Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder en FeCl3-medierad skada för att inducera arteriell trombos och hur man samlar in och förbereder arteriella skadeprover vid olika stadier av trombos för elektronmikroskopianalys.
Abstract
Hjärt- och kärlsjukdomar är en ledande orsak till dödlighet och sjuklighet över hela världen. Avvikande trombos är ett vanligt inslag i systemiska tillstånd som diabetes och fetma och kroniska inflammatoriska sjukdomar som åderförkalkning, cancer och autoimmuna sjukdomar. Vid vaskulär skada verkar vanligtvis koagulationssystemet, blodplättar och endotel på ett orkestrerat sätt för att förhindra blödning genom att bilda en blodpropp på skadan. Avvikelser i denna process leder till antingen kraftig blödning eller okontrollerad trombos/otillräcklig antitrombotisk aktivitet, vilket leder till kvarocklusion och dess följder. FeCl3-inducerad karotisskademodell är ett värdefullt verktyg för att undersöka hur trombos initieras och fortskrider in vivo. Denna modell innefattar endotelskada / denudation och efterföljande koagulationsbildning på den skadade platsen. Det ger en mycket känslig, kvantitativ analys för att övervaka vaskulär skada och koagulationsbildning som svar på olika grader av vaskulär skada. När den har optimerats kan denna standardteknik användas för att studera de molekylära mekanismerna bakom trombos, liksom de ultrastrukturella förändringarna i blodplättar i en växande trombos. Denna analys är också användbar för att studera effekten av antitrombotiska och trombocythämmande medel. Denna artikel förklarar hur man initierar och övervakar FeCl3-inducerad arteriell trombos och hur man samlar in prover för analys med elektronmikroskopi.
Introduction
Trombos är bildandet av en blodpropp som helt eller delvis blockerar ett blodkärl, vilket hindrar blodets naturliga flöde. Detta leder till allvarliga och dödliga kardiovaskulära händelser, såsom ischemisk hjärtsjukdom och stroke. Hjärt-kärlsjukdomar är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet och orsakar en av fyra dödsfall i världen 1,2,3. Även om trombos manifesteras som ett fel i kärlsystemet kan det vara ett resultat av en underliggande mikrobiell eller virusinfektion, immunsjukdom, malignitet eller metaboliskt tillstånd. Blodflödet upprätthålls av den komplexa interaktionen mellan olika komponenter i kärlsystemet, inklusive endotelceller, röda / vita blodkroppar, blodplättar och koagulationsfaktorer4. Vid vaskulär skada interagerar blodplättar med adhesiva proteiner på subendotelmatrisen och frigör deras granulära innehåll, vilket rekryterar fler blodplättar5. Samtidigt aktiveras koagulationskaskaden, vilket leder till fibrinbildning och avsättning. I slutändan bildas en blodpropp som innehåller blodplättar och röda blodkroppar fångade i ett fibrinnät6. Även om trombocythämmande och antikoagulantia läkemedel finns tillgängliga för att modulera trombos, är falsk blödning fortfarande ett stort problem med dessa terapier, vilket kräver finjustering av doserna och kombinationerna av dessa läkemedel. Således finns det fortfarande ett brådskande behov av att upptäcka nya antitrombotiska läkemedel7.
Trombos studeras med flera metoder för att orsaka vaskulär skada: mekanisk (kärlligering), termisk (laserskada) och kemisk skada (FeCl3 / Rose Bengal applikation). Trombosens art varierar beroende på platsen (arteriell kontra venös), metod eller skadans omfattning. Bland alla dessa typer är FeCl3-inducerad vaskulär skada den mest använda metoden. Det har använts på möss, råttor, kaniner, marsvin och hundar 8,9,10,11,12. Metoden är relativt enkel, lätt att använda, och om viktiga parametrar standardiseras är den känslig och reproducerbar i olika kärlsystem (t.ex. artärer [halspulsåder och lårben], vener [jugulära] och arterioler [cremaster och mesenteric]) (kompletterande tabell 1).
