Summary
본 프로토콜은 동맥 혈전증을 유도하기 위해 FeCl3 매개 손상을 사용하는 방법, 및 전자 현미경 분석을 위해 혈전증의 다양한 단계에서 동맥 손상 샘플을 수집하고 준비하는 방법을 설명합니다.
Abstract
심혈관 질환은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 비정상적인 혈전증은 당뇨병 및 비만과 같은 전신 질환과 죽상동맥경화증, 암 및 자가면역 질환과 같은 만성 염증성 질환의 일반적인 특징입니다. 혈관 손상 시 일반적으로 응고계, 혈소판 및 내피가 조율된 방식으로 작용하여 손상 부위에 혈전을 형성하여 출혈을 예방합니다. 이 과정의 이상은 과도한 출혈 또는 조절되지 않는 혈전증/불충분한 항혈전 활성으로 이어져 혈관 폐색 및 후유증으로 이어집니다. FeCl3 유도 경동맥 손상 모델은 생체 내에서 혈전증이 어떻게 시작되고 진행되는지 조사하는 데 유용한 도구입니다. 이 모델은 손상 부위의 내피 손상/탈락 및 후속 혈전 형성을 포함합니다. 다양한 정도의 혈관 손상에 대한 반응으로 혈관 손상 및 혈전 형성을 모니터링하기 위해 매우 민감한 정량적 분석을 제공합니다. 일단 최적화되면, 이 표준 기술은 혈전증의 기저에 있는 분자 메커니즘과 성장하는 혈전에서 혈소판의 미세구조적 변화를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 분석은 또한 항혈전제 및 항혈소판제의 효능을 연구하는 데 유용합니다. 이 기사에서는 FeCl3 유도 동맥 혈전증을 시작하고 모니터링하는 방법과 전자 현미경으로 분석할 샘플을 수집하는 방법을 설명합니다.
Introduction
혈전증은 혈관을 부분적으로 또는 완전히 차단하여 혈액의 자연스러운 흐름을 방해하는 혈전의 형성입니다. 이것은 허혈성 심장 질환 및 뇌졸중과 같은 심각하고 치명적인 심혈관 사건으로 이어집니다. 심혈관 질환은 이환율과 사망률의 주요 원인이며 전 세계적으로 4명 중 1명이 사망합니다 1,2,3. 혈전증은 혈관계 기능 장애로 나타나지만 기저 미생물 또는 바이러스 감염, 면역 장애, 악성 종양 또는 대사 상태의 결과일 수 있습니다. 혈액의 흐름은 혈관 내피 세포, 적혈구/백혈구, 혈소판, 응고인자 등 혈관계의 다양한 구성 요소들 간의 복잡한 상호작용에 의해 유지된다4. 혈관 손상 시, 혈소판은 내피하 기질의 접착 단백질과 상호작용하여 과립 내용물을 방출하여 더 많은 혈소판을 모집한다5. 동시에 응고 캐스케이드가 활성화되어 피브린 형성 및 침착을 유발합니다. 궁극적으로, 혈소판과 적혈구가 피브린 메쉬(fibrin mesh) 내에 갇혀있는 혈전이 형성된다 6. 혈전증을 조절하기 위해 항혈소판제 및 항응고제를 사용할 수 있지만 가짜 출혈은 이러한 요법의 주요 관심사로 남아 있으며 이러한 약물의 복용량과 조합을 미세 조정해야 합니다. 따라서, 새로운 항혈전제를 발견하는 것이 여전히 시급하다7.
혈전증은 기계적 손상(혈관 결찰), 열적 손상(레이저 손상) 및 화학적 손상(FeCl3/로즈 벵골 적용)과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 연구됩니다. 혈전증의 성격은 부상의 위치(동맥 대 정맥), 방법 또는 정도에 따라 다릅니다. 이러한 모든 유형 중에서 FeCl3 유발 혈관 손상이 가장 널리 사용되는 방법입니다. 생쥐, 쥐, 토끼, 기니피그 및 개 8,9,10,11,12에 사용되었습니다. 이 방법은 비교적 간단하고 사용하기 쉬우며 주요 매개변수가 표준화되면 다양한 혈관계(예: 동맥[경동맥 및 대퇴골], 정맥[경정맥] 및 세동맥[크레마스터 및 장간막])에서 민감하고 재현 가능합니다(보충 표 1).
