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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64971
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Summary

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪测量小鼠和人中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的逐步方案。

Abstract

中性粒细胞是人类的第一道防线，也是最丰富的白细胞。这些效应细胞执行吞噬作用和氧化爆发等功能，并产生中性粒细胞细胞外陷阱（NET）用于微生物清除。对中性粒细胞代谢活动的新见解挑战了它们主要依赖于糖酵解的早期概念。代谢活动的精确测量可以揭示中性粒细胞的不同代谢需求，包括生理条件和疾病状态下的三羧酸（TCA）循环（也称为克雷布斯循环），氧化磷酸化（OXPHOS），磷酸戊糖途径（PPP）和脂肪酸氧化（FAO）。本文描述了在代谢细胞外通量分析仪上进行代谢通量分析，测量小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血源性中性粒细胞和中性粒细胞样HL60细胞系的耗氧率（OCR）作为线粒体呼吸指标的分步方案和先决条件。该方法可用于量化中性粒细胞在正常和疾病条件下的线粒体功能。

Introduction

线粒体在细胞生物能量学中起主要作用，其通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。除此之外，线粒体的作用延伸到活性氧的产生和解毒，细胞质和线粒体基质钙调节，细胞合成，分解代谢以及细胞内代谢物的运输1。线粒体呼吸在所有细胞中都是必不可少的，因为它们的功能障碍会导致代谢问题2，包括心血管疾病3 和多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4，帕金森氏症和阿尔茨海默氏症5，以及Charcot-Marie-Tooth疾病2 A（CMT2A）6。

对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，线粒体7相对较少，并且由于线粒体呼吸速率非常低，它们严重依赖糖酵解来产生能量8。然而，线粒体对中性粒细胞功能至关重要，例如趋化性9和细胞凋亡10,11,12。之前的一项研究揭示了具有高膜电位的人中性粒体中性粒体网络。线粒体膜电位丢失是中性粒细胞凋亡的早期指标10。用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯基腙（CCCP）处理显示出对趋化性的显着抑制，以及线粒体形态的变化9,10。

虽然中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过推动嘌呤能信号传导的第一阶段来提供启动中性粒细胞激活的 ATP，从而促进 Ca2+ 信号传导，放大线粒体 ATP 的产生，并启动中性粒细胞功能反应13。线粒体呼吸链功能障碍导致有毒活性氧（ROS）的过量产生并导致致病性损害14,15,16。NETosis是形成中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的过程，是中性粒细胞的关键特性，可帮助它们对抗病原体17，并导致许多病理状况，包括癌症，血栓形成和自身免疫性疾病18。线粒体来源的 ROS 有助于 NETosis19，线粒体 DNA 可以是NETs 18 的组成部分，线粒体稳态改变会损害 NETosis 20,21,22,23,24。此外，在正常分化或成熟期间，中性粒细胞代谢重编程通过限制糖酵解活性而被逆转，并且它们参与线粒体呼吸并动员细胞内脂质25,26。

代谢细胞外通量分析仪可以连续监测和量化活细胞线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪利用一个 96 孔板格式的传感器盒和两个荧光团来量化氧 （O2） 浓度和 pH 值变化。在测定过程中，传感器盒位于细胞单层上方，并形成~200nm高的微室。分析仪中的光纤束用于激发荧光团并检测荧光强度变化。自动计算 O2 浓度和 pH 值的实时变化，并显示为耗氧速率 （OCR） 和细胞外酸化速率 （ECAR）。传感器盒上有四个端口，允许在测定测量期间将多达四种化合物加载到每个孔中。该协议侧重于使用代谢细胞外通量分析仪量化小鼠和人中性粒细胞的线粒体呼吸，以及中性粒细胞样HL60细胞。

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Protocol

肝素化全血样本是在获得知情同意后从健康人类捐赠者那里获得的，经康涅狄格大学卫生机构审查委员会根据赫尔辛基宣言批准。所有动物实验都遵循康涅狄格大学卫生机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针，并根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中概述的标准，获得了康涅狄格大学健康IACUC对啮齿动物的使用批准。本研究使用6周龄的雄性C57BL / 6小鼠。