Denna modell kan också användas för att öka vår förståelse av mekaniken och morfologin för koagulationsbildning. Denna teknik erbjuder unikt fördelen att stoppa trombos vid olika flödeshastighetspunkter, för att studera de mellanliggande stadierna i processen innan den blir ocklusiv. Nya framsteg inom trombosforskning har använt denna modell för att fokusera uppmärksamheten på icke-farmakologiska metoder för trombolys13 eller icke-invasiv leverans av antitrombotiska och / eller fibrinolytiska medel14,15. Flera grupper har visat att när trombocytmembran är belagda med dessa terapier kan läkemedlen aktiveras vid termisk stimulering för att rikta blodproppar16. De tekniker som beskrivs här kan vara användbara för sådana studier som validering av deras resultat på enkel trombocytnivå. I detta manuskript beskriver protokoll 1 den grundläggande FeCl3-medierade vaskulära skadeproceduren, medan protokoll 2 beskriver metoden för att samla in och fixera kärlskadeprovet för vidare analys med elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som diskuteras här granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky.
OBS: Kirurgiska instrument listas i figur 1 och materialtabellen. C57BL/6J-möss, 8-10 veckor gamla, hanar/honor eller relevanta genetiskt manipulerade (knockout- eller knockin-) stammar användes.
1. FeCl3-inducerad halspulsåderskada
- Induktion av musanestesi
- Väg musen.
- Bedöva musen genom att injicera 0,2 g/kg tribrometanollösning intraperitonealt (i.p.). Se till att bedövningslösningen har rumstemperatur (RT) innan du injicerar den. Denna dos är tillräcklig för att lugna musen i ca 1 h.
- Kontrollera tåreflexen genom att nypa tån 5 minuter efter injektionen för att se till att musen är nedsövd. Om musen inte är sederad kommer den att dra tån bort. Om det händer, vänta 5 minuter och kontrollera igen.
- Om musen fortfarande inte är helt sederad, administrera 1/4 av den initiala dosen och vänta i 5 minuter.
- Under hela proceduren övervakar du regelbundet musens anestesiplan via en tå-nypa. Dessutom kan andningsfrekvens och kroppstemperatur också övervakas för att upprätthålla optimal anestesi.
- Immobilisera musen
- Lägg musen på värmedynan (37 °C) i ryggläge och använd tejp för att immobilisera extremiteterna.
- Använd en kirurgisk tråd (0,1 mm) för att försiktigt dra i musens övre framtänder för att förlänga livmoderhalsen/halsområdet. Detta är viktigt för bättre visualisering av det kirurgiska området och stabiliteten hos dopplersonden. Trådstorleken är inte viktig, eftersom den bara används för att dra djurets främre tänder för att förlänga nacken.
- Snitt
- Spraya det kirurgiska området med 70% etanol eller torka av det med en alkoholtork.
- Använd en bomullspinne, applicera en liten mängd hårborttagningskräm på det kirurgiska området. Vänta i 1-2 min och använd sedan en våt pappershandduk eller vävnad för att ta bort grädden.
OBS: Detta steg är viktigt för ett rent kirurgiskt område. - Använd sax och pincett (figur 1B11,1B13) och gör ett snitt i mittlinjen från underkäken till det suprasternala hacket. Dra tillbaka huden för att få en bättre visualisering av området (figur 2A).
- Exponering för halspulsåder
- Med hjälp av kirurgiska pincett och mikrodissekerande pincett dissekerar trubbigt den överliggande ytliga fascian och tar bort den för att exponera den vänstra halspulsådern (figur 1B12,1B13). Se till att inte använda sax i detta skede för att undvika att skada andra kärl i detta område.
- Ta bort extra vävnad som omger halspulsådern. Undvik överdriven dissektion av den omgivande vävnaden, eftersom detta område hamnar vagusnerven och ryggradsartären.