이 모델은 또한 혈전 형성의 역학과 형태에 대한 이해를 높이는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 유속 지점에서 혈전증을 멈추고 폐색되기 전에 공정의 중간 단계를 연구할 수 있는 이점을 제공합니다. 혈전증 연구의 최근 발전은 이 모델을 사용하여 혈전용해의 비약리학적 방법13 또는 항혈전 및/또는 섬유소 용해제의 비침습적 전달에 주의를 집중시켰다14,15. 몇몇 연구진은 혈소판막이 이러한 치료제로 코팅될 때, 혈전을 표적으로 하는 열 자극에 의해 약물이 활성화될 수 있음을 보여주었다16. 여기에 설명된 기술은 단일 혈소판 수준에서 결과를 검증하는 것과 같은 연구에 유용할 수 있습니다. 이 원고에서 프로토콜 1은 기본적인 FeCl3 매개 혈관 손상 절차를 설명하는 반면, 프로토콜 2는 전자 현미경에 의한 추가 분석을 위해 혈관 손상 샘플을 수집하고 고정하는 방법을 설명합니다.
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Protocol
여기에서 논의된 모든 실험은 켄터키 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인했습니다.
참고: 수술 기구는 그림 1 과 재료 표에 나와 있습니다. C57BL/6J 마우스, 8-10주령, 수컷/암컷 또는 관련 유전자 조작(Knockout 또는 Knockin) 균주를 사용했습니다.
1. FeCl3 유발 경동맥 손상
- 마우스 마취 유도
- 마우스의 무게를 잰다.
- 0.2g/kg 트리브로모에탄올 용액을 복강내(i.p.) 주사하여 마우스를 마취합니다. 마취액을 주입하기 전에 실온(RT)에 있는지 확인하십시오. 이 용량은 약 1 시간 동안 마우스를 진정시키기에 충분합니다.
- 주사 후 5분 후에 발가락을 꼬집어 발가락 반사를 확인하여 마우스가 진정되었는지 확인합니다. 마우스가 진정되지 않으면 발가락이 당겨집니다. 이 경우 5분 정도 기다렸다가 다시 확인하세요.
- 마우스가 여전히 완전히 진정되지 않으면 초기 용량의 1/4을 투여하고 5 분 동안 기다리십시오.
- 시술 전반에 걸쳐 발가락 핀치를 통해 마우스의 마취면을 주기적으로 모니터링하십시오. 또한 최적의 마취를 유지하기 위해 호흡수와 체온을 모니터링할 수도 있습니다.
- 마우스를 고정시킵니다
- 마우스를 앙와위 자세로 가열 패드(37°C)에 놓고 접착 테이프를 사용하여 사지를 고정합니다.
- 수술용 실(0.1mm)을 사용하여 마우스의 위쪽 앞니를 부드럽게 당겨 경추/목 부위를 확장합니다. 이는 수술 부위를 더 잘 시각화하고 도플러 프로브의 안정성을 높이는 데 중요합니다. 실의 크기는 목을 늘리기 위해 동물의 앞니를 당기는 데만 사용되기 때문에 중요하지 않습니다.
- 베기
- 수술 부위에 70% 에탄올을 뿌리거나 알코올 물티슈로 닦아냅니다.
- 면봉을 사용하여 수술 부위에 소량의 제모 크림을 바릅니다. 1-2분 동안 기다린 다음 젖은 종이 타월이나 티슈를 사용하여 크림을 제거합니다.
알림: 이 단계는 깨끗한 수술 부위에 중요합니다. - 가위와 집게(그림 1B11,1B13)를 사용하여 하악에서 흉골 위 노치까지 정중선을 절개합니다. 영역을 더 잘 시각화하기 위해 피부를 수축시킵니다(그림 2A).
- 경동맥 노출
- 외과 용 겸자와 미세 해부 겸자를 사용하여 겹쳐진 표면 근막을 무디게 해부하고 제거하여 왼쪽 경동맥을 노출시킵니다 (그림 1B12,1B13). 이 단계에서 가위를 사용하지 마십시오.tage 이 부위의 다른 혈관 구조가 손상되지 않도록 하십시오.
- 경동맥을 둘러싼 여분의 조직을 제거하십시오. 이 부위에는 미주 신경과 척추 동맥이 있으므로 주변 조직의 과도한 절개를 피하십시오.
- 경동맥을 수술 및 봉합사 묶는 집게로 해부하여 주변 조직과 분리합니다(그림 1B12,1B15,2C). 동맥이나 주변 혈관 구조에 기계적 손상을 방지하기 위해 동맥을 확장하거나 당기지 마십시오.
