Summary
Met behulp van een dieet-geïnduceerde niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) muismodel, beschrijven we het gebruik van nieuwe in vivo micro-computertomografie beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling.
Abstract
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een groeiend wereldwijd gezondheidsprobleem en de impact van NAFLD wordt verergerd door het huidige gebrek aan effectieve behandelingen. Aanzienlijke beperkende factoren die de tijdige en nauwkeurige diagnose (inclusief grading) en monitoring van NAFLD belemmeren, evenals de ontwikkeling van potentiële therapieën, zijn de huidige tekortkomingen in de karakterisering van de hepatische micro-omgevingsstructuur en de score van het ziektestadium op een spatiotemporale en niet-invasieve manier. Met behulp van een dieet-geïnduceerd NAFLD-muismodel onderzochten we het gebruik van in vivo micro-computertomografie (CT) beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen, voornamelijk gericht op het hepatische vasculaire netwerk vanwege de significante betrokkenheid bij NAFLD-gerelateerde leverontregeling. Deze beeldvormingsmethodologie maakt longitudinale analyse van leversteatose en functionele weefselopname mogelijk, evenals de evaluatie van het relatieve bloedvolume, de poortaderdiameter en de dichtheid van het vasculaire netwerk. Het begrijpen van de aanpassingen van het hepatische vasculaire netwerk tijdens NAFLD-progressie en dit correleren met andere manieren om de ziekteprogressie (steatose, ontsteking, fibrose) te karakteriseren met behulp van de voorgestelde methode, kan de weg vrijmaken voor de oprichting van nieuwe, efficiëntere en reproduceerbare benaderingen voor NAFLD-onderzoek bij muizen. Dit protocol zal naar verwachting ook de waarde van preklinische diermodellen voor het onderzoeken van de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen ziekteprogressie verbeteren.
Introduction
Niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) is een stofwisselingsziekte die ongeveer 25% van de bevolking en >80% van de morbide zwaarlijvige mensen treft1. Naar schatting een derde van deze personen ontwikkelt zich tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), die wordt gekenmerkt door leversteatose, ontsteking en fibrose2. NASH is een ziektestadium met een significant hoger risico op de ontwikkeling van cirrose en hepatocellulair carcinoom (HCC)3,4. Om deze reden is NASH momenteel de tweede meest voorkomende oorzaak van levertransplantatie, en het zal naar verwachting ook binnenkort de belangrijkste voorspeller van levertransplantatieworden 5,6,7. Ondanks de prevalentie en ernst is er geen ziektespecifieke therapie beschikbaar voor NAFLD en zijn de bestaande behandelingen alleen gericht op het aanpakken van ziektegerelateerde pathologieën zoals insulineresistentie en hyperlipidemie 5,6.
In de afgelopen jaren zijn de pathofysiologische rol en aanpassingen van het endotheel en, in het algemeen, van het vasculaire netwerk van metabole weefsels, zoals het vetweefsel en de lever, belangrijker geworden in onderzoek, vooral tijdens obesitas en metabole ontregeling 7,8. Het endotheel is een cellulaire monolaag die het vasculaire netwerk intern bekleedt en fungeert als een functionele en structurele barrière. Het draagt ook bij aan verschillende fysiologische en pathologische processen, zoals trombose, metaboliettransport, ontsteking en angiogenese 9,10. In het geval van de lever wordt het vasculaire netwerk, naast andere kenmerken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zeer gespecialiseerde cellen, gedefinieerd als lever sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's). Deze cellen missen een keldermembraan en hebben meerdere fenestrae, waardoor de overdracht van substraten tussen het bloed en leverparenchym gemakkelijker is. Vanwege hun onderscheidende anatomische locatie en kenmerken hebben LSEC's waarschijnlijk een cruciale rol in de pathofysiologische processen van de lever, waaronder de ontwikkeling van leverontsteking en fibrose tijdens NAFLD / NASH. Inderdaad, de pathologische, moleculaire en cellulaire aanpassingen die LSEC's ondergaan in de loop van NAFLD dragen bij aan de ziekteprogressie11. In het bijzonder is de LSEC-afhankelijke leverangiogenese die plaatsvindt tijdens NAFLD significant geassocieerd met de ontwikkeling van ontsteking en de progressie van de ziekte naar NASH of zelfs HCC12. Bovendien wordt obesitas-gerelateerde vroege NAFLD gekenmerkt door de ontwikkeling van insulineresistentie in LSEC's, die voorafgaat aan de ontwikkeling van leverontsteking of andere geavanceerde NAFLD-tekenen13.
Bovendien zijn LSEC's onlangs naar voren gekomen als centrale regulatoren van hepatische bloedstroom en vasculaire netwerkaanpassingen tijdens leverziekte van verschillende etiologieën14,15. Inderdaad, chronische leverziekte wordt gekenmerkt door prominente intra-hepatische vasoconstrictie en verhoogde weerstand tegen de bloedstroom, die bijdragen aan de ontwikkeling van portale hypertensie16. In het geval van NAFLD dragen verschillende LSEC-gerelateerde mechanismen bij aan dit fenomeen. LSEC-specifieke insulineresistentie, zoals hierboven vermeld, is bijvoorbeeld geassocieerd met verminderde insulineafhankelijke vaatverwijding van de levervasculatuur13. Bovendien wordt de levervasculatuur in de loop van de ziekte gevoeliger voor vasoconstrictoren, wat verder bijdraagt aan een verslechtering van de leverbloedstroom en leidt tot het ontstaan van schuifspanning, die beide resulteren in een verstoring van de sinusoïdale microcirculatie17. Deze feiten suggereren dat de vasculatuur een belangrijk doelwit is bij leverziekte. Niettemin zijn beperkende factoren die de tijdige diagnose en monitoring van NAFLD / NASH belemmeren, evenals de ontwikkeling van potentiële therapieën, de tekortkomingen in de consistente karakterisering van de hepatische micro-omgeving en (micro)vasculaire structuur, evenals de score van het ziektestadium op een spatiotemporale en niet-invasieve manier.
Micro-computertomografie (CT) beeldvorming is momenteel de gouden standaard niet-invasieve beeldvormingsmethode voor het nauwkeurig weergeven van anatomische informatie in een levend organisme. Micro-CT en MRI vertegenwoordigen twee complementaire beeldvormingsmethoden die een breed scala aan pathologieën kunnen bestrijken en uitzonderlijke resolutie en detail bieden in de afgebeelde structuren en weefsels. Micro-CT, in het bijzonder, is een zeer snel en nauwkeurig hulpmiddel dat vaak wordt gebruikt voor het bestuderen van pathologieën zoals botziekten en bijbehorende veranderingen in het botoppervlak18, het beoordelen van de progressie van longfibrose in de loop van de tijd19, het diagnosticeren van longkanker en de stadiëring ervan20, of zelfs het onderzoeken van tandheelkundige pathologieën21, zonder dat een speciale voorbereiding (of vernietiging) van de monsters in beeld wordt gebracht.
