Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man bruker en FeCl3-mediert skade for å indusere arteriell trombose, og hvordan man samler inn og forbereder arterielle skadeprøver på ulike stadier av trombose for elektronmikroskopianalyse.
Abstract
Hjerte- og karsykdommer er en ledende årsak til dødelighet og sykelighet over hele verden. Avvikende trombose er et vanlig trekk ved systemiske tilstander som diabetes og fedme, og kroniske inflammatoriske sykdommer som aterosklerose, kreft og autoimmune sykdommer. Ved vaskulær skade virker vanligvis koagulasjonssystemet, blodplater og endotel på en orkestrert måte for å forhindre blødning ved å danne en blodpropp på skadestedet. Abnormaliteter i denne prosessen fører til enten overdreven blødning eller ukontrollert trombose / utilstrekkelig antitrombotisk aktivitet, noe som oversettes til okklusjon av fartøyet og dets følgesykdommer. FeCl 3-indusert carotisskademodell er et verdifullt verktøy for å undersøke hvordan trombose initierer og utvikler seg in vivo. Denne modellen innebærer endotelskade/denudasjon og påfølgende koagulasjonsdannelse på skadestedet. Det gir en svært sensitiv, kvantitativ analyse for å overvåke vaskulær skade og koagulasjonsdannelse som respons på forskjellige grader av vaskulær skade. Når den er optimalisert, kan denne standardteknikken brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for trombose, samt de ultrastrukturelle endringene i blodplater i en voksende trombus. Denne analysen er også nyttig for å studere effekten av antitrombotiske og platehemmende midler. Denne artikkelen forklarer hvordan man initierer og overvåker FeCl 3-indusert arteriell trombose og hvordan man samler prøver for analyse ved elektronmikroskopi.
Introduction
Trombose er dannelsen av en blodpropp som delvis eller helt blokkerer et blodkar, og hindrer blodets naturlige strømning. Dette fører til alvorlige og dødelige kardiovaskulære hendelser, som iskemisk hjertesykdom og slag. Hjerte- og karsykdommer er den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet, og forårsaker ett av fire dødsfall på verdensbasis 1,2,3. Selv om trombose manifesteres som en funksjonsfeil i det vaskulære systemet, kan det være et resultat av en underliggende mikrobiell eller virusinfeksjon, immunforstyrrelse, malignitet eller metabolsk tilstand. Blodstrømmen opprettholdes av det komplekse samspillet mellom ulike komponenter i det vaskulære systemet, inkludert endotelceller, røde / hvite blodlegemer, blodplater og koagulasjonsfaktorer4. Ved vaskulær skade interagerer blodplater med klebende proteiner på subendotelmatrisen og frigjør deres granulære innhold, som rekrutterer flere blodplater5. Samtidig aktiveres koagulasjonskaskaden, noe som fører til fibrindannelse og avsetning. Til slutt dannes en blodpropp som inneholder blodplater og røde blodlegemer fanget i et fibrinnett6. Selv om antiplatelet og antikoagulerende legemidler er tilgjengelige for å modulere trombose, er falsk blødning fortsatt et stort problem med disse terapiene, og krever finjustering av doser og kombinasjoner av disse legemidlene. Dermed er det fortsatt et presserende behov for å oppdage nye antitrombotiske legemidler7.
Trombose studeres ved hjelp av flere metoder for å forårsake vaskulær skade: mekanisk (fartøyligering), termisk (laserskade) og kjemisk skade (FeCl3 / Rose Bengal-applikasjon). Arten av trombose varierer avhengig av plasseringen (arteriell vs venøs), metode eller omfanget av skaden. Blant alle disse typene er FeCl 3-indusert vaskulær skade den mest brukte metoden. Det har vært brukt på mus, rotter, kaniner, marsvin og hunder 8,9,10,11,12. Metoden er relativt enkel, enkel å bruke, og hvis hovedparametrene er standardiserte, er den sensitiv og reproduserbar i forskjellige vaskulære systemer (f.eks. arterier [carotis og femoral], vener [jugular] og arterioler [cremaster og mesenteric]) (tilleggstabell 1).
Denne modellen kan også brukes til å fremme vår forståelse av mekanikken og morfologien til koagulasjonsdannelse. Denne teknikken gir unikt fordelen av å stoppe trombose ved forskjellige strømningshastighetspunkter, for å studere mellomstadiene av prosessen før den blir okklusiv. Nylige fremskritt innen tromboseforskning har brukt denne modellen til å fokusere oppmerksomheten på ikke-farmakologiske metoder for trombolyse13 eller ikke-invasiv levering av antitrombotiske og / eller fibrinolytiske midler14,15. Flere grupper har vist at når blodplatemembraner er belagt med disse terapiene, kan legemidlene aktiveres ved termisk stimulering for å målrette blodpropper16. Teknikkene beskrevet her kan være nyttige for slike studier som validering av funnene på enkelt blodplatenivå. I dette manuskriptet beskriver protokoll 1 den grunnleggende FeCl 3-medierte vaskulære skadeprosedyren, mens protokoll 2 beskriver metoden for innsamling og fiksering av vaskulær skadeprøve for videre analyse ved elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter diskutert her ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky.
MERK: Kirurgiske instrumenter er oppført i figur 1 og materialfortegnelsen. C57BL/6J mus, 8-10 uker gamle, mannlige/kvinnelige eller relevante genetisk manipulerte (Knockout eller Knockin) stammer ble brukt.
1. FeCl 3-indusert halspulsåreskade
- Induksjon av anestesi på mus
- Vei musen.
- Bedøv musen ved å injisere 0,2 g/kg tribromoetanoloppløsning intraperitonealt (i.p.). Forsikre deg om at bedøvelsesoppløsningen er romtemperert (RT) før den injiseres. Denne dosen er nok til å bedøve musen i ca. 1 time.
- Kontroller tårefleksen ved å klemme tåen 5 minutter etter injeksjonen for å sikre at musen er bedøvet. Hvis musen ikke er bedøvet, vil den trekke tåen bort. Hvis det skjer, vent 5 min og sjekk igjen.
- Hvis musen fortsatt ikke er fullstendig sedert, administrer 1/4 av startdosen og vent i 5 minutter.
- Gjennom hele prosedyren må du regelmessig overvåke bedøvelsesplanet til musen via en tå-klemme. I tillegg kan respirasjonsfrekvens og kroppstemperatur også overvåkes for å opprettholde optimal anestesi.
- Immobiliser musen
- Legg musen på varmeputen (37 °C) i liggende stilling og bruk tape for å immobilisere ekstremitetene.
- Bruk en kirurgisk tråd (0,1 mm) for å forsiktig trekke de øvre fortennene på musen for å utvide livmorhals-/nakkeregionen. Dette er viktig for bedre visualisering av operasjonsområdet og stabilitet av Dopplersonden. Trådstørrelsen er ikke viktig, da den bare brukes til å trekke dyrets fremre tenner for å forlenge nakken.
- Innsnitt
- Spray operasjonsområdet med 70% etanol eller tørk det med en alkoholserviett.
- Bruk en bomullspinne, påfør en liten mengde hårfjerningskrem på operasjonsområdet. Vent i 1-2 min og bruk deretter et vått papirhåndkle eller papirlommetørkle for å fjerne kremen.
MERK: Dette trinnet er viktig for et rent kirurgisk område. - Bruk saks og tang (figur 1B11,1B13) til å lage et midtlinjesnitt fra kjeven til det suprasternale hakket. Trekk inn huden for å få en bedre visualisering av området (figur 2A).
- Eksponering av halspulsåren
- Ved hjelp av kirurgisk tang og mikrodissekerende tang dissekerer du stump den overliggende fascien overfladisk og fjerner den for å eksponere venstre halspulsåre (figur 1B12,1B13). Pass på at du ikke bruker saks på dette stadiet for å unngå å skade andre vaskulaturer i dette området.
- Fjern ekstra vev rundt halspulsåren. Unngå overdreven disseksjon av det omkringliggende vevet, siden dette området har vagusnerven og vertebralarterien.
- Separer halspulsåren fra omkringliggende vev ved å dissekere den med kirurgisk og suturbindende tang (figur 1B12,1B15,2C). Pass på at du ikke forlenger eller trekker arterien for å unngå mekanisk skade på arterien eller den omkringliggende vaskulaturen.
- Plasser et stykke plast under arterien for å markere skadestedet (figur 2D). Bruk et farget gjennomsiktighetsark for å gjøre det lettere å se i det kirurgiske feltet.
- Plassering av strømningssonden
- Plasser Dopplers transoniske strømningssonde i saltoppløsning (0,9 % NaCl idH2O) i ca. 10 minutter før operasjonen. Sett den andre enden av sonden inn i et vedlegg i mengdemåleren for å lette avlesningen av strømningen. Koble mengdemåleren til en datamaskin.
MERK: Ved mellom operasjoner skal Dopplers transoniske strømningssonde være i saltvann. Sørg for å holde sonden fuktig og ren gjennom hele prosedyren. - Plasser ultralyd Doppler transonisk strømningssonde rundt arterien oppstrøms for plasten (figur 2D). Forsikre deg om at sondens holderområde ikke er for utvidet (figur 1C, rød pil).
MERK: Støtt om nødvendig sonden med gasbind (figur 1B1) for å oppnå en passende høyde på sonden, noe som letter den optimale leseposisjonen. - Hvis det kirurgiske området er tørt på dette punktet, legg til noen dråper RT saltvann for å holde området fuktig. Overvåk avlesningen av strømningssonden. Den optimale avlesningen varierer for hvert dyr og kan være hvor som helst mellom 0,6-1,2 ml / min. Hvis den er mindre eller ikke stabil, endrer du posisjonen til strømningssonden for å få en optimal avlesning.
MERK: Pass på at musens hals ikke er for utstrakt, og at operasjonsområdet er rent.
- Plasser Dopplers transoniske strømningssonde i saltoppløsning (0,9 % NaCl idH2O) i ca. 10 minutter før operasjonen. Sett den andre enden av sonden inn i et vedlegg i mengdemåleren for å lette avlesningen av strømningen. Koble mengdemåleren til en datamaskin.
- Registrere opprinnelig flyt
- Etter å ha plassert sonden, må du overvåke blodstrømmen i 2 minutter for å sikre at strømmen er jevn. Deretter registrerer du flyten i 2 minutter (figur 3B) som en grunnlinje. For en detaljert beskrivelse av mengdemåleren, se Subramaniam et al.17.
- For å registrere blodstrømmen, start WinDAQ-programvaren. Klikk på Fil-alternativet og klikk deretter på Record. Lag en ny mappe og fil, og start opptaket. For å stoppe opptaket, klikk på Stopp i filseksjonen.
MERK: WinDAQ-programvaren er fritt tilgjengelig fra utgiveren: https://www.dataq.com/products/windaq/.
- Skade
- Stopp registreringen av flyten. Pass på at du ikke endrer sondeposisjonen slik at avlesningene forblir konsistente etter skaden.
- Tørk området grundig med en serviett/tørkepapir.
MERK: Selv et lite volum gjenværende væske kan endre konsentrasjonen av FeCl 3-oppløsningen som brukes til å forårsake vaskulær skade. Dette fører til variable resultater og påvirker reproduserbarheten. Når området er helt tørt, er sonden ikke i stand til å måle strømmen. - I en plastveiebåt legger du et sirkulært filterpapir (1 mm diameter, kuttet med en ørestans med en diameter på 1 mm). Tilsett 1 μL 6% FeCl3-løsning (laget i dH2O) på filterpapiret.
NOTAT: Sørg for å legge til FeCl3-løsningen rett før du bruker filterpapiret. Bløtlegging av papiret for tidlig kan føre til fordampning av FeCl3-oppløsning og endre alvorlighetsgraden av skaden. - Bruk tynntang til å plukke opp filterpapiret og legge det på arterien oppstrøms sonden, på den delen av arterien som er merket med plasten (figur 2D,E). Denne plasten fungerer som en markør og et avstandsstykke. Det markerer det skadde området og forhindrer utilsiktet fortynning av FeCl3 ved å unngå kontakt med det omkringliggende fuktige området.
MERK: Forsikre deg om at filterpapiret er rett, ikke klemt eller på annen måte brettet på noen måte. Når den er plassert på arterien, må du ikke endre posisjonen til filterpapiret; Dette endrer skadeomfanget. - Etter å ha plassert filterpapiret, start timeren og registrer blodstrømmen. Etter 3 minutter, fjern papiret og tilsett saltvann på skadestedet for å fjerne FeCl3 og stoppe skadeprosessen. Det gjør også området fuktig. På dette stadiet bør blodstrømmen gå tilbake til baseline-nivået, som registrert før skaden.
- Overvåk og ta opp flyten til den reduseres til 10 % av originalopptaket eller når null. Det er en jevn nedgang når tromben begynner å danne seg på skadestedet (figur 3C). Legg merke til eventuelle betydelige svingninger i strømmen i løpet av denne tiden.
- For å studere trombusens stabilitet, registrer den raske økningen i blodstrømmen etter hver signifikant og konsistent reduksjon. Disse hendelsene klassifiseres som embolisering på grunn av ustabil trombose (figur 4D). Etter den konsekvente reduksjonen i strømning kan operatøren se skaden på arterien ved avslutning av forsøket (figur 2F, blå pil / stiplet oval).
- Fartøyets okklusjonstid er definert som fullstendig opphør av blodstrømmen i minst 1 min. Registrer tidspunktet da en okklusiv trombose dannes, som vist ved nullavlesning eller signifikant reduksjon i strømning.
- Avslutt forsøket etter 30 min. Hvis tromben ikke dannes innen 30 minutter etter overvåking, registrerer du strømmen, stopper opptaket og fjerner sonden.
- Rengjør sonden med 70% etanol og en børste for å fjerne gjenværende vev / hår eller rusk. Tørk sonden helt før du legger den i oppbevaringsboksen. Tørk sonden helt før du legger den i oppbevaringsboksen for langtidsoppbevaring.
- Euthanize musen ved cervical dislokasjon. Legg i avfallsposen, merket med laboratoriets navn og dato.
2. Innsamling og klargjøring av prøver for seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) studier etter FeCl 3-indusert skade
MERK: EM-protokollen som presenteres er egnet for prøveklargjøring for SBF-SEM. Denne bildebehandlingsteknikken gir en enestående evne til å studere den tredimensjonale strukturen av blodplater i en blodpropp. Med denne teknikken visualiseres prøven som en serie sekvensielle blokk SEM-bilder, generert når man går gjennom prøven. Nøkkelpunkter for dette preparatet er: 1) prøven må være farget med tungmetaller pre-embedding; og 2) den innebygde plastprøven må trimmes på riktig måte for montering i SEM (se figur 6 for et visuelt bilde av trimmede prøver). Farging etter innebygging er ikke mulig innenfor SEM. Når du samler en prøve fra en FeCl 3-indusert karskade for EM-analyse, må følgende endringer gjøres mens du utfører operasjonen. Modifikasjonene i den presenterte FeCl 3-operasjonsprotokollen gjelder også for enhver form for elektronmikroskopi. Anestesiforholdene og trinnene for å gjøre et snitt og eksponere halspulsåren er de samme som i protokoll 1.
- Etter å ha eksponert halspulsåren, skadestedet ved løst å omringe området mellom to kirurgiske tråder (størrelse: 0,1 mm) (figur 5A,B).
- Plasser sonden under arterien, distalt fra nedre tråd (figur 5C).
- Sett plastbiten under arterien mellom de to trådene for å markere stedet for FeCl3-skade (figur 5C).
- Ta strømningsmålinger før du utfører skade for å merke basalstrømmen. Disse målingene brukes til å bestemme på hvilket stadium prøven skal samles inn.
MERK: Forsikre deg om at fikseringsmiddelet (3% paraformaldehyd / PFA + 0,1% glutaraldehyd, begge laget i 1x PBS) er klar og ved RT. Alternativt kan fiksering med 2,5% glutaraldehyd i saltvannsbakgrunn også brukes.
FORSIKTIG: Både paraformaldehyd og glutaraldehyd er svært giftige og irriterende. Mens du håndterer dem, bør hansker, øyeskjold og masker brukes til å beskytte mot eksponering. Alle fikseringsløsninger er giftige, og fikseringstrinn skal utføres i en avtrekkshette. - Utfør skaden ved å plassere FeCl 3-dynket filterpapir på arterien (8% FeCl 3 brukes) i3 minutter (denne tiden kan også variere). Etter 3 min, fjern filterpapiret og tilsett saltvann på skadestedet for å fjerne overflødig gjenværende FeCl3. Dette trinnet er nødvendig for å forhindre det variable omfanget av skaden og for å lette strømningstelling av sonden (figur 5D).
- Overvåk strømningsavlesningen. Når strømmen faller under 50% av den opprinnelige verdien, fjern sonden. Tørk området raskt og legg til fikseringsmiddelet i området for å fikse skadeområdet eksternt.
- Hold straks arterien nær skadeområdet med tang, og kutt nedstrøms for den nedre tråden og oppstrøms for den øvre tråden. Be om nødvendig en annen person om å hjelpe til med å kutte den ene enden. Sett vevet på plastvevskulturskålen i samme retning som det ble samlet, og tilsett noen dråper fikseringsmiddelet.
MERK: Kutting av arterien forårsaker umiddelbar omfattende blødning, så sørg for å holde arterien før du kutter den første gang. I dette scenariet er musen exsanguinated. Musen avlives ved ekssanguinering og cervikal dislokasjon. - Bruk en skalpell, rengjør det ekstra vevet rundt arterien. Vær oppmerksom på å registrere orienteringen av blodstrømmen. For å markere det, kutt den ene enden horisontalt og den andre avsmalnende / skrå (figur 5E).
- Hold prøven i fikserende middel (3% PFA og 0,1% glutaraldehyd) i 1 time ved RT. Deretter lagrer du prøven i 1% PFA ved 4 ° C til den sendes på våt is til prøvebehandlingslaboratoriet for EM-analyse.
MERK: Prøvene skal ikke fryses. Utfordringene for denne metoden for prøveinnsamling er:- Den første avlesningen kan ikke være optimal eller kan svinge etter skaden. Dette kan påvirke skadeomfanget som velges å pågripe for EM-analyse. For å løse dette problemet, sørg for å registrere grunnlinjeavlesningen i noen minutter, etter å ha prøvd forskjellige posisjoner for å plassere sonden for å bestemme hvilken posisjon som er optimal.
- Tiden for å arrestere skaden ved å legge til ekstern fiksativ og faktisk skjæring av arteriell seksjon for analyse kan gi variasjon i omfanget av trombose. Vær rask under prøveinnsamling etter fiksering eksternt.
- Motta prøvene for behandling for EM-analyse i 1% PFA på våt is. Skyll prøvene i 3 min, på is, med 0,1 M kakodylatbuffer for å starte videre behandling.
- Fest prøvene i 1 time på is i 0,1 M kakodylatbuffer + 2,5% glutaraldehyd + 2 mM CaCl2.
- Fikseringsmiddelet skal kastes og vaskes med en kald 0,1 M natriumkakodylatbuffer inneholdende 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (figur 6A).
- Fest prøvene med osmiumoppløsning (3% kaliumferrocyanid [K 4 C 6 N6Fe] + 0,3M kakodylatbuffer + 4 mM CaCl 2 blandet med et likt volum på 4% vandig osmiumtetroxid [OsO4; i ddH2 O]) i 1 time på is.
- Mens prøvene fikseres, lager du fersk 1% trikloracetaldehydhydrat (TCH) oppløsning i ddH2O. Inkuber oppløsningen ved 60 ° C i 1 time mens du blander forsiktig.
- Etter fiksering vaskes prøvene med ddH2O ved RT i 5 x 3 min.
- Inkuber prøvene i filtrert 1% TCH-løsning (laget i ddH2O) i 20 minutter ved RT.
- Vask prøvene med ddH2O ved RT (5 x 3 min).
- Fest prøvene i 2% osmiumtetroxid i ddH2O i 30 min ved RT.
- Vask prøvene med ddH2O ved RT i 5 x 3 min hver.
- Plasser prøvene i 1 % uranylacetat (vandig) og inkuber over natten ved 4 °C.
- Vask prøvene med ddH2O ved RT i 5 x 3 min hver, og behandle dem med en bloc Waltons bly aspartatfarging.
- En bloc Waltons bly aspartatfarging3:
- Lag 30 mM L-asparaginsyreoppløsning i ddH2O.
MERK: Asparaginsyren oppløses raskere hvis pH heves til 3,8. Denne stamløsningen er stabil i 1-2 måneder hvis den oppbevares i kjøleskap. - Lag 20 mM blynitratoppløsning i 10 ml asparaginsyrelager, og juster pH til 5,5 med 1 N KOH.
- Legg prøvene i blyaspartatoppløsning ved 60 °C i 30 minutter, etter fem vask med ddH2O ved RT, hver i 3 minutter.
- Lag 30 mM L-asparaginsyreoppløsning i ddH2O.
- Dehydrer prøvene med en gradert etanolserie. Bruk kjemisk dehydrering av Valdivia-protokollen18.
- Vask prøvene i hver av følgende oppløsninger for gradvis å dehydrere prøven (figur 6B):
25% etylalkohol i 3 min
50% etylalkohol i 3 min
75% etylalkohol i 3 min
95% etylalkohol i 3 min
100% etylalkohol i 10 min, og gjenta trinnet to ganger (totalt tre vasker).
- Vask prøvene i hver av følgende oppløsninger for gradvis å dehydrere prøven (figur 6B):
- Vask prøvene i 100% propylenoksid (PO) i 10 minutter, og gjenta trinnet to ganger (totalt tre vasker).
- Inkuber i 50% / 50% PO / harpiks med DMP 30 aktivator over natten på RT, og legg inn 100% Araldite 502 / embed 812 / DDSA med DMP30 aktivator i 48 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene presenteres generelt som tid til okklusjon, eller tid som kreves for å danne en fullstendig okklusiv trombe. Disse dataene kan plottes som en Kaplan-Meier-overlevelseskurve (figur 4A)19, et punktdiagram med søyler som viser den terminale blodstrømmen på tidspunktet for enten opphør av blodstrømmen eller avslutningen av et eksperiment (figur 4B), eller som en linjegraf (figur 4C). Trombusstabilitet kan studeres ved hjelp av denne teknikken. I de fleste tilfeller, ved FeCl3-skade, dannes trombusen gradvis, og når den vokser, reduseres blodstrømmen gradvis og når null ved fullstendig okklusjon av fartøyet. I noen tilfeller øker blodstrømmen plutselig etter en gradvis reduksjon i noen minutter. Dette tolkes som delvis utskilling av den voksende tromben, og kan betraktes som en emboliseringshendelse (figur 4D). Okklusiv trombemorfologi (figur 7A) kan også studeres ved hjelp av denne metoden.
Tabell 1: Potensielle tekniske utfordringer i FeCl 3-indusert trombosemodell og løsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1 Kirurgiske instrumenter nødvendig for å utføre FeCl 3-indusert carotistrombose hos mus. (A) 1: LEICA S8AP0 mikroskop og stativ. 2: Lite dyr oppvarmet pute dekket av aluminiumsfolie. (B) 1: Gasbind svamper. 2: 26 G x 3/8 kanyle. 3: 1 ml sprøyte. 4: Sterile applikatorer med bomullstipp. 5: Svart flettet silkeutur. 6: Kirurgisk blad. 7: Knivhåndtak i rustfritt stål. 8: Kommersiell hårfjerningskrem. 9: Øreslag. 10: Dissekere saks. 11: Fin saks. 12: Kirurgisk tang. 13: Mikro dissekere tang. 14: Øye dressing tang. 15: Suturbindende tang. (C) Transonisk strømningssonde med det fleksible området (rød pil) og et hakk som holder et fartøy (svart pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Kirurgiske tiltak for å klargjøre halspulsåren for skade og måle okklusjon av kar. Bruk saks og kirurgisk tang, lage en midtlinjeseksjon og trekk forsiktig bort vevet (A) for å eksponere halspulsåren under den (B). Den svarte pilen viser retningen av blodstrømmen (B). Rengjør det omkringliggende vevet som omkranser halspulsåren (C) og legg et stykke plastpapir (gul plast vist med en svart pil) og sonden (D). Skad beholderen ved å plassere FeCl3-gjennomvåt filterpapir (vist med en rød pil) på arterien (E). Fjern papiret og overvåk skaden. På slutten er skaden synlig som en gulhvit strek, indikert med den blå pilspissen (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Blodstrømavlesning ved hjelp av mengdemåleren. Blodstrømmen i halspulsåren måles ved hjelp av en flowmeter (A). Flyten registreres ved hjelp av en postfunksjon i filfanen (B). Utgangsstrømmen bør være relativt konstant før skaden gjennomføres (ca. 0,8 ml/min, vist med svart pil) (B). Etter skaden reduseres blodstrømmen jevnt (ca. 50% reduksjon fra startverdien, ca. 0,4 ml / min), vist med en svart pil (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative datapresentasjoner fra FeCl 3-indusert carotisskademodell. Ulike metoder tilgjengelig for å presentere data fra FeCl 3-indusert vaskulær skade er vist. Kaplan-Meier-overlevelseskurver viser tid til okklusjon for hver mus. En log-rank test utføres for statistisk analyse. p ≤ 0,001 (A). Blodstrømmen på slutten av forsøket kan også representeres i et søylediagram (B). For dataene representert i B ble det utført en uparet t-test *** p ≤ 0,001. Feillinjen representerer gjennomsnittlig ± SD. Dopplerstrømningsdataene samlet inn etter skade fra et enkelt dyr kunne presenteres i en linjegraf (C). Eksempel på en potensiell emboliseringshendelse ved den plutselige økningen i blodstrømmen etter en vedvarende gradvis reduksjon i strømmen i en enkelt mus på forskjellige tidspunkter (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Innsamling av FeCl 3-induserte skadepropper for elektronmikroskopistudier. Etter å ha eksponert en arterie (A), merk skadestedet ved å binde trådene løst (B), og plasser plastpapiret under arterien og sonden nedstrøms for den (C). Utfør skaden og overvåk skaden (D). Samle vevet som forklart i teksten, og rengjør og kutt prøven rett på den ene siden og skrå på den andre siden for å vise retningen på blodstrømmen (den svarte pilen viser retningen på blodstrømmen og den røde konturen indikerer det skadede området) (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Postfiksasjonsprosessering og montering av prøver for elektronmikroskopi. Prøvene vaskes i mikrosentrifugerør mellom behandlingstrinn (A) og serielt dehydrert med økt konsentrasjon av etanol (B). Etter bearbeiding er de innebygd i harpiks (C), og blokkene er merket med retningen av blodstrømmen (D) og deretter kuttet i skiver for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7 Representative elektronmikrografer av proksimale og distale regioner av en fullstendig okklusiv trombe etter FeCl3-mediert carotisskade. (A) Et komplett tverrsnitt av en okkludert arterie, proksimalt for skadestedet, med innsatser under, som viser strukturer ved høyere forstørrelse (a: 2x og a': 4x). Det skadde området er angitt med en pil i A. Skala bar: 100 μm. (B) Et komplett tverrsnitt av en okkludert arterie, distalt for skadestedet, med innsatser under, som viser strukturer ved høyere forstørrelse (b: 2x og b': 4x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: En kort undersøkelse av variasjoner i dyremodeller, FeCl 3 skadested, FeCl3-konsentrasjon, skademetode og trombosetider. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den topiske anvendelsen av FeCl3 til vaskulaturen for å indusere trombose er en mye brukt teknikk, og har vært medvirkende til å etablere roller for forskjellige blodplatereseptorer, ligandsignalveier og deres hemmere20,21,22,23. Mekanismen gjennom hvilken FeCl3 forårsaker trombose er mangesidig; Tidligere ble endotelial denudasjon ansett som en årsak til trombose, men de siste årene har flere rapporter antydet rollen som røde blodlegemer og plasmaproteiner i denne prosessen24,25,26,27.
De mest kritiske trinnene i denne protokollen er: plassering av Doppler-sonden for å få en optimal strømning, plassering av filterpapiret og rask avslutning av skaden for å hente og umiddelbart fikse prøven. Konsekvensene av uhell i disse trinnene og hvordan de kan håndteres er beskrevet i tabell 1. Selv om det er enkelt og følsomt, kan denne teknikken være utfordrende å bruke, avhengig av dyremodell, dyrebakgrunn, sted for vaskulær skade, konsentrasjon av FeCl 3, FeCl3 påføringsmetode, varighet av påføring, dyrs alder og kjønn og type anestesi som brukes. Disse forskjellene kan forklare det relativt brede spekteret av trombosetider i C57BL/6J rapportert i litteraturen (tilleggstabell 1)27,28,29,30,31,32. Denne protokollen foreslår å bruke 8-10 uker gamle mus til forsøket, da vaskulaturstørrelsen er lettere å visualisere og operasjonere. Noen grupper har brukt mus så unge som 6 uker gamle33. Det er viktig å aldersmatche musene for konsistent og reproduserbar sammenligning mellom ulike dyregrupper. Anestesien som er beskrevet, tribromoetanol, foretrekkes fordi den er lett tilgjengelig, er lettere å administrere, den opprettholder et bedøvelsesplan i den nødvendige varigheten, og doseringen som kreves er reproduserbar. Mange andre bedøvelsesalternativer er tilgjengelige, inkludert isofluran og forskjellige kombinasjoner av tribromoetanol med tertiær amylalkohol med xylazin og/eller acepromazin. Det er viktig å bruke en optimal dose for å oppnå sedasjon uten å påvirke hjertefrekvensen eller blodtrykket til dyret negativt. Bruk av samme metode for anestesi gjennom hele forsøket forhindrer potensielle sammensatte effekter på trombosetiden.
Dette manuskriptet presenterer en detaljert prosedyre for å minimere datavariasjoner og øke reproduserbarheten. En tabell er gitt for å feilsøke noen problemer som kan oppstå under denne operasjonen (tabell 1). I tillegg foreslår dette manuskriptet en metode for å samle prøver på slutten av skaden for å studere strukturen og morfologien til en okklusiv trombe (figur 7). Oppløsningen av EM gir en bedre visualisering enn det som tidligere var mulig25 av blodplater i en voksende thombus, og hvordan de interagerer med andre blodplater og endotelet både proksimalt og distalt for vaskulær skade. Det kan også brukes til å studere ulike aktiveringsstadier av blodplater på skadestedet.
En annen viktig fordel ved denne teknikken er at operatøren kan bruke baselineavlesninger for å bestemme på hvilket stadium trombusprøven samles inn. Det skal bemerkes at dette er omtrentlige tidspunkter og ikke angir det nøyaktige omfanget av skade/trombose. Basale avlesninger er avhengig av optimal plassering av sonden, og hvis den ikke er plassert riktig, kan avlesningene bare registrere delvis strømning. Dette fører til feil tolkning av avslutningstiden og dermed morfologien til den innsamlede prøven. Rask avslutning av skadeprosessen og umiddelbar fiksering av prøvene er nødvendig for å oppnå konsistente og reproduserbare resultater.
Denne protokollen presenterer de minste nødvendige innstillingene for evaluering av okklusiv trombose. Med fremskritt innen mikroskopi har flere grupper brukt denne teknikken til å fluorescerende merke blodplater / endotelceller og / eller blodplatereleasatet, som PF4 og P-Selectin og fibrin, for å visualisere spesifikke aspekter av in vivo trombose og for å bestemme kinetikken 34,35. Som beskrevet kan metoden her rapportere om emboliseringshendelser, som indikerer trombeinstabilitet (figur 4D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter knyttet til denne studien.
ORCID-profiler: SJ: 0000-0001-6925-2116; SWW: 00000-0001-5577-0473.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmene av Whiteheart Laboratory for deres grundige gjennomlesning av dette manuskriptet. Arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 og HL150818), og en Department of Veterans Affairs Merit Award til S.W.W., R01 HL 155519 til BS, og NIBIB intramural program grant til RDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1x2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A.
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P.
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
