Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/65030
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Chan Zuckerberg Biohub, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 3Programs in Human Genetics and Biological Sciences, University of California San Francisco

Summary

עבודה זו מפתחת בדיקת ספיגת נוגדנים להדמיית איתות תוך שושלת Notch/DeltaD בחלוקת אבות גליה רדיאלית במוח דג הזברה העוברי.

Abstract

חלוקת תאים אסימטרית (ACD), המייצרת שני תאי בת בעלי גורלות שונים, היא בסיסית ליצירת מגוון תאי. באיברים המתפתחים הן של חסרי חוליות והן של בעלי חוליות, חלוקה א-סימטרית של אבות יוצרת בת נוץ'היי המתחדשת מעצמה ובת נוץ'לו מבדילה. במוח של דגי זברה עובריים, אבות גליה רדיאלית (RGPs) – תאי הגזע העצביים העיקריים של בעלי החוליות – עוברים לרוב ACD כדי ללדת RGP אחד ותא עצב מתמיין אחד. הבהירות האופטית והנגישות הקלה של עוברי דגי זברה הופכות אותם לאידיאליים עבור הדמיה בהילוך מהיר in vivo כדי להמחיש ישירות כיצד ומתי אסימטריה של איתות Notch נוצרת במהלך ACD. מחקרים אחרונים הראו כי אנדוציטוזה דינמית של ליגנד Notch ligand DeltaD ממלאת תפקיד מכריע בקביעת גורל התא במהלך ACD, והתהליך מווסת על ידי וסת הקוטביות השמור אבולוציונית Par-3 (הידוע גם בשם Pard3) והקומפלקס המוטורי של הדיניין. כדי להמחיש את דפוסי הסחר in vivo של אנדוזומי איתות Notch ב-RGPs מיטוטיים, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים הזו. באמצעות הבדיקה, חשפנו את הדינמיקה של אנדוזומים המכילים DeltaD במהלך חלוקת RGP.

Introduction

איתות חריץ שולט בהחלטה ובדפוס של גורל התא במהלך ההתפתחות במטזואנים1, ומחקרים אחרונים הראו כי איתות Notch בחלוקת תאי גזע תלוי בעיקר בסחר אנדוציטי 2,3. Endocytosed Notch/Delta יכול להפעיל איתות Notch בגרעין ולשפר את השעתוק של גנים המטרה Notch 4,5,6. תנועה אנדוזומלית מסוג Directional Notch/Delta נצפתה לראשונה בתאי Drosophila sensory organy precursor (SOP) במהלך חלוקת התאים הא-סימטרית שלה (ACD), וכתוצאה מכך פעילות איתות Notch גבוהה יותר ב-pIIa מאשר ב-pIIb 7,8. בדיקות ספיגת נוגדנים עם נוגדנים אנטי דלתא ואנטי Notch יושמו כדי לפקח על התהליך האנדוציטי בתאי SOP מיטוטיים. אנדוזומים מסוג Notch/DeltaD נעים יחד עם חלבון קינזין מוטורי אל הציר המרכזי במהלך הציטוקינזיס, ועוברים טרנסלוקציה אסימטרית לתא pIIa עקב המערך האנטי-מקבילי של הציר המרכזי הא-סימטרי ברגע האחרון של חלוקת התא 3,8. מחקרים אלה שפכו אור על המנגנונים המולקולריים המווסתים חלוקה אסימטרית בתאי SOP דרוזופילה, אך לא ברור אם תהליכים אנדוציטיים דומים מתרחשים באבות גליה רדיאלית של בעלי חוליות (RGPs).

יתר על כן, המנגנונים המולקולריים המווסתים איתות Notch/DeltaD אסימטרי במהלך חלוקת RGP של בעלי חוליות אינם מובנים היטב. בדגי זברה, דווח כי האינטראקציה של Notch ו- Delta מקלה על אנדוציטוזה של ליגנד DeltaD9. לא ידוע אם אנדוציטוזה של DeltaD יכולה להשפיע על בחירת גורל התא של תאי בת במוח החוליות המתפתח. מחקרים אחרונים מראים כי הזרקת נוגדנים אנטי-דלתא-D מצומדים פלואורסצנטית לתוך הצינור העצבי יכולה לתייג אנדוזומי Sara באופן ספציפי בתאים נוירואפיתליאליים, ואנדוזומי אנטי-DeltaD המכילים Sara מפרידים באופן מועדף לתאי בת מתרבים10. הוצע כי איתות Notch מהאנדוזומים יכול לווסת את גורל תאי הבת. תוצאות קודמות הראו שרוב תאי RGP של דגי זברה במוח הקדמי המתפתח עוברים ACD, וקביעת גורל תאי הבת תלויה באיתות Notch/DeltaD11. על מנת להבהיר את טבעו של איתות Notch/DeltaD תוך שושלת בדגי זברה, פיתחנו את בדיקת ספיגת הנוגדנים נגד DeltaD במוח המתפתח של דגי זברה. באמצעות פרוטוקול זה, ביצענו בהצלחה תיוג חי והדמיה של סחר אנדוציטי DeltaD ב- RGPs מיטוטיים.

הנוגדן נגד DeltaD המסומן באופן פלואורסצנטי מופנם ביעילות לתוך RGPs לאורך החדר הקדמי במוח. זה הקל מאוד על גילוי הסחר הכיווני של אנדוזומי DeltaD בחלוקה אסימטרית של RGPs12,13. בהשוואה לפרוטוקולים קודמים של ספיגת נוגדנים שפותחו עבור תרביות Drosophila notum וחוט השדרה 10 של דג הזברה, פרוטוקול זה השיג תיוג אנטי-DeltaD ארוך טווח ויעיל ביותר בשכבת תאי חדר המוח, במיוחד עם פחותמ-10 nL של תערובת נוגדנים במיקרו-הזרקה. הזרקת חדר המוח האחורי נוחה מאוד ליישום בדיקת ספיגת הנוגדנים במוח המתפתח, שכן חדר המוח האחורי מורחב היטב בעוברים של דגי זברה ומתמלא בנוזל מוחי שדרתי בשלב ההתפתחות המוקדם14. על ידי הזרקת תערובת הנוגדנים לחדר המוח האחורי מבלי לפגוע ברקמות מתפתחות חיוניות, הפרוטוקול מזער ככל האפשר נזק אפשרי לאזור הדימות במוח הקדמי. המינון המופחת של הנוגדן הראשוני המוזרק מנע גם מתופעות לוואי אפשריות של הפרעה לאיתות אנדוגני של Delta-Notch in vivo. פרוטוקול זה יכול להיות משולב בקלות עם הפרעות פרמקולוגיות או גנטיות אחרות, בשימוש בשלבים התפתחותיים שונים, ואולי מותאם למוח הבוגר, כמו גם אורגנואידים מוח דו-ממדיים / תלת-ממדיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. יחד, הפרוטוקול איפשר להבין כיצד ומתי נוצרת אסימטריה באיתות Notch במהלך ACD. האתגר העיקרי ליישום מוצלח של פרוטוקול זה הוא להשיג אספקה מדויקת של ריכוזים מתאימים של הנוגדן בהתבסס על תנאי ניסוי ספציפיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השתמשנו בקו מסוג AB פראי וקו מהונדס Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] לצורך המחקר. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו, ארה"ב (מספר אישור: AN179000).

1. הכנת עוברים של דגי זברה

  1. הציבו מכלי חציית דגים בשעות אחר הצהריים לפני השעה 17:00, עם נקבת דג בר אחת ודגי Tg זכר אחד [ef1a:Myr-Tdtomato] על ידי שימוש במחיצות כדי להפריד ביניהם בכל מכל.
  2. הסר את המחיצות לפני השעה 11:00 מכל מכלי המעבר למחרת בבוקר. שמור על שקט ואל תפריע לדגים בזמן שהם מזדווגים. ההשרצה מתרחשת בדרך כלל תוך 30 דקות לאחר הסרת החוצצים. הביציות המופרות נשארות בתחתית המיכל.
    1. לאסוף ביצים מופרות מן המיכלים עם מסנן רשת. מעבירים את הביציות על ידי שטיפתן לצלחת פטרי מלאה במי ביצים ובוחנים את העוברים תחת מיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 10 עד פי 20.
  3. העבירו את העוברים המופרים לצלחת פטרי נקייה המכילה כ-20 מ"ל של תווך עובר (100 מ"ל של תמיסת מלאי פי 1,000 מכילה 29.4 גרם NaCl, 1.27 גרם KCl, 4.85 גרם CaCl 2.2H 2 O ו-8.13 גרם MgSO4.7H 2O) עם פיפטות פסטר מזכוכית גדולה. שמור את העוברים ב 28 ° C. שמור 50 עוברים מופרים לכל צלחת פטרי עם 30 מ"ל של עובר בינוני ב 28.5 ° C.
    הערה: זוג דגים אחד מייצר בדרך כלל 100-300 עוברים, ושיעור ההפריה וההישרדות של עוברים בריאים הוא מעל 95% עבור כל הזדווגות.
  4. למחרת בבוקר, הוציאו את העוברים מהאינקובטור בשעה 8:00 בבוקר, כאשר העוברים הגיעו לשלב התפתחותי של ~18-20 שעות לאחר ההפריה (hpf). צפו בהם תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהגדלה של פי 20, תוך שימוש באור לבן בהתחלה. בשלב זה, עוברי דגי הזברה נמצאים בשלב 20 הסומיט.
    1. השליכו עוברים מתים עכורים או קרועים מתחת למיקרוסקופ באמצעות פיפטה מזכוכית.
  5. הפעל את מנורת הפלואורסצנט ובחר את הגדרת מסנן RFP של המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות אדומה חזקה ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מי ביצה.
    1. יש לפרק את העוברים ידנית בעזרת שני מלקחיים עדינים (קצות המלקחיים צריכים להיות חדים ולא פגומים) תחת אור לבן (טבלת חומרים).
    2. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד ועשו קרע בכוריון עם המלקחיים האחרים. פתחו את הקרע בזהירות בעזרת המלקחיים, והפכו אותו לגדול מספיק כדי שהעובר יוכל לעבור דרכו על ידי דחיפת העובר בעדינות עם קצות המלקחיים האחרים.
  6. העבירו את העוברים המפרקים לצלחת פטרי חדשה עם מדיום עוברי טרי לשטיפה מהירה לפני מיקרו-הזרקה.

2. הכנת מיקרו-הזרקה

  1. השתמש בנימים (1.2 מ"מ OD, 0.9 מ"מ ID, עם חוט להט) למשיכת מחטי הזרקה עדינות על מושך. תכנן וייעל את תוכנית המשיכה בהתאם למדריך.
  2. פתח את קצה המחט עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו. הפוך את קוטר הקצה סביב 10 מיקרומטר, ואת זווית התחדדות סביב 30°.
  3. הצמד את הנוגדן החד-שבטי נגד Dld של העכבר עם האנטי-עכבר-IgG-Atto647N לפני ההזרקה.
    1. עבור כל ניסוי הזרקה, לערבב 0.5 μL של נוגדן anti-Dld (0.5 מ"ג / מ"ל) עם 2 μL של נוגדן נגד עכבר IgG-Atto647N (1 מ"ג / מ"ל) על ידי pipetting 5-10 פעמים. לאחר מכן, דגרו בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות (או על קרח במשך 2-3 שעות).
    2. לאחר הדגירה, הוסף 2.5 μL של חיץ חוסם (10 מ"ג / מ"ל עכבר IgG) ו 0.5 μL של 0.5% פנול אדום לתערובת הנוגדנים, ופיפטה 10x כדי לערבב היטב, כדי לחסום נוגדנים לא מצומדים שנותרו בתערובת.
      הערה: עבור כל ניסוי, הכינו תערובת אחת נוספת ללא נוגדן נגד Dld והשתמשו בה כבקרה.
  4. הכינו אגרוז של 1% נקודת התכה נמוכה בתווך העוברי. מחממים את תערובת האגרוז ב-70 מעלות צלזיוס עד שהתערובת הופכת לשקופה.
    1. Aliquot פתרון agarose ב 2 מ"ל צינורות microcentrifuge. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
  5. יש לשטוף את העובר בצינור המכיל 1% נקודת התכה נמוכה למשך 3 שניות.
  6. הניחו את העובר על מכסה צלחת פטרי מפלסטיק הפוך יחד עם טיפות בודדות של אגרוז (~30-40 μL) כדי להרכיב כל עובר בנפרד על המכסה, כפי שמוצג באיור 1. הניחו את העוברים שטוחים לרוחב באגרוז ושמרו על תנוחה זו עד שהאגרוז התמצק בטמפרטורת החדר.
  7. הר 12 עוברים בשלוש שורות אחד אחד כמו לעיל. מכסים את כל העוברים הרכובים באגרוז עם מדיום ביצית.

3. מיקרו-הזרקה

  1. שים את העוברים המשובצים מתחת לסטריאומיקרוסקופ וכסה את האגרוז במי ביצה.
  2. מקמו את מזרק לחץ האוויר יחד עם מיקרומניפולטורים, ומקמו אותם קרוב למיקרוסקופים כפי שמוצג באיור 1. השתמש בבלון גז פלדה המכיל חנקן גזי (N2) בלחץ גבוה כמשאב האוויר.
    1. פתח את שסתום הגז רק לאחר שהעוברים הותקנו באגרוז. לאחר מכן, טען מקדימה את מחט הזכוכית המוכנה עם 2 μL של תערובת נוגדנים על המיקרומניפולטור, כפי שמוצג באיור 1, בעת שימוש במודול המילוי הקדמי של המיקרו-מזרק.
    2. כוונן את לחץ הכניסה ל~80-90 psi, ואת לחץ ההזרקה ל~20 psi.
  3. כיול נפח ההזרקה באמצעות מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ, כפי שתואר קודם15. הגדר את משך זמן הכוונון להיות בין 10 אלפיות השנייה ל- 120 אלפיות השנייה, בהתאם לגודל פתח המחט. העבר כל פעימה של הזרקה על ידי הקשה על המשוט. כוונן את נפח ההזרקה של כל מסירה ל~ 4-5 nL.
  4. יש לדחוף את קצה מחט המיקרו-הזרקה דרך לוחית הגג הגבית של המוח האחורי לנקודת הציר r0/r1, ולהזריק כ-10 nL (שתיים או שלוש פעימות) של תערובת נוגדנים מבלי לפגוע ברקמת המוח. שימו לב לזרימת נוזלים אדומים בחדר המוח.
    הערה: חדר המוח האחורי הוא אחורי לגבול המוח האחורי של המוח האמצעי. תערובת הנוגדנים המוזרקת המכילה פנול אדום ממלאת את חדר המוח מהמוח האחורי למוח הקדמי באופן מיידי על ידי פיזור עם נוזל מוחי שדרתי.
  5. לאחר ההזרקה, להסיר את קצה המחט מן העובר במהירות על ידי סיבוב הידית של micromanipulator. להזרקה מוצלחת, הצבע האדום של התערובת המוזרקת נשאר בחדר המוח ביציבות מבלי לדלוף לתוך האגרוז שמסביב.
  6. הזיזו את לוחית ההרכבה מתחת למיקרוסקופ כדי לאתר עובר רכוב אחר במיקום מתאים לחזרות.
    1. לאחר הזרקת שישה עד שמונה עוברים, מקלפים את האגרוז בסכין מיקרוכירורגית כדי לשחרר את העוברים מהאגרוז המשובץ. מעבירים את העוברים המוזרקים לצלחת טרייה עם 30 מ"ל של תווך עובר, ומניחים אותם בטמפרטורת החדר לשלבים הבאים.

4. הדמיה חיה של הרכבה וקיטועי זמן

  1. לאחר 30 דקות, להעביר את העוברים שנבחרו ל 10 מ"ל של מדיום העובר. הוסף 420 μL של מלאי טריקאין (4 מ"ג / מ"ל) ל 10 מ"ל של מדיום העובר כדי להרדים את העוברים.
  2. כדי להרכיב את העוברים, להכין 0.8% נקודת התכה נמוכה agarose המכיל את אותו ריכוז של tricaine בצינור. שמור את aliquots בלוק חום ב ~ 40 ° C.
  3. השתמש פיפטה זכוכית לטבול את העוברים המוזרקים באגרוז חם במשך 3 שניות. לאחר מכן, הוציאו מיד את העוברים מהאגרוז עם אותה פיפטה מזכוכית והניחו את העוברים במרכז צלחות תרבית תחתית זכוכית 35 מ"מ עם טיפת אגרוז מהשפופרת. הניחו על הכוס עובר אחד בלבד בכל טיפה.
  4. כוונו את העוברים בעדינות עם בדיקת סיבים או קצה העמסה כדי לשמור על הצד הגבי של המוח העוברי קרוב ככל האפשר לתחתית הזכוכית. כוונן את תנוחת העובר בעדינות כדי להאריך את העובר מבלי לסלסל כאשר האגרוז מתמצק בהדרגה.
  5. לאחר מכן, בדקו את מיקום העובר על ידי הפיכת צלחת תחתית הזכוכית. ודא כי כל המוח הקדמי הגבי עם עוברים רכובים כראוי ניתן לראות תחת המיקרוסקופ.
  6. הוסף 2-3 מ"ל של 28.5 ° C מחומם מראש תווך עוברי המכיל tricaine כדי לכסות את העובר. הניחו את הצלחת כראוי על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ הקונפוקלי, כפי שמוצג באיור 1. כוונן את הטמפרטורה של תא ההדמיה להיות 28.5 ° C. העובר מוכן כעת להדמיה.
  7. בצע הדמיה חיה בהילוך מהיר עם מרווח זמן קבוע באמצעות יעד טבילה במים של 40x.
    1. השתמש בתוכנת בקרת הדימות והמיקרוסקופ (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
    2. בחרו את תעלות ההדמיה של 564 ננומטר ו-647 ננומטר לצורך הדמיה של פלואורסצנטיות הממברנה של דגי זברה טרנסגניים MyR-Tdtomato ונוגדי Dld-Atto647N אנדוזומליים בתא (איור 1).
    3. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 30% עבור שני הערוצים. השתמש בזמן חשיפה לכל מישור z של 200 אלפיות השנייה עבור כל ערוץ.
    4. עבור כל עובר דג זברה רכוב, השתמש בצעד z סורק של 1 מיקרומטר עבור 20 מישורי z בסך הכל, ובמחזור סריקה של 100 מסגרות זמן.
    5. הגדר את מרווח הזמן בין כל מחזור סריקה ל- 20 שניות ומצב הסריקה כערוץ, פרוסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באיור 2A, העוברים שהוזרקו להם Atto647N, ללא קישור עם הנוגדן הראשוני, הראו פלואורסצנטיות רקע בחדר המוח. מעט מאוד חלקיקים פלואורסצנטיים נבלעים ניתן לראות בתאים. עוברי דגי הזברה שהוזרקו נגד Dld-Atto647N הראו כמויות גדולות של חלקיקים פלואורסצנטיים מופנמים ברוב התאים במוח הקדמי המתפתח (איור 2A, פאנל ימני). לאחר התקרבות כדי להתמקד ב-RGPs מיטוטיים, כפי שמוצג באיור 2B, הצלחנו לתעד את התנועה הדינמית של אנדוזומים תוך-תאיים אנטי-Dld-Atto647N במהלך חלוקת התא (וידאו 1). רוב ה-RGPs המיטוטי הראו הפרדה אסימטרית קדמית או אחורית של אנדוזומים אנטי-Dld-Atto647N לשני תאי בת12. שמנו לב גם שהא-סימטריה התייצבה לקראת סוף האנאפאזה, וכתוצאה מכך נוצרה תורשה אסימטרית של אנדוזומי איתות Notch על ידי תאי הבת לאחר12.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של שלבי ניסוי. דגי זברה טרנסגניים המבטאים את כתב MyR-Tdtomato מוצלבים עם סוג בר AB ביום הראשון. ביום השני, עוברים פלואורסצנטיים אדומים נבחרים למיקרו-הזרקה, ולאחר מכן הדמיה בזמן. כל הניסוי ביום השני לוקח בערך 8 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה בהילוך מהיר של ספיגת נוגדנים נגד Dld-Atto-647N במוח של דגי זברה מתפתחים. (A) ספיגה של נוגדני Dld-Atto-647N לאחר 30 דקות של מיקרו-הזרקה במוח הקדמי של עובר יום אחד לאחר ההפריה (DPF). בפאנל השמאלי נמצא העובר המוזרק עם Atto-647N בלבד. בפאנל הימני נמצא העובר המוזרק עם anti-Dld-Atto-647N. קווי מקף מציינים את השכבה האפיקלית לאורך החדר. אזור המלבן מוצג בהגדלה גבוהה ב-B. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. קיצורים: Di = Diencephalon; תל = טלנספלון; Ve = חדר. (B) לוחות הדמיה בהילוך מהיר של דינמיקה אנטי-Dld-Atto-647N במהלך מיטוזה. שמונה מסגרות הזמן במונטאז' כיסו את כל המחזור המיטוטי, ותיארו את הקליטה וההפרדה של אנטי-Dld-Atto-647N לשני תאי בת של RGP מתחלק. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר קרום התא מתואר. גם ב-A וגם ב-B, סימון MyR-Tdtomato על הממברנה הוא כחול, ו-anti-Dld-Atto-647N הוא מגנטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון 1: דינמיקה של אנטי-Dld-Atto-647N מופנם בחלוקת תאי גליה רדיאליים לאורך מיטוזה (40 מסגרות זמן ומרווח של 30 שניות בין כל מסגרת; 20 דקות בסך הכל). אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו בדיקת ספיגת נוגדנים לתיוג והדמיה של סחר אנדוזומלי Notch/Delta באבות גליה רדיאלית של דגי זברה ביעילות גבוהה. בהשוואה לשיטות קודמות ששימשו למעקב אחר נוגדנים מסומנים נגד DeltaD בתאי SOPדרוזופילה 7,8, השיטה שלנו השתמשה במיקרו-הזרקה במקום דגירה של דגימות בנוגדן המצומד. נוגדנים מצומדים פלואורסצנטית נגד Dld הוזרקו במיקרו לחדר המוח האחורי; טכניקה זו אינה גורמת לפציעה, כפי שמעידה התפתחות תקינה והתאוששות מלאה של עוברים לאחר ההזרקה. החדרים העובריים הם רציפים, ומאפשרים לנוגדן המוזרק להתפזר בחופשיות לכיוון המוח הקדמי לאחר מיקרו-הזרקה. ההזרקה נגד Dld-atto647N נמשכת מעל 24 שעות כמשאב יציב של ספיגת נוגדנים מתמשכת במוח. בהשוואה להזרקת צינור עצבי, שהוצגה בדו"ח קודם10, הזרקת חדר המוח האחורי של דג הזברה אינה גורמת לפגיעה ברקמה ומאפשרת ספיגה סלקטיבית של נוגדי Dld-Atto647N על ידי RGPs מיטוטיים המרפדים את חדרי המוח in vivo. למרות שלא בדקנו את ספיגת הנוגדנים בתאי נוירואפיתל בחוט השדרה, ספיגת הנוגדנים נגד Dld-Atto647N צריכה להיות ישימה שם, בדיוק כמו במוח. הנוגדנים המצומדים המוזרקים לחדר המוח האחורי צפויים להתפזר גם לאורך חוט השדרה.

ליישום מוצלח של בדיקת ספיגת הנוגדנים, הנושא החשוב ביותר הוא להשתמש בנוגדן ראשוני בעל זיקה וספציפיות גבוהה לתחום החוץ תאי של מטרת חלבון הממברנה. בנוסף לתיוג איתות Notch/דלתא, הפרוטוקול ישים לתיוג חלבוני ממברנה אחרים או חלבונים חוץ-תאיים באמצעות אסטרטגיות דומות. הפרוטוקול שלנו הוכיח ספיגה יעילה ביותר של נוגדנים נגד Dld בפיתוח עוברים של דגי זברה בגלל האיכות הגבוהה והספציפיות הגבוהה של הנוגדן הראשוני נגד Dld. שנית, הצמידות של נוגדן ראשוני אנטי-Dld עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי היא קריטית להשגת רמה גבוהה של יעילות ספיגת נוגדנים in vivo. מצאנו שנוגדנים משניים שאינם מלבינים של אטו יציבים יותר ובהירים הרבה יותר מנוגדנים פלואורסצנטיים אחרים, כגון נוגדנים שניוניים של זנון ואלכסה המשמשים בתרביות דרוזופילה נוטום 7,10. בחרנו ב-Atto647N כתווית הפלואורסצנטית, מכיוון שבדרך כלל היינו משתמשים בה יחד עם דגי זברה טרנסגניים GFP או RFP או סמנים פלואורסצנטיים אחרים החולקים אורכי גל עירור דומים לאלה של GFP או RFP. נוגדנים משניים אחרים שאינם ניתנים להלבנה עם אורכי גל עירור שונים צריכים גם הם לעבוד עם הפרוטוקול. בפרוטוקול שלנו, קיצרנו את זמן הדגירה של נוגדנים ראשוניים מעורבבים עם נוגדן Atto משני מ -12 שעות ל -30 דקות, והורדנו את ריכוז הנוגדנים נגד Dld ל -0.05 מ"ג / מ"ל בתערובות המיקרו-הזרקה הסופיות. ריכוז גבוה יותר של נוגדנים נגד Dld (0.25 מ"ג/מ"ל) לא הגדיל את יעילות ספיגת הנוגדנים בעוברים של דגי זברה; זו עשויה להיות הסיבה לצורך בזמני דגירה ארוכים, על מנת להשיג תיוג מספיק עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים10. לא השתמשנו בנוגדנים נגד Dld בריכוז גבוה יותר כמו במחקרים קודמים10, מכיוון שקיימת אפשרות שנוגדנים מוזרקים נגד Dld-Atto647N מתחרים עם Notch/Delta המתבטאים אנדוגנית בעת קשירת ליגנד DeltaD על הממברנה של RGPs, ובכך מפריעים לאיתות cis או trans Notch/Delta in vivo. מצאנו גם כי חסימת חיץ שנוסף לאחר צימוד נוגדנים ראשוני הייתה מועילה להגדלת הספציפיות של בדיקת ספיגת הנוגדנים in vivo. כפי שניתן לראות באיור 2, רוב ה-RGPs במוח הקדמי מפנימים אנטי-Dld-Atto647N באופן פעיל. מבלי להוסיף את המאגר החוסם, רוב התאים מראים מעט מאוד אנדוזומים אנטי-Dld-Atto647N מופנמים (הנתונים אינם מוצגים).

המגבלה העיקרית של הפרוטוקול היא זמינות הנוגדנים שניתן להשתמש בהם לבדיקת הקליטה. הפרוטוקול שלנו ישים לתיוג חלבונים המבוטאים בממברנה, אם קיים נוגדן טוב לתחום החוץ תאי. עבור חלבונים ציטוסוליים וגרעיניים, בדיקת ספיגת הנוגדנים אינה ישימה, מכיוון שהנוגדנים המצומדים אינם יכולים לעבור דרך קרום התא כדי להיקשר למטרות הקישור התוך-תאיות שלהם. הדמיה חיה של חלבונים תוך תאיים תלויה בעיקר בסוגים שונים של מודלים טרנסגניים פלואורסצנטיים. בעשורים האחרונים פותחו יותר צבעים פלואורסצנטיים לדימות תאים חיים, כגון טכנולוגיית סיליקון רודאמין (SiR), שתרמה משמעותית לדימות תאים חיים של DNA, RNA, אקטין וטובולין17. שילוב של אסטרטגיות שונות לתיוג חי יהיה הדרך הטובה ביותר לחקור מסלולי איתות מורכבים בתאים חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

הפרויקט נתמך על ידי NIH R01NS120218, פרס זרעי מרי אן קודה-קימבל של UCSF לחדשנות, וצ'אן צוקרברג Biohub.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm glass bottom culture dish  MatTek corporation P35GC-1.5-10-C
air pressure injector  Narishige IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N  Sigma-Aldrich 50185
CaCl2.2H2O  Sigma-Aldrich C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament World Precision Instruments 1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield Nikin N/A Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. 
Dumont Medical Tweezers Style 5 Thomas Scientific 72877-D
Flaming-Brown P897 puller Sutter Instruments N/A https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl Millipore 529552
MgSO4.7H2O Sigma-Aldrich M2773
micromanipulators World Precