Summary
代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。
Abstract
好中球は防御の最前線であり、ヒトで最も豊富な白血球です。これらのエフェクター細胞は、食作用や酸化バーストなどの機能を果たし、微生物クリアランスのための好中球細胞外トラップ(NET)を作成します。好中球の代謝活動に関する新しい洞察は、好中球が主に解糖に依存しているという初期の概念に挑戦します。代謝活性の正確な測定は、トリカルボン酸(TCA)サイクル(クレブス回路としても知られています)、酸化的リン酸化(OXPHOS)、ペントースリン酸経路(PPP)、および生理学的条件および疾患状態における脂肪酸酸化(FAO)を含む好中球のさまざまな代謝要件を明らかにすることができます。本論文では、代謝細胞外フラックス分析装置による代謝フラックス解析を用いて、マウス骨髄由来好中球、ヒト血液由来好中球、好中球様HL60細胞株のミトコンドリア呼吸の指標として酸素消費率(OCR)を測定するための段階的なプロトコルと前提条件について説明します。この方法は、正常および疾患条件下での好中球のミトコンドリア機能を定量するために使用できます。
Introduction
ミトコンドリアは、酸化的リン酸化(OXPHOS)によってアデノシン三リン酸(ATP)を生成する細胞の生体エネルギー学において主要な役割を果たしています。これに加えて、ミトコンドリアの役割は、活性酸素種の生成と解毒、細胞質およびミトコンドリアマトリックスカルシウム調節、細胞合成、異化、および細胞内の代謝産物の輸送にまで及びます1。ミトコンドリア呼吸は、その機能不全が心血管疾患3や加齢黄斑変性症4、パーキンソン病およびアルツハイマー病5、シャルコー・マリー・トゥース病2A(CMT2A)6などの多種多様な神経変性疾患を含む代謝障害2を引き起こす可能性があるため、すべての細胞に不可欠です。
好中球に関する電子顕微鏡的研究により、ミトコンドリアは比較的少なく7、ミトコンドリアの呼吸速度は非常に低いため、エネルギー産生を解糖に大きく依存していることが明らかになりました8。ただし、ミトコンドリアは、走化性9やアポトーシス10、11、12などの好中球機能にとって重要です。以前の研究では、膜電位の高いヒト好中球における複雑なミトコンドリアネットワークが明らかになりました。ミトコンドリア膜電位損失は、好中球アポトーシスの早期指標である10。ミトコンドリア脱共役カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)による処理は、ミトコンドリアの形態の変化とともに、走化性の有意な阻害を示しました9,10。
好中球の主要なエネルギー源は解糖系であるが、ミトコンドリアは、プリン作動性シグナル伝達の第1段階に燃料を供給することによって好中球活性化を開始するATPを提供し、これはCa2+シグナル伝達を高め、ミトコンドリアATP産生を増幅し、好中球機能応答を開始する13。ミトコンドリア呼吸鎖の機能不全は、有毒な活性酸素種(ROS)の過剰産生をもたらし、病原性損傷につながります14,15,16。好中球細胞外トラップ(NET)を形成するプロセスであるNETosisは、好中球の重要な特性であり、病原体と戦うのに役立ち17、癌、血栓症、自己免疫疾患などの多くの病理学的状態に寄与します18。ミトコンドリア由来のROSはNETosis19に寄与し、ミトコンドリアDNAはNETs18の構成要素となり得、そして変化したミトコンドリア恒常性はNETosis20,21,22,23,24を損なう。さらに、正常な分化または成熟の間に、好中球代謝リプログラミングは解糖活性を制限することによって逆転し、それらはミトコンドリア呼吸に従事し、細胞内脂質を動員します25,26。
代謝細胞外フラックス分析装置は、生細胞のミトコンドリア呼吸と解糖を継続的に監視および定量することができます。この分析装置は、96ウェルプレートフォーマットのセンサーカートリッジと2つの蛍光色素を使用して、酸素(O2)濃度とpH変化を定量します。センサーカートリッジは、アッセイ中に細胞単層の上にあり、~200 nmの高さのマイクロチャンバーを形成します。分析器内の光ファイバー束は、蛍光色素を励起し、蛍光強度の変化を検出するために使用されます。O2 濃度とpHのリアルタイム変化が自動的に計算され、酸素消費速度(OCR)と細胞外酸性化速度(ECAR)として表示されます。センサーカートリッジには4つのポートがあり、アッセイ測定中に各ウェルに最大4つの化合物をロードできます。このプロトコルは、代謝細胞外フラックスアナライザーを使用して、マウスおよびヒト好中球、ならびに好中球様HL60細胞のミトコンドリア呼吸を定量化することに焦点を当てています。
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Protocol
ヘパリン処理全血サンプルは、ヘルシンキ宣言に従ってUConn Healthの治験審査委員会によって承認されたように、インフォームドコンセントを取得した後、健康なヒトドナーから取得されました。すべての動物実験は、UConn Health施設動物管理および使用委員会(IACUC)のガイドラインに従い、げっ歯類の使用の承認は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている基準に従って、UConn Health IACUCから取得されました。この研究では、6週齢の雄C57BL / 6マウスを使用しました。