1.用于代谢细胞外通量测定的96孔板的制备

  1. 传感器盒封装在专门设计的 96 孔板顶部，用于代谢细胞外通量测定。小心地提起墨盒水合墨盒，并将 200 μL/孔的校准培养基放入下层板的每个孔中。将滤芯放在带有校准剂的板上，置于非CO2，加湿，37°C培养箱中过夜以水合。
  2. 根据细胞类型，为培养板使用特定的涂层以确保细胞粘附。对于人中性粒细胞 - 未分化和分化的HL60细胞 - 用含有50μL5μg/ mL纯化的小鼠抗人CD18抗体（克隆TS1 / 18）的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）在4°C下涂覆96孔板过夜。对于小鼠中性粒细胞，在室温 （RT） 下在 pH 8.0 的 0.1 M NaHCO3 中用 25 μL 22.4 μg/mL Cell Tak 涂覆 96 孔板 20 分钟。
  3. 用 200 μL 无菌 PBS 清洗板两次。
  4. 将完全培养基添加到细胞培养板（无细胞）的角孔（A1、A12、H1 和 H12）中，以便在接种时在细胞培养板中进行背景校正。
    注意：涂层和校准过程中的蒸发可能会影响校准介质的体积和归一化。使用带有无菌水润湿组织的托盘或腔室，并将带有校准剂的板放在其上方以防止蒸发。