- Separera halspulsådern från omgivande vävnad genom att dissekera den med kirurgiska och suturbindande pincett (figur 1B12,1B15,2C). Se till att inte förlänga eller dra artären för att undvika mekanisk skada på artären eller den omgivande vaskulaturen.
- Placera en bit plast under artären för att markera platsen för skadan (figur 2D). Använd ett färgat genomskinlighetsark för att göra det lättare att se i det kirurgiska fältet.
- Placering av flödessonden
- Placera dopplerns transoniska flödessond i saltlösning (0,9% NaCl i dH2O) i cirka 10 minuter före operationen. Sätt in den andra änden av sonden i ett tillbehör i flödesmätaren för att underlätta avläsningen av flödet. Anslut flödesmätaren till en dator.
OBS: Mellan operationerna bör dopplerns transoniska flödessond vara i saltlösning. Se till att hålla sonden fuktig och ren under hela proceduren. - Placera ultraljudsdopplerns transoniska flödessond runt artären uppströms plasten (figur 2D). Se till att sondens kärlhållarregion inte är för utsträckt (figur 1C, röd pil).
Anmärkning: Om det behövs, stöd sonden med gasbindor (figur 1B1) för att uppnå en lämplig höjd på sonden, vilket underlättar optimal avläsningsposition. - Om det kirurgiska området är torrt vid denna punkt, tillsätt några droppar RT-saltlösning för att hålla området fuktigt. Övervaka avläsningen av flödesavsökningen. Den optimala avläsningen varierar för varje djur och kan vara var som helst mellan 0,6-1,2 ml / min. Om den är mindre eller inte stabil, ändra flödesprobens position för att få en optimal avläsning.
OBS: Se till att musens hals inte är för utsträckt och att det kirurgiska området är rent.
- Placera dopplerns transoniska flödessond i saltlösning (0,9% NaCl i dH2O) i cirka 10 minuter före operationen. Sätt in den andra änden av sonden i ett tillbehör i flödesmätaren för att underlätta avläsningen av flödet. Anslut flödesmätaren till en dator.
- Registrera baslinjen för flödet
- Efter att ha placerat sonden, övervaka blodflödet i 2 minuter för att säkerställa att flödet är stabilt. Registrera sedan flödet i 2 minuter (bild 3B) som baslinje. För en detaljerad beskrivning av flödesmätaren, se Subramaniam et al.17.
- För att registrera blodflödet, starta WinDAQ-programvaran. Klicka på alternativet Arkiv och klicka sedan på Spela in. Skapa en ny mapp och fil och börja spela in. För att stoppa inspelningen, klicka på Sluta i filavsnittet.
WinDAQ-programvaran är fritt tillgänglig från utgivaren: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Skada
- Stoppa registreringen av flödet. Se till att inte ändra sondpositionen så att avläsningarna förblir konsekventa efter skadan.
- Torka området noggrant med en torka / pappershandduk.
OBS: Även en liten volym kvarvarande vätska kan förändra koncentrationen av FeCl3-lösning som används för att orsaka vaskulär skada. Detta leder till varierande resultat och påverkar reproducerbarheten. När området är helt torrt kan sonden inte mäta flödet. - I en plastvägningsbåt, sätt ett cirkulärt filterpapper (1 mm diameter, skuren med en öronstans på 1 mm). Tillsätt 1 μl 6%FeCl3-lösning (tillverkad idH2O) på filterpapperet.
OBS: Se till att tillsätta FeCl3-lösning precis innan du använder filterpapperet. Blötläggning av papperet för tidigt kan leda till avdunstning av FeCl3-lösning och ändra skadans allvar. - Ta upp filterpapperet med fin pincett och lägg det på artären uppströms sonden, på den del av artären som markeras av plasten (figur 2D,E). Denna plast fungerar som en markör och en distans. Det markerar det skadade området och förhindrar oavsiktlig utspädning av FeCl3 genom att undvika kontakt med det omgivande fuktiga området.
