Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Nötrofiller ilk savunma hattıdır ve insanlarda en bol bulunan lökositlerdir. Bu efektör hücreler fagositoz ve oksidatif patlama gibi işlevleri yerine getirir ve mikrobiyal klirens için nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) oluşturur. Nötrofillerin metabolik aktivitelerine ilişkin yeni anlayışlar, öncelikle glikolize dayandıkları erken kavramına meydan okuyor. Metabolik aktivitelerin hassas ölçümü, fizyolojik koşullar altında ve hastalık durumlarında trikarboksilik asit (TCA) döngüsü (Krebs döngüsü olarak da bilinir), oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), pentoz fosfat yolu (PPP) ve yağ asidi oksidasyonu (FAO) dahil olmak üzere nötrofillerin farklı metabolik gereksinimlerini ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, fare kemik iliği kaynaklı nötrofiller, insan kanından türetilmiş nötrofiller ve nötrofil benzeri HL60 hücre hattı üzerindeki mitokondriyal solunumun bir göstergesi olarak oksijen tüketim hızını (OCR) ölçmek için adım adım bir protokol ve ön gereksinimler, metabolik bir hücre dışı akı analizörü üzerinde metabolik akı analizi kullanılarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerin mitokondriyal fonksiyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Introduction

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile adenozin trifosfat (ATP) üreten hücre biyoenerjetik maddelerinde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, mitokondrinin rolü, reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ve detoksifikasyonuna, sitoplazmik ve mitokondriyal matriks kalsiyum regülasyonuna, hücresel senteze, katabolizmaya ve metabolitlerin hücre1 içinde taşınmasına kadar uzanır. Mitokondriyal solunum tüm hücrelerde esastır, çünkü işlev bozuklukları kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere metabolik sorunlara2 ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu4, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları5 ve Charcot-Marie-Tooth hastalığı 2 A (CMT2A)6 gibi çok çeşitli nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir.

Nötrofiller üzerinde yapılan elektron mikroskobik çalışmaları, nispeten az sayıda mitokondri7 olduğunu ve mitokondriyal solunum hızları çok düşük olduğu için enerji üretimi için glikolize büyük ölçüde güvendiklerini ortaya koymuştur8. Bununla birlikte, mitokondri, kemotaksis9 ve apoptoz10,11,12 gibi nötrofil fonksiyonları için çok önemlidir. Önceki bir çalışma, yüksek membran potansiyeline sahip insan nötrofillerinde karmaşık bir mitokondriyal ağ ortaya koymuştur. Mitokondriyal membran potansiyel kaybı, nötrofil apoptozunun erken bir göstergesidir10. Mitokondriyal uncoupler karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedavi, mitokondriyal morfolojide bir değişiklik ile birlikte kemotaksiste önemli inhibisyon göstermiştir 9,10.

Nötrofiller için birincil enerji kaynağı glikoliz olmasına rağmen, mitokondri, Ca2 + sinyallemesini artıran, mitokondriyal ATP üretimini artıran ve nötrofil fonksiyonel yanıtlarını başlatan pürinerjik sinyallemenin ilk aşamasını besleyerek nötrofil aktivasyonunu başlatan ATP'yi sağlar13. Mitokondriyal solunum zincirinin disfonksiyonu, toksik reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimine neden olur ve patojenik hasarlara yol açar14,15,16. Nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturma süreci olan NETosis, nötrofillerin patojenlere karşı savaşmalarına yardımcı olan kritik bir özelliktir17 ve kanser, tromboz ve otoimmün bozukluklar18 dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunur. Mitokondriyal kaynaklı ROS, NETosis19'a katkıda bulunur, mitokondriyal DNA, NETs18'in bir bileşeni olabilir ve değiştirilmiş mitokondriyal homeostaz, NETosis 20,21,22,23,24'ü bozar. Ayrıca, normal farklılaşma veya olgunlaşma sırasında, nötrofil metabolik yeniden programlama, glikolitik aktiviteyi sınırlayarak tersine döner ve mitokondriyal solunuma katılır ve hücre içi lipitleri harekete geçirir25,26.

Metabolik hücre dışı akı analizörü, canlı hücre mitokondriyal solunumu ve glikolizi sürekli olarak izleyebilir ve ölçebilir. Analizör, oksijen (O2) konsantrasyonunu ve pH değişikliklerini ölçmek için 96 delikli plaka formatlı bir sensör kartuşu ve iki florofor kullanır. Sensör kartuşu, tahlil sırasında hücre tek katmanının üzerindedir ve ~ 200 nm yüksekliğinde bir mikro oda oluşturur. Analizördeki optik fiber demetleri, floroforları uyarmak ve floresan yoğunluğu değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. O2 konsantrasyonu ve pH'daki gerçek zamanlı değişiklikler otomatik olarak hesaplanır ve oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) olarak gösterilir. Sensör kartuşunda, tahlil ölçümleri sırasında her bir kuyucuğa dört adede kadar bileşiğin yüklenmesine izin veren dört bağlantı noktası vardır. Bu protokol, metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Heparinize edilmiş tam kan örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı gibi, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı insan bağışçılarından alınmıştır. Tüm hayvan deneyleri, UConn Sağlık Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerini izledi ve kemirgenlerin kullanımı için onay, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen kriterlere göre UConn Health IACUC'den alındı. Bu çalışmada 6 haftalıkken erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.