2. 细胞的制备和接种

  1. 检测培养基的制备
    1. 通过将 1 mM 丙酮酸、10 mM 葡萄糖和 2 mM 谷氨酰胺添加到 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中来制备测定培养基。
  2. 从骨髓中分离小鼠中性粒细胞
    1. 根据制造商的说明，使用小鼠中性粒细胞富集试剂盒从骨髓中分离小鼠中性粒细胞。
    2. 通过腹膜内（ip）注射氯胺酮（125mg / kg）和甲苯噻嗪（12.5mg / kg）麻醉小鼠，然后通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死。
    3. 收获股骨和胫骨，如前所述27.简而言之，切开皮肤以露出带有肌肉的腿。切开髋关节，将腿从身体上移开。然后，移除肌肉以收集股骨和胫骨。
    4. 切开股骨和胫骨的较小末端。按住切割端，将它们放入底部有两个25 G注射器针孔的0.5 mL离心管中，然后将0.5 mL管放入1.5 mL离心管中（图1A）。将 50 μL PBS 加入 0.5 mL 管中，以防止骨髓细胞干燥。
    5. 在室温下以 5,900 × g 离心 15 秒，以收集 1.5 mL 管底部的骨髓。用 1 mL DMEM 重悬骨髓细胞。从试剂盒中加入 50 μL 大鼠血清，通过移液轻轻混合，然后将细胞悬液转移到 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
    6. 从小鼠中性粒细胞富集试剂盒中加入 50 μL 富集鸡尾酒，并在室温下孵育 15 分钟。 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 用 1 mL DMEM 重悬细胞，从试剂盒中加入 50 μL 生物素选择鸡尾酒，通过移液轻轻混合，并在室温下孵育 15 分钟。
    8. 从试剂盒中加入 150 μL 涡旋磁性颗粒，通过移液轻轻混合，并在室温下孵育 10 分钟。
    9. 加入~1.3 mL DMEM，通过移液轻轻混合，将管放入磁铁中 3 分钟，通过将原始管与磁铁一起倒置，将含有纯化小鼠中性粒细胞的上清液转移到新的 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
    10. 在室温下以300× g 离心5分钟。通过真空抽吸除去上清液后，用1mL测定培养基重悬细胞。
    11. 使用血细胞计数器手动计数细胞。
    12. 通过加入测定培养基将细胞密度调节至1.1×106 细胞/ mL，将每孔180μL小鼠中性粒细胞悬液（2×105 细胞）接种到制备的96孔板中（步骤1.2-1.4），并将板在室温下以300 ×g 离心3分钟而不制动以确保细胞在板底部的适当粘附。
    13. 将板在非CO2，加湿的37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
      注意：中性粒细胞的纯度对于测定至关重要，因为它是潜在的偏差。通过该方案，小鼠中性粒细胞分离的纯度为69.9%-88.7%。还有其他方法可以从小鼠骨髓中分离中性粒细胞，例如密度梯度离心28。还有来自其他供应商的替代中性粒细胞分离试剂盒，基于负磁性选择，使用针对中性粒细胞上未表达的抗原的单克隆抗体。
  3. 从外周血中分离人中性粒细胞
    1. 将 8 mL 多糖溶液加入 15 mL 离心管中，然后在多糖溶液上叠加 4 mL 外周血，不混合。
    2. 在20°C下以550× g 离心30分钟。使转子在 1 时减速。
