die Zuverlässigkeit des berechneten HU-Werts der einzelnen ROI beeinträchtigen kann. Dies führt zur Abtastung mehrerer 3D-ROIs, die kleinen Organvolumina entsprechen. - Verwenden Sie die angezeigte Benutzeroberfläche, um einen Namen und eine Farbe für jede ROI anzugeben.
- Wenn Sie mit den entworfenen ROIs zufrieden sind, gehen Sie zur Navigation und wählen Sie Tabelle anzeigen , um die Quantifizierungstabelle mit den berechneten HU-Werten für jeden ROI anzuzeigen.
HINWEIS: Die interessierenden Werte werden in der Spalte "Mittelwert" aufgeführt, in der die numerischen Mittelwerte der Voxel (HU) angezeigt werden, die im ROI enthalten sind. Der durchschnittliche HU-Wert der ROIs jedes Organs entspricht dem PV-Organt i. Notieren Sie sich die gewünschten Werte, oder speichern Sie die gesamte Tabelle, indem Sie Tabelle exportieren auswählen. - Um das PV-Organ t0 zu erhalten, wiederholen Sie alle oben genannten Schritte mit der Vorkontrast-DICOM-Datei, um die mittlere Helligkeit der Leber, der Milz und des linken Ventrikels vor der Kontrastmittelinjektion zu berechnen.
- Fügen Sie die Werte in die obige Gleichung ein, um den prozentualen Kontrast zu extrahieren, der der funktionellen Gewebeaufnahme/dem Lipidtransfer (Chylomikron) entspricht.
- Architektur und Dichte des hepatischen Gefäßnetzwerks
ANMERKUNG: Die Analyse der Architektur und Dichte des hepatischen Gefäßnetzwerks basiert auf einer zuvor veröffentlichten Methodik33 und wird auf den Leberscans durchgeführt, die 10 min PI des zweiten Kontrastmittels erhalten haben.- Um diese Analyse durchzuführen, laden Sie die ExiTron-Scan-DICOM-Datei und passen Sie den Balken/Kontrast an, um das Lebergefäßnetzwerk deutlich zu sehen.
- Greifen Sie über das Werkzeug-Pulldown-Menü auf der Vorderseite auf den Modellierungsoperator zu und wählen Sie 3D-ROI-Werkzeug aus.
- Wählen Sie unter dem 3D-ROI-Operator die Option ROI hinzufügen aus, um einen 3D-ROI für die Leber zu generieren.
- Wählen Sie unter dem 3D-Malmodus und der Funktion "Erodieren/Erweitern" die Option " 3D" aus.
HINWEIS: Verwenden Sie das ROI-Werkzeug Kugel malen mit −1 erodieren, um die Segmentierungsebenen über die koronale Ebene zu definieren. Der Durchmesser des ROI-Malwerkzeugs muss für jede Ebene angepasst werden (zum Hinzufügen/Löschen von gewünschten/unerwünschten Voxelauswahlen). Es wird empfohlen, das Lebervolumen zunächst über die koronale Ebene zu definieren, und dann können die transversale und sagittale Ebene verwendet werden, um den ROI zu korrigieren. Dieser Prozess erfordert Präzision. Der Benutzer muss sehr vorsichtig sein, um keine anderen Gewebe, Gefäße und Knochen einzubeziehen, wenn er jede ROI-Schicht segmentiert, und gleichzeitig sicherstellen, dass alle Bereiche der Leber in den definierten ROI einbezogen werden. Aus diesem Grund ist es wichtig, sich mit den anatomischen Grenzen der Leber vertraut zu machen. - Wenn Sie mit dem resultierenden Leber-ROI zufrieden sind, führen Sie einen Schnitt durch, um alle Voxel aus den Bilddaten zu entfernen, die nicht in den anfänglich segmentierten Leber-ROI gehören. Wählen Sie dazu den Leber-ROI aus der ROI-Auswahl aus und klicken Sie auf das Symbol " Schnitt durchführen" . Dieser Vorgang entfernt den Hintergrund und lässt den Leber-ROI unverändert.