1. Metabolik hücre dışı akı testi için 96 delikli plakanın hazırlanması

  1. Metabolik hücre dışı akı testi için özel olarak tasarlanmış 96 delikli plakanın üzerine bir sensör kartuşu yerleştirilmiştir. Kartuşu dikkatlice kaldırarak nemlendirin ve alttaki plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL/kuyu kalibrasyon ortamı yerleştirin. Kartuşu, nemlendirmek için gece boyunca CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde kalibrantla plakanın üzerine yerleştirin.
  2. Hücre tipine bağlı olarak, hücre yapışmasını sağlamak için kültür plakası için özel bir kaplama kullanın. İnsan nötrofilleri için farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücreleri, 96 delikli plakayı, bir gecede 4 °C'de 50 μL 5 μg / mL saflaştırılmış fare anti-insan CD18 antikoru (Klon TS1/18) içeren steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile kaplar. Fare nötrofilleri için, 96 delikli plakayı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) pH 8,0'da pH 8,0'da 0,1 M NaHCO3'te 25 μL 22,4 μg / mL Hücre Tak ile kaplayın.
  3. Plakaları 200 μL steril PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Tohumlama sırasında hücre kültürü plakalarında arka plan düzeltmesi için hücre kültürü plakasının köşe kuyucuklarına (A1, A12, H1 ve H12) tam ortam ekleyin (hücreler olmadan).
    NOT: Kaplama ve kalibrasyon sırasında buharlaşma, kalibrasyon ortamının hacmini ve normalleşmeyi etkileyebilir. Steril suyla ıslatılmış dokuya sahip bir tepsi veya hazne kullanın ve buharlaşmayı önlemek için plakayı üzerinde kalibrant ile yerleştirin.