- 부상 위치를 표시하기 위해 동맥 아래에 플라스틱 조각을 놓습니다(그림 2D). 수술 현장에서 더 쉽게 볼 수 있도록 컬러 투명 시트를 사용하십시오.
- 유량 프로브의 배치
- 도플러 천음향 흐름 프로브를 식염수(0.9% NaCl indH2O)에 약 10분 동안 수술 전에 놓습니다. 유량을 쉽게 읽을 수 있도록 프로브의 다른 쪽 끝을 유량계의 부착물에 삽입합니다. 유량계를 컴퓨터에 연결합니다.
알림: 수술 사이에 도플러 천음속 유량 프로브는 식염수에 있어야 합니다. 절차 내내 프로브를 촉촉하고 깨끗하게 유지하십시오. - 초음파 도플러 천음속 흐름 프로브를 플라스틱의 상류 동맥 주위에 놓습니다(그림 2D). 프로브의 용기 홀더 영역이 너무 확장되지 않았는지 확인합니다(그림 1C, 빨간색 화살표).
알림: 필요한 경우 거즈 패드(그림 1B1)로 프로브를 지지하여 프로브의 적절한 높이를 달성하여 최적의 판독 위치를 용이하게 합니다. - 이 시점까지 수술 부위가 건조하면 RT 식염수 몇 방울을 추가하여 해당 부위를 촉촉하게 유지하십시오. 유량 프로브 판독값을 모니터링합니다. 최적의 판독값은 동물마다 다르며 0.6-1.2mL/분 사이일 수 있습니다. 덜 안정적이거나 안정적이지 않은 경우 최적의 판독값을 얻기 위해 유량 프로브 위치를 변경하십시오.
참고: 마우스의 목이 너무 길어지지 않았는지, 수술 부위가 깨끗한지 확인하십시오.
- 도플러 천음향 흐름 프로브를 식염수(0.9% NaCl indH2O)에 약 10분 동안 수술 전에 놓습니다. 유량을 쉽게 읽을 수 있도록 프로브의 다른 쪽 끝을 유량계의 부착물에 삽입합니다. 유량계를 컴퓨터에 연결합니다.
- 흐름 기준선 기록
- 프로브를 배치한 후 2분 동안 혈류를 모니터링하여 흐름이 안정적인지 확인합니다. 그런 다음 2분 동안의 흐름을 기준으로 기록합니다(그림 3B). 유량계에 대한 자세한 설명은 Subramaniam et al.17을 참조하십시오.
- 혈류를 기록하려면 WinDAQ 소프트웨어를 시작하십시오. 파일 옵션을 클릭 한 다음 기록을 클릭하십시오. 새 폴더와 파일을 만들고 녹음을 시작합니다. 녹음을 중지하려면 파일 섹션에서 중지 를 클릭하십시오.
참고: WinDAQ 소프트웨어는 출판사에서 무료로 사용할 수 있습니다: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- 부상
- 흐름 기록을 중지합니다. 부상 후 판독값이 일정하게 유지되도록 프로브 위치를 변경하지 않도록 하십시오.
- 물티슈/종이 타월로 해당 부위를 완전히 말리십시오.
알림: 소량의 잔류 액체라도 혈관 손상을 입히는 데 사용되는 FeCl3 용액의 농도를 변경할 수 있습니다. 이는 다양한 결과로 이어지고 재현성에 영향을 미칩니다. 해당 영역이 완전히 건조되면 프로브가 유량을 측정할 수 없습니다. - 플라스틱 계량 보트에 원형 여과지 (직경 1mm, 직경 1mm 이어 펀치로 자른 것)를 넣습니다. 1 μL의 6 % FeCl3 용액 (dH2O로 만든)을 여과지에 첨가한다.
알림: 여과지를 사용하기 직전에 FeCl3 용액을 추가해야 합니다. 종이를 너무 일찍 담그면 FeCl3 용액이 증발하고 부상의 심각성이 바뀔 수 있습니다. - 미세 집게를 사용하여 여과지를 집어 플라스틱으로 표시된 동맥 부분의 프로브 상류에 놓습니다(그림 2D,E). 이 플라스틱은 마커와 스페이서 역할을 합니다. 부상 부위를 표시하고 주변 습한 부위와의 접촉을 피함으로써 FeCl3 의 우발적 인 희석을 방지합니다.