HINWEIS: Obwohl die Rückgängig-/Wiederherstellungsfunktionen auf alle Vorgänge anwendbar sind, die mit dem 3D-ROI-Tool ausgeführt werden, kann die Aktion zum Schneiden einer ROI nicht rückgängig gemacht werden. Vor dieser Aktion kann der Benutzer also in Erwägung ziehen, den anfänglichen Leber-ROI im DICOM-Format zu speichern. - Der resultierende Leber-ROI umfasst das Gefäßnetzwerk und das umgebende Gewebe, das entfernt werden muss. Setzen Sie dazu den Leber-ROI zurück, indem Sie auf die Schaltfläche ROI-Besen zurücksetzen klicken.
- Verwenden Sie die angezeigte Schnittstelle, um alle Pixel des Leber-ROI in den Hintergrund zu übertragen.
HINWEIS: Der Leber-ROI ist nach dieser Operation weiterhin vorhanden, enthält jedoch keine Voxel mehr. - Um den ROI der Leber neu zu segmentieren, sodass er nur vaskulär assoziierte Pixel enthält, gehen Sie zu Segmentierungsalgorithmen , die durch das Zauberstabsymbol gekennzeichnet sind, und wählen Sie Verbundene Schwellenwerte aus.
- Definieren Sie die ROI als Ausgabe und den Hintergrund als Eingabe aus dem Dropdown-Menü " Eingabe ", bevor Sie die Schwellenwerte anwenden.
- Legen Sie die Schwellenwerte fest, indem Sie auf die Symbole " Min" und " Max" links neben jedem Schwellenwertfeld klicken, um Maximal- und Minimalwerte einzugeben und das Gefäßnetzwerk zu erhalten.
HINWEIS: Nur Pixel innerhalb des ausgewählten Bereichs werden in die resultierende ROI einbezogen. Durch die Anpassung der Grenzwerte zwischen verschiedenen Tieren wird sichergestellt, dass die gleichen anatomischen Regionen in Bezug auf die genaue Menge des Kontrastmittels, die jedem Tier injiziert wird, berücksichtigt werden. Dies ist bei den ausgewählten Geweben konstant, auch wenn die Zahlenwerte nicht identisch sind. - Klicken Sie mit dem Fadenkreuz-Werkzeug auf einen Punkt, an dem das Gefäßnetz klar erscheint, und klicken Sie auf Anwenden , um die Segmentierung durchzuführen.
- Aktivieren Sie den MIP-Viewer (Maximum Intensity Projection).
- Bewerten Sie den resultierenden Leber-ROI im Hinblick darauf, wie klar das Gefäßnetzwerk in der MIP-Ansicht erscheint.
- Wenn das Gewebe in Teilen des Leber-ROI verbleibt, wiederholen Sie die Schritte 4.3.5-4.3.11, indem Sie den Min-Schwellenwert anpassen, bis der segmentierte Leber-ROI eindeutig das Gefäßnetzwerk darstellt.
- Wenn Sie mit dem resultierenden Leber-ROI zufrieden sind, generieren Sie die Quantifizierungstabelle, die das berechnete Leber-ROI-Volumen in Kubikmillimetern enthält.
HINWEIS: Die interessierenden Werte sind in der Spalte "mm3" aufgeführt, die den numerischen Volumenwert der Voxel (HU) enthält, die im Leber-ROI enthalten sind. Notieren Sie sich die gewünschten Werte, oder speichern Sie die gesamte Tabelle, indem Sie Tabelle exportieren auswählen.