1. 代謝細胞外フラックスアッセイ用の96ウェルプレートの調製
- センサーカートリッジは、代謝細胞外フラックスアッセイ用に特別に設計された96ウェルプレートの上にパッケージされています。カートリッジを慎重に持ち上げて水和し、200 μL/ウェルの校正培地を下になるプレートの各ウェルに入れます。キャリブラント付きのプレート上にカートリッジを置き、非CO2、加湿、37°Cインキュベーター内で一晩水和する。
- 細胞の種類に応じて、培養プレートに特定のコーティングを使用して細胞の接着を確保します。ヒト好中球-未分化および分化したHL60細胞の場合、5 μLの5 μg/mL精製マウス抗ヒトCD18抗体(クローンTS1/18)50 μLを含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で96ウェルプレートを4°Cで一晩コーティングします。マウス好中球の場合は、96 ウェルプレートに25 μLの22.4 μg/mL Cell TakをpH 8.0、0.1 M NaHCO3 中、室温(RT)で20分間コーティングします。
- プレートを200 μLの滅菌PBSで2回洗浄します。
- 播種中に細胞培養プレート内のバックグラウンド補正のために、細胞培養プレート(細胞なし)のコーナーウェル(A1、A12、H1、およびH12)に完全な培地を追加します。
注意: コーティングおよびキャリブレーション中の蒸発は、キャリブレーションメディアの量と正規化に影響を与える可能性があります。滅菌水濡れティッシュの入ったトレイまたはチャンバーを使用し、蒸発を防ぐためにその上にキャリブラントを付けたプレートを置きます。
2.細胞の調製と播種
- アッセイ培地の調製
- 1 mM ピルビン酸、10 mM グルコース、および 2 mM グルタミンをダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) に添加してアッセイ培地を調製します。
- 骨髄からのマウス好中球の単離
- 製造元の指示に従って、マウス好中球濃縮キットを使用して骨髄からマウス好中球を分離します。
- ケタミン(125 mg / kg)とキシラジン(12.5 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけ、次に頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
- 前述のように、大腿骨と脛骨を収穫します27。簡単に言うと、筋肉で脚を露出させるために皮膚をカットします。股関節を切断して、脚を体から取り外します。次に、筋肉を取り除き、大腿骨と脛骨を収集します。
- 大腿骨と脛骨の小さい方の端を切ります。切断端を下にして、底部に2つの25 Gシリンジニードルパンチ穴がある0.5 mL遠沈管に入れ、0.5 mLチューブを1.5 mL遠沈管に入れます(図1A)。骨髄細胞の乾燥を防ぐために、50 μLのPBSを0.5 mLチューブに加えます。
- RTで5,900 × g で15秒間遠心分離し、1.5 mLチューブの底で骨髄を採取します。骨髄細胞を1 mLのDMEMで再懸濁します。キットからラット血清50 μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、細胞懸濁液を5 mLポリスチレン培養試験管に移します。
- マウス好中球濃縮キットから50 μLの濃縮カクテルを加え、RTで15分間インキュベートします。 RTで300 × g で5分間遠心分離します。
- 細胞を1 mLのDMEMで再懸濁し、キットから50 μLのビオチン選択カクテルを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで15分間インキュベートします。
- キットから150 μLのボルテックス磁性粒子を添加し、ピペッティングで穏やかに混合し、RTで10分間インキュベートします。
- DMEMを~1.3 mL加え、ピペッティングで穏やかに混合し、チューブを磁石に3分間入れ、精製マウス好中球を含む上清を、元のチューブを磁石と一緒に反転させて、新しい5 mLポリスチレン培養試験管に移します。
- RTで300 × g で5分間遠心分離します。真空吸引により上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁する。
- 血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。
- 調製した96ウェルプレートにアッセイ培地、マウス好中球懸濁液(2 × 10 5細胞)の播種180 μLを加えて細胞密度を1.1 ×10 6 cells/mLに調整し(ステップ1.2-1.4)、プレートを300 × gでRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。
- プレートを非CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。