알림: 여과지가 똑바로, 끼이거나 어떤 식으로든 접히지 않았는지 확인하십시오. 동맥에 놓인 후에는 여과지의 위치를 변경하지 마십시오. 그렇게 하면 부상의 정도가 바뀝니다. - 여과지를 놓은 후 타이머를 시작하고 혈류를 기록하십시오. 3분 후 종이를 제거하고 부상 부위에 식염수를 첨가하여FeCl3 를 제거하고 부상 과정을 중지합니다. 또한 해당 부위를 촉촉하게 만듭니다. 이 단계에서 혈류는 기록 된 부상 전과 같이 기준 수준으로 돌아 가야합니다.
- 원래 기록의 10%로 감소하거나 0에 도달할 때까지 흐름을 모니터링하고 기록합니다. 손상 부위에 혈전이 형성되기 시작하면 꾸준히 감소합니다(그림 3C). 이 시간 동안 흐름의 상당한 변동에 유의하십시오.
- 혈전의 안정성을 연구하려면 각각의 유의미하고 일관된 감소 후 혈류의 급격한 증가를 기록하십시오. 이러한 사건은 불안정한 혈전증으로 인한 색전술로 분류됩니다(그림 4D). 유량이 지속적으로 감소한 후 작업자는 실험이 종료될 때 동맥의 손상을 볼 수 있습니다(그림 2F, 파란색 화살표/점선 타원).
- 혈관 폐색 시간은 최소 1분 동안 혈류가 완전히 중단된 것으로 정의됩니다. 폐색 혈전이 형성되는 시간을 기록하며, 판독값이 0이거나 흐름이 크게 감소합니다.
- 30분에 실험을 종료합니다. 모니터링 후 30분 이내에 혈전이 형성되지 않으면 흐름을 기록하고 기록을 중지한 다음 프로브를 제거합니다.
- 70% 에탄올과 브러시로 프로브를 청소하여 잔여 조직/머리카락 또는 부스러기를 제거합니다. 보관 상자에 넣기 전에 프로브를 완전히 건조시키십시오. 장기 보관을 위해 보관 상자에 넣기 전에 프로브를 완전히 건조시키십시오.
- 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시킵니다. 시체를 시체 처리 가방에 넣고 실험실 이름과 날짜가 표시되어 있습니다.
2. FeCl3 유발 손상 후 직렬 블록 표면 주사 전자 현미경(SBF-SEM) 연구를 위한 샘플 수집 및 준비
참고: 제시된 EM 프로토콜은 s에 적합합니다.ampSBF-SEM을 위한 준비. 이 이미징 기술은 혈전에서 혈소판의 3차원 구조를 연구하는 전례 없는 능력을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 샘플이 일련의 순차적 블록 SEM 이미지로 시각화되며, 샘플을 진행하면서 생성됩니다. 이 준비의 요점은 다음과 같습니다 : 1) 샘플은 미리 임베딩 된 중금속으로 염색되어야합니다. 2) 플라스틱 내장 샘플은 SEM 내에 장착하기 위해 적절하게 트리밍되어야 합니다(트리밍된 샘플의 시각적 내용은 그림 6 참조). SEM 내에서는 포매 후 염색이 불가능합니다. EM 분석을 위해 FeCl3 유발 혈관 손상에서 샘플을 수집할 때 수술을 수행하는 동안 다음과 같은 변경이 필요합니다. 제시된 FeCl3 수술 프로토콜의 수정은 모든 형태의 전자 현미경에도 적용할 수 있습니다. 마취 상태와 절개 및 경동맥 노출 단계는 프로토콜 1과 동일합니다.
- 경동맥을 노출시킨 후 두 수술실(크기: 0.1mm) 사이의 영역을 느슨하게 둘러싸서 부상 부위를 표시합니다(그림 5A,B).
- 프로브를 하부 나사산에서 말단의 동맥 아래에 놓습니다(그림 5C).
- 두 나사산 사이의 동맥 아래에 플라스틱 조각을 삽입하여 FeCl3 손상 부위를 표시합니다(그림 5C).
- 부상을 입기 전에 유량을 측정하여 기초 유량을 기록하십시오. 이러한 측정은 샘플을 수집할 단계를 결정하는 데 사용됩니다.
알림: 고정액(3% 파라포름알데히드/PFA + 0.1% 글루타르알데히드, 둘 다 1x PBS로 만듦)이 준비되어 있고 RT에 있는지 확인하십시오. 또는 식염수 배경에 2.5% 글루타르알데히드로 고정하는 것도 사용할 수 있습니다.