2. Hücrelerin hazırlanması ve tohumlanması

  1. Tahlil ortamının hazırlanması
    1. Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) 1 mM piruvat, 10 mM glikoz ve 2 mM glutamin ekleyerek tahlil ortamı hazırlayın.
  2. Fare nötrofillerinin kemik iliğinden izolasyonu
    1. Üreticinin talimatlarına göre, Fare Nötrofil Zenginleştirme Kitini kullanarak fare nötrofillerini kemik iliğinden izole edin.
    2. Fareleri intraperitoneal (yani ketamin (125 mg / kg) ve ksilazin (12.5 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezi altına alın ve daha sonra fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
    3. Daha önce tarif edildiği gibi femurları ve tibiaları hasatedin 27. Kısaca, bacağı kaslarla açığa çıkarmak için cildi kesin. Bacağı vücuttan çıkarmak için kalça eklemini kesin. Ardından, femur ve tibiayı toplamak için kasları çıkarın.
    4. Femurların ve tibiaların daha küçük uçlarını kesin. Kesik uçları aşağıda tutarak, altta iki adet 25 G şırınga iğnesi delikli delikli 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 0,5 mL'lik tüpü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin (Şekil 1A). Kemik iliği hücrelerinin kurumasını önlemek için 0,5 mL'lik tüpe 50 μL PBS ekleyin.
    5. 1,5 mL tüpün altındaki kemik iliğini toplamak için RT'de 15 saniye boyunca 5.900 × g'da santrifüj. Kemik iliği hücrelerini 1 mL DMEM ile yeniden askıya alın. Kitten 50 μL sıçan serumu ekleyin, pipetleme ile nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir polistiren kültür test tüpüne aktarın.
    6. Fare Nötrofil Zenginleştirme Kiti'nden 50 μL zenginleştirme kokteyli ekleyin ve RT'de ×15 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Hücreleri 1 mL DMEM ile tekrar askıya alın, kitten 50 μL biyotin seçim kokteyli ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Kitten 150 μL vorteksli manyetik parçacık ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
    9. ~ 1,3 mL DMEM ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın, tüpü mıknatısa 3 dakika boyunca yerleştirin ve orijinal tüpü mıknatısla birlikte ters çevirerek saflaştırılmış fare nötrofilleri içeren süpernatantı yeni bir 5 mL polistiren kültür test tüpüne aktarın.
    10. RT'de 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı vakum aspirasyonu ile çıkardıktan sonra, hücreleri 1 mL tahlil ortamı ile yeniden askıya alın.
    11. Bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.
    12. Tahlil ortamı, hazırlanan 96 delikli plakaya (1.2-1.4 adımları) kuyucuk başına 180 μL fare nötrofil süspansiyonunun (2 × 105 hücre) tohumunu ekleyerek hücre yoğunluğunu 1.1 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı RT'de 300 × g'da frensiz 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    13. Hücreleri tahlil ortamı ile önceden dengelemek için plakayı CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Nötrofillerin saflığı, potansiyel bir önyargı olduğu için tahlil için kritik öneme sahiptir. Fare nötrofil izolasyonunun saflığı bu protokol ile %69.9-%88.7'dir. Nötrofilleri fare kemik iliğinden izole etmek için yoğunluk gradyanı santrifüjleme28 gibi başka yöntemler de vardır. Ayrıca, nötrofiller üzerinde eksprese edilmeyen antijenlere karşı monoklonal antikorların kullanıldığı negatif manyetik seçilime dayanan diğer satıcılardan alternatif nötrofil izolasyon kitleri de vardır.
  3. İnsan nötrofillerinin periferik kandan izolasyonu
    1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 8 mL polisakkarit çözeltisi ekleyin, daha sonra karıştırmadan polisakkarit çözeltisinin üzerine 4 mL periferik kan tabakası ekleyin.
    2. 30 dakika boyunca 20 °C'de 550 × g'da santrifüj. Rotorun 1'de yavaşlamasını sağlayın.
      NOT: Nötrofil ayırma süresi donörler arasında değişebilir. En az 30 dakikadır ve nötrofil ayrımı başarısız olursa 10-20 dakika daha gerekebilir.
    3. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, santrifüjlemeden sonra plazma/trombositlerin ve mononükleer hücrelerin ayrılmasını gözlemleyin. Üstteki üst sarı sıvıyı (plazma ve trombositler) ve üst bulutlu bandı (mononükleer hücreler) 1 mL'lik bir pipet kullanarak alt bulutlu bandı (nötrofiller) rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın.
    4. Alt bulutlu bandı ve aşağıdaki berrak sıvının ~3-4 mL'sini 10 mL PBS içeren yeni bir 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.