De beeldvormingstechnologie van micro-CT is gebaseerd op de verschillende verzwakkingseigenschappen van verschillende organen in termen van de interactie van röntgenstralen met materie. Organen met hoge röntgenverzwakkingsverschillen worden afgebeeld met een hoog contrast in CT-beelden (d.w.z. de longen lijken donker en de botten licht). Organen met zeer vergelijkbare verzwakkingseigenschappen (verschillende zachte weefsels) zijn moeilijk te onderscheiden op CT-beelden22. Om deze beperking aan te pakken, zijn gespecialiseerde contrastmiddelen op basis van jodium, goud en bismut uitgebreid onderzocht voor in vivo gebruik. Deze middelen veranderen de verzwakkingseigenschappen van de weefsels waarin ze zich ophopen, worden langzaam uit de bloedsomloop verwijderd en maken de uniforme en stabiele opacificatie van het gehele vasculaire systeem of gekozen weefsels mogelijk23.
In de menselijke diagnostiek worden CT-beeldvorming en vergelijkbare technieken, zoals MRI-afgeleide protondichtheid vetfractie, al gebruikt voor de bepaling van het levervetgehalte24,25. In de context van NAFLD is een hoog contrast van zacht weefsel essentieel om pathologische laesies of kleine bloedvaten nauwkeurig te onderscheiden. Voor dit doel worden contrastmiddelen gebruikt die een verbeterd contrast van de leverweefselkenmerken bieden. Dergelijke hulpmiddelen en materialen maken de studie van meerdere leverkenmerken en mogelijke pathologie-expressies mogelijk, zoals de architectuur en dichtheid van het vasculaire netwerk, lipideafzetting / steatose en functionele weefselopname / lipide (chylomicron) overdracht in de lever. Bovendien kunnen het relatieve levervolume en de poortaderdiameter ook worden geëvalueerd. In een zeer korte scantijd bieden al deze parameters verschillende en complementaire informatie over de evaluatie en progressie van NAFLD, die kan worden gebruikt om een niet-invasieve en gedetailleerde diagnose te ontwikkelen.
In dit artikel bieden we een stapsgewijs protocol voor het gebruik van nieuwe in vivo micro-CT-beeldvormingstechnieken als een niet-invasieve methode om de progressiestadia van NAFLD te beoordelen. Met behulp van dit protocol kan de longitudinale analyse van leversteatose en functionele weefselopname, evenals de evaluatie van het relatieve bloedvolume, de poortaderdiameter en de dichtheid van het vasculaire netwerk, worden uitgevoerd en toegepast in muismodellen van leverziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd door het personeel van BIOEMTECH in overeenstemming met de Europese en nationale welzijnsvoorschriften en werden goedgekeurd door de nationale autoriteiten (licentienummer EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Alle experimenten werden ontworpen en gerapporteerd met inachtneming van ARRIVE-richtlijnen26. De muizen werden gekocht bij het Hellenic Pasteur Institute, Athene, Griekenland.
OPMERKING: De dieren werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien verrijkt met rails en kartonnen buizen in een ruimte van 20-22 °C, met een relatieve vochtigheid van 50%-60% en een licht/donkercyclus van 12 uur (licht 07:00-19:00 uur). Een combinatie van een vetrijk dieet (HFD) en fructose-glucosestroop (HFCS), een fructose- en glucosebevattende zoetstof die veel wordt gebruikt in moderne soorten met vet verrijkte diëten, werd gebruikt om NAFLD te induceren als een erkend betrouwbaar model27,28,29,30. Op de leeftijd van 7-8 weken kregen mannelijke C57BL/6-muizen ad libitum toegang tot een normaal dieet (n = 2) met 10% kilocalorieën uit vet of een HFD (n = 2) met 60% kilocalorieën uit vet aangevuld met 5% HFCS in water gedurende 22 weken. Het lichaamsgewicht werd wekelijks verkregen met behulp van een digitale balans en tijdens de experimentele periode werd het dierenwelzijn op wisselende dagen gemonitord met behulp van een scoreblad. Aan het einde van het beeldvormingsprotocol werden de muizen geëuthanaseerd via cervicale dislocatie.
1. Voorbereiding van dieren
OPMERKING: Het beeldvormingsprotocol is samengevat in figuur 1.
- Verdoof de muis met behulp van 3% -4% isofluraan (in kamerlucht) en handhaaf de lichaamstemperatuur met behulp van een speciaal verwarmingskussen.
OPMERKING: De afwezigheid van een pedaalontwenningsreflex moet worden gebruikt om voldoende anesthesiediepte te bevestigen voordat de scan wordt gestart. - Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier voorafgaand aan het experimenteren.
- Plaats het dier in de houder van de CT-scanner, zet de neuskegel vast en schakel over op 1,5% -3% isofluraan (in de kamerlucht) voor onderhoud.
OPMERKING: De afwezigheid van een pedaalontwenningsreflex moet worden gebruikt om het juiste percentage isofluraan voor het behoud van anesthesie te bevestigen. - Controleer de muis continu.
2. Pre-scanning voorbereiding
OPMERKING: Beeldvorming wordt uitgevoerd in twee experimentele fasen om het eerste contrastmiddel adequaat uit de bloedsomloop en weefsels te verwijderen. eXIA (eerste contrastmiddel) wordt toegediend in de eerste fase en ExiTron (tweede contrastmiddel) in de tweede fase, zoals beschreven in de sectie "Imaging workflow" (rubriek 3) hieronder.
- Laat het contrastmiddel (eXIA of ExiTron, afhankelijk van de experimentele fase) gedurende 3 uur op kamertemperatuur komen.
- Stel de volgende scanparameters in op de CT-scanner: protocol met hoge resolutie onder 50 kVp buisspanning en een stroom van 460 μA, niet-spiraal, 720 projecties / rotatie, vier rotaties en 4 minuten acquisitietijd.
3. Imaging workflow
- Experimentele fase 1
- Bereken en bereid het volume van het eerste contrastmiddel dat moet worden toegediend in een onverdunde dosis van 6 μl/g lichaamsgewicht voor maximaal contrast.
- Bereid de staartaderkatheter voor door deze te vullen met een zoutoplossing en deze aan te sluiten op de spuit gevuld met het contrastmiddel.
- Verkrijg een pre-contrast whole body (WB) en lever baseline scan.
- Zorg ervoor dat er geen bubbels of verstoppingen in de spuit of katheter zitten.
- Breng de voorgevulde katheter in de staartader en dien het contrastmiddel toe via een injectie die langzaam en handmatig wordt uitgevoerd, met een duur van 1-3 minuten (niet als een bolusinjectie). Een spuitpomp kan worden gebruikt wanneer deze is ingesteld op de juiste infusiesnelheid.
OPMERKING: De staart van het dier kan in lauw water worden geplaatst om vaatverwijding te induceren en te helpen bij het inbrengen van de katheter - Verkrijg WB- en leverscans op verschillende tijdstippen, zoals aangegeven in tabel 1.