OBS: Se till att filterpapperet är rakt, inte klämt eller på annat sätt vikt på något sätt. En gång placerad på artären, ändra inte filterpapperets position; Om du gör det ändras skadans omfattning. - När du har placerat filterpapperet startar du timern och registrerar blodflödet. Efter 3 minuter, ta bort papperet och tillsätt saltlösning på skadestället för att ta bort FeCl3 och stoppa skadeprocessen. Det gör också området fuktigt. I detta skede bör blodflödet återgå till baslinjenivån, som registrerats före skadan.
- Övervaka och spela in flödet tills det minskar till 10% av originalinspelningen eller når noll. Det sker en stadig minskning när tromben börjar bildas på skadestället (figur 3C). Notera eventuella betydande fluktuationer i flödet under denna tid.
- För att studera trombens stabilitet, registrera den snabba ökningen av blodflödet efter varje signifikant och konsekvent minskning. Dessa händelser klassificeras som embolisering på grund av instabil trombos (figur 4D). Efter den konsekventa minskningen av flödet kan operatören se skadan på artären vid experimentets slut (figur 2F, blå pil/prickad oval).
- Kärlocklusionstiden definieras som fullständigt upphörande av blodflödet i minst 1 min. Registrera den tidpunkt vid vilken en ocklusiv trombos bildas, vilket visas av nollavläsningen eller signifikant minskning av flödet.
- Avsluta experimentet vid 30 min. Om tromben inte bildas inom 30 minuter efter övervakningen, registrera flödet, stoppa inspelningen och ta bort sonden.
- Rengör sonden med 70% etanol och en borste för att ta bort eventuell kvarvarande vävnad / hår eller skräp. Torka sonden helt innan du lägger den i förvaringslådan. Torka sonden helt innan du lägger den i förvaringslådan för långvarig förvaring.
- Eutanize musen genom cervikal dislokation. Placera slaktkroppen i avfallspåsen, märkt med laboratoriets namn och datum.
2. Insamling och beredning av prover för seriell blockansiktsskanningselektronmikroskopi (SBF-SEM) studier efter FeCl3-inducerad skada
OBS: EM-protokollet som presenteras är lämpligt för provberedning för SBF-SEM. Denna bildteknik erbjuder en oöverträffad förmåga att studera den tredimensionella strukturen hos blodplättar i en blodpropp. Med denna teknik visualiseras provet som en serie sekventiella block SEM-bilder, genererade när man går igenom provet. Viktiga punkter för denna beredning är: 1) provet måste färgas med tungmetaller före inbäddning; och 2) det inbäddade plastprovet måste trimmas på lämpligt sätt för montering i SEM (se figur 6 för en bild av trimmade prover). Inbäddning efter infärgning är inte möjlig inom SEM. Vid insamling av ett prov från en FeCl3-inducerad kärlskada för EM-analys måste följande ändringar göras under operationen. Modifieringarna i FeCl3-operationsprotokollet som presenteras är också tillämpliga på någon form av elektronmikroskopi. Anestesiförhållanden och stegen för att göra ett snitt och exponera halspulsådern är desamma som i protokoll 1.
- Efter att ha exponerat halspulsådern, markera skadestället genom att löst omsluta området mellan två kirurgiska trådar (storlek: 0,1 mm) (figur 5A, B).
- Placera sonden under artären, distal från den nedre tråden (figur 5C).
- Sätt in plastbiten under artären mellan de två trådarna för att markera platsen för FeCl3-skada (figur 5C).
- Ta flödesmätningar innan du utför skada för att notera basalflödet. Dessa mätningar används för att bestämma i vilket skede provet ska samlas in.
OBS: Se till att fixeringsmedlet (3% paraformaldehyd / PFA + 0,1% glutaraldehyd, båda gjorda i 1x PBS) är klart och vid RT. Alternativt kan fixering med 2,5% glutaraldehyd i en saltlösning bakgrund också användas.
VARNING: Både paraformaldehyd och glutaraldehyd är mycket giftiga och irriterande. Vid hantering av dem bör handskar, ögonsköld och masker användas för att skydda mot exponering. Alla fixativa lösningar är giftiga och fixeringssteg bör utföras i en dragskåp. - Utför skadan genom att placera FeCl 3-blött filterpapper på artären (8% FeCl 3 används) i3 minuter (denna tid kan också variera). Efter 3 minuter, ta bort filterpapperet och tillsätt saltlösning på skadestället för att avlägsna eventuellt överskott av FeCl3. Detta steg är nödvändigt för att förhindra skadans varierande omfattning och för att underlätta sondens flödesräkning (figur 5D).
- Övervaka flödesavläsningen. När flödet sjunker under 50% av det ursprungliga värdet, ta bort sonden. Torka snabbt området och tillsätt fixeringsmedlet i området för att externt fixa skadeområdet.
- Håll omedelbart artären nära skadeområdet med pincett och skär nedströms den nedre tråden och uppströms den övre tråden. Om det behövs, be en annan person att hjälpa till att skära ena änden. Lägg vävnaden på plastvävnadsodlingsskålen i samma orientering som den samlades in och tillsätt några droppar fixeringsmedel.
OBS: Skärning av artären orsakar omedelbar omfattande blödning, så se till att hålla artären innan du skär den första gången. I det här fallet exsanguineras musen. Musen avlivas genom exsanguination och cervikal dislokation. - Använd en skalpell, rengör den extra vävnaden runt artären. Var uppmärksam på att registrera orienteringen av blodflödet. För att markera det, skär ena änden horisontellt och den andra avsmalnande / sned (figur 5E).
- Förvara provet i fixativ (3% PFA och 0,1% glutaraldehyd) i 1 h vid RT. Förvara sedan provet i 1% PFA vid 4 °C tills det skickas på våt is till provbearbetningslaboratoriet för EM-analys.
OBS: Proverna får inte frysas. Utmaningarna för denna metod för provinsamling är:- Den första avläsningen kanske inte är optimal eller kan fluktuera efter skadan. Detta kan påverka omfattningen av den skada som väljs att gripa för EM-analys. För att lösa detta problem, se till att spela in baslinjeavläsningen i några minuter, efter att ha provat olika positioner för att placera sonden för att bestämma vilken position som är optimal.
- Tiden för att stoppa skadan genom att lägga till extern fixativ och faktisk skärning av arteriell sektion för analys kan öka variationen i trombosens omfattning. Var snabb under provinsamlingen efter fixering externt.
- Ta emot proverna för bearbetning för EM-analys i 1% PFA på våt is. Skölj proverna i 3 min, på is, med 0,1 M cakodylatbuffert för att påbörja vidare bearbetning.
- Fixera proverna i 1 timme på is i 0,1 M cakodylatbuffert + 2,5% glutaraldehyd + 2 mM CaCl2.
- Kassera fixeringsmedlet och tvätta proverna med en kall 0,1 M natriumkadodylatbuffert innehållande 2 mMCaCl2 (5 x 3 min) (figur 6A).
- Fixera proverna med osmiumlösning (3% kaliumferrocyanid [K 4 C 6N6Fe] + 0,3 M kokodylatbuffert + 4 mM CaCl 2 blandad med en lika stor volym 4% vattenhaltig osmiumtetroxid [OsO4; i ddH2 O]) i 1 timme på is.
- Medan proverna fixerar görs en färsk 1 % trikloracetaldehydhydratlösning (TCH) iddH2O. Inkubera lösningen vid 60 °C i 1 timme under försiktig blandning.
- Efter fixering, tvätta proverna med ddH2Ovid RT i 5 x 3 min.
- Inkubera proverna i filtrerad 1% TCH-lösning (gjord i ddH2O) i 20 minuter vid RT.
- Tvätta proverna med ddH2O vid rumstemperatur (5 x 3 min).
- Fixera proverna i 2% osmiumtetroxid iddH2Oi 30 min vid rumstemperatur.
- Tvätta proverna med ddH2Ovid rumstemperatur i 5 x 3 min vardera.
- Placera proverna i 1 % uranylacetat (vattenhaltigt) och inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta proverna med ddH2O vid RT i 5 x 3 min vardera och bearbeta dem med en bloc Waltons blyaspartatfärgning.
- En bloc Waltons bly aspartat färgning3:
- Gör 30 mM L-asparaginsyralösning iddH2O.
OBS: Asparaginsyran löser sig snabbare om pH höjs till 3,8. Denna stamlösning är stabil i 1-2 månader om den kyls. - Gör 20 mM blynitratlösning i 10 ml asparaginsyrastam och justera pH till 5,5 med 1 N KOH.
- Placera proverna i blylösning av aspartat vid 60 °C i 30 minuter efter fem tvättar medddH2Ovid rumstemperatur och vardera i 3 minuter.
- Gör 30 mM L-asparaginsyralösning iddH2O.
- Dehydrera proverna med en graderad etanolserie. Använd den kemiska uttorkningen enligt Valdivia-protokoll18.
- Tvätta proverna i var och en av följande lösningar för att gradvis dehydrera provet (figur 6B):
25% etylalkohol i 3 min
50% etylalkohol i 3 min
75% etylalkohol i 3 min
95% etylalkohol i 3 min
100% etylalkohol i 10 minuter och upprepa steget två gånger (totalt tre tvättar).
- Tvätta proverna i var och en av följande lösningar för att gradvis dehydrera provet (figur 6B):
- Tvätta proverna i 100 % propylenoxid (PO) i 10 minuter och upprepa steget två gånger (totalt tre tvättar).
- Inkubera i 50%/50% PO/harts med DMP 30-aktivator över natten vid RT och bädda in 100% Araldite 502/embed 812/DDSA med DMP30-aktivator i 48 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data presenteras i allmänhet som tid till ocklusion eller tid som krävs för att bilda en helt ocklusiv tromb. Dessa data kan plottas som en Kaplan-Meier-överlevnadskurva (figur 4A)19, ett punktdiagram med staplar som visar det terminala blodflödet vid tidpunkten för antingen upphörande av blodflödet eller avslutning av ett experiment (figur 4B) eller som ett linjediagram (figur 4C). Trombstabilitet kan studeras med hjälp av denna teknik. I de flesta fall, vid FeCl3-skada, bildar tromben gradvis, och när den växer minskar blodflödet gradvis och når noll vid fullständig ocklusion av kärlet. I vissa fall ökar blodflödet plötsligt efter en gradvis minskning i några minuter. Detta tolkas som partiell utsöndring av den växande tromben och kan betraktas som en emboliseringshändelse (figur 4D). Ocklusiv trombos morfologi (figur 7A) kan också studeras med denna metod.
Tabell 1: Potentiella tekniska utmaningar i FeCl3-inducerad trombosmodell och lösningar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1: Kirurgiska instrument som behövs för att utföra FeCl3-inducerad halspulsådertrombos hos möss. (A) 1: LEICA S8AP0 mikroskop och stativ. 2: Liten djuruppvärmd dyna täckt av aluminiumfolie. (B) 1: Gasvävsvampar. 2: 26 G x 3/8 nål. 3: 1 ml spruta. 4: Sterila applikatorer med bomullsspets. 5: Svart flätad sidensutur. 6: Kirurgiskt blad. 7: Knivhandtag i rostfritt stål. 8: Kommersiell hårborttagningskräm. 9: Öronstans. 10: Dissekera sax. 11: Fin sax. 12: Kirurgiska pincett. 13: Mikrodissekerande pincett. 14: Tång för ögonförband. 15: Suturbindningstång. (C) Transonisk flödessond med det flexibla området (röd pil) och ett hack som håller ett kärl (svart pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kirurgiska steg för att förbereda halspulsådern för skada och mäta ocklusion av kärl. Använd sax och kirurgisk pincett, gör en mittlinjesektion och dra försiktigt bort vävnaden (A) för att exponera halspulsådern under den (B). Den svarta pilen visar blodflödets riktning (B). Rengör den omgivande vävnaden som omger halspulsådern (C) och placera en bit plastpapper (gul plast som visas med en svart pil) och sonden (D). Skada kärlet genom att placera FeCl 3-indränkt filterpapper (visas med en röd pil) på artären (E). Ta bort papperet och övervaka skadan. I slutet är skadan synlig som en gulvit strimma, indikerad av den blå pilspetsen (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Avläsning av blodflödet med hjälp av flödesmätaren. Blodflödet i halspulsådern mäts med hjälp av en flödesmätare (A). Flödet registreras med hjälp av en postfunktion i filfliken (B). Baslinjeflödet bör vara relativt konstant innan skadan utförs (cirka 0,8 ml/min, visas med en svart pil) (B). Efter skadan minskar blodflödet jämnt (ca 50% minskning från startvärdet, ca 0,4 ml/min), visat med en svart pil (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativa datapresentationer från FeCl3-inducerad karotisskademodell. Olika metoder tillgängliga för att presentera data från FeCl3-inducerad vaskulär skada visas. Kaplan-Meiers överlevnadskurvor visar tiden till ocklusion för varje mus. Ett log-rank-test utförs för statistisk analys. p ≤ 0,001 (A). Blodflödet i slutet av experimentet kan också representeras i ett stapeldiagram (B). För data representerade i B utfördes ett oparat t-test *** p ≤ 0,001. Felstapeln representerar medelvärde ± SD. Dopplerflödesdata som samlats in efter skada från ett enda djur kan presenteras i ett linjediagram (C). Exempel på en potentiell emboliseringshändelse genom plötslig ökning av blodflödet efter en ihållande gradvis minskning av flödet i en enda mus vid olika tidpunkter (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Insamling av FeCl3-inducerade skadeproppar för elektronmikroskopistudier. Efter att ha exponerat en artär (A), markera skadestället genom att löst binda trådarna (B) och placera plastpapperet under artären och sonden nedströms den (C). Utför skadan och övervaka skadan (D). Samla vävnaden som förklaras i texten och rengör och skär provet rakt på ena sidan och snett på andra sidan för att visa blodflödesriktningen (den svarta pilen visar blodflödesriktningen och den röda konturen indikerar det skadade området) (E). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Efterfixeringsbearbetning och montering av prover för elektronmikroskopi. Proverna tvättas i mikrocentrifugrör mellan bearbetningsstegen (A) och torkas i serie med en ökad koncentration av etanol (B). Efter bearbetning är de inbäddade i harts (C), och blocken markeras med blodflödets riktning (D) och skärs sedan i skivor för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Representativa elektronmikrografer av proximala och distala regioner av en helt ocklusiv trombos efter FeCl3-medierad halspulsåderskada. a) Ett fullständigt tvärsnitt av en tilltäppt artär, nära skadestället, med infällningar nedanför som visar strukturer med högre förstoring (a: 2x och a': 4x). Det skadade området indikeras med en pil i A. Skalstång: 100 μm. (B) Ett komplett tvärsnitt av en ockluderad artär, distalt mot skadestället, med insatser nedanför, som visar strukturer vid högre förstoring (b: 2x och b': 4x). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: En kort undersökning av variationer i djurmodeller, FeCl 3 skadeställe, FeCl3 koncentration, skademetod och trombostider. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den topiska appliceringen av FeCl3 på vaskulaturen för att inducera trombos är en allmänt använd teknik och har varit avgörande för att etablera roller för olika trombocytreceptorer, ligandsignalvägar och deras hämmare20,21,22,23. Mekanismen genom vilken FeCl3 orsakar trombos är mångfacetterad; Tidigare ansågs endoteldenudation vara en orsak till trombos, men de senaste åren har flera rapporter föreslagit rollen av röda blodkroppar och plasmaproteiner i denna process24,25,26,27.
De mest kritiska stegen i detta protokoll är: placeringen av dopplersonden för att få ett optimalt flöde, placeringen av filterpapperet och omedelbar avslutning av skadan för att hämta och omedelbart fixa provet. Konsekvenserna av missöden i dessa steg och hur man hanterar dem beskrivs i tabell 1. Även om den är enkel och känslig kan denna teknik vara utmanande att använda, beroende på djurmodell, djurbakgrund, kärlskada, koncentration avFeCl3, FeCl 3-appliceringsmetod, appliceringstid, djurålder och kön och typ av anestesi som används. Dessa skillnader kan förklara det relativt stora intervallet av trombostider i C57BL/6J som rapporterats i litteraturen (kompletterande tabell 1)27,28,29,30,31,32. Detta protokoll föreslår att man använder 8-10 veckor gamla möss för experimentet, eftersom vaskulaturstorleken är lättare att visualisera och surgerisera. Vissa grupper har använt möss så unga som 6 veckor gamla33. Det är absolut nödvändigt att åldersmatcha mössen för konsekvent och reproducerbar jämförelse mellan olika djurgrupper. Den beskrivna anestesin, tribrometanol, föredras eftersom den är lättillgänglig, är lättare att administrera, den upprätthåller ett bedövningsplan under den erforderliga varaktigheten och den erforderliga dosen är reproducerbar. Många andra anestesialternativ finns tillgängliga, inklusive isofluran och olika kombinationer av tribrometanol med tertiär amylalkohol med xylazin och / eller acepromazin. Det är absolut nödvändigt att använda en optimal dos för att uppnå sedering utan att negativt påverka djurets hjärtfrekvens eller blodtryck. Användning av samma anestesimetod under hela experimentet förhindrar potentiella sammansatta effekter på trombostiden.
Detta manuskript presenterar en detaljerad procedur för att minimera datavariationer och öka reproducerbarheten. En tabell tillhandahålls för att felsöka några problem som kan uppstå under denna operation (tabell 1). Dessutom föreslår detta manuskript en metod för att samla prover i slutet av skadan för att studera strukturen och morfologin hos en ocklusiv tromb (figur 7). Upplösningen av EM ger en bättre visualisering än vad som tidigare var möjligt25 av trombocyter i en växande thombus, och hur de interagerar med andra blodplättar och endotelet både proximalt och distalt av kärlskadan. Det kan också användas för att studera olika aktiveringsstadier av blodplättar på skadestället.
En annan viktig fördel med denna teknik är att operatören kan använda baslinjeavläsningar för att bestämma i vilket skede trombprovet samlas in. Det bör noteras att dessa är ungefärliga tidpunkter och inte anger den exakta omfattningen av skada/trombos. Basala avläsningar är beroende av sondens optimala placering, och om de inte placeras korrekt kan avläsningarna registrera endast partiellt flöde. Detta leder till felaktig tolkning av avslutningstiden och därmed morfologin för det insamlade provet. Omedelbart avslutande av skadeprocessen och omedelbar fixering av proverna krävs för att uppnå konsekventa och reproducerbara resultat.
Detta protokoll presenterar de minimala nödvändiga inställningarna för utvärdering av ocklusiv trombos. Med framsteg inom mikroskopi har flera grupper använt denna teknik för att fluorescerande märka blodplättarna / endotelcellerna och / eller trombocytrelakatet, såsom PF4 och P-Selectin och fibrin, för att visualisera specifika aspekter av trombos in vivo och för att bestämma dess kinetik34,35. Som beskrivits kan metoden här rapportera om emboliseringshändelser, vilket indikerar trombinstabilitet (figur 4D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter relaterade till denna studie.
ORCID-profiler: S.J.: 0000-0001-6925-2116; SWW: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Författarna tackar medlemmarna i Whiteheart Laboratory för deras noggranna granskning av detta manuskript. Arbetet stöddes av bidrag från NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 och HL150818) och ett Department of Veterans Affairs Merit Award till S.W.W., R01 HL 155519 till BS och NIBIB intramuralt programbidrag till R.D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