    5. 20 ° C'de 400 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı vakum aspirasyonu ile çıkarın.
    6. Hücreleri 5 mL PBS ile tekrar askıya alın ve 5 dakika boyunca 20 ° C'de 300 × g'da santrifüj yapın.
    7. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri 1 mL tahlil ortamı ile yeniden askıya alın.
    8. Bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.
      NOT: Kandaki eritrositlerde mitokondri bulunmadığından, eritrosit kontaminasyonu mitokondriyal stres testi testini etkilemez ve nötrofil aktivasyonunu/astarlama 29,30'u önler. Doğru bir nötrofil konsantrasyonu elde etmek için hücre sayımı sırasında eritrositlerin lize edilmesi gerekir. Eritrositleri lize etmek için 10-30 s boyunca 891 μL deiyonize suya 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından ozmotik basıncı dengelemek için 99 μL 10x PBS ekleyin, nötrofillerin parçalanmasını önleyin.
    9. Tahlil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu 2.2 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın, hazırlanan 96 delikli plakaya kuyucuk başına 180 μL insan nötrofil (~ 4 ×10 5) tohumlayın ve plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı RT'de ×3 dakika boyunca 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    10. Hücreleri tahlil ortamı ile önceden dengelemek için plakayı -CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Nötrofillerin saflığı, potansiyel bir önyargı olduğu için tahlil için kritik öneme sahiptir. İnsan nötrofil izolasyonunun saflığı% 86.6 -% 96.8'dir. Nötrofilleri insan kanından izole etmek için Percoll izolasyonunun yanı sıra Ficoll izolasyonu ve dekstran sedimantasyonunun bir kombinasyonu da dahil olmak üzere başka yoğunluk gradyanı santrifüjleme yöntemleri de vardır31.
  4. HL60 hücre kültürü ve nötrofil yönelimli farklılaşma
    1. HL60 hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 μg/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 250 ng/mL amfoterisin B içeren Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 besiyerinde 37 °C ve %5 CO2'de muhafaza edin.
    2. Nötrofil yönelimli farklılaşma için, HL60 hücrelerini (asılı hücreler) bir T25 şişesinde, %10 FBS, 100 μg / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 250 ng / mL amfoterisin B ve% 1.3 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren RPMI-1640 ortamında 1 ×ila 105 hücre / mL yoğunlukta tutun 6gün boyunca% 10 FBS, 100 μg / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 250 ng / mL amfoterisin B ve% 1.3 dimetil sülfoksit (DMSO) içerir.
    3. Tahlil gününde, hemositometreyi kullanarak hücreleri manuel olarak sayın, farklılaşmış veya farklılaşmamış HL60 hücrelerini RT'de 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin, DMEM ile bir kez yıkayın ve 1.39 × 106 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücreleri tahlil ortamı ile yeniden askıya alın.
    4. Hazırlanan 96 delikli plakaya kuyucuk başına 180 μL farklılaştırılmış veya farklılaşmamış HL60 hücrelerini (~ 2.5 × 105) tohumlayın ve plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı RT'de 300 × g'da 3 dakika boyunca frensiz olarak santrifüj edin.
    5. Hücreleri tahlil ortamı ile önceden dengelemek için plakayı CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Bir sonraki adımdan önce mikroskop kullanarak hücrelerin tam yapışmasını onaylayın.

Figure 1
Resim 1: Kemik iliği hücrelerinin ve nötrofillerin izolasyonunun şematik diyagramı. (A) Bir fareden kemik iliği hücrelerinin toplanması ve (B) nötrofillerin insan kanından izole edilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre türü Kuyu başına düşen hücreler Bileşikler/Reaktifler Çalışma çözeltisi konsantrasyonu Bağlantı noktalarına enjeksiyon hacmi Kuyularda son konsantrasyon
Fare nötrofilleri 2 × 105 Oligomisin 25 μM 20 μL 2,5 μM
cesaret 7,5 μM 17,6 μL 0,61 μM
Rotenone Antimisin A karışımı 10 μM 24 μL 1 μM
İnsan nötrofilleri 4 × 105 Oligomisin 10 μM 20 μL 1 μM
cesaret 12,5 μM 22 μL 1,25 μM
Rotenone Antimisin A karışımı 10 μM 24 μL 1 μM
Farklılaşmamış veya farklılaşmış HL60 hücreleri 2.5 × 105 Oligomisin 25 μM 20 μL 2,5 μM
cesaret 15 μM 22 μL 1,5 μM
Rotenone Antimisin A karışımı 10 μM 24 μL 1 μM

Tablo 1: Mitokondriyal stres testi için hücre sayıları ve reaktif konsantrasyonları.