OPMERKING: Als het verkrijgen van alle punten niet mogelijk is, moet de focus worden gelegd op 45 minuten na injectie (PI), wat het punt is van maximale leveropname, en 48 h PI, dat is wanneer klaring wordt bereikt.
- Experimentele fase 2
- Bereid de muis opnieuw voor zoals beschreven in rubriek 1 voor de toediening van het tweede contrastmiddel 10 dagen na de laatste meting met het eerste contrastmiddel (48 h PI).
- Voer stap 2.1-2.2 uit.
- Bereken en bereid het volume van het tweede contrastmiddel voor dat moet worden toegediend in een onverdunde dosis van 8 μL/g lichaamsgewicht voor maximaal contrast.
- Bereid de staartaderkatheter voor door deze te vullen met een zoutoplossing en deze aan te sluiten op de spuit gevuld met het contrastmiddel.
- Verkrijg een pre-contrast WB en lever baseline scan om het relatieve bloedvolume en leversteatose te evalueren.
- Zorg ervoor dat er geen contrast kan worden gedetecteerd in de scan als een indicatie van de volledige klaring van het eerste contrastmiddel.
- Breng de voorgevulde katheter in de staartader in en dien het contrastmiddel toe via een intraveneuze injectie die langzaam en handmatig wordt uitgevoerd, met een duur van 1-3 minuten (niet als een bolusinjectie). Een spuitpomp kan worden gebruikt wanneer deze is ingesteld op de juiste infusiesnelheid.
- Verkrijg WB- en leverscans op verschillende tijdstippen, zoals aangegeven in tabel 1.
OPMERKING: WB-scans worden verkregen na 10 minuten en 4 uur PI. Het aanzienlijke tijdsverloop tussen hen maakt de evaluatie van de biodistributie van de tracer in het lichaam mogelijk, evenals de relatieve klaring ervan.
4. Gegevensextractie en -analyse
OPMERKING: In dit protocol worden de gegevensextractie- en analysestappen op basis van een specifieke beeldverwerkingssoftware (zie materiaaltabel) aangeboden. De beschreven stappen moeten mogelijk worden aangepast bij gebruik van andere software.
- Evaluatie van hepatische lipideafzetting/steatose.
OPMERKING: Voor de evaluatie van leversteatose wordt geen contrastmiddel gebruikt en wordt een vergelijking tussen controle en pathologie uitgevoerd. Vanwege relatief hoge afwijkingen in weefselverzwakkingseigenschappen tussen verschillende muizen, worden de dichtheidswaarden genormaliseerd voor de lever tegen de milt (vetvrij weefsel) en het vet (absolute vetweefsels) volgens de volgende vergelijking en zoals eerder beschreven25:
- Om de analyse uit te voeren, laadt u het DICOM-bestand van de pre-contrastscan en past u de balk / het contrast aan om de lever, milt en het witte vetweefsel (WAT) duidelijk te zien.
- Open de Modelling Operator tool via het gereedschap pull-down menu op het voorpaneel en selecteer 3D ROI Tool.
- Selecteer onder de 3D ROI-operator de optie ROI toevoegen om meerdere ROI's te genereren (maximaal acht voor elk weefsel) om bemonstering uit te voeren in de gebieden waar de lever (bij voorkeur in de gebieden van de linker mediale kwab, de rechter mediale kwab en de linker laterale kwab) en milt helder lijken, zonder duidelijke bloedvaten en vet.
OPMERKING: Voor WAT worden ROIs geselecteerd in het midden van het viscerale vetweefseldepot. Aanbevolen gebieden zijn weergegeven in figuur 2. Normalisatiemethoden met behulp van de lever/miltverhouding en zonder WAT op te nemen, kunnen ook worden toegepast zoals eerder vastgesteld31. - Selecteer onder de functie 3D-verfmodus en erode/verwijten de optie 2D en gebruik de interface die wordt weergegeven om een naam en kleur op te geven voor elke ROI.
- Gebruik het gereedschap Sphere paint ROI met een diameter van 8 pixels om de 2D-ROI's handmatig te tekenen.
- Voer steekproeven uit door de 2D-ROI's op de interessegebieden te segmenteren met het gereedschap Kruis op het dwarsvlak, zoals weergegeven in figuur 3A.
- Klik op het geselecteerde punt op het sagittale en coronale vlak om de segmentatie van de 2D ROI te voltooien, zoals weergegeven in figuur 3B.
- Herhaal het proces voor het definiëren van de rest van de ROI's.
OPMERKING: Vermijd bij het nemen van monsters de grensgebieden van de organen, omdat dit ruis kan veroorzaken en de betrouwbaarheid van de berekende Hounsfield-eenheid (HU) -waarde van elke ROI kan beïnvloeden. - Zodra u tevreden bent met de gesegmenteerde ROI's, gaat u naar Navigatie en selecteert u Tabel weergeven om de kwantificeringstabel weer te geven met de berekende HU-waarden voor elke ROI.
OPMERKING: De waarden van belang worden vermeld in de kolom "Gemiddelde", die de numerieke gemiddelde waarden van de voxels (HU) bevat die zijn opgenomen in de ROIs voor de organen van belang. Noteer de interessante waarden of sla de hele tabel op door Tabel exporteren te selecteren. - Bereken de gemiddelde HU voor de lever, milt en WAT en sluit de waarden aan bij de bovenstaande vergelijking om het percentage levervet te berekenen.
- Functionele weefselopname/lipide (chylomicron) overdracht in de lever
OPMERKING: Functionele weefselopname/lipide (chylomicron) overdracht wordt geanalyseerd van de verworven scans na 45 min en 48 h na de eerste contrastmiddelinfusie, gebaseerd op een eerder gepubliceerde methode32. Het contrast wordt berekend voor de verschillende weefsels en tijdspunten met behulp van de onderstaande vergelijking:
PV-orgaan t i is de gemiddelde pixelwaarde in het orgaan op tijdstip t i (variërend van 0 h tot 48 h), en PV-orgaan t0 is de gemiddelde pixelwaarde in het orgaan in de afbeelding zonder contrast.- Om deze analyse uit te voeren, laadt u het eXIA-scan-DICOM-bestand en past u de balk / het contrast aan om de lever, milt en linkerkamer duidelijk te zien.
- Open de Modelling Operator via het vervolgkeuzemenu voor gereedschappen op het voorpaneel en selecteer 3D ROI Tool.
- Selecteer onder de 3D ROI-operator de optie ROI toevoegen om meerdere ROI's voor de lever te segmenteren.
- Gebruik onder de functie 3D-verfmodus en erode/verwijten het roi-gereedschap Sphere paint met een diameter van 8 pixels en eroderen −1.
OPMERKING: Selecteer meerdere ROI's op segmenten waar elk orgaan duidelijk wordt weergegeven. Vermijd grensregio's, omdat dit ruis kan veroorzaken en de betrouwbaarheid van de berekende HU-waarde van elke ROI kan beïnvloeden. Dit zal resulteren in de bemonstering van meerdere 3D-ROIs, die overeenkomen met kleine orgaanvolumes. - Gebruik de interface die wordt weergegeven om een naam en kleur op te geven voor elke ROI.
- Zodra u tevreden bent met de ontworpen ROI's, gaat u naar Navigatie en selecteert u Tabel weergeven om de kwantificeringstabel weer te geven met de berekende HU-waarden voor elke ROI.
OPMERKING: De interessante waarden worden vermeld onder de kolom "Gemiddelde", die de numerieke gemiddelde waarden weergeeft van de voxels (HU) die zijn opgenomen in de ROI. De gemiddelde HU-waarde van de ROI's van elk orgel komt overeen met PV-orgaan ti. Noteer de interessante waarden of sla de hele tabel op door Tabel exporteren te selecteren. - Om PV-orgaan t0 te verkrijgen, herhaalt u alle bovenstaande stappen met behulp van het pre-contrast DICOM-bestand om de gemiddelde helderheid van de lever, milt en linker ventrikel te berekenen vóór de injectie van het contrastmiddel.
- Voeg de waarden in de bovenstaande vergelijking in om het percentage contrast te extraheren dat overeenkomt met de functionele weefselopname / lipide (chylomicron) overdracht.
- Architectuur en dichtheid van het vasculaire netwerk van de lever
OPMERKING: De analyse van de architectuur en dichtheid van het vasculaire netwerk van de lever is gebaseerd op een eerder gepubliceerde methodologie33 en wordt uitgevoerd op de leverscans verkregen 10 min PI van het tweede contrastmiddel.- Om deze analyse uit te voeren, laadt u het ExiTron-scan DICOM-bestand en past u de balk / het contrast aan om het vasculaire levernetwerk duidelijk te zien.
- Open de Modelling Operator via het vervolgkeuzemenu voor gereedschappen op het voorpaneel en selecteer 3D ROI Tool.
- Selecteer onder de 3D ROI-operator de optie ROI toevoegen om een 3D-ROI voor de lever te genereren.
- Selecteer onder de functie 3D-verfmodus en eroderen/verwijden de optie 3D.
OPMERKING: Gebruik het roi-gereedschap Bolverf met -1 erode om de segmentatielagen over het coronale vlak te definiëren. De diameter van het ROI-tekengereedschap moet worden aangepast aan elke laag (voor het toevoegen / verwijderen van gewenste / ongewenste voxelselecties). Het wordt aanbevolen om het levervolume in eerste instantie te definiëren over het coronale vlak, en vervolgens kunnen de transversale en sagittale vlakken worden gebruikt om de ROI te corrigeren. Dit proces vereist precisie. De gebruiker moet heel voorzichtig zijn om geen andere weefsels, bloedvaten en botten op te nemen bij het segmenteren van elke ROI-laag, terwijl hij ervoor zorgt dat alle delen van de lever zijn opgenomen in de gedefinieerde ROI. Om deze reden is vertrouwdheid met de anatomische grenzen van de lever cruciaal. - Zodra u tevreden bent met de resulterende lever-ROI, voert u een snede uit om alle voxels uit de afbeeldingsgegevens te verwijderen die niet thuishoren in de aanvankelijk gesegmenteerde lever-ROI. Kies hiervoor de lever-ROI uit de ROI-selector en klik op het pictogram Cut uitvoeren . Deze bewerking verwijdert de achtergrond en laat de ROI van de lever ongewijzigd.
OPMERKING: Hoewel de functies ongedaan maken/opnieuw uitvoeren van toepassing zijn op alle bewerkingen die worden uitgevoerd onder de 3D ROI-tool, kan de actie van het snijden van een ROI niet ongedaan worden gemaakt. Dus, voorafgaand aan deze actie, kan de gebruiker overwegen om de initiële lever-ROI op te slaan in DICOM-indeling. - De resulterende lever-ROI omvat het vasculaire netwerk en het omliggende weefsel, dat moet worden verwijderd. Reset hiervoor de lever-ROI door op de knop ROI-bezem opnieuw in te stellen.
- Gebruik de interface die lijkt om alle pixels van de lever-ROI naar de achtergrond over te brengen.
OPMERKING: De ROI van de lever zal na deze operatie nog steeds bestaan, maar het zal geen voxels meer bevatten. - Als u de ROI van de lever opnieuw wilt segmenteren zodat deze alleen vasculaire geassocieerde pixels bevat, gaat u naar Segmentatiealgoritmen die worden aangeduid met het toverstafpictogram en selecteert u Verbonden drempelwaarden.
- Definieer de ROI als Uitvoer en de achtergrond als Invoer in het vervolgkeuzemenu Invoer voordat u drempelwaarden toepast.
- Stel de drempels in door op de min - en max-pictogrammen links van elk drempelveld te klikken om maximum- en minimumwaarden in te vullen en het vasculaire netwerk te verkrijgen.
OPMERKING: Alleen pixels binnen het gekozen bereik worden opgenomen in de resulterende ROI. Het aanpassen van de drempelwaarden tussen verschillende dieren zorgt ervoor dat dezelfde anatomische gebieden in aanmerking worden genomen met betrekking tot de exacte hoeveelheid contrastmiddel die in elk dier wordt geïnjecteerd. Dit is constant tussen de geselecteerde weefsels, zelfs als de numerieke waarden niet identiek zijn. - Gebruik het gereedschap Cross Hair om op een punt te klikken waar het vasculaire netwerk vrij lijkt en klik op Toepassen om de segmentatie uit te voeren.
- Activeer de MIP-viewer (Maximum intensity Projection).
- Evalueer de resulterende lever-ROI in termen van hoe duidelijk het vasculaire netwerk wordt weergegeven in de MIP-weergave.
- Als het weefsel in delen van de lever-ROI achterblijft, herhaalt u stap 4.3.5-4.3.11 door de Min-drempelwaarde aan te passen totdat de gesegmenteerde lever-ROI duidelijk het vasculaire netwerk vertegenwoordigt.
- Zodra u tevreden bent met de resulterende lever-ROI, genereert u de kwantificeringstabel met het berekende lever-ROI-volume in kubieke millimeters.
OPMERKING: De interessante waarden worden vermeld in de kolom "mm3", die de numerieke volumewaarde van de voxels (HU) in de lever-ROI bevat. Noteer de interessante waarden of sla de hele tabel op door Tabel exporteren te selecteren.
- Lever relatief bloedvolume
OPMERKING: Voor de meting van het relatieve levervolume (rBV), dat significant correleert met de hoeveelheid nieuw gevormde bloedvaten tijdens fibroseprogressie, worden pre-contrastscans en scans 4 uur na de tweede contrastmiddelinjectie gebruikt. De analyse wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven34.- Als u deze analyse wilt uitvoeren, laadt u het DICOM-scanbestand van ExiTron en past u de balk/het contrast aan.
OPMERKING: De MIP-viewer uitschakelen: schakel onder Voorkeuren het selectievakje in om de MIP-viewer uit te schakelen bij het laden. Voor grote datasets kan dit de laadsnelheid verbeteren. - Open de Modelling Operator via het vervolgkeuzemenu voor gereedschappen op het voorpaneel en selecteer 3D ROI Tool. Deze tool biedt geavanceerde opties voor het tekenen, visualiseren, opslaan en kwantificeren van zowel 2D- als 3D-regio's.
- Selecteer onder de 3D ROI-operator de optie ROI toevoegen en segmenteer twee ROI's: één voor de lever en één voor een groot bloedvat.
- Selecteer onder de functie 3D-verfmodus en eroderen/verwijden de optie 2D.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het ROI-gereedschap Sphere paint te gebruiken met een diameter van 8-10 pixels voor de lever en 4-6 pixels voor het bloedvat. De diameter van het verfgereedschap kan echter worden aangepast, afhankelijk van hoe klein het te selecteren gebied is. - Gebruik de interface die wordt weergegeven om een naam en kleur op te geven voor elke ROI.
OPMERKING: Selecteer twee tot vijf segmenten van centrale delen van de weefsels van belang en definieer de segmentatielagen om 2D-ROIs voor elk weefsel te genereren. Vermijd bij het selecteren van de gebieden op elk segment de orgaangrensgebieden, zoals weergegeven in figuur 4, omdat dit ruis kan veroorzaken en de betrouwbaarheid van de berekende HU-waarde van elke ROI kan beïnvloeden. - Zodra u tevreden bent met de ontworpen ROI's, gaat u naar Navigatie en selecteert u Tabel weergeven om de kwantificeringstabel weer te geven met de berekende HU-waarden voor elke ROI.
OPMERKING: De interessante waarden worden vermeld onder de kolom "Gemiddelde", die de numerieke gemiddelde waarden weergeeft van de voxels (HU) die zijn opgenomen in de ROI. Noteer de interessante waarden of sla de hele tabel op door Tabel exporteren te selecteren. - Herhaal alle stappen voor het pre-contrast DICOM-bestand om de gemiddelde helderheid van de lever te verkrijgen vóór de injectie met contrastmiddel. Voer hiervoor stappen 4.4.2-4.4.5 alleen uit voor de lever.
- Bereken de gemiddelde HU-waarden voor elk weefsel op de equivalente tijdstippen en voeg de verkregen waarden in de onderstaande vergelijking in:
OPMERKING: Een groot bloedvat na injectie met contrastmiddel wordt beschouwd als 100% rBV en de lever, vóór toediening van contrastmiddelen, wordt beschouwd als 0% rBV.
- Als u deze analyse wilt uitvoeren, laadt u het DICOM-scanbestand van ExiTron en past u de balk/het contrast aan.
- Portaaladerdiameter
OPMERKING: Voor de metingen van de poortaderdiameter worden dezelfde scans geanalyseerd die worden gebruikt voor de hepatische rBV-metingen zoals eerder beschreven35.- Laad het DICOM-scanbestand van ExiTron en pas de balk/het contrast aan.
- Lokaliseer de transversale vlakken van drie tot vier plakjes boven de kruising van de superieure mesenteriale en miltaders (figuur 5).
- Gebruik het gereedschap Liniaal om de exacte afstand tussen twee punten te meten (d.w.z. de diameter van het cirkelvormige adergebied).
OPMERKING: De afstand wordt geëxtraheerd op de afbeelding, maar men kan ook naar Navigatie gaan en Tabel weergeven selecteren om de kwantificeringstabel met de berekende afstand weer te geven of Tabel exporteren selecteren om het resultaat op te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze representatieve studie wees micro-CT-beeldvorming zonder enig contrastmiddel op een hoger percentage levervet bij muizen met NAFLD in vergelijking met controles (tabel 2), wat de pathologie bevestigde. Met behulp van het ExiTron-contrastmiddel en de hierboven beschreven analyse van de levervasculaire netwerkarchitectuur en dichtheid, bleek de totale volumedichtheid van het hepatische vasculaire netwerk hoger te zijn bij muizen met NAFLD in vergelijking met gezonde controles (figuur 6, tabel 2). Muizen met NAFLD hadden ook een grotere poortaderdiameter in vergelijking met controlemuizen (tabel 2), een structurele verandering geassocieerd met portale hypertensie tijdens leverziekte34,36,37. Evenzo werd berekend dat de lever-rBV van dieren met NAFLD hoger was in vergelijking met gezonde controles (tabel 2).
Bovendien wees de analyse van de functionele weefselopnametest op een hogere accumulatie en langzamere klaring van het eXIA-contrastmiddel bij muizen met NAFLD in vergelijking met gezonde controles (figuur 7). Deze resultaten suggereren dat steatotische hepatocyten waarschijnlijk hoge niveaus van cellulaire endocytose en distributie ondergaan, hoewel vergezeld van verminderd metabolisch katabolisme of klaring / secretie. Over het algemeen komt deze bevinding overeen met het fenotype van verminderde leverstofwisselingsactiviteit, zoals verwacht in het geval van vetinfiltratie/NAFLD38,39.
Figuur 1: Schematische weergave van een overzicht van het experimentele protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve afbeeldingen die de voorgestelde gebieden markeren die worden gebruikt om monsters te nemen voor het segmenteren van de 2D-ROI voor de lever (rood), milt (groen) en WAT (blauw). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatief voorbeeld van het segmenteren van een 2D ROI voor het berekenen van steatose . (A) Het gereedschap Cross Hair wordt gebruikt om een 2D ROI te selecteren op een gewenst gebied van de lever op het dwarsvlak. (B) Het proces wordt herhaald op het sagittale en coronale vlak om de segmentatie van de 2D ROI te voltooien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief voorbeeld van een segmentatielaag voor het genereren van een 2D-lever-ROI. Centrale delen van het orgel worden handmatig geselecteerd, waarbij de grensgebieden worden vermeden om ruis te elimineren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: 2D axiaal gebied. Representatieve voorbeelden van het 2D-axiale gebied van de verschillende segmenten die zijn gekozen om de poortaderdiameter te meten bij muizen met NAFLD en gezonde controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Hepatische vasculaire netwerkarchitectuur. Representatieve geëxtraheerde beelden van de hepatische vasculaire netwerkarchitectuur, zoals weergegeven door CT-segmentatie, verkregen van een controlemuis (176,9 mm 3) en een muis met NAFLD (390,3 mm3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Gemiddelde contrastwaarden. Gegroepeerde gegevens met de gemiddelde contrastwaarden, die de opname van leverweefsel vertegenwoordigen gedurende 48 uur na injectie van eXIA bij muizen met NAFLD (n = 2) en gezonde controles (n = 2). Alle gegroepeerde gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| ExiA | ExiTron | |||
| Tijdstip | Whole Body Scan | Lever scan | Whole Body Scan | Lever scan |
| Voorcontrast | X | X | X | X |
| 10 min PI | - | - | - | X |
| 15 min PI | O | O | - | - |
| 45 min PI | X | X | - | - |
| 2 uur PI | O | O | - | - |
| 4 uur PI | - | - | X | X |
| 24 uur PI | O | O | - | - |
| 48 uur PI | X | X | - | - |
Tabel 1: Tijdstippen van de CT-scans. De juiste tijdstippen van het hele lichaam en leverscans verkregen pre- en post-injectie (PI) van de contrastmiddelen. X geeft verplichte scans aan, - geeft geen scans aan en O geeft optionele (aanbevolen maar niet verplichte) scans aan.
| Controle (n = 1–2) | NAFLD (n = 1–2) | |
| % Levervet | 2,4 ± 1,5% | 18,4 ± 3,1% |
| Hepatisch vasculair netwerkvolume | 176,9 mm3 | 390,3 mm3 |
| Portaaladerdiameter | 1,1 mm | 1,4 mm |
| Lever relatief bloedvolume | ~54% | ~79% |
Tabel 2: Representatieve resultaten die wijzen op verschillen in het percentage levervet, het volume van het vasculaire levernetwerk, de diameter van de poortader en het relatieve leverbloedvolume tussen muizen met NAFLD en gezonde controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige aanbevolen methode voor NAFLD-diagnose en stadiëring bij mensen is leverbiopsie, die het risico op bloedingscomplexiteiten herbergt, evenals bemonsteringsonnauwkeurigheden40. Integendeel, in diermodellen wordt een dergelijke diagnose uitgevoerd door histologie post-mortem, hoewel protocollen voor overleefbare leverbiopsie nu beschikbaar zijn en worden aanbevolen wanneer de onderzoeksopzet41 toestaat. Het gebruik van postmortale histologie betekent dat een groot aantal dieren nodig is om de progressie van deze ziekte te onderzoeken. Als zodanig kan een onderzoek niet bij hetzelfde dier worden uitgevoerd terwijl de ziekte vordert; De variabiliteit zal naar verwachting ook hoger zijn bij het vergelijken van monsters die op verschillende tijdstippen van verschillende dieren zijn verkregen. In dit artikel bieden we een innovatieve, niet-invasieve in vivo micro-CT-benadering, toegepast in een gevestigd proefdiermodel van NAFLD, die de longitudinale evaluatie van ziekteprogressie mogelijk maakt door de kwantificering van functionele parameters, namelijk leversteatose en functionele weefselopname, het relatieve bloedvolume, de poortaderdiameter en de dichtheid van het vasculaire netwerk, in hetzelfde dier.
Micro-CT-beeldvorming is momenteel de gouden standaard niet-invasieve beeldvormingsmethode voor het nauwkeurig weergeven van anatomische informatie in een levend organisme. Micro-CT heeft de mogelijkheid om een hoge ruimtelijke resolutie te bereiken, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor het bestuderen van zeer fijne details in een breed scala aan pathologieën. Bovendien is het een snel en betrouwbaar hulpmiddel om ziekteprogressie in de tijdte bestuderen 21,22,23,24 door gebruik te maken van de intrinsieke kenmerken van röntgenstralen zonder de integriteit van het afgebeelde monster te verstoren. Een groot voordeel van deze techniek in dieronderzoek is de mogelijkheid om een combinatie van geselecteerde contrastmiddelen te gebruiken die zonder ingewikkelde preparaten (niet-invasief) worden toegediend. Dit maakt het mogelijk om verschillende parameters te extraheren uit hetzelfde dier dat longitudinaal wordt gescand tijdens de progressie van de ziekte, waardoor maximale output en naleving van de ARRIVE-richtlijnen en de 3Rs26 wordt gegarandeerd. Bovendien bieden micro-CT-scanners beelden met een hoge resolutie in zeer korte acquisitietijden (met scanduur van slechts enkele minuten of minder), waarbij de interpretatie van de resultaten in 2D- en 3D-formaten relatief eenvoudig is (vooral bij gebruik van gebruiksvriendelijke software, zoals hier voorgesteld).
Alle scans die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd op een kleine CT-scanner voor knaagdieren (zie materiaaltabel). Het CT-systeem voert een spiraalscan uit en kan beelden leveren met een resolutie van 100 μm. Het werkt tussen 35-80 kVp en 10-500 μA buisstroom. De CT-gegevensacquisities duren 7-10 minuten per scan en worden gereconstrueerd via een beeldruimtereconstructiealgoritme (ISRA) met een ruimtelijke resolutie van 100 μm. CT-beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van de volgende parameters: i) protocol met hoge resolutie bij 50 kVp voor WB-scans en ii) lokale multirotatie-scan met hoge resolutie bij 50 kVp voor lokale leverscans. Alle parameters worden ingesteld in de software van het scanapparaat (zie Materiaaltabel) die bij het systeem wordt geleverd door de instructies op de gebruikersinterface te volgen. De reconstructie wordt uitgevoerd door middel van een Feldkamp, Davis en Kress (FDK) algoritme met een voxelgrootte van 0,1 mm. CT-artefacten worden geminimaliseerd door de detectoren periodiek te kalibreren en het systeem goed te onderhouden door middel van geschikte services. Als er artefacten optreden, kan de problematische detector die het ringartefact veroorzaakt op afstand worden geannuleerd en het beeld worden gecorrigeerd.
Het beschreven technische protocol werd geoptimaliseerd met behulp van de eXIA- en ExiTron-contrastmiddelen, die werden geselecteerd vanwege hun speciale formuleringen en temporele biokinetiek in de verschillende weefsels. eXIA is een volledig biologisch afbreekbaar contrastmiddel dat 160 mg / ml jodium bevat als röntgenverzwakkingsmiddel. Eenmaal intraveneus geïnjecteerd, toont dit contrastmiddel de verblijftijd van het bloed (met een klaringshalftijd van >30 min) en wordt vervolgens opgenomen door metabolisch actieve organen zoals de lever, milt, myocard en bruin vetweefsel. Het eerste contrastmiddel is daarom geschikt voor de niet-invasieve in vivo detectie van lever- en miltafwijkingen, myocardinfarct en cardiomyopathie, evenals voor het identificeren en kwantificeren van actief bruin vetweefsel. ExiTron is een op aardalkalimetaal gebaseerd nanodeeltjescontrastmiddel van ~ 12.000 HU onverdunde dichtheid42, dat specifiek is geformuleerd voor preklinische CT-beeldvorming. Bij intraveneuze injectie circuleert het tweede contrastmiddel in de bloedbaan en wordt het opgenomen door de cellen van het reticulo-endotheelsysteem43, inclusief macrofagen in de lever.
Er zijn bepaalde beperkingen verbonden aan de voorgestelde methodologie. Om dit protocol succesvol te laten zijn, mag er geen CT-signaal worden gedetecteerd van het eerste contrastmiddel voorafgaand aan toediening van het tweede contrastmiddel. Het tijdsbestek dat in dit protocol wordt voorgesteld, werd geselecteerd na optimalisatie-experimenten (en gebaseerd op andere studies)44, wat suggereerde dat het eerste contrastmiddel een langzame klaring heeft. Aangezien het tweede contrastmiddel een nog tragere klaringssnelheidvan 45,46 heeft, moet het als tweede worden toegediend, na de volledige klaring van het eerste contrastmiddel. We hebben inderdaad vastgesteld dat de klaring van het eerste contrastmiddel na 12 dagen injectie bevredigend is. Afhankelijk van de duur van het gebruikte diermodel, kan deze tijdschaal de vergelijking mogelijk maken van twee tijdstippen waarop de leverziekte zich zou kunnen hebben ontwikkeld. Gezien het feit dat het hier gebruikte voedingsprotocol 22 weken duurt, wordt niet verwacht dat een time-lapse van 12 dagen significante veranderingen in de ziekteprogressie zal veroorzaken. De experimentator moet de juiste validatie en optimalisatie uitvoeren voordat het voorgestelde beeldvormingsprotocol wordt aangepast. Men moet ook de kosten-batenanalyse van het progressie- en beeldsignaal beoordelen voordat het type en de concentratie van de gebruikte contrastmiddelen worden gewijzigd, evenals het tijdsbestek van toediening.
Bovendien kunnen beide contrastmiddelen alleen worden getolereerd tot een specifiek totaal toedieningsvolume voordat toxische niveaus voor het dier worden bereikt43. Vanwege het feit dat een maximaal contrastmiddelvolume vereist is om een optimaal contrast te garanderen, in combinatie met de langzame klaringssnelheid van de middelen, wordt een eenmalige injectie voorgesteld voor deze analyse. Herhaalde toedieningen van deze of andere geschikte alternatieve contrastmiddelen kunnen ook voor verschillende experimenten worden gebruikt, zolang het totale volume van het contrastmiddel op een bepaald tijdstip onder de aanbevolen limiet blijft. Een andere vereiste voor succesvolle beeldvorming met behulp van dit micro-CT-protocol is de juiste toediening van de contrastmiddelen. Zoals vermeld in het protocol, moet de experimentator zorgen voor een langzame infusie van het middel in de juiste dosering rechtstreeks in de bloedbaan via de ader, zonder bubbels. Als u dit niet doet, komen de beeldresolutie en -uitvoer in gevaar. Daarom vermindert de selectie van een optimale dosering en geschikte toedieningsmethoden (infusie en duur tussen verschillende middelen) het risico op toxiciteit en de bijbehorende beperkingen in de CT-beeldvorming.
Voor het scannen op meerdere tijdstippen moet aandacht worden besteed aan het zo kort mogelijk houden van de anesthesieduur. Omdat CT-scans slechts enkele minuten duren om te voltooien, kan de anesthesie tussen sommige scans worden omgekeerd om het risico te minimaliseren dat gepaard gaat met langdurige anesthesieduur. Herhaalde anesthesie-inducties hebben ook risico's. Het plaatsen van de dieren op een verwarmd pad tussen scans en zorgen voor voldoende hydratatie helpt echter bij het herstel en het behoud van de fysiologie. Bovendien is de blootstelling aan ioniserende straling die door röntgenstraling wordt uitgezonden voldoende om de orgaan- en celbiologie te beïnvloeden, waardoor dit potentieel schadelijk is voor de dieren en bijgevolg resulteert in bevooroordeelde en misleidende experimentele gegevens22. Aangezien de verwachte dosis die per scan moet worden toegediend ongeveer 385 mGy is, kunnen muizen die tijdens het onderzoek meerdere scans ontvangen, tot 1,8 Gy of meer ontvangen. Dit is een aanzienlijke stralingsdosis voor muizen die potentieel schadelijke effecten kan hebben op hun weefselbiologie. Dit is vooral zorgwekkend omdat een verhoging van de dosis vereist is bij het verminderen van de isotrope voxelafstand met behoud van dezelfde beeldkwaliteit22.
In termen van beeldnabewerking met behulp van de aanbevolen software (zie Materiaaltabel), worden segmentatiemaskers gemaakt met behulp van een mix van regio-groeiende en drempelingstools, en dit is de meest tijdrovende stap van de analyse. In sommige gevallen moeten handmatige wijzigingen van de verkregen segmentaties worden uitgevoerd met behulp van een afvlakkingsmethode. Om de randbesparende en ruisonderdrukkende eigenschappen van het gewenste netwerk te optimaliseren, adviseren wij een Gaussisch filter met een waarde van 0,3. Representatieve beelden van een dergelijk vasculair netwerk zijn weergegeven in figuur 6 (nabewerking met behulp van een open-access DICOM medische beeldviewer). De belangrijkste beperking in termen van het meten van het vasculaire netwerk is dat de software niet de mogelijkheid heeft om de geselecteerde gedefinieerde ROI (die het vasculaire netwerk van de lever vertegenwoordigt) nauwkeurig te scheiden van de achtergrond (die het omliggende leverweefsel vertegenwoordigt); daarom moet de juiste drempel met vallen en opstaan worden gekozen. In eerste instantie definieert de gebruiker een lagere drempelwaarde van 600 HU en een maximum van 10.000 HU. Als het geëxtraheerde vasculaire netwerk en de scheiding van het omliggende weefsel niet acceptabel zijn, wordt de lagere waarde met vallen en opstaan aangepast na stapsgewijze veranderingen van 50-100 HU. Het proces wordt door de gebruiker herhaald totdat het vasculaire netwerk voldoende van het weefsel is gescheiden.
Kortom, het begrijpen van de aanpassingen van het hepatische vasculaire netwerk tijdens NAFLD-progressie en het correleren ervan met andere methoden voor ziektekarakterisering met behulp van de voorgestelde methode kan de weg vrijmaken voor de vaststelling van nieuwe, efficiëntere en reproduceerbare benaderingen voor NAFLD-onderzoek bij muizen. Dit protocol zal naar verwachting ook de waarde van preklinische diermodellen voor het onderzoeken van de ontwikkeling van nieuwe therapieën tegen ziekteprogressie verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com. Dit werk werd ondersteund door de Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 tot A.C.). Anna Hadjihambi wordt gefinancierd door het Roger Williams Institute of Hepatology, Foundation for Liver Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| eXIA160 | Binitio Biomedical, Inc. | https://www.binitio.com/?Page=Products | |
| High fat diet with 60% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12492 | |
| High-fructose corn syrup | Best flavors, CA | hfcs-1gallon | |
| Lacrinorm ophthalmic ointment | Bausch & Lomb | ||
| Normal diet with 10% of kilocalories from fat | Research Diets, New Brunswick, NJ, USA | D12450 | |
| Viscover ExiTron nano 12000 | Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-095-698 | |
| VivoQuant | Invicro | ||
| X-CUBE | Molecubes, Belgium | https://www.molecubes.com/systems/ |
References
- Lazarus, J. V., et al. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 19 (1), 60-78 (2022).
- Takahashi, Y., Fukusato, T. Histopathology of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15539-15548 (2014).
- Huang, D. Q., El-Serag, H. B., Loomba, R. Global epidemiology of NAFLD-related HCC: Trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 18 (4), 223-238 (2021).
- Niederseer, D., Wernly, B., Aigner, E., Stickel, F., Datz, C. NAFLD and cardiovascular diseases: Epidemiological, mechanistic and therapeutic considerations. Journal of Clinical Medicine. 10 (3), 467 (2021).
- Lefere, S., et al. Differential effects of selective- and pan-PPAR agonists on experimental steatohepatitis and hepatic macrophages. Journal of Hepatology. 73 (4), 757-770 (2020).
- Chrysavgis, L., Papatheodoridi, A. M., Chatzigeorgiou, A., Cholongitas, E. The impact of sodium glucose co-transporter 2 inhibitors on non-alcoholic fatty liver disease.Journal of Gastroenterology and Hepatology. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 36 (4), 893-909 (2021).
- Li, M., Qian, M., Xu, J. Vascular endothelial regulation of obesity-associated insulin resistance. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 51 (2017).
- Pi, X., Xie, L., Patterson, C. Emerging roles of vascular endothelium in metabolic homeostasis. Circulation Research. 123 (4), 477-494 (2018).
- Chiu, J. J., Chien, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
- Koyama, Y., Brenner, D. A.
- Nasiri-Ansari, N., et al. Endothelial cell dysfunction and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): A concise review. Cells. 11 (16), 2511 (2022).
- Lefere, S., et al. Angiopoietin-2 promotes pathological angiogenesis and is a therapeutic target in murine non-alcoholic fatty liver disease. Hepatology. 69 (3), 1087-1104 (2019).
- Pasarin, M., et al. Insulin resistance and liver microcirculation in a rat model of early NAFLD. Journal of Hepatology. 55 (5), 1095-1102 (2011).
- Hammoutene, A., Rautou, P. E. Role of liver sinusoidal endothelial cells in non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 70 (6), 1278-1291 (2019).
- Sun, X., Harris, E. N. New aspects of hepatic endothelial cells in physiology and non-alcoholic fatty liver disease. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 318 (6), C1200-C1213 (2020).
- Iwakiri, Y., Shah, V., Rockey, D. C. Vascular pathobiology in chronic liver disease and cirrhosis - current status and future directions. Journal of Hepatology. 61 (4), 912-924 (2014).
- Baffy, G. Origins of portal hypertension in non-alcoholic fatty liver disease. Digestive Diseases and Sciences. 63 (3), 563-576 (2018).
- Ruhli, F. J., Kuhn, G., Evison, R., Muller, R., Schultz, M. Diagnostic value of micro-CT in comparison with histology in the qualitative assessment of historical human skull bone pathologies. American Journal of Physical Anthropology. 133 (4), 1099-1111 (2007).
- Rodt, T., et al. Micro-computed tomography of pulmonary fibrosis in mice induced by adenoviral gene transfer of biologically active transforming growth factor-beta1. Respiratory Research. 11 (1), 181 (2010).
- Deng, L., Xiao, S. M., Qiang, J. W., Li, Y. A., Zhang, Y. Early lung adenocarcinoma in mice: Micro-computed tomography manifestations and correlation with pathology. Translational Oncology. 10 (3), 311-317 (2017).
- Feng, J., et al.
- Kagadis, G. C., Loudos, G., Katsanos, K., Langer, S. G., Nikiforidis, G. C. In vivo small animal imaging: current status and future prospects. Medical Physics. 37 (12), 6421-6442 (2010).
- Starosolski, Z., et al. Ultra high-resolution in vivo computed tomography imaging of mouse cerebrovasculature using a long circulating blood pool contrast agent. Scientific Reports. 5, 10178 (2015).
- Caussy, C., Reeder, S. B., Sirlin, C. B., Noninvasive Loomba, R. quantitative assessment of liver fat by MRI-PDFF as an endpoint in NASH trials. Hepatology. 68 (2), 763-772 (2018).
- Lubura, M., et al. Non-invasive quantification of white and brown adipose tissues and liver fat content by computed tomography in mice. PLoS One. 7 (5), e37026 (2012).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 18 (7), e3000410 (2020).
- Tetri, L. H., Basaranoglu, M., Brunt, E. M., Yerian, L. M., Neuschwander-Tetri, B. A. Severe NAFLD with hepatic necroinflammatory changes in mice fed trans fats and a high-fructose corn syrup equivalent. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (5), G987-G995 (2008).
- Machado, M. V., et al. Mouse models of diet-induced non-alcoholic steatohepatitis reproduce the heterogeneity of the human disease. PLoS One. 10 (5), 0127991 (2015).
- Jensen, T., et al. Fructose and sugar: A major mediator of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (5), 1063-1075 (2018).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- De Rudder, M., et al. Automated computerized image analysis for the user-independent evaluation of disease severity in preclinical models of NAFLD/NASH. Laboratory Investigation. 100 (1), 147-160 (2020).
- Willekens, I., et al. Time-course of contrast enhancement in spleen and liver with Exia 160, Fenestra LC, and VC. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 128-135 (2009).
- Das, N. M., et al. In vivo quantitative microcomputed tomographic analysis of vasculature and organs in a normal and diseased mouse model. PLoS One. 11 (2), e0150085 (2016).
- Ehling, J., et al. CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis. Gut. 63 (12), 1960-1971 (2014).
- Zhang, J., et al. Gamna-Gandy bodies of the spleen detected with susceptibility weighted imaging: maybe a new potential non-invasive marker of esophageal varices. PLoS One. 8 (1), e55626 (2013).
- Chen, Y., Li, J., Zhou, Q., Lyu, G., Li, S. Detection of liver and spleen stiffness in rats with portal hypertension by two-dimensional shear wave elastography. BMC Medical Imaging. 22 (1), 68 (2022).
- Lessa, A. S., et al. Ultrasound imaging in an experimental model of fatty liver disease and cirrhosis in rats. BMC Veterinary Research. 6, 6 (2010).
- Abikhzer, G., Alabed, Y. Z., Azoulay, L., Assayag, J., Rush, C. Altered hepatic metabolic activity in patients with hepatic steatosis on FDG PET/CT. AJR. American Journal of Roentgenology. 196 (1), 176-180 (2011).
- Newman, E. M., Rowland, A. A physiologically based pharmacokinetic model to predict the impact of metabolic changes associated with metabolic associated fatty liver disease on drug exposure. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11751 (2022).
- Tsai, E., Lee, T. P. Diagnosis and evaluation of non-alcoholic fatty liver disease/non-alcoholic steatohepatitis, including noninvasive biomarkers and transient elastography. Clinics in Liver Disease. 22 (1), 73-92 (2018).
- Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments. 146, e59130 (2019).
- Boll, H., et al. Comparison of Fenestra LC, ExiTron nano 6000, and ExiTron nano 12000 for micro-CT imaging of liver and spleen in mice. Academic Radiology. 20 (9), 1137-1143 (2013).
- Ashton, J. R., West, J. L., Badea, C. T. In vivo small animal micro-CT using nanoparticle contrast agents. Frontiers in Pharmacology. 6, 256 (2015).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: Comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
- Toczek, J., et al. Computed tomography imaging of macrophage phagocytic activity in abdominal aortic aneurysm. Theranostics. 11 (12), 5876-5888 (2021).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media & Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