주의: 파라포름알데히드와 글루타르알데히드는 모두 독성이 강하고 자극적입니다. 취급하는 동안 장갑, 보안대 및 마스크를 사용하여 노출로부터 보호해야 합니다. 모든 고정 용액은 독성이 있으며 고정 단계는 흄 후드에서 수행해야합니다. - FeCl3에 담근 여과지를 동맥(8% FeCl 3 사용)에3 분 동안 놓아(이 시간도 다를 수 있음) 부상을 수행합니다. 3분 후 여과지를 제거하고 부상 부위에 식염수를 추가하여 과도한 잔류 FeCl3를 제거합니다. 이 단계는 손상의 가변적인 정도를 방지하고 프로브에 의한 유량 계수를 용이하게 하기 위해 필요합니다(그림 5D).
- 흐름 판독값을 모니터링합니다. 유량이 초기 값의 50% 미만으로 떨어지면 프로브를 제거합니다. 해당 부위를 빠르게 건조시키고 해당 부위에 고정제를 추가하여 부상 부위를 외부에 고정합니다.
- 집게로 부상 부위 근처의 동맥을 즉시 잡고 하부 실의 하류와 상부 실의 상류를 절단합니다. 필요한 경우 다른 사람에게 한쪽 끝을 자르는 것을 도와달라고 요청하십시오. 플라스틱 조직 배양 접시에 조직을 채취 한 것과 같은 방향으로 놓고 고정액을 몇 방울 떨어 뜨립니다.
알림: 동맥을 절단하면 즉시 광범위한 출혈이 발생하므로 처음 절단하기 전에 동맥을 잡고 있어야 합니다. 이 시나리오에서는 마우스가 방혈됩니다. 마우스는 출혈과 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. - 메스를 사용하여 동맥 주변의 여분의 조직을 청소하십시오. 혈류의 방향을 기록하는 데 유의하십시오. 이를 표시하려면 한쪽 끝을 수평으로 자르고 다른 쪽 끝을 가늘어지거나 비스듬히 자릅니다(그림 5E).
- RT에서 1시간 동안 고정액(3% PFA 및 0.1% 글루타르알데히드)에 샘플을 보관합니다. 그런 다음 EM 분석을 위해 샘플 처리 실험실로 보낼 때까지 4°C에서 1% PFA에 샘플을 보관합니다.
알림: 샘플을 얼지 않아야 합니다. 이 샘플 수집 방법의 과제는 다음과 같습니다.- 초기 판독값이 최적이 아니거나 부상 후 변동될 수 있습니다. 이것은 EM 분석을 위해 체포하기 위해 선택된 부상의 정도에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 프로브를 배치하는 다양한 위치를 시도한 후 몇 분 동안 기준선 판독값을 기록하여 최적의 위치를 결정해야 합니다.
- 분석을 위해 외부 고정액을 추가하고 동맥 부분을 실제로 절단하여 부상을 체포하는 시간은 혈전증의 정도에 변동성을 추가할 수 있습니다. 외부에서 고정한 후 시료를 채취하는 동안 신속히 처리하십시오.
- 습빙판에서 1% PFA로 EM 분석을 위한 처리를 위한 샘플을 받습니다. 샘플을 얼음 위에서 3분 동안 0.1M 카코딜레이트 완충액으로 헹구어 추가 처리를 시작합니다.
- 샘플을 0.1 M 카코딜레이트 완충액 + 2.5% 글루타르알데히드 + 2 mMCaCl2에 얼음 상에서 1시간 동안 고정시킨다.
- 고정액을 버리고 2mMCaCl2 를 함유하는 차가운 0.1M 나트륨 카코딜레이트 완충액으로 샘플을 세척합니다(5 x 3분)(그림 6A).
- 샘플을 얼음 상에서 1시간 동안 오스뮴 용액(3% 칼륨 페로시안화물[K4C6N6Fe] + 0.3 M 카코딜레이트 완충액 + 4 mMCaCl2와 동량의 4% 사산화오스뮴 수용액[OsO4; inddH2O])과 혼합하여 고정한다.
- 샘플이 고정되는 동안 ddH2O에 신선한 1% 트리클로로아세트알데히드 수화물(TCH) 용액을 만들고 부드럽게 혼합하면서 60°C에서 1시간 동안 용액을 배양합니다.
- 고정시킨 후, 샘플을 RT에서ddH2O로 5 x 3분 동안 세척한다.
- RT에서 20분 동안 여과된 1% TCH 용액(ddH2O로 제조됨)에서 샘플을 인큐베이션합니다.
- 샘플을 RT에서ddH2O로 세척한다 (5 x 3 분).
- 샘플을 RT에서 30분 동안ddH2O중의 2% 사산화오스뮴에 고정시킨다.
- 샘플을 RT에서ddH2O로 각각 5 x 3분 동안 세척한다.
- 샘플을 1% 우라닐 아세테이트(수용성)에 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 샘플을 RT에서ddH2O로 각각 5 x 3분 동안 세척하고, 이들을 월 튼의 납 아스파르테이트 염색으로 처리하였다.
- En bloc Walton의 납 아스파르테이트 염색3:
- ddH2O에 30mM L-아스파라긴산 용액을 만듭니다.
참고: 아스파라긴산은 pH가 3.8로 올라가면 더 빨리 용해됩니다. 이 원액은 냉장 보관하면 1-2개월 동안 안정적입니다. - 아스파라긴산 스톡 10mL에 20mM 질산납 용액을 만들고 1N KOH로 pH를 5.5로 조정합니다.
- 샘플을 60°C에서 30분 동안 아스파르테이트납 용액에 넣고, RT에서ddH2O로 각각 3분 동안 5회 세척합니다.
- ddH2O에 30mM L-아스파라긴산 용액을 만듭니다.
- 등급이 매겨진 에탄올 시리즈로 표본을 탈수합니다. 발디비아 프로토콜18에 의한 화학적 탈수를 사용하십시오.
- 샘플을 점진적으로 탈수하기 위해 다음 각 용액에서 샘플을 세척합니다(그림 6B).
3 분 동안 25 % 에틸 알코올
3 분 동안 50 % 에틸 알코올
3 분 동안 75 % 에틸 알코올
3분 동안 95% 에틸 알코올
100% 에틸 알코올을 10분 동안 반응시키고, 상기 단계를 2회 반복한다(총 3회 세척).
- 샘플을 점진적으로 탈수하기 위해 다음 각 용액에서 샘플을 세척합니다(그림 6B).
- 샘플을 100% 프로필렌 옥사이드(PO)로 10분 동안 세척하고, 단계를 2회 반복한다(총 3회 세척).
- RT에서 하룻밤 동안 DMP 30 활성제를 사용하여 50%/50% PO/수지에서 배양하고 100% Araldite 502/embed 812/DDSA를 DMP30 활성제와 함께 48시간 동안 포함합니다.
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Representative Results
데이터는 일반적으로 폐색까지의 시간 또는 완전 폐색 혈전을 형성하는 데 필요한 시간으로 표시됩니다. 이러한 데이터는 Kaplan-Meier 생존 곡선(그림 4A)19, 혈류 중단 또는 실험 종료 시점의 최종 혈류를 보여주는 막대가 있는 도트 플롯(그림 4B) 또는 선 그래프(그림 4C)로 표시할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 혈전 안정성을 연구 할 수 있습니다. 대부분의 경우 FeCl3 손상 시 혈전이 점진적으로 형성되고 성장함에 따라 혈류가 점진적으로 감소하여 혈관이 완전히 폐색되면 0에 도달합니다. 어떤 경우에는 몇 분 동안 점진적으로 감소한 후 혈류가 갑자기 증가합니다. 이것은 성장하는 혈전의 부분적인 탈락으로 해석되며 색전술 사건으로 간주될 수 있습니다(그림 4D). 폐색 혈전 형태(그림 7A)도 이 방법을 사용하여 연구할 수 있습니다.
표 1: FeCl3 유도 혈전증 모델 및 솔루션의 잠재적인 기술적 과제. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 생쥐에서 FeCl3 유도 경동맥 혈전증을 수행하는 데 필요한 수술 도구. (A) 1: 라이카 S8AP0 현미경 및 스탠드. 2 : 알루미늄 호일로 덮인 작은 동물 가열 패드. (B) 1: 거즈 스펀지. 2: 26G x 3/8 바늘. 3 : 1 ml 주사기. 4: 멸균 면 팁 어플리케이터. 5 : 검은 꼰 실크 봉합사. 6: 수술용 칼날. 7: 스테인리스 칼 손잡이. 8: 상업적인 머리 제거 크림. 9: 이어 펀치. 10 : 가위 해부. 11 : 미세 가위. 12: 수술용 겸자. 13: 미세 해부 겸자. 14: 아이 드레싱 집게. 15 : 봉합사 묶는 집게. (C) 유연한 영역(빨간색 화살표)과 용기를 고정하는 노치(검은색 화살표)가 있는 천음속 흐름 프로브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경동맥 손상을 준비하고 혈관 폐색을 측정하기 위한 수술 단계. 가위와 수술용 집게를 사용하여 정중선 부분을 만들고 조직(A)을 부드럽게 당겨 그 아래의 경동맥(B)을 노출시킵니다. 검은색 화살표는 혈류의 방향(B)을 나타냅니다. 경동맥을 둘러싸고 있는 주변 조직(C)을 청소하고 플라스틱 종이(검은색 화살표로 표시된 노란색 플라스틱)와 프로브(D)를 놓습니다. 동맥(E)에 FeCl3에 적신 여과지(빨간색 화살표로 표시)를 놓아 혈관을 손상시킵니다. 용지를 제거하고 부상을 모니터링합니다. 마지막에 부상은 파란색 화살촉(F)으로 표시된 황백색 줄무늬로 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유량계를 사용한 혈류 판독값. 경동맥의 혈류는 유량계(A)를 사용하여 측정됩니다. 흐름은 파일 탭(B)의 기록 기능을 사용하여 기록됩니다. 부상을 수행하기 전에 기준선 흐름이 비교적 일정해야 합니다(약 0.8mL/분, 검은색 화살표로 표시)(B). 손상 후 혈류가 균일하게 감소합니다(시작 값에서 약 50% 감소, 약 0.4mL/분), 검은색 화살표(C)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: FeCl3 유도 경동맥 손상 모델의 대표적인 데이터 표현. FeCl3 유발 혈관 손상으로부터의 데이터를 제시하는 데 사용할 수 있는 다양한 방법이 표시됩니다. Kaplan-Meier 생존 곡선은 각 마우스의 폐색 시간을 보여줍니다. 통계 분석을 위해 로그 순위 테스트가 수행됩니다. p ≤ 0.001(A)이다. 실험이 끝날 때의 혈류도 막대 그래프(B)로 나타낼 수 있습니다. B로 표현된 데이터에 대해, 0.001 *** p ≤ unpaired t-검정을 수행하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 단일 동물로부터 부상 후 수집된 도플러 흐름 데이터는 선 그래프(C)로 표시될 수 있습니다. 다양한 시점에서 단일 마우스에서 혈류의 지속적인 점진적 감소 후 혈류의 갑작스러운 증가에 의한 잠재적인 색전술 사건의 예(D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전자 현미경 연구를 위한 FeCl3 유도 손상 혈전 수집. 동맥(A)을 노출시킨 후 실(B)을 느슨하게 묶어 부상 부위를 표시하고 플라스틱 종이를 동맥과 동맥 하류의 프로브(C) 아래에 놓습니다. 부상을 수행하고 손상(D)을 모니터링합니다. 본문에 설명된 대로 조직을 수집하고 샘플을 세척하고 한쪽은 똑바로 자르고 다른 쪽은 비스듬히 잘라 혈류의 방향을 표시합니다(검은색 화살표는 혈류의 방향을, 빨간색 윤곽선은 손상 부위를 나타냄)(E). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 전자 현미경을 위한 시료의 사후 고정 처리 및 장착. 샘플은 처리 단계(A) 사이에 미세 원심분리기 튜브에서 세척되고 증가된 농도의 에탄올(B)로 연속적으로 탈수됩니다. 가공 후 수지(C)에 매립하고 블록에 혈류 방향(D)을 표시한 다음 이미징을 위해 조각으로 절단합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: FeCl3 매개 경동맥 손상 후 완전 폐색 혈전의 근위 및 원위 영역의 대표적인 전자 현미경 사진. (A) 폐색된 동맥의 완전한 횡단면, 손상 부위 근위부, 아래에 삽입된 삽입물, 더 높은 배율의 구조를 보여줍니다(a: 2x 및 a': 4x). 부상 부위는 A에 화살표로 표시됩니다. 스케일 바: 100μm. (B) 폐색된 동맥의 완전한 횡단면, 손상 부위 원위, 아래에 삽입된 삽입물, 더 높은 배율(b: 2x 및 b': 4x)의 구조를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 동물 모델, FeCl3 손상 부위, FeCl3 농도, 손상 방법 및 혈전증 시간의 변화에 대한 간략한 조사. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
혈전증을 유도하기 위해 맥관 구조에 FeCl3 를 국소 적용하는 것은 널리 사용되는 기술이며 다양한 혈소판 수용체, 리간드 신호 전달 경로 및 그 억제제20,21,22,23에 대한 역할을 확립하는 데 도움이되었습니다. FeCl3 가 혈전증을 일으키는 메커니즘은 다각적입니다. 이전에는 내피 탈락이 혈전증의 원인으로 간주되었지만 최근 몇 년 동안 여러 보고서에서 이 과정에서 적혈구와 혈장 단백질의 역할을 제안했습니다24,25,26,27.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 최적의 흐름을 얻기 위한 도플러 프로브 배치, 여과지 배치, 샘플을 회수하고 즉시 수정하기 위한 부상의 즉각적인 종료입니다. 이러한 단계에서 사고의 결과와 해결 방법은 표 1에 설명되어 있습니다. 이 기술은 간단하고 민감하지만 동물 모델, 동물 배경, 혈관 손상 부위, FeCl3 농도, FeCl3 적용 방법, 적용 기간, 동물 연령 및 성별, 사용된 마취 유형에 따라 사용하기 어려울 수 있습니다. 이러한 차이는 문헌에 보고된 C57BL/6J의 비교적 광범위한 혈전증 시간을 설명할 수 있습니다(보충 표 1)27,28,29,30,31,32. 이 프로토콜은 혈관 크기를 시각화하고 수술하기가 더 쉽기 때문에 실험에 8-10주 된 마우스를 사용할 것을 제안합니다. 일부 그룹은 생후 6주령33세의 어린 생쥐를 사용했습니다. 다양한 동물 그룹 간의 일관되고 재현 가능한 비교를 위해 마우스의 연령을 일치시키는 것이 필수적입니다. 설명 된 마취 인 트리 브로 모 에탄올은 쉽게 이용할 수 있고, 투여하기 쉽고, 필요한 기간 동안 마취 평면을 유지하며, 필요한 용량을 재현 할 수 있기 때문에 바람직하다. 이소플루란 및 트리브로모에탄올과 자일라진 및/또는 아세프로마진이 포함된 3차 아밀 알코올의 다양한 조합을 포함하여 많은 다른 마취 옵션을 사용할 수 있습니다. 동물의 심박수 또는 혈압에 부정적인 영향을 미치지 않고 진정 작용을 달성하기 위해 최적의 용량을 사용하는 것이 필수적입니다. 실험 전반에 걸쳐 동일한 마취 방법을 사용하면 혈전증 시간에 대한 잠재적인 복합 효과를 방지할 수 있습니다.
이 원고는 데이터 변동을 최소화하고 재현성을 높이기 위한 자세한 절차를 제시합니다. 이 수술 중에 발생할 수 있는 몇 가지 문제를 해결하기 위한 표가 제공됩니다(표 1). 또한, 이 원고는 폐쇄성 혈전의 구조와 형태를 연구하기 위해 손상이 끝날 때 샘플을 수집하는 방법을 제안합니다(그림 7). EM의 해상도는 성장하는 솜에서 이전에 가능했던 것보다 더 나은 시각화를 제공합니다25 개의 혈소판과 혈관 손상의 근위 및 원위 모두에서 다른 혈소판 및 내피와 상호 작용하는 방식. 또한 손상 부위에서 혈소판의 다양한 활성화 단계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
이 기술의 또 다른 중요한 이점은 작업자가 기준선 판독값을 사용하여 혈전 샘플이 수집되는 단계를 결정할 수 있다는 것입니다. 이는 대략적인 시기이며 부상/혈전증의 정확한 정도를 나타내지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 기본 판독값은 프로브의 최적 배치에 따라 달라지며 올바르게 배치되지 않으면 판독값에 부분적인 흐름만 기록될 수 있습니다. 이로 인해 종결 시간과 수집된 샘플의 형태에 대한 잘못된 해석이 발생합니다. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 부상 과정을 즉시 종료하고 샘플을 즉시 고정해야 합니다.
이 프로토콜은 폐쇄성 혈전증의 평가에 필요한 최소 설정을 제공합니다. 현미경 검사의 발전과 함께, 몇몇 그룹은 이 기술을 사용하여 혈소판/내피 세포 및/또는 혈소판 방출물(예: PF4, P-셀렉틴 및 피브린)을 형광으로 표지하여 생체 내 혈전증의 특정 측면을 시각화하고 그 동역학을 결정했습니다34,35. 설명된 바와 같이, 여기에서 방법은 혈전 불안정성을 나타내는 색전술 사건에 대해 보고할 수 있습니다(그림 4D).
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Disclosures
저자는 이 연구와 관련된 이해 상충이 없습니다.
ORCID 프로필 : SJ : 0000-0001-6925-2116; SWW: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
저자는 이 원고를 주의 깊게 정독한 Whiteheart Laboratory 회원들에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH, NHLBI(HL56652, HL138179 및 HL150818)의 보조금과 SWW에 대한 재향 군인회 공로상, BS에 R01 HL 155519, RDL에 대한 NIBIB 교내 프로그램 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
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