3. Mitokondriyal stres testi kitinde bileşiklerin hazırlanması

  1. Mitokondriyal stres testi kitini açın ve reaktifleri hazırlayın.
    NOT: Fare nötrofilleri, insan nötrofilleri ve HL60 hücreleri için kullanılan oligomisin, karbonilsiyanür p-triflorometoksi fenilhidrazon (FCCP) ve rotenon / antimisin A karışımının kuyucuklarındaki farklı çalışma çözeltisi konsantrasyonları, kuyucuklara enjeksiyon hacmi ve nihai konsantrasyonlar Tablo 1'de gösterilmiştir.
    1. 100 μM stok çözeltisi elde etmek için oligomisin'i 630 μL tahlil ortamı ile yeniden yapılandırarak oligomisin stok çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Stok çözeltisinin aynı gün kullanılması tavsiye edilir.
      1. 25 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 630 μL stok çözeltisini 1.890 μL tahlil ortamı ile karıştırarak fare nötrofil ve HL60 hücre tahlilleri için oligomisin çalışma çözeltisi hazırlayın.
      2. 10 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 300 μL stok çözeltisini 2.700 μL tahlil ortamı ile karıştırarak insan nötrofil testi için oligomisin çalışma çözeltisi hazırlayın.
        NOT: Oligomisinin Fo / F1 ATPaz'ın (ATP sentaz) Fo taban plakası alt birimine bağlanması, protonların mitokondriye yeniden girmesini önler ve ATP senteziniinhibe eder 32. Bu, elektron taşıma zinciri ve OCR boyunca elektron akışını önemli ölçüde azaltır. Bununla birlikte, elektron akışı, iç mitokondriyal membran33 boyunca proton sızıntısı nedeniyle tamamen durmaz.
    2. 100 μM stok çözeltisi elde etmek için FCCP'yi 720 μL tahlil ortamı ile yeniden yapılandırarak FCCP stok çözeltisini hazırlayın.
      1. 7,5 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 300 μL stok çözeltisini 3.700 μL tahlil ortamı ile karıştırarak fare nötrofil testi için çalışma çözeltisi hazırlayın.
      2. 12,5 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 375 μL stok çözeltisini 2.625 μL tahlil ortamı ile karıştırarak insan nötrofil testi için çalışma çözeltisi hazırlayın.
      3. 15 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 720 μL stok çözeltisini 4.080 μL tahlil ortamıyla karıştırarak HL60 hücre tahlili için çalışma çözeltisi hazırlayın.
        NOT: FCCP'nin eklenmesi, mitokondrinin OXPHOS kullanmak için maksimum kapasitesini ortaya koymaktadır. Mitokondriye geçirgen, lipitte çözünür, zayıf bir asittir ve transmembran potansiyelinin bozulmasına neden olur. Proton gradyanının mitokondriyal iç membran boyunca boşaltılması ve proton akısının Fo / F1 ATP sentazdan saptırılması, mitokondriyal ayrışma ile sonuçlanır. Bu ayırma etkisi, proton gradyanı34'ü korumak için mitokondriyal oksijen tüketimini aniden arttırır.
    3. 50 μM stok çözeltisi elde etmek için rotenon / antimisin A karışımını 540 μL tahlil ortamı ile yeniden yapılandırarak rotenon / antimisin A stok çözeltisi hazırlayın.
      1. Rotenon / antimisin hazırlayın 10 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 540 μL stok çözeltisini 2.160 μL tahlil ortamı ile karıştırarak tüm tahliller için bir çalışma çözeltisi.
        NOT: Rotenone, kompleks I'deki demir-kükürt merkezlerinden ubikinona elektron transferini inhibe ederek kompleks I'i bloke ederken, antimisin A, elektron taşıma zincirinin kompleks III'ünü bloke eder ve sınırlı bir ATP35 sentezi ile OXPHOS'un blokajına yol açar. Böylece, bu mitokondriyal olmayan solunum 36,37'yi ortaya çıkarır.
  2. Kartuşu reaktiflerle yükleyin; Hazırlanan oligomisin, FCCP ve rotenon/antimisin A karışımını enjeksiyon için kartuşta sırasıyla A, B ve C portlarına yükler (Şekil 2). Reaktiflerin bağlantı noktalarına yüklenmesini kolaylaştırmak için kartuşla birlikte bulunan şablon ekini kullanın. Kullanılmayan portları 20 μL tahlil ortamı ile doldurun.
    1. Fare nötrofil testi için, A portlarına 20 μL oligomisin (25 μM; 96 delikli plakanın her bir kuyucuğu başlangıçta 180 μL tahlil ortamına sahiptir, bu nedenle nihai konsantrasyon 2.5 μM'dir) yükleyin. B bağlantı noktalarına 17,6 μL FCCP (7,5 μM; son konsantrasyon: ~0,61 μM) yükleyin. C portlarına 24 μL rotenon/antimisin A karışımı (10 μM; nihai konsantrasyon: ~1 μM) yükleyin.
    2. İnsan nötrofil testi için, A portlarına 20 μL oligomisin (10 μM; 96 delikli plakanın her bir kuyucuğu başlangıçta 180 μL tahlil ortamına sahiptir, bu nedenle nihai konsantrasyon 1 μM'dir) yükleyin. B bağlantı noktalarına 22 μL FCCP (12,5 μM; son konsantrasyon: ~1,25 μM) yükleyin. C portlarına 24 μL rotenon/antimisin A karışımı (10 μM; nihai konsantrasyon: ~1 μM) yükleyin.
    3. HL60 ve dHL60 hücre tahlili için, A portlarına 20 μL oligomisin (25 μM; 96 delikli plakanın her bir kuyucuğu başlangıçta 180 μL tahlil ortamına sahiptir, bu nedenle nihai konsantrasyon 2,5 μM'dir) yükleyin. B bağlantı noktalarına 22 μL FCCP (15 μM; son konsantrasyon: ~1,5 μM) yükleyin. C portlarına 24 μL rotenon/antimisin A karışımı (10 μM; nihai konsantrasyon: ~1 μM) yükleyin.
      NOT: Bağlantı noktasının alt kısmına dokunmadan bağlantı noktasındaki ilaç solüsyonunu pipetleyin. Sıvılar kılcal kuvvetler tarafından tutulduğundan, sızıntıyı önlemek için yüklemeden sonra plakaya dokunmayın. Kültür plakasının arka plan kuyucukları ve sensör kartuşu üzerindeki portlar, reaktiflerin arka plan değerleri üzerindeki etkisini normalleştirmek için tahlil ortamı veya numune kuyucuklarında olduğu gibi reaktiflerin yüklenme portu ile yüklenir. Reaktifler, herhangi bir hava sıkışmasını önlemek için kartuşu kalibre içeren yardımcı plakadan kaldırmadan ilgili bağlantı noktalarına eklenmelidir. Tüm kuyucukların son portunu Şekil 2'de gösterildiği gibi ortamla doldurun.