- Relatives Blutvolumen in der Leber
HINWEIS: Für die Messung des hepatischen relativen Blutvolumens (rBV), das signifikant mit der Menge der neu gebildeten Blutgefäße während des Fortschreitens der Fibrose korreliert, werden Präkontrastscans und Scans 4 h nach der zweiten Kontrastmittelinjektion verwendet. Die Analyse wird wie zuvor beschrieben34 durchgeführt.- Um diese Analyse durchzuführen, laden Sie die ExiTron-Scan-DICOM-Datei und passen Sie den Balken/Kontrast an.
HINWEIS: Deaktivieren Sie den MIP-Viewer: Aktivieren Sie unter "Einstellungen" das Kontrollkästchen, um den MIP-Viewer beim Laden zu deaktivieren. Bei großen Datasets kann dadurch die Ladegeschwindigkeit verbessert werden. - Greifen Sie über das Werkzeug-Pulldown-Menü auf der Vorderseite auf den Modellierungsoperator zu und wählen Sie 3D-ROI-Werkzeug aus. Dieses Werkzeug bietet erweiterte Optionen zum Zeichnen, Visualisieren, Speichern und Quantifizieren von 2D- und 3D-Regionen.
- Wählen Sie unter dem 3D-ROI-Operator die Option ROI hinzufügen aus, und segmentieren Sie zwei ROIs: eine für die Leber und eine für ein großes Blutgefäß.
- Wählen Sie unter dem 3D-Malmodus und der Funktion "Erodieren/Erweitern " die Option " 2D" aus.
HINWEIS: Es wird empfohlen, das ROI-Werkzeug " Kugelfarbe " mit einem Durchmesser von 8-10 Pixeln für die Leber und 4-6 Pixeln für das Blutgefäß zu verwenden. Der Durchmesser des Malwerkzeugs kann jedoch angepasst werden, je nachdem, wie klein der auszuwählende Bereich ist. - Verwenden Sie die angezeigte Benutzeroberfläche, um einen Namen und eine Farbe für jede ROI anzugeben.
HINWEIS: Wählen Sie zwei bis fünf Schichten der zentralen Teile des interessierenden Gewebes aus und definieren Sie die Segmentierungsebenen, um 2D-ROIs für jedes Gewebe zu generieren. Vermeiden Sie bei der Auswahl der Bereiche auf jeder Schicht die Organrandbereiche, wie in Abbildung 4 dargestellt, da dies zu Rauschen führen und die Zuverlässigkeit des berechneten HU-Werts jedes ROI beeinträchtigen kann. - Wenn Sie mit den entworfenen ROIs zufrieden sind, gehen Sie zur Navigation und wählen Sie Tabelle anzeigen , um die Quantifizierungstabelle mit den berechneten HU-Werten für jeden ROI anzuzeigen.
HINWEIS: Die interessierenden Werte werden in der Spalte "Mittelwert" aufgeführt, in der die numerischen Mittelwerte der Voxel (HU) angezeigt werden, die im ROI enthalten sind. Notieren Sie sich die gewünschten Werte, oder speichern Sie die gesamte Tabelle, indem Sie Tabelle exportieren auswählen. - Wiederholen Sie alle Schritte für die DICOM-Datei vor dem Kontrastmittel, um die mittlere Helligkeit der Leber vor der Kontrastmittelinjektion zu erhalten. Führen Sie dazu die Schritte 4.4.2-4.4.5 nur für die Leber durch.
- Berechnen Sie die durchschnittlichen HU-Werte für jedes Gewebe zu den entsprechenden Zeitpunkten und fügen Sie die erhaltenen Werte in die folgende Gleichung ein:
HINWEIS: Ein großes Blutgefäß nach Kontrastmittelinjektion gilt als 100 % rBV und die Leber vor Kontrastmittelgabe als 0 % rBV.
- Um diese Analyse durchzuführen, laden Sie die ExiTron-Scan-DICOM-Datei und passen Sie den Balken/Kontrast an.
- Durchmesser der Pfortader
HINWEIS: Für die Messung des Pfortaderdurchmessers werden die gleichen Scans analysiert, die für die Messungen des hepatischen rBV verwendet wurden, wie zuvor beschrieben35.- Laden Sie die ExiTron-Scan-DICOM-Datei und passen Sie den Balken/Kontrast an.
- Lokalisieren Sie die Transversalebenen von drei bis vier Schichten oberhalb der Verbindung der Vena mesenterica superior und der Vena milz superior (Abbildung 5).
- Verwenden Sie das Lineal-Werkzeug , um den genauen Abstand zwischen zwei Punkten zu messen (d. h. den Durchmesser des kreisförmigen Venenbereichs).
HINWEIS: Die Entfernung wird auf dem Bild extrahiert, aber man kann auch zur Navigation gehen und Tabelle anzeigen auswählen, um die Quantifizierungstabelle mit der berechneten Entfernung anzuzeigen, oder Tabelle exportieren auswählen, um das Ergebnis zu speichern.
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Representative Results
In dieser repräsentativen Studie zeigte die Mikro-CT-Bildgebung ohne Kontrastmittel einen höheren Anteil an Leberfett bei Mäusen mit NAFLD im Vergleich zu den Kontrollen (Tabelle 2), was die Pathologie bestätigt. Unter Verwendung des ExiTron-Kontrastmittels und der oben beschriebenen Analyse der Architektur und Dichte des hepatischen Gefäßnetzwerks wurde festgestellt, dass die Gesamtvolumendichte des hepatischen Gefäßnetzwerks bei Mäusen mit NAFLD im Vergleich zu gesunden Kontrollen höher war (Abbildung 6, Tabelle 2). Mäuse mit NAFLD hatten auch einen größeren Pfortaderdurchmesser im Vergleich zu Kontrollmäusen (Tabelle 2), eine strukturelle Veränderung, die mit portaler Hypertonie während einer Lebererkrankung assoziiert ist34,36,37. In ähnlicher Weise wurde berechnet, dass die hepatische rBV von Tieren mit NAFLD im Vergleich zu gesunden Kontrollen höher war (Tabelle 2).
Darüber hinaus zeigte die Analyse des funktionellen Gewebeaufnahme-Assays eine höhere Akkumulation und langsamere Clearance des eXIA-Kontrastmittels bei Mäusen mit NAFLD im Vergleich zu gesunden Kontrollen (Abbildung 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass steatotische Hepatozyten wahrscheinlich ein hohes Maß an zellulärer Endozytose und -verteilung durchlaufen, wenn auch begleitet von einem reduzierten metabolischen Katabolismus oder einer reduzierten Clearance/Sekretion. Insgesamt stimmt dieser Befund mit dem Phänotyp der reduzierten hepatischen Stoffwechselaktivität überein, wie er im Falle der Fettinfiltration/NAFLD zu erwarten ist38,39.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder, die die vorgeschlagenen Bereiche hervorheben, die für die Durchführung von Probenahmen zur Segmentierung des 2D-ROI für Leber (rot), Milz (grün) und WAT (blau) verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Beispiel für die Segmentierung eines 2D-ROI zur Berechnung der Steatose. (A) Das Fadenkreuz-Werkzeug wird verwendet, um einen 2D-ROI für einen gewünschten Bereich der Leber auf der Querebene auszuwählen. (B) Der Prozess wird auf der sagittalen und koronalen Ebene wiederholt, um die Segmentierung des 2D-ROI abzuschließen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentatives Beispiel einer Segmentierungsschicht zur Generierung eines 2D-Leber-ROI. Zentrale Teile der Orgel werden manuell ausgewählt, wobei die Randbereiche vermieden werden, um Rauschen zu eliminieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Axialer 2D-Bereich. Repräsentative Beispiele für die axiale 2D-Fläche der verschiedenen Schichten, die zur Messung des Pfortaderdurchmessers bei Mäusen mit NAFLD und gesunden Kontrollen ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Architektur des hepatischen vaskulären Netzwerks. Repräsentativ extrahierte Bilder der Architektur des hepatischen Gefäßnetzwerks, wie sie durch CT-Segmentierung gezeigt wird, aufgenommen von einer Kontrollmaus (176,9 mm 3) und einer Maus mit NAFLD (390,3 mm3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Durchschnittliche Kontrastwerte. Gruppierte Daten mit den durchschnittlichen Kontrastwerten, die die Aufnahme von eXIA über 48 Stunden nach der Injektion von eXIA bei Mäusen mit NAFLD (n = 2) und gesunden Kontrollen (n = 2) darstellen. Alle gruppierten Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| ExiA | ExiTron | |||
| Zeitpunkt | Ganzkörper-Scan | Leber-Scan | Ganzkörper-Scan | Leber-Scan |
| Vorkontrast | X | X | X | X |
| 10 min PI | - | - | - | X |
| 15 min PI | O | O | - | - |
| 45 min PI | X | X | - | - |
| 2 h PI | O | O | - | - |
| 4 h PI | - | - | X | X |
| 24 h PI | O | O | - | - |
| 48 h PI | X | X | - | - |
Tabelle 1: Zeitpunkte der CT-Scans. Die entsprechenden Zeitpunkte der Ganzkörper- und Leberscans, die vor und nach der Injektion (PI) der Kontrastmittel aufgenommen wurden. X steht für obligatorische Scans, - für keine Scans und O für optionale (empfohlene, aber nicht obligatorische) Scans.
| Kontrolle (n = 1–2) | NAFLD (n = 1–2) | |
| % Leberfett | 2,4 ± 1,5 % | 18,4 ± 3,1 % |
| Volumen des hepatischen Gefäßnetzwerks | 176,9 Millimeter3 | 390,3 Millimeter3 |
| Durchmesser der Pfortader | 1,1 Millimeter | 1,4 Millimeter |
| Relatives Blutvolumen in der Leber | ~54% | ~79% |
Tabelle 2: Repräsentative Ergebnisse, die Unterschiede im Prozentsatz des Leberfetts, des Volumens des hepatischen Gefäßnetzwerks, des Pfortaderdurchmessers und des relativen Leberblutvolumens zwischen Mäusen mit NAFLD und gesunden Kontrollpersonen anzeigen.
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Discussion
Die derzeit empfohlene Methode für die NAFLD-Diagnose und das Staging beim Menschen ist die Leberbiopsie, die das Risiko von Blutungskomplexitäten sowie Ungenauigkeiten bei der Probenahme birgt40. Im Gegenteil, in Tiermodellen wird eine solche Diagnose durch histologische postmortale Untersuchung durchgeführt, obwohl Protokolle für eine überlebensfähige Leberbiopsie jetzt verfügbar sind und empfohlen werden, wenn das Studiendesign dies zulässt41. Der Einsatz der postmortalen Histologie bedeutet, dass eine große Anzahl von Tieren erforderlich ist, um den Verlauf dieser Krankheit zu untersuchen. Daher kann eine Studie nicht an demselben Tier durchgeführt werden, während die Krankheit fortschreitet. Es wird auch erwartet, dass die Variabilität höher ist, wenn Proben verglichen werden, die zu verschiedenen Zeitpunkten von verschiedenen Tieren gewonnen wurden. In diesem Artikel stellen wir einen innovativen, nicht-invasiven In-vivo-Mikro-CT-Ansatz vor, der in einem etablierten experimentellen Tiermodell der NAFLD angewendet wird und die longitudinale Bewertung des Krankheitsverlaufs durch die Quantifizierung funktioneller Parameter ermöglicht, nämlich Lebersteatose und funktionelle Gewebeaufnahme, des relativen Blutvolumens, des Pfortaderdurchmessers und der Dichte des Gefäßnetzwerks. im selben Tier.
Die Mikro-CT-Bildgebung ist derzeit der Goldstandard unter den nicht-invasiven Bildgebungsmethoden zur genauen Darstellung anatomischer Informationen innerhalb eines lebenden Organismus. Die Mikro-CT ist in der Lage, eine hohe räumliche Auflösung zu erreichen und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung sehr feiner Details in einer Vielzahl von Pathologien dar. Darüber hinaus ist es ein schnelles und zuverlässiges Werkzeug, um das Fortschreiten der Krankheit im Laufe der Zeit zu untersuchen21,22,23,24 indem es die intrinsischen Eigenschaften von Röntgenstrahlen ausnutzt, ohne die Integrität der abgebildeten Probe zu beeinträchtigen. Ein großer Vorteil dieser Technik in der Tierforschung ist die Möglichkeit, eine Kombination ausgewählter Kontrastmittel zu verwenden, die ohne komplizierte Präparate verabreicht werden (nicht-invasiv). Auf diese Weise können mehrere Parameter aus demselben Tier extrahiert werden, die während des Fortschreitens der Krankheit längstens gescannt werden, wodurch eine maximale Leistung und die Einhaltung der ARRIVE-Richtlinien und der 3Rs26 gewährleistet werden. Darüber hinaus liefern Mikro-CT-Scanner hochauflösende Bilder in sehr kurzen Aufnahmezeiten (mit Scandauern von nur wenigen Minuten oder weniger), wobei die Interpretation der Ergebnisse in 2D- und 3D-Formaten relativ einfach ist (insbesondere bei Verwendung einer benutzerfreundlichen Software, wie hier vorgeschlagen).
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Scans wurden mit einem kleinen Nagetier-CT-Scanner durchgeführt (siehe Materialtabelle). Das CT-System führt einen Spiralscan durch und kann Bilder mit einer Auflösung von 100 μm liefern. Er arbeitet zwischen 35-80 kVp und 10-500 μA Röhrenstrom. Die CT-Datenerfassung dauert 7-10 min pro Scan und wird durch einen Bildraumrekonstruktionsalgorithmus (ISRA) mit einer räumlichen Auflösung von 100 μm rekonstruiert. Die CT-Bildgebung wird mit folgenden Parametern durchgeführt: i) hochauflösendes Protokoll bei 50 kVp für WB-Scans und ii) hochauflösender lokaler Multirotationsscan bei 50 kVp für lokale Leberscans. Alle Parameter werden in der Software des Scangeräts (siehe Materialtabelle) eingestellt, die mit dem System geliefert wird, indem Sie den Anweisungen auf der Benutzeroberfläche folgen. Die Rekonstruktion wird durch einen Feldkamp-Davis-und-Kress-Algorithmus (FDK) mit einer Voxelgröße von 0,1 mm durchgeführt. CT-Artefakte werden durch regelmäßige Kalibrierung der Detektoren und gute Wartung des Systems durch geeignete Dienstleistungen minimiert. Wenn Artefakte auftreten, kann der problematische Detektor, der das Ringartefakt verursacht, aus der Ferne aufgehoben und das Bild korrigiert werden.
Das beschriebene technische Protokoll wurde mit den Kontrastmitteln eXIA und ExiTron optimiert, die aufgrund ihrer speziellen Formulierungen und zeitlichen Biokinetik in den verschiedenen Geweben ausgewählt wurden. eXIA ist ein vollständig biologisch abbaubares Kontrastmittel, das 160 mg/ml Jod als röntgendämpfendes Mittel enthält. Nach intravenöser Injektion zeigt dieses Kontrastmittel die Verweilzeit des Blutes an (mit einer Clearance-Halbwertshalbzeit von >30 min) und wird dann von stoffwechselaktiven Organen wie Leber, Milz, Myokard und braunem Fettgewebe aufgenommen. Das erste Kontrastmittel eignet sich daher für den nicht-invasiven In-vivo-Nachweis von Leber- und Milzanomalien, Myokardinfarkt und Kardiomyopathie sowie für die Identifizierung und Quantifizierung von aktivem braunem Fettgewebe. ExiTron ist ein Nanopartikel-Kontrastmittel auf Basis von Erdalkalimetallen mit einer unverdünnten Dichte von ~12.000 HU42, das speziell für die präklinische CT-Bildgebung entwickelt wurde. Bei intravenöser Injektion zirkuliert das zweite Kontrastmittel im Blutkreislauf und wird von den Zellen des retikuloendothelialen Systems43, einschließlich der Makrophagen in der Leber, aufgenommen.
Die vorgeschlagene Methodik weist bestimmte Einschränkungen auf. Damit dieses Protokoll erfolgreich ist, sollte vor der Verabreichung des zweiten Kontrastmittels kein CT-Signal vom ersten Kontrastmittel detektiert werden. Der in diesem Protokoll vorgeschlagene Zeitrahmen wurde nach Optimierungsexperimenten (und auf der Grundlage anderer Studien) ausgewählt44, die darauf hindeuteten, dass das erste Kontrastmittel eine langsame Clearance aufweist. Da das zweite Kontrastmittel eine noch langsamere Clearance-Rate45,46 aufweist, muss es nach der vollständigen Clearance des ersten Kontrastmittels als zweites verabreicht werden. In der Tat haben wir festgestellt, dass die Clearance des ersten Kontrastmittels nach 12 Tagen Injektion zufriedenstellend ist. Abhängig von der Dauer des verwendeten Tiermodells könnte diese Zeitskala den Vergleich von zwei Zeitpunkten ermöglichen, zu denen die Lebererkrankung fortgeschritten sein könnte. Wenn man bedenkt, dass das hier verwendete Fütterungsprotokoll 22 Wochen dauert, ist nicht zu erwarten, dass ein Zeitablauf von 12 Tagen signifikante Veränderungen im Krankheitsverlauf verursacht. Der Versuchsleiter muss eine entsprechende Validierung und Optimierung durchführen, bevor er das vorgeschlagene Bildgebungsprotokoll anpasst. Man muss auch die Kosten-Nutzen-Analyse des Verlaufs und des Bildsignals bewerten, bevor man die Art und Konzentration der verwendeten Kontrastmittel sowie den Zeitrahmen der Verabreichung ändert.
Darüber hinaus können beide Kontrastmittel nur bis zu einem bestimmten Gesamtvolumen der Verabreichung vertragen werden, bevor sie toxische Werte für das Tier erreichen43. Aufgrund der Tatsache, dass ein maximales Kontrastmittelvolumen erforderlich ist, um einen optimalen Kontrast zu gewährleisten, wird in Kombination mit der langsamen Clearance-Rate der Mittel eine einmalige Injektion für diese Analyse empfohlen. Wiederholte Verabreichungen dieser oder anderer geeigneter alternativer Kontrastmittel könnten auch für verschiedene Versuche verwendet werden, solange das Gesamtvolumen des Kontrastmittels zu einem bestimmten Zeitpunkt unter dem empfohlenen Grenzwert bleibt. Eine weitere Voraussetzung für eine erfolgreiche Bildgebung mit diesem Mikro-CT-Protokoll ist die korrekte Gabe der Kontrastmittel. Wie im Protokoll angegeben, sollte der Versuchsleiter eine langsame Infusion des Mittels in der entsprechenden Dosierung direkt durch die Vene in den Blutkreislauf ohne Blasen sicherstellen. Andernfalls werden die Bildauflösung und die Ergebnisse beeinträchtigt. Daher reduziert die Auswahl einer optimalen Dosierung und geeigneter Verabreichungsmethoden (Infusion und Dauer zwischen verschiedenen Wirkstoffen) das Risiko einer Toxizität und die damit verbundenen Einschränkungen in der CT-Bildgebung.
Beim Scannen zu mehreren Zeitpunkten sollte darauf geachtet werden, die Anästhesiedauer so kurz wie möglich zu halten. Da die CT-Untersuchung nur wenige Minuten dauert, kann die Anästhesie zwischen einigen Scans umgekehrt werden, um das Risiko zu minimieren, das mit einer längeren Anästhesiedauer verbunden ist. Auch wiederholte Narkoseeinleitungen bergen Risiken. Die Tiere zwischen den Scans auf ein beheiztes Pad zu legen und für eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr zu sorgen, hilft jedoch bei der Erholung und der Aufrechterhaltung der Physiologie. Darüber hinaus ist die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung, die von Röntgenstrahlen emittiert wird, ausreichend, um die Organ- und Zellbiologie zu beeinflussen, was für die Tiere potenziell schädlich ist und folglich zu verzerrten und irreführenden Versuchsdaten führt22. Da die erwartete Dosis pro Scan bei etwa 385 mGy liegt, können Mäuse, die während der Studie mehrere Scans erhalten, bis zu 1,8 Gy oder mehr erhalten. Dies ist eine erhebliche Strahlendosis für Mäuse, die potenziell schädliche Auswirkungen auf ihre Gewebebiologie haben könnte. Dies ist besonders besorgniserregend, da eine Dosiserhöhung erforderlich ist, wenn der isotrope Voxelabstand bei gleichbleibender Bildqualität reduziertwird 22.
In Bezug auf die Bildnachbearbeitung mit der empfohlenen Software (siehe Materialtabelle) werden Segmentierungsmasken mit einer Mischung aus Werkzeugen zum Vergrößern von Regionen und Schwellenwerten erstellt, was der zeitaufwändigste Schritt der Analyse ist. In einigen Fällen sollten manuelle Modifikationen der erhaltenen Segmentierungen mit einer Glättungsmethode durchgeführt werden. Um die kantenerhaltenden und rauschreduzierenden Eigenschaften des gewünschten Netzwerks zu optimieren, empfehlen wir einen Gauß-Filter mit einem Wert von 0,3. Repräsentative Bilder eines solchen Gefäßnetzwerks sind in Abbildung 6 dargestellt (nachbearbeitet mit einem frei zugänglichen DICOM-Bildbetrachter für medizinische Bilder). Die Haupteinschränkung in Bezug auf die Messung des Gefäßnetzwerks besteht darin, dass die Software nicht in der Lage ist, den ausgewählten definierten ROI (der das Gefäßnetzwerk der Leber darstellt) genau vom Hintergrund (der das umgebende Lebergewebe darstellt) zu trennen. Daher muss der geeignete Schwellenwert durch Versuch und Irrtum ausgewählt werden. Der Anwender definiert zunächst einen unteren Schwellenwert von 600 HE und maximal 10.000 HE. Wenn das extrahierte Gefäßnetz und die Trennung vom umgebenden Gewebe nicht akzeptabel sind, dann wird der untere Wert nach schrittweisen Veränderungen von 50-100 HU durch Versuch und Irrtum angepasst. Der Vorgang wird vom Anwender so lange wiederholt, bis das Gefäßnetz ausreichend vom Gewebe getrennt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Verständnis der Anpassungen des hepatischen Gefäßnetzwerks während der NAFLD-Progression und deren Korrelation mit anderen Methoden der Krankheitscharakterisierung unter Verwendung der vorgeschlagenen Methode den Weg zur Etablierung neuer, effizienterer und reproduzierbarer Ansätze für die NAFLD-Forschung an Mäusen ebnen kann. Es wird auch erwartet, dass dieses Protokoll den Wert präklinischer Tiermodelle für die Untersuchung der Entwicklung neuartiger Therapien gegen das Fortschreiten der Krankheit erhöht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde von der Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 bis A.C.) unterstützt. Anna Hadjihambi wird vom Roger Williams Institute of Hepatology, Foundation for Liver Research, finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