      注意：中性粒细胞分离时间可能因供体而异。它至少需要 30 分钟，如果中性粒细胞分离不成功，可能需要额外的 10-20 分钟。
    3. 观察离心后血浆/血小板和单核细胞的分离，如图 1B所示。使用 1 mL 移液管小心去除顶部（血浆和血小板）和上部混浊带（单核细胞）上的上部黄色液体，而不会干扰下部混浊带（中性粒细胞）。
    4. 将下部浑浊带和下方~3-4 mL透明液体收集到含有10 mL PBS的新15 mL离心管中。
    5. 在20°C下以400 ×g 离心10分钟，并通过真空抽吸除去上清液。
    6. 用5mL PBS重悬细胞，并在20°C下以300 ×g 离心5分钟。
    7. 除去上清液后，用1mL测定培养基重悬细胞。
    8. 使用血细胞计数器手动计数细胞。
      注意：由于血液中的红细胞没有任何线粒体，因此红细胞污染不会影响线粒体应激试验测定并阻止中性粒细胞活化/启动29,30。在细胞计数过程中需要裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 μL 细胞悬液加入 891 μL 去离子水中 10-30 秒以裂解红细胞，然后加入 99 μL 10x PBS 以平衡渗透压，避免中性粒细胞裂解。
    9. 通过加入测定培养基将细胞密度调节至 2.2 × 106 个细胞/mL，将每孔接种 180 μL 人中性粒细胞 （~4 × 105） 到制备的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心板 3 分钟，无需制动，以确保细胞在板底部正确粘附。
    10. 将板在非CO2，加湿，37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
      注意：中性粒细胞的纯度对于测定至关重要，因为它是潜在的偏倚。人中性粒细胞分离纯度为86.6%-96.8%。还有其他密度梯度离心方法可用于从人血液中分离中性粒细胞，包括Percoll分离以及Ficoll分离和葡聚糖沉降的组合31。
  4. HL60细胞培养和中性粒细胞定向分化
    1. 在罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI）-1640 培养基中维持含有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B 的培养基中的 HL60 细胞在 37 °C 和 5% CO2。
    2. 对于中性粒细胞定向分化，将 HL60 细胞（悬浮细胞）保持在 T25 烧瓶中的密度为 1 × 10 5 个细胞/mL 在含有 10% FBS、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B 和 1.3% 二甲基亚砜 （DMSO） 的 RPMI-1640 培养基中，在 37 °C 和 5% CO2 下维持 6 天。
    3. 在测定当天，使用血细胞计数器手动计数细胞，在室温下以300× g 离心分化或未分化的HL60细胞5分钟，用DMEM洗涤一次，并用测定培养基重悬细胞以获得1.39×106 细胞/ mL的细胞密度。
    4. 将每孔 180 μL 分化或未分化的 HL60 细胞（~2.5 × 105）接种到制备的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心板 3 分钟而不制动以确保细胞在板底部的适当粘附。
    5. 将板在非CO2，加湿的37°C培养箱中孵育1小时，以用测定培养基预平衡细胞。
      注意：在下一步之前，使用显微镜确认细胞的完全粘附。