Figure 2
Şekil 2: Mitokondriyal stres testi kartuşu ve enjeksiyon portları. Görüntü, mitokondriyal stres testinin kartuşunu ve bireysel ilaçların / ortamların portlara yüklenmesini gösteren büyütülmüş bir görüntüyü göstermektedir. Kısaltma: FCCP = karbonilsiyanür p-triflorometoksi fenilhidrazon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Mitokondriyal stres testinin yapılması

  1. Metabolik analizörü ve bilgisayarı açın, Wave yazılımını açın ve makineyi en az 5 saat önceden 37 ° C'de kurmak için Isıtıcı Açık'a tıklayın. Sıcaklığa ulaştıktan sonra dalga yazılımının sol alt köşesi hazır görünüyor.
  2. Yazılımda mitokondriyal stres testi kiti için bir şablon açın. Üst menü çubuğundaki Grup Tanımı'na tıklayın.
  3. Sol tarafta, enjeksiyon stratejileri, ön işlemler, tahlil ortamı ve (kullanılan biyomateryal) hücre tipleri gibi her tanımı ayrı ayrı önceden ayarlayın.
  4. Sol taraftaki enjeksiyon stratejilerine tıklayın, ardından Ekle'ye tıklayın ve enjeksiyon durumunu İnsan nötrofilleri / Fare nötrofilleri / HL60 olarak adlandırın. Her birine tıklayarak A-D portunu seçin ve Bileşik ekle'ye tıklayın ve ilgili konsantrasyonlarla Oligomisin / FCCP / Rotenon Antimisin A'yı girin (Tablo 1).
  5. Sol taraftaki ön işleme tıklayın, ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları CD18 ve Hücre Tak olarak ayrı ayrı adlandırın. Sol tarafta kullanılan biyomateryale tıklayın, ardından Ekle'ye tıklayın ve bunları tohumlama yoğunluğuna sahip İnsan nötrofilleri, Fare nötrofilleri ve HL60 / dHL60 olarak adlandırın.
  6. Grup Ekle'ye tıklayarak (örneğin, insan nötrofil testi için) ve bunun altında yatan tanıma tıklayarak grupları tanımlayın (örneğin, Tablo 1-İnsan nötrofillerine göre enjeksiyon stratejileri, CD18 olarak Ön İşlem ve İnsan nötrofilleri olarak hücre tipi).
  7. Sol tarafta tanımlar ve sağda plaka haritası ile tüm grupları gözlemlemek için üst menüdeki Plaka Haritası'na tıklayın. Dört köşe kuyucuğunu Arka Plan (varsayılan) olarak korurken her bir kuyucuğu gruba eklemek için sürükleyip bırakın.
  8. Üst menüdeki Protokol'e tıklayarak protokolü ayarlayın ve Karıştırma süresini 3 dakika, Dinlenme 0 dakika ve Ölçüm olarak ayarlayarak üç taban çizgisi, oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin A karışımı döngüsü tanımlayın.
  9. Testi Çalıştır sayfasına gidin, başvuru için proje özet bilgilerini sağlayın ve Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın.
  10. Dosyaların kaydedileceği konumu verin, böylece tüm sonuçlar tahlilin tamamlanmasından sonra kaydedilir.
  11. Tahlilin otomatik olarak yüklenmesinden sonra, sensör kartuşunu ve plakayı 200 μL kalibrant ile yerleştirmek için tepsinin açılmasını bekleyin (adım 1.1). Kartuş barkod yönünü sağa bakacak şekilde ayarlayın. Hazırım'a tıklayarak kalibrasyonu çalıştırın, bu da yaklaşık 20 dakika sürer.
  12. Kalibrasyondan sonra, Tepsiyi Aç'a tıklayın. Plakayı hücre tohumlu plaka ile değiştirin ve tahlile devam etmek için Yük Hücresi Plakasına tıklayın.
  13. Testi tamamladıktan sonra, veriler otomatik olarak kaydedilir. Sonuçları görüntüle'ye tıklayın ve elektronik tablo veya başka bir analiz yazılımı dosyası olarak dışa aktarın.
  14. Verileri grafiklendirin ve analiz edin (Şekil 3 ve Şekil 4).
  15. Bazal mitokondriyal solunum, proton sızıntısına bağlı solunum, ATP'ye bağlı solunum, maksimum solunum, yedek solunum kapasitesi ve mitokondriyal olmayan solunum dahil olmak üzere solunum parametrelerini hesaplayın (Şekil 4A)38,39,40,41.
    1. Oligomisin enjekte etmeden önce OCR'den rotenon/antimisin A karışımı eklendikten sonra ölçülen OCR değerini çıkararak bazal mitokondriyal solunumu hesaplayın (Şekil 4A, a).
    2. Rotenon/antimisin A karışımı enjeksiyonundan sonra OCR değerini, oligomisin enjeksiyonu sonrası ölçülen OCR değerinden çıkararak proton sızıntısına bağlı solunumu hesaplayın (Şekil 4A,b).
    3. Bazal mitokondriyal solunum ile proton sızıntısına bağlı solunum arasındaki farkı hesaplayarak ATP'ye bağlı solunumu tahmin edin. Oligomisin enjeksiyonundan sonra ölçülen ilk OCR değerini, oligomisin enjeksiyonundan önceki ilk OCR değerinden çıkarın (Şekil 4A,c).
    4. Maksimum solunum, bir hücrenin FCCP eklendikten sonra elde edebileceği maksimum solunum hızıdır. Bunu, rotenon/antimisin A karışımı enjeksiyonundan sonraki OCR değerini, FCCP enjeksiyonundan sonra ölçülen OCR değerinden çıkararak hesaplayın (Şekil 4A, d).
    5. Yedek solunum kapasitesi, bir hücrenin OXPHOS aracılığıyla daha yüksek enerji talebini karşılama kapasitesini ifade eder. Bunu, maksimal solunum ile bazal mitokondriyal solunum arasındaki farkı bularak hesaplayın (Şekil 4A, e).
    6. Mitokondriyal olmayan solunum, mitokondriyal olmayan kaynaklar tarafından tüketilen oksijen miktarıdır. Rotenon/antimisin A karışımı eklendikten sonra bunu ölçün (Şekil 4A,f).
  16. Farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerinin farklı solunum parametrelerini karşılaştırmak için Student'ın t-testini kullanarak istatistiksel analiz yapın. P < 0.05'in istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.
    NOT: OCR veya ECAR değerleri sıfırın altında olan replikalar, numune hazırlama, bileşik enjeksiyon veya ölçümde hata olarak kabul edilir. Gelecekteki analizlerin dışında tutulurlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare nötrofillerinin oligomisin, FCCP ve rotenon / antimisin A karışımına (Şekil 3A), insan nötrofillerine (Şekil 3B) ve farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerine (Şekil 3C) yanıt olarak mitokondriyal solunum değişikliklerini gösteren temsili OCR dinamikleri gösterilmiştir. Tüm hücrelerde, oligomisin tedavisi, ATP sentazın proton kanalını inhibe ederek OCR değerini düşürür; FCCP tedavisi, membran potansiyelini korumak ve maksimum solunum elde etmek için elektron akışını ve oksijen tüketimini artırarak OCR değerini geri yükler; ve rotenon / antimisin A karışım tedavisi, elektron taşıma zincirinin I ve III komplekslerini bloke ederek mitokondriyal solunumu ortadan kaldırır.

Nötrofil yönelimli farklılaşmadan sonra HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumda azalma gösterdiğini gözlemledik (Şekil 3C). Yukarıda bahsedilen farklı solunum parametrelerini ölçtükten sonra, farklılaşmış HL60 hücreleri önemli ölçüde daha düşük bazal mitokondriyal (Şekil 4B) solunum, proton sızıntısına bağlı solunum (Şekil 4C), ATP'ye bağlı solunum (Şekil 4D) ve mitokondriyal olmayan solunum (Şekil 4G) göstermiştir. Diferansiye HL60 hücrelerinde maksimal solunum (Şekil 4E) artmıştır, ancak anlamlı değildir. Yedek solunum kapasitesi (Şekil 4F) anlamlı olarak artmıştır.