注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。マウス好中球単離の純度は、このプロトコルによって69.9%〜88.7%である。マウス骨髄から好中球を単離するための他の方法、例えば密度勾配遠心分離28がある。好中球に発現しない抗原に対するモノクローナル抗体を使用した負の磁気選択に基づく、他のベンダーからの代替好中球分離キットもあります。
- 末梢血からのヒト好中球の単離
- 8 mLの多糖類溶液を15 mLの遠沈管に加え、混合せずに多糖類溶液の上に4 mLの末梢血を重ねます。
- 550 × g 、20°Cで30分間遠心分離します。ローターを1で減速させます。
注:好中球分離時間はドナーによって異なる場合があります。それは最低30分であり、好中球分離が失敗した場合はさらに10〜20分かかる場合があります。 - 図1Bに示すように、遠心分離後の血漿/血小板および単核球の分離を観察します。1 mLピペットを使用して、下部の曇ったバンド(好中球)を乱さずに、上部の上部の黄色の液体(血漿および血小板)と上部の曇ったバンド(単核球)を慎重に取り除きます。
- 下の白濁バンドと~3-4 mLの透明な液体を、10 mLのPBSを含む新しい15 mLの遠沈管に集めます。
- 400 × g 、20°Cで10分間遠心分離し、真空吸引により上清を除去します。
- 細胞を5 mLのPBSで再懸濁し、300 × g 、20°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を除去した後、細胞を1 mLのアッセイ培地で再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して手動で細胞をカウントします。
注:血液中の赤血球にはミトコンドリアがないため、赤血球汚染はミトコンドリアストレステストアッセイに影響を与えず、好中球の活性化/プライミングを防ぎます29,30。赤血球は、正確な好中球濃度を得るために、細胞計数中に溶解する必要があります。10 μLの細胞懸濁液を891 μLの脱イオン水に10〜30秒間加えて赤血球を溶解し、次に99 μLの10x PBSを加えて浸透圧のバランスを取り、好中球の溶解を回避します。 - アッセイ培地を添加して細胞密度を2.2 ×10 6 cells/mLに調整し、調製した96ウェルプレートに1ウェルあたり180 μLのヒト好中球(~4 ×10 5)を播種し、プレートを300 × g でRTで3分間、ブレーキをかけずに遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。
- プレートを非-CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。
注:好中球の純度は、潜在的なバイアスであるため、アッセイにとって重要です。ヒト好中球単離の純度は86.6%〜96.8%である。ヒト血液から好中球を単離するための密度勾配遠心分離法には、パーコール単離やフィコール単離とデキストラン沈降の組み合わせなどがあります31。
- HL60細胞培養と好中球指向性分化
- HL60細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)、100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および250 ng/mLアムホテリシンBを含むロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地で37°Cおよび5%CO2で維持します。
- 好中球指向性分化のために、HL60細胞(浮遊細胞)をT25フラスコ中で1 ×10 5細胞/mLの密度で、10%FBS、100 μg/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、250 ng/mLアムホテリシンB、および1.3%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むRPMI-1640培地で37°Cおよび5%CO2 で6日間維持します。
- アッセイ当日、血球計算盤を用いて手動で細胞を計数し、分化または未分化HL60細胞をRTで300 × g で5分間遠心分離し、DMEMで1回洗浄し、アッセイ培地で細胞を再懸濁して、1.39 ×10 6 細胞/mLの細胞密度を得た。
- ウェルあたり180 μLの分化または未分化HL60細胞(~2.5 × 105)を調製した96ウェルプレートにシードし、プレートを300 × g でRTで3分間、ブレーキなしで遠心分離して、プレート底部の細胞が適切に接着するようにします。
- プレートを非CO2中でインキュベートし、加湿し、37°Cインキュベーター中で1時間、アッセイ培地で細胞を予備平衡化した。
注:次のステップの前に、顕微鏡を使用して細胞の完全な接着を確認してください。
図1:骨髄細胞と好中球の単離の模式図。 (A)マウスから骨髄細胞を採取し、(B)ヒト血液から好中球を単離する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 細胞の種類 | ウェルあたりの細胞数 | 化合物/試薬 | 作業溶液濃度 | ポートへの注入量 | ウェル内の最終濃縮 |
| マウス好中球 | 2 × 105 | オリゴマイシン | 25 μM | 20 μL | 2.5 μM |
| ティッカー | 7.5ミクロン | 17.6 μL | 0.61 μM | ||
| ロテノンアンチマイシンA混合物 | 10ミクロン | 24 μL | 1ミクロン | ||
| ヒト好中球 | 4 × 105 | オリゴマイシン | 10ミクロン | 20 μL | 1ミクロン |
| ティッカー | 12.5 μM | 22 μL | 1.25 μM | ||
| ロテノンアンチマイシンA混合物 | 10ミクロン | 24 μL | 1ミクロン | ||
| 未分化または分化したHL60細胞 | 2.5 × 105 | オリゴマイシン | 25 μM | 20 μL | 2.5 μM |
| ティッカー | 15 μM | 22 μL | 1.5 μM | ||
| ロテノンアンチマイシンA混合物 | 10ミクロン | 24 μL | 1ミクロン |
表1:ミトコンドリアストレス試験の細胞数と試薬濃度。
3.ミトコンドリアストレステストキットでの化合物の調製
- ミトコンドリアストレステストキットを開き、試薬を準備します。
注:オリゴマイシン、カルボニルシアニド p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、およびロテノン/抗マイシンのウェル内のさまざまな作業溶液濃度、ウェルへの注入量、およびマウス好中球、ヒト好中球、およびHL60細胞に使用される混合物を 表1に示します。- オリゴマイシンを630 μLのアッセイ培地で再構成してオリゴマイシン原液を調製し、100 μMの原液を得た。
注:同じ日に原液を使用することをお勧めします。- 630 μLのストック溶液と1,890 μLのアッセイ培地を混合して、マウス好中球およびHL60細胞アッセイ用のオリゴマイシン作業溶液を調製し、25 μMの作業溶液を得ます。
- 300 μLのストック溶液と2,700 μLのアッセイ培地を混合してヒト好中球アッセイ用のオリゴマイシン作業溶液を調製し、10 μMの作業溶液を得ます。
注:オリゴマイシンがFo/F1 ATPアーゼ(ATPシンターゼ)のFoベースプレートサブユニットに結合すると、ミトコンドリアへのプロトンの再侵入が妨げられ、ATP合成が阻害されます32。これにより、電子伝達系とOCRを通る電子の流れが大幅に減少します。しかし、電子の流れは、ミトコンドリア内膜33を横切るプロトンリークのために完全には止まらない。
- 720 μLのアッセイ培地でFCCPを再構成してFCCPストック溶液を調製し、100 μMストック溶液を得ます。
- 300 μLのストック溶液と3,700 μLのアッセイ培地を混合してマウス好中球アッセイ用の作業溶液を調製し、7.5 μMの作業溶液を得ます。
- 375 μLのストック溶液と2,625 μLのアッセイ培地を混合してヒト好中球アッセイ用の作業溶液を調製し、12.5 μMの作業溶液を得ます。
- 720 μLのストック溶液と4,080 μLのアッセイ培地を混合してHL60細胞アッセイ用の作業溶液を調製し、15 μMの作業溶液を得ます。
注:FCCPを追加すると、ミトコンドリアがOXPHOSを使用する最大容量が明らかになります。それは、脂溶性であり、ミトコンドリアに透過性の弱酸は膜貫通電位の消散をもたらす。ミトコンドリア内膜を横切ってプロトン勾配を排出し、Fo/F1 ATPシンターゼからプロトンフラックスを迂回させると、ミトコンドリアの脱共役が起こります。この脱共役効果は、プロトン勾配34を維持するためにミトコンドリアの酸素消費量を急激に増加させる。
- ロテノン/抗マイシンA混合物を540 μLのアッセイ培地で再構成してロテノン/抗マイシンAストック溶液を調製し、50 μMストック溶液を得ます。
- 540 μLのストック溶液と2,160 μLのアッセイ培地を混合して、すべてのアッセイに対応するロテノン/抗マイシンA作業溶液を調製し、10 μMの作業溶液を得ます。
注:ロテノンは複合体Iの鉄硫黄中心からユビキノンへの電子移動を阻害することによって錯体Iをブロックし、抗マイシンAは電子伝達鎖の複合体IIIをブロックし、ATP35の限られた合成でOXPHOSを遮断します。これにより、これは非ミトコンドリア呼吸を明らかにする36,37。
- 540 μLのストック溶液と2,160 μLのアッセイ培地を混合して、すべてのアッセイに対応するロテノン/抗マイシンA作業溶液を調製し、10 μMの作業溶液を得ます。
- オリゴマイシンを630 μLのアッセイ培地で再構成してオリゴマイシン原液を調製し、100 μMの原液を得た。
- カートリッジに試薬をロードします。調製したオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物を、注射用カートリッジのA、B、およびCポートにそれぞれロードします(図2)。カートリッジと一緒に利用可能なテンプレートインサートを使用して、ポートへの試薬のロードを容易にします。未使用のポートに20 μLのアッセイ培地を充填します。
- マウス好中球アッセイでは、20 μLのオリゴマイシン(25 μM、96ウェルプレートの各ウェルには最初に180 μLのアッセイ培地があり、したがって最終濃度は2.5 μM)をAポートにロードします。17.6 μL の FCCP (7.5 μM、最終濃度: ~0.61 μM) を B ポートにロードします。24 μLのロテノン/抗マイシンA混合物(10 μM、最終濃度:~1 μM)をCポートにロードします。
- ヒト好中球アッセイでは、20 μLのオリゴマイシン(10 μM、96ウェルプレートの各ウェルには最初に180 μLのアッセイ培地があり、したがって最終濃度は1 μM)をAポートにロードします。22 μL の FCCP (12.5 μM、最終濃度: ~1.25 μM) を B ポートにロードします。24 μLのロテノン/抗マイシンA混合物(10 μM、最終濃度:~1 μM)をCポートにロードします。
- HL60およびdHL60細胞アッセイでは、20 μLのオリゴマイシン(25 μM、96ウェルプレートの各ウェルには最初に180 μLのアッセイ培地があり、したがって最終濃度は2.5 μM)をAポートにロードします。22 μL の FCCP (15 μM、最終濃度: ~1.5 μM) を B ポートにロードします。24 μLのロテノン/抗マイシンA混合物(10 μM、最終濃度:~1 μM)をCポートにロードします。
注意: ポートの下部に触れずに、ポート内の薬液をピペットで囲みます。液体は毛細管力によって保持されるため、漏れを防ぐために、ロード後にプレートを軽くたたかないでください。培養プレートのバックグラウンドウェルとセンサーカートリッジのポートには、アッセイ培地またはサンプルウェルと同じ試薬ローディングポートを装填して、バックグラウンド値に対する試薬の効果を正規化します。エアトラップを避けるために、カートリッジをキャリブラントを含むユーティリティプレートから持ち上げずに、試薬をそれぞれのポートに追加する必要があります。図2に示すように、すべてのウェルの最後のポートに培地を充填します。
図2:ミトコンドリアストレスアッセイカートリッジとその注入口。 画像は、ミトコンドリアストレスアッセイのカートリッジと、ポートへの個々の薬物/培地の負荷を示す拡大画像を示しています。略称:FCCP =カルボニルシアニド p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.ミトコンドリアストレスアッセイの実行
- 代謝分析装置とコンピューターの電源を入れ、 Wave ソフトウェアを開き、[ ヒーターオン ]をクリックして、少なくとも37時間前に5°Cでマシンをセットアップします。温度に達すると、ウェーブソフトウェアの左下隅に 準備完了が表示されます。
- ソフトウェアでミトコンドリアストレスアッセイキットのテンプレートを開きます。上部のメニューバーの [グループ定義 ]をクリックします。
- 注射戦略、前処理、アッセイ培地、(生体材料使用)細胞タイプなど、左側の各定義を個別に事前設定します。
- 左側の注射 戦略 をクリックし、[ 追加 ]をクリックして、注射条件にヒト好中球 /マウス好中球/ HL60という名前を付けます。 それぞれをクリックしてポートA〜D を選択し、[ 化合物の追加 ]をクリックして、 オリゴマイシン/ FCCP /ロテノンアンチマイシンA をそれぞれの濃度で入力します(表1)。
- 左側の前処理をクリックし、[追加]をクリックして、CD18とCell Takに別々に名前を付けます。左側で使用されている生体材料をクリックし、[追加]をクリックして、ヒト好中球、マウス好中球、および播種密度のあるHL60 / dHL60と名前を付けます。
- グループを定義するには、[グループの追加]をクリックし(例:ヒト好中球アッセイの場合)、その基礎となる定義をクリックします(例:表1-ヒト好中球による注射戦略、CD18としての前処理、およびヒト好中球としての細胞タイプ)。
- トップメニューのプレートマップをクリックして、すべてのグループを観察し、左側に定義、右側に プレートマップ を表示します。ドラッグアンドドロップして、4つのコーナーウェルを 背景 (デフォルト)として維持しながら、各ウェルをグループに追加します。
- トップメニューの[プロトコル]をクリックして プロトコル を設定し、 混合 時間を3分、 休止 時間を0分、 測定 を7分に設定して、ベースライン、オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、および抗マイシンA混合物の3サイクルを定義します。
- Run Assayページに移動し、参照用にプロジェクトの概要情報を入力して、Run Start をクリックします。
- アッセイの完了後にすべての結果が保存されるように、ファイルを保存する場所を指定します。
- アッセイの自動ロード後、トレイが開くのを待って、センサーカートリッジとプレートに200 μLのキャリブラントを入れます(ステップ1.1)。カートリッジのバーコードの方向を右に向けて設定します。 [準備完了]をクリックしてキャリブレーションを実行します。これには約20分かかります。
- キャリブレーション後、[ トレイを開く]をクリックします。プレートをセルシードプレートと交換し、 ロードセルプレート をクリックしてアッセイを続行します。
- アッセイが完了すると、データは自動的に保存されます。 [結果の表示 ]をクリックして、スプレッドシートまたはその他の分析ソフトウェアファイルとしてエクスポートします。
- データをグラフ化して分析します(図3 および 図4)。
- 基礎ミトコンドリア呼吸、プロトンリーク関連呼吸、ATP関連呼吸、最大呼吸、予備呼吸容量、および非ミトコンドリア呼吸を含む呼吸パラメータを計算します(図4A)38,39,40,41。
- オリゴマイシンを注入する前にOCRからロテノン/抗マイシンA混合物を添加した後に測定されたOCR値を差し引くことにより、基礎ミトコンドリア呼吸を計算します(図4A、a)。
- オリゴマイシン注入後に測定されたOCR値からロテノン/抗マイシンA混合物注入後のOCR値を差し引くことにより、プロトンリークリンク呼吸を計算します(図4A、b)。
- 基底ミトコンドリア呼吸とプロトンリーク関連呼吸の差を計算することにより、ATP連鎖呼吸を推定します。オリゴマイシン注入前の最初のOCR値からオリゴマイシン注入後に測定された最初のOCR値を差し引く(図4A、c)。
- 最大呼吸は、FCCPを添加した後に細胞が達成できる最大呼吸数です。FCCP注射後に測定されたOCR値からロテノン/抗マイシンA混合物注射後のOCR値を差し引くことによってこれを計算します(図4A、d)。
- 予備呼吸能力とは、OXPHOSを介してより高いエネルギー需要を満たすためのセルの容量を指します。最大呼吸と基底ミトコンドリア呼吸の差を見つけることによってこれを計算します(図4A、e)。
- 非ミトコンドリア呼吸は、非ミトコンドリア源によって消費される酸素の量です。ロテノン/抗マイシンA混合物を添加した後にこれを測定します(図4A、f)。
- スチューデントの t検定を使用して統計解析を実行し、未分化および分化したHL60細胞の異なる呼吸パラメータを比較します。 p < 0.05 は統計的に有意であると考えてください。
注:OCRまたはECAR値がゼロ未満の反復は、サンプル調製、化合物注入、または測定のエラーと見なされます。それらは将来の分析から除外されます。
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Representative Results
マウス好中球(図3A)、ヒト好中球(図3B)、および未分化および分化したHL60細胞(図3C)の混合物であるオリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/抗マイシンA混合物に応答するミトコンドリア呼吸の変化を示す代表的なOCRダイナミクスが示されています。すべての細胞において、オリゴマイシン処理は、ATPシンターゼのプロトンチャネルを阻害することによってOCR値を減少させる。FCCP治療は、電子の流れと酸素消費量を増やして膜電位を維持し、最大の呼吸を達成することにより、OCR値を回復させます。ロテノン/抗マイシンA混合処理は、電子伝達鎖の複合体IおよびIIIをブロックすることにより、ミトコンドリア呼吸を排除します。
好中球指向性分化後、HL60細胞はミトコンドリア呼吸の低下を示すことを観察しました(図3C)。上記の異なる呼吸パラメータを定量した後、分化したHL60細胞は、有意に低い基底ミトコンドリア(図4B)呼吸、プロトンリーク連鎖呼吸(図4C)、ATP連鎖呼吸(図4D)、および非ミトコンドリア呼吸(図4G)を示した。分化したHL60細胞における最大呼吸(図4E)は増加したが、有意ではなかった。予備呼吸容量(図4F)は大幅に増加しました。
図3:ミトコンドリアストレステストアッセイ中のOCRの動的変化を示す代表的なグラフ。 (a)マウス好中球のn=3反復からSDの平均±。(B)ヒト好中球のn=3反復からSDの平均±。(c)未分化(HL60、青色)および分化型(dHL60、赤色)HL60細胞のn=3複製から平均±SDである。略語:OCR =酸素消費率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:OCRダイナミクスから得られた呼吸パラメータ。 (a)(a)基底ミトコンドリア呼吸、(b)プロトンリーク呼吸、(c)ATP結合呼吸、(d)最大呼吸、(e)予備呼吸容量、および(f)非ミトコンドリア呼吸の計算方法を示す模式図。(B-G)n = 3の平均±SDである。(B)基底ミトコンドリア呼吸、(C)プロトンリーク連鎖呼吸、(D)ATP連鎖呼吸、(E)最大呼吸、(F)予備呼吸能力、および(G)未分化(HL60)および分化(dHL60)HL60細胞の非ミトコンドリア呼吸。ns (有意でない) p > 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001 対応のないスチューデントの t 検定による。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
代謝細胞外フラックス分析装置を使用して好中球のミトコンドリア呼吸を測定する標準的な手順は、細胞数、細胞増殖、生存率などの多くの要因によって制限されます。各化合物濃度は、このアッセイにおける細胞の種類と供給源によって異なります。オリゴマイシンとロテノン/抗マイシンAは、ほとんどの細胞タイプの中で主に同様の濃度で使用されます。ただし、FCCPによって誘発される最大呼吸数は細胞によって異なるため、濃度を最適化するにはFCCPの慎重な滴定が必要です42。また、最適化中にFCCPの順次追加を実行することをお勧めします。代謝細胞外フラックス分析装置は、空気圧43下でプレート内に薬物を注入するが、いくつかのミトコンドリア複合体阻害剤に対する細胞膜の不透過性は、単離されたミトコンドリア44と比較して、無傷の細胞の場合のそれらの使用を制限する。ポートへの積み込みは、相互汚染を避けるために慎重に実行する必要があります。培地中の基質濃度(グルコース、ピルビン酸、グルタミンなど)もミトコンドリア活性に影響を与える可能性があり、最適化する必要があります。
薬物濃度とは別に、細胞播種密度も良好なOCR値を得る上で重要なパラメータです。最適な細胞播種密度は細胞の種類によって異なるため、測定の有効性をテストするために予備実験で異なる播種密度を使用することをお勧めします。グループ間のばらつきを減らすには正確な細胞カウントが必須であり、プレートの底部に細胞が付着していることを確認するために、培養プレートに適したコーティング材料をテストする必要があります。培養プレートをRTで300 × g の速度で5分間、ブレーキなしで遠心分離すると、細胞の迅速な沈降と付着に役立ちます。細胞を播種する前に、コーティング材料を吸引した後に十分な洗浄が望ましい。
細胞の播種は、エッジ効果を回避し、細胞45の均一な広がりを確実にするために、下端で細胞をピペッティングすることによって行われる。細胞を37°Cに維持し、エッジ効果を最小限に抑えるために少なくとも1時間休ませます46。ガス混合物中の酸素レベルは実験や細胞の種類によって異なり、組織や細胞の種類によって低酸素値が異なる可能性があるため、測定前に非CO2 インキュベーターで細胞培養プレートを脱気することをお勧めします47。アッセイ培地は、アッセイ当日に調製する必要があります(アッセイには70 mLの培地で十分です)。細胞数によるデータの正規化は、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2,5−テトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ、ヘキストを用いた核断片化アッセイ、細胞計数アッセイ、またはタンパク質もしくはDNA定量アッセイ48を用いて行うことができる。異なるミトコンドリア阻害剤が使用されるため、細胞の生存率を結果の要因として考慮する必要があります。アッセイの最後に細胞生存率試験を実施して、使用する薬物の細胞毒性効果の可能性を除外することが推奨される。
OCRに加えて、代謝細胞外フラックス分析装置は、解糖系の定量に一般的に使用されるECORも測定することができる49。しかしながら、ミトコンドリアストレスアッセイにおいて、ECAR値は、ミトコンドリア呼吸における解糖およびトリカルボン酸回路(CO2を介して)の両方によって生成される酸性度を反映する。解糖を測定するには、解糖ストレステストキットをお勧めします。最初に、化合物を添加する前のOCRは、好中球の基礎呼吸を示す。基底呼吸は、ミトコンドリア内膜組成に応じて、ミトコンドリアマトリックスから内ミトコンドリア膜を通過する膜間空間にプロトンが輸送されるために起こる。基礎呼吸は、休止細胞の代謝率の~30%-50%を占めます1,50。
アッセイの基礎呼吸に基づく計算は、細胞群および細胞タイプ間のばらつきを低減することができる。データの正規化は、薬物を添加しない基礎呼吸と比較することによって達成されており、アッセイの細胞数とベンチエラーに応じて変化を正規化することができます。予備呼吸能力は、最大OCRと基礎OCRの差であり、細胞が生体エネルギー限界にどれだけ近づいているかを示す指標です。最大呼吸の減少は、複合体IおよびIIから錯体IIIおよびIV、そして最終的には分子状酸素への呼吸鎖における電子伝達の減少を示す。図 4A は、アッセイの計算の概略図を示す。
予備呼吸能力の増加は、細胞がさらなるエネルギー需要によく反応できることを示しており、好中球の場合、好中球は活性化時に呼吸バーストに終わるため、前提条件です51,52,53,54,55。ただし、ミトコンドリアストレスアッセイのECARデータは、好中球の解糖速度を表すことはできません。データに対して特定の評価を行うことができます。例えば、ロテノンおよび抗マイシンAの添加後のマウスおよびヒト好中球の両方におけるECAR値の減少は、これらの複合体IおよびIII阻害剤の添加前のECAR値が主にTCAサイクルからのCO2産生に起因することを意味する。細胞株の場合、ECOR値はロテノンおよび抗マイシンAの添加後に一定であり、添加前のECAR値は解糖によるものであることが示唆される45。
ミトコンドリア障害は、欠陥のあるOXPHOSを特徴とする臨床状態です。好中球の場合、細胞増殖がなく、ミトコンドリア数が少なく、老化が早いため、OCRの測定は低くなります56。神経変性疾患では、好中球はアミロイドβ(Aβ)沈着領域に血管を放出します。Aβ42ペプチドは、インテグリン活性化および急速な好中球接着を誘発する57。アポトーシスの間、好中球ミトコンドリアはアポトーシス促進タンパク質を細胞質ゾル58に放出する。また、CCCP9で治療すると好中球の移動速度が低下し、走化性が消失することも示されています。これは、好中球機能におけるミトコンドリアとミトコンドリア呼吸の潜在的な役割を示唆しています。アルツハイマー病5、統合失調症59、慢性呼吸器疾患60、双極性障害、敗血症、糖尿病患者、喘息、肺高血圧症、鎌状赤血球症など、多くの病理学的条件下での多様な細胞型におけるミトコンドリア活性が報告されており、病因に関連しています。抗酸化物質(CoQ10、イデベノン、α-リポ酸、ビタミンCおよびEなど)および/または補因子(リボフラビン、チアミンなど)の使用による呼吸鎖フラックスの改善、L-カルニチンなどのミトコンドリア基質の投与などの新しい治療法は、ミトコンドリア障害の治療に使用されています。ただし、これらの治療法は標準化されておらず、効果的ではない可能性があります61。好中球などの疾患関連細胞のミトコンドリア機能を定量するための代謝細胞外フラックス分析装置の使用などの非侵襲的な標準化された方法論は、治療における診断バイオマーカーとして役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
UConn Healthの免疫学部のAnthony T. Vella博士とFederica Aglianoin博士の代謝細胞外フラックス分析装置の使用に関するトレーニング、およびUConn Healthの免疫学部のLynn Puddington博士の機器のサポートに感謝します。UConn医学部のジュネーブ・ハーギス博士が、この原稿の科学的執筆と編集に協力してくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所、国立心臓肺血液研究所(R01HL145454)、国立総合医学研究所(R35GM147713およびP20GM139763)、UConn Healthのスタートアップファンド、および米国免疫学会のキャリア再エントリーフェローシップからの助成金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 °C non-CO2 incubator | Precision | Economy Model 2EG | Instrument |
| Biorender | Software Application | ||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | Instrument |
| Corning Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 102416-100 | Reagent |
| EasySep Magnet | STEMCELL | 18000 | Magnet |
| EasySepMouse Neutrophil Enrichment kit | STEMCELL | 19762A | Reagents |
| Graphpad Prism 9 | Software Application | ||
| Human Serum Albumin Solution (25%) | GeminiBio | 800-120 | Reagents |
| Ketamine (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | Anesthetic |
| PBS | Cytiva | SH30256.01 | Reagents |
| Plate buckets | Eppendorf | UL155 | Accessory |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (previous 1114683) | polysaccharide solution |
| Purified mouse anti-human CD18 antibody | Biolegend | 302102 | Clone TS1/18 |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11-875-093 | Reagents |
| Seahorse metabolic extracellular flux analyzer | Agilent | XFe96 | Instrument |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | mitochondrial stress test Kit |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 | Rotor |
| Vactrap 2 Vacum Trap | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | Instrument |
| Wave | Software Application | ||
| XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent | 103577-100 | Reagent |
| XF 100 mM Pyruvate Solution | Agilent | 103578-100 | Reagent |
| XF 200 mM Glutamine Solution | Agilent | 103579-100 | Reagent |
| XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | Reagent |
| XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Material |
| Xylazine (AnaSed Injection) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | Anesthetic |
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