Figure 1
图1：骨髓细胞和中性粒细胞分离示意图。 （A）从小鼠身上收获骨髓细胞和（B）从人类血液中分离中性粒细胞。 请点击此处查看此图的大图。

细胞类型 每孔细胞数 化合物/试剂 工作溶液浓度 端口进样量 井中的最终浓度
小鼠中性粒细胞 2 ×10 5 寡霉素 25微米 20 微升 2.5微米
苜蓿属 7.5微米 17.6 微升 0.61微米
鱼藤酮抗霉素A混合物 10 微米 24 微升 1 微米
人中性粒细胞 4 ×10 5 寡霉素 10 微米 20 微升 1 微米
苜蓿属 12.5微米 22 微升 1.25微米
鱼藤酮抗霉素A混合物 10 微米 24 微升 1 微米
未分化或分化的HL60细胞 2.5 × 105 寡霉素 25微米 20 微升 2.5微米
苜蓿属 15微米 22 微升 1.5微米
鱼藤酮抗霉素A混合物 10 微米 24 微升 1 微米

表1：线粒体应激试验的细胞数和试剂浓度。

3. 在线粒体压力测试试剂盒中制备化合物

  1. 打开线粒体压力测试试剂盒并准备试剂。
    注意：用于小鼠中性粒细胞，人中性粒细胞和HL60细胞的不同工作溶液浓度，注入孔中的体积以及孔中的最终浓度用于小鼠中性粒细胞，人中性粒细胞和HL60细胞。
    1. 通过用 630 μL 测定培养基重构寡霉素来制备寡霉素储备溶液，以获得 100 μM 储备溶液。
      注意：建议在同一天使用储备溶液。
      1. 通过将 630 μL 储备溶液与 1,890 μL 测定培养基混合以获得 25 μM 工作溶液，制备用于小鼠中性粒细胞和 HL60 细胞测定的寡霉素工作溶液。
      2. 通过将 300 μL 储备溶液与 2,700 μL 测定培养基混合以获得 10 μM 工作溶液，制备用于人中性粒细胞测定的寡霉素工作溶液。
        注意：寡霉素与 Fo/F1 ATP 酶（ATP 合酶）的 Fo 基板亚基的结合可防止质子重新进入线粒体并抑制 ATP 合成32。这大大减少了通过电子传输链和OCR的电子流量。然而，由于质子泄漏穿过线粒体内膜33，电子流不会完全停止。
    2. 通过用 720 μL 测定培养基重构 FCCP 来制备 FCCP 储备溶液，以获得 100 μM 储备溶液。
      1. 通过将 300 μL 储备溶液与 3,700 μL 测定培养基混合以获得 7.5 μM 工作溶液，制备小鼠中性粒细胞测定的工作溶液。
      2. 通过将 375 μL 储备溶液与 2,625 μL 测定培养基混合以获得 12.5 μM 工作溶液，制备人中性粒细胞测定的工作溶液。
      3. 通过将 720 μL 储备溶液与 4,080 μL 测定培养基混合以获得 15 μM 工作溶液，制备用于 HL60 细胞测定的工作溶液。
        注意：FCCP的添加揭示了线粒体使用OXPHOS的最大容量。它是一种脂溶性弱酸，可渗透到线粒体，导致跨膜电位的消散。将质子梯度放电穿过线粒体内膜并从Fo / F1 ATP合酶转移质子通量导致线粒体解偶联。这种解偶联效应突然增加了线粒体的耗氧量，以保持质子梯度34。
    3. 通过将鱼藤酮/抗霉素 A 混合物与 540 μL 测定培养基重新配制来制备鱼藤酮/抗霉素 A 储备溶液，以获得 50 μM 储备溶液。
      1. 通过将 540 μL 储备溶液与 2,160 μL 测定培养基混合以获得 10 μM 工作溶液，制备鱼藤酮/抗霉素 适用于所有测定的工作溶液。
        注意：鱼藤酮通过抑制从复合物I中的铁硫中心到泛醌的电子转移来阻断复合物I，而抗霉素A阻断电子传递链的复合物III，导致ATP35的有限合成阻断OXPHOS。因此，这揭示了非线粒体呼吸36,37。
  2. 用试剂装入试剂盒;将制备好的寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A 混合物分别加载到药筒中的 A、B 和 C 端口进行注射（图 2）。使用随小柱一起提供的模板插件，以便将试剂加载到端口。用 20 μL 测定培养基填充未使用的端口。
    1. 对于小鼠中性粒细胞测定，将20μL寡霉素（25μM;96孔板的每个孔开始时有180μL测定培养基，因此终浓度为2.5μM）加载到A端口中。将 17.6 μL FCCP（7.5 μM;终浓度：~0.61 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度：~1 μM）加载到 C 端口中。
    2. 对于人中性粒细胞测定，将 20 μL 寡霉素（10 μM;96 孔板的每个孔开始时有 180 μL 测定培养基，因此最终浓度为 1 μM）加载到 A 端口中。将 22 μL FCCP（12.5 μM;终浓度：~1.25 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度：~1 μM）加载到 C 端口中。
    3. 对于HL60和dHL60细胞测定，将20μL寡霉素（25μM;96孔板的每个孔开始时有180μL测定培养基，因此最终浓度为2.5μM）加载到A端口中。将 22 μL FCCP（15 μM;终浓度：~1.5 μM）加载到 B 端口中。将 24 μL 鱼藤酮/抗霉素 A 混合物（10 μM;终浓度：~1 μM）加载到 C 端口中。
      注意：在端口中吸取药物溶液，不要接触端口底部。装载后不要敲击板以避免泄漏，因为液体被毛细管力固定。培养板的背景孔和传感器盒上的端口装有检测培养基或与样品孔中相同的试剂加载端口，以使试剂对背景值的影响归一化。试剂必须添加到相应的端口，而无需将试剂盒从含有校准剂的实用板上提起，以避免任何空气滞留。如图2所示，用培养基填充所有孔的最后一个端口。

Figure 2
图2：线粒体应力测定试剂盒及其注射口。 该图像显示了线粒体应激测定的墨盒和显示单个药物/培养基到端口的加载的放大图像。缩写：FCCP = 羰基 氰对三氟甲氧基苯腙。 请点击此处查看此图的大图。

4. 运行线粒体应激测定

  1. 打开代谢分析仪和计算机的电源，打开 Wave 软件，然后单击 加热器打开 以至少提前5小时将机器设置为37°C。达到温度后，波软件的左下角显示 就绪。
  2. 在软件中打开线粒体应激测定试剂盒的模板。单击顶部菜单栏中的 组定义 。
  3. 在左侧分别预先设置每个定义，例如注射策略、预处理、分析培养基和（使用的生物材料）细胞类型。
  4. 单击左侧的注射策略，然后单击添加并将注射条件命名为人中性粒细胞/小鼠中性粒细胞/HL60。通过单击每个端口选择端口A-D，然后单击添加化合物，然后输入具有相应浓度的寡霉素/FCCP/鱼藤酮抗霉素A（表1）。
  5. 单击左侧的预处理，然后单击添加并分别将它们命名为 CD18 和 Cell Tak。单击左侧使用的生物材料，然后单击添加并将它们命名为具有接种密度的人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞和 HL60/dHL60。
  6. 通过单击添加组（例如，用于人中性粒细胞测定）并单击其基础定义（例如，表1中的注射策略-人中性粒细胞，预处理为CD18，细胞类型为人中性粒细胞）来定义组。
  7. 单击顶部菜单中的板图以观察所有组，左侧是定义，右侧是 板图 。拖放以将每个孔添加到组中，同时将四个角孔保留为 背景 （默认）。
  8. 通过单击顶部菜单中的协议来设置方案，并通过将混合时间为 3 分钟、休息为 0 分钟和测量设置为 7 分钟来定义基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物的三个周期。
  9. 转到“运行 分析 ”页面，提供项目摘要信息以供参考，然后单击“ 开始运行”。
  10. 给出保存文件的位置，以便在测定完成后保存所有结果。
  11. 自动上样测定后，等待托盘打开，将传感器盒和板放入 200 μL 校准品（步骤 1.1）。将墨盒条形码方向朝右设置。通过单击“ 我准备好了”运行校准，大约需要 20 分钟。
  12. 校准后，单击打开 托盘。用细胞接种板替换板，然后单击 称重传感器板 以继续测定。
  13. 完成测定后，数据将自动保存。单击查看 结果 并将其导出为电子表格或其他分析软件文件。
  14. 绘制和分析数据（图 3 和 图 4）。
  15. 计算呼吸参数，包括基础线粒体呼吸、质子泄漏相关呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力和非线粒体呼吸（图 4A）38,39,40,41。
    1. 通过在注射寡霉素之前从OCR中加入鱼藤酮/抗霉素A混合物后测量的OCR值来计算基础线粒体呼吸（图4A，a）。
    2. 通过从寡霉素注射后测量的OCR值中减去鱼藤酮/抗霉素A混合物注射后的OCR值来计算质子泄漏连接的呼吸（图4A，b）。
    3. 通过计算基础线粒体呼吸和质子泄漏相关呼吸之间的差异来估计 ATP 相关的呼吸。从寡霉素注射前的第一个OCR值中减去寡霉素注射后测量的第一个OCR值（图4A，c）。
    4. 最大呼吸是细胞在添加FCCP后可以达到的最大呼吸速率。通过从FCCP注射后测量的OCR值中减去鱼藤酮/抗霉素A混合物注射后的OCR值来计算这一点（图4A，d）。
    5. 备用呼吸能力是指细胞通过 OXPHOS 满足更高能量需求的容量。通过找到最大呼吸和基础线粒体呼吸之间的差异来计算这一点（图4A，e）。
    6. 非线粒体呼吸是非线粒体来源消耗的氧气量。在加入鱼藤酮/抗霉素A混合物后测量（图4A，f）。
  16. 使用学生 t检验进行统计分析，以比较未分化和分化的HL60细胞的不同呼吸参数。将 p < 0.05 视为具有统计显著性。
    注意：OCR 或 ECAR 值低于零的重复被认为是样品制备、化合物进样或测量中的错误。它们被排除在将来的分析之外。

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Representative Results

显示代表性的OCR动力学表明线粒体呼吸变化响应寡霉素，FCCP和鱼藤酮/抗霉素A小鼠中性粒细胞（图3A），人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化的HL60细胞（图3C）的混合物。在所有细胞中，寡霉素处理通过抑制ATP合酶的质子通道来降低OCR值;FCCP处理通过增加电子流量和耗氧量来恢复OCR值，以维持膜电位并实现最大呼吸;和鱼藤酮/抗霉素 A 混合物处理通过阻断电子传递链的复合物 I 和 III 来消除线粒体呼吸。

我们观察到，在中性粒细胞定向分化后，HL60细胞显示出线粒体呼吸减少（图3C）。在量化上述不同的呼吸参数后，分化的HL60细胞显示出显着降低的基础线粒体呼吸（图4B），质子泄漏连接呼吸（图4C），ATP连接呼吸（图4D）和非线粒体呼吸（图4G）。分化的HL60细胞的最大呼吸（图4E）增加，但不显着。备用呼吸能力（图4F）显着增加。

Figure 3
图 3：显示线粒体压力测试测定期间 OCR 动态变化的代表性图表。 （A）小鼠中性粒细胞n = 3次重复的平均SD±。（B）人中性粒细胞n = 3个重复的平均SD±。（C） 未分化（HL60，蓝色）和分化（dHL60，红色）HL60 细胞的 n = 3 次重复的平均 SD ±。缩写：OCR = 耗氧率。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：从 OCR 动力学中获得的呼吸参数。 （A）显示如何计算（a）基础线粒体呼吸，（b）质子泄漏相关呼吸，（c）ATP相关呼吸，（d）最大呼吸，（e）备用呼吸能力和（f）非线粒体呼吸的示意图。（B-G）平均±标准偏差为 n = 3;（B）基础线粒体呼吸，（C）质子泄漏相关呼吸，（D）ATP相关呼吸，（E）最大呼吸，（F）备用呼吸能力，以及（G）未分化（HL60）和分化（dHL60）HL60细胞的非线粒体呼吸。ns（非显著性）p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，通过未配对的学生 t 检验。请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

使用代谢细胞外通量分析仪测量中性粒细胞线粒体呼吸的标准程序受到许多因素的限制，包括细胞数量、细胞生长和活力。在该测定中，每种化合物浓度因细胞的类型和来源而异。寡霉素和鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中大多以相似的浓度使用。然而，由于FCCP诱导的最大呼吸频率因不同细胞而异，因此需要仔细滴定FCCP以优化浓度42。在优化期间执行 FCCP 的顺序添加也更好。尽管代谢细胞外通量分析仪在气压下将药物注射到平板43中，但与分离的线粒体44相比，细胞膜对某些线粒体复合物抑制剂的不渗透性限制了它们在完整细胞中的使用。必须小心地装载到港口，以避免交叉污染。培养基中的底物浓度（例如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺）也可能影响线粒体活性，需要优化。

除了药物浓度外，细胞接种密度也是获得良好OCR值的关键参数。最佳细胞接种密度因细胞类型而异，建议在初步实验中使用不同的接种密度来测试测量的有效性。准确的细胞计数对于降低组之间的变异性是强制性的，并且必须测试用于培养板的适当包被材料，以确保细胞在板底部的粘附性。在不制动的情况下以300 × g 的速度离心培养板5分钟有助于细胞的快速沉降和附着。在接种细胞之前，需要在吸出涂层材料后进行充分的洗涤。

细胞的接种是通过在底部边缘移液细胞来进行的，以避免边缘效应并确保细胞的均匀扩散45。将细胞保持在37°C并静置至少1小时以最小化边缘效应46。建议在测量前将它们保存在非CO2 培养箱中以对细胞培养板进行脱气，因为气体混合物中的氧气水平可能因实验和细胞类型而异，不同组织和细胞类型的缺氧值不同47。测定培养基必须在测定当天制备（70 mL培养基足以用于测定）。可以使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2,5-四唑溴化物（MTT）测定，Hoechst的核碎裂测定，细胞计数测定或蛋白质或DNA定量测定48进行细胞数数据归一化。由于使用不同的线粒体抑制剂，因此需要考虑细胞活力作为结果的一个因素。建议在测定结束时进行细胞活力测试，以排除所用药物可能的细胞毒性作用。

除OCR外，代谢细胞外通量分析仪还可以测量ECAR，ECAR通常用于定量糖酵解49。然而，在线粒体应激测定中，ECAR值反映了线粒体呼吸中糖酵解和三羧酸循环（通过CO2）产生的酸度。为了测量糖酵解，建议使用糖酵解应激测试试剂盒。最初，添加化合物之前的OCR显示中性粒细胞的基础呼吸。基底呼吸是由于质子从线粒体基质运输到通过线粒体内膜的膜间空间而发生的，这取决于线粒体内膜组成。基底呼吸占静息细胞代谢率的~30%-50%1,50。

基于测定的基础呼吸的计算可以减少组和细胞类型之间的变异性。通过与基础呼吸进行比较，无需添加任何药物即可实现数据的标准化，这允许根据测定的细胞计数和工作台误差进行标准化变化。备用呼吸能力是最大OCR和基础OCR之间的差异，是细胞功能接近其生物能量极限的指标。最大呼吸减少表明呼吸链中从复合物I和II到复合物III和IV的电子传输减少，最终到分子氧。 图4A 显示了测定计算的示意图。

备用呼吸能力的增加表明细胞可以很好地响应进一步的能量需求，这是中性粒细胞的先决条件，因为它们在激活时最终会呼吸爆发51,52,53,54,55。然而，线粒体应激测定的ECAR数据不能代表中性粒细胞的糖酵解速率。可以对数据进行某些评估;例如，加入鱼藤酮和抗霉素A后小鼠和人中性粒细胞中ECAR值的降低意味着添加这些复合物I和III抑制剂之前的ECAR值主要是由于TCA循环产生的CO2。在细胞系的情况下，加入鱼藤酮和抗霉素A后的ECAR值是恒定的，这表明添加前的ECAR值是由于糖酵解45。

线粒体疾病是以 OXPHOS 缺陷为特征的临床疾病。在中性粒细胞的情况下，由于没有细胞增殖、线粒体计数低和早期衰老，OCR 的测量值很低56。在神经退行性疾病中，中性粒细胞外渗到淀粉样蛋白-β （Aβ） 沉积区。Aβ42肽触发整合素活化和快速中性粒细胞粘附57。在细胞凋亡过程中，中性粒细胞线粒体将促凋亡蛋白释放到细胞质中58。还表明，用CCCP9处理时，中性粒细胞迁移速度降低，趋化性消除。这表明线粒体和线粒体呼吸在中性粒细胞功能中的潜在作用。已经报道了在许多病理条件下不同细胞类型中的线粒体活性，并与发病机制有关，例如阿尔茨海默氏症5，精神分裂症59，慢性呼吸系统疾病60，双相情感障碍，败血症，糖尿病患者，哮喘，肺动脉高压和镰状细胞病。新兴疗法，例如通过使用抗氧化剂（例如辅酶Q10、艾地苯醌、α-硫辛酸、维生素C和E）和/或辅助因子（例如核黄素、硫胺素）和线粒体底物（如左旋肉碱）来改善呼吸链通量，已被用于治疗线粒体疾病。然而，这些治疗并不标准化，可能无效61。一种非侵入性标准化方法，例如使用代谢细胞外通量分析仪来量化疾病相关细胞（如中性粒细胞）中的线粒体功能，可以作为治疗中的诊断生物标志物。

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Disclosures

作者声明没有竞争性经济利益。

Acknowledgments

我们感谢UConn Health免疫学系的Anthony T. Vella博士和Federica Aglianoin博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及UConn Health免疫学系的Lynn Puddington博士对这些仪器的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的日内瓦·哈吉斯博士在科学写作和编辑本手稿方面的帮助。这项研究得到了美国国立卫生研究院，国家心脏，肺和血液研究所（R01HL145454），国家普通医学科学研究所（R35GM147713和P20GM139763），UConn Health的启动基金以及美国免疫学家协会的职业再入奖学金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37 °C non-CO2 incubator Precision Economy Model 2EG Instrument
Biorender Software Application
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 102416-100 Reagent
EasySep Magnet STEMCELL 18000 Magnet
EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit STEMCELL 19762A Reagents
Graphpad Prism 9 Software Application
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Ketamine (VetaKet) DAILYMED NDC 59399-114-10 Anesthetic
PBS Cytiva SH30256.01 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) polysaccharide solution
Purified mouse anti-human CD18 antibody Biolegend 302102 Clone TS1/18
RPMI 1640 Medium Gibco 11-875-093 Reagents
Seahorse metabolic extracellular flux analyzer Agilent XFe96 Instrument
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 mitochondrial stress test Kit
Swing-bucket rotor Eppendorf A-4-62 Rotor
Vactrap 2 Vacum Trap Fox Lifesciences 3052101-FLS Instrument
Wave Software Application
XF 1.0 M Glucose Solution Agilent 103577-100 Reagent
XF 100 mM Pyruvate Solution Agilent 103578-100 Reagent
XF 200 mM Glutamine Solution Agilent 103579-100 Reagent
XF DMEM medium Agilent 103575-100 Reagent
XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Material
Xylazine (AnaSed Injection) DAILYMED NDC 59399-110-20 Anesthetic

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免疫学与感染，第196期，
实时测量中性粒细胞的线粒体生物能量特征
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Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z.… More

Pulikkot, S., Zhao, M., Fan, Z. Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils. J. Vis. Exp. (196), e64971, doi:10.3791/64971 (2023).

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