Figure 3
Şekil 3: Mitokondriyal stres testi testi testi sırasında OCR'nin dinamik değişikliklerini gösteren temsili grafikler. (A) N'den ortalama ± SD = fare nötrofillerinin 3 replikasıdır. (B) N'den ortalama ± SD = 3 insan nötrofil replikasyonu. (C) n = 3'ten ortalama ± SD, farklılaşmamış (HL60, mavi) ve farklılaşmış (dHL60, kırmızı) HL60 hücrelerinin replikalarıdır. Kısaltma: OCR = oksijen tüketim oranı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: OCR dinamiklerinden elde edilen solunum parametreleri. (A) (a) bazal mitokondriyal solunum, (b) proton sızıntısına bağlı solunum, (c) ATP'ye bağlı solunum, (d) maksimum solunum, (e) yedek solunum kapasitesi ve (f) mitokondriyal olmayan solunumun nasıl hesaplanacağını gösteren şematik. (B-G) Ortalama ± SD n = 3; (B) bazal mitokondriyal solunum, (C) proton sızıntısına bağlı solunum, (D) ATP'ye bağlı solunum, (E) maksimum solunum, (F) yedek solunum kapasitesi ve (G) farklılaşmamış (HL60) ve farklılaşmış (dHL60) HL60 hücrelerinin mitokondriyal olmayan solunumu. ns (anlamlı olmayan) p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 eşleşmemiş Student's t-testi ile. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak nötrofillerin mitokondriyal solunumunu ölçen standart prosedür, hücre sayısı, hücre büyümesi ve canlılık gibi birçok faktörle sınırlıdır. Her bileşik konsantrasyonu, bu tahlildeki hücrelerin tipi ve kaynağı arasında değişir. Oligomisin ve rotenon / antimisin A, çoğu hücre tipi arasında çoğunlukla benzer konsantrasyonda kullanılır. Bununla birlikte, FCCP kaynaklı maksimum solunum hızı farklı hücreler arasında değiştiğinden, konsantrasyon42'yi optimize etmek için FCCP'nin dikkatli bir şekilde titrasyona tabi tutulması gerekir. Optimizasyon sırasında FCCP'nin sıralı eklemelerini gerçekleştirmek de daha iyidir. Metabolik hücre dışı akı analizörü, ilaçları hava basıncı43 altında plakaya enjekte etmesine rağmen, hücre zarının bazı mitokondriyal kompleks inhibitörlere karşı geçirimsizliği, izole mitokondri44'e kıyasla sağlam hücreler durumunda kullanımlarını sınırlar. Çapraz kontaminasyonu önlemek için limanlara yükleme dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Ortamdaki substrat konsantrasyonu (örneğin, glikoz, piruvat, glutamin) de mitokondriyal aktiviteyi etkileyebilir ve optimize edilmesi gerekir.

İlaç konsantrasyonlarının yanı sıra, hücre tohumlama yoğunluğu da iyi bir OCR değeri elde etmede kritik bir parametredir. Optimum hücre tohumlama yoğunluğu, hücre tipine göre değişir ve ölçümün etkinliğini test etmek için ön deneylerde farklı tohumlama yoğunluklarının kullanılması önerilir. Gruplar arasındaki değişkenliği azaltmak için doğru hücre sayımı zorunludur ve plakanın altındaki hücrelerin yapışmasını sağlamak için kültür plakası için uygun kaplama malzemeleri test edilmelidir. Kültür plakasının RT'de 300 × g hızla frensiz 5 dakika boyunca santrifüjlenmesi, hücrelerin hızlı bir şekilde çökelmesine ve bağlanmasına yardımcı olur. Hücreleri tohumlamadan önce, kaplama malzemesini aspire ettikten sonra yeterli yıkama arzu edilir.

Hücrelerin tohumlanması, kenar etkilerinden kaçınmak ve hücrelerin düzgün yayılmasını sağlamak için alt kenardaki hücrelerin pipetlenmesiyle gerçekleştirilir45. Hücreler 37 ° C'de tutulur ve kenar etkisini en aza indirmek için en az 1 saat dinlenmeye bırakılır46. Gaz karışımındaki oksijen seviyesi, farklı dokular ve hücre tipleri için farklı hipoksi değerleri ile deneye ve hücre tipine göre farklılık gösterebileceğinden, ölçümden önce hücre kültürü plakasının gazını gidermek için CO2 olmayan bir inkübatörde tutulması önerilir47. Tahlil ortamı, tahlil gününde hazırlanmalıdır (tahlil için 70 mL ortam yeterlidir). Verilerin hücre numarası ile normalleştirilmesi, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil-2,5-tetrazolyum bromür (MTT) testi, Hoechst ile nükleer parçalanma testi, hücre sayma testi veya protein veya DNA niceleme testleri48 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Farklı mitokondriyal inhibitörler kullanıldığından, hücre canlılığı sonuç için bir faktör olarak düşünülmelidir. Kullanılan ilaçların olası bir sitotoksik etkisini dışlamak için tahlilin sonunda bir hücre canlılığı testi yapılması önerilir.

OCR'ye ek olarak, metabolik hücre dışı akı analizörü, glikoliz49'un ölçülmesinde yaygın olarak kullanılan ECAR'ı da ölçebilir. Bununla birlikte, mitokondriyal stres testinde, ECAR değerleri, mitokondriyal solunumda hem glikoliz hem de trikarboksilik asit döngüsü (CO2 yoluyla) tarafından üretilen asitliği yansıtır. Glikolizi ölçmek için bir glikoliz stres testi kiti önerilir. Başlangıçta, bileşiklerin eklenmesinden önceki OCR, nötrofillerin bazal solunumunu gösterir. Bazal solunum, iç mitokondriyal membran bileşimine bağlı olarak, mitokondriyal matrikstan iç mitokondriyal membrandan geçen zarlar arası boşluğa taşınan protonlar nedeniyle oluşur. Bazal solunum, istirahat hücrelerinin metabolik hızının ~% 30-50'sini oluşturur 1,50.

Tahlilin bazal solunumuna dayanan hesaplamalar, hücre grupları ve tipleri arasındaki değişkenliği azaltabilir. Verilerin normalleştirilmesi, herhangi bir ilaç eklenmeden bazal solunum ile karşılaştırılarak sağlanmıştır, bu da hücre sayısına ve tahlildeki tezgah hatasına bağlı olarak normalleştirici değişikliklere izin verir. Yedek solunum kapasitesi, maksimal OCR ve bazal OCR arasındaki farktır ve hücrelerin biyoenerjetik sınırlarına ne kadar yakın çalıştıklarının bir göstergesidir. Maksimum solunumdaki azalma, solunum zincirinde I ve II komplekslerinden III ve IV komplekslerine ve nihayetinde moleküler oksijene elektron taşınımının azaldığını gösterir. Şekil 4A , tahlilin hesaplamalarının şematik gösterimini göstermektedir.

Yedek solunum kapasitesindeki artış, hücrelerin daha fazla enerji talebine iyi yanıt verebileceğini göstermektedir; bu, nötrofiller durumunda bir ön koşuldur, çünkü aktivasyondasolunum patlamasına neden olurlar 51,52,53,54,55. Bununla birlikte, mitokondriyal stres testinin ECAR verileri, nötrofillerin glikoliz oranını temsil edemez. Veriler üzerinde belirli değerlendirmeler yapılabilir; Örneğin, rotenon ve antimisin A ilavesinden sonra hem fare hem de insan nötrofillerinde ECAR değerlerindeki azalma, bu kompleks I ve III inhibitörlerinin eklenmesinden önceki ECAR değerlerinin öncelikle TCA döngüsünden CO2 üretimine bağlı olduğunu ima eder. Hücre hatları söz konusu olduğunda, ECAR değerleri rotenon ve antimisin A ilavesinden sonra sabittir, bu da eklemeden önceki ECAR değerlerinin glikoliz45'e bağlı olduğunu düşündürmektedir.

Mitokondriyal bozukluklar hatalı OXPHOS ile karakterize klinik durumlardır. Nötrofiller söz konusu olduğunda, hücre proliferasyonu olmaması, düşük mitokondriyal sayı ve erken yaşlanma nedeniyle OCR ölçümü düşüktür56. Nörodejeneratif bozukluklarda, nötrofiller amiloid-β (Aβ) tortu alanlarına ekstravaze olur. Aβ42 peptidi, integrin aktivasyonunu ve hızlı nötrofil yapışmasını tetikler57. Apoptoz sırasında, nötrofil mitokondri proapoptotik proteinleri sitosol58'e salgılar. Ayrıca nötrofil migrasyon hızının azaldığı ve CCCP9 ile tedavi edildiğinde kemotaksisin ortadan kalktığı gösterilmiştir. Bu, mitokondri ve mitokondriyal solunumun nötrofil fonksiyonundaki potansiyel rolünü göstermektedir. Alzheimer5, şizofreni59, kronik solunum yolu hastalıkları60, bipolar bozukluklar, sepsis, şeker hastaları, astım, pulmoner hipertansiyon ve orak hücre hastalığı gibi birçok patolojik durum altında çeşitli hücre tiplerinde mitokondriyal aktiviteler bildirilmiş ve patogenezle ilişkilendirilmiştir. Antioksidanlar (örneğin, CoQ10, idebenon, alfa-lipoik asit, C vitamini ve E) ve / veya kofaktörler (örneğin, riboflavin, tiamin) kullanarak solunum zinciri akısını iyileştirmek ve L-karnitin gibi mitokondriyal substratların uygulanması gibi yeni tedaviler, mitokondriyal bozuklukların tedavisinde kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu tedaviler standartlaştırılmamıştır ve etkili olmayabilir61. Nötrofiller gibi hastalıkla ilgili hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonları ölçmek için metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanmak gibi invaziv olmayan standartlaştırılmış bir metodoloji, terapötiklerde tanısal bir biyobelirteç olarak hizmet edebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Anthony T. Vella ve Dr. Federica Aglianoin'e metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanma konusundaki eğitimleri için ve UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Lynn Puddington'a enstrümanlara verdiği destek için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi'nden Dr. Geneva Hargis'e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R35GM147713 ve P20GM139763), UConn Health'ten bir başlangıç fonu ve Amerikan İmmünologlar Birliği'nden bir Kariyer yeniden giriş bursu ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136 (2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858 (2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472 (2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521 (2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121 (2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444 (2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487 (2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907 (2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850 (2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465 (2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656 (2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845 (2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975 (2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079 (2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899 (2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608 (2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856 (2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099 (2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306 (2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 196
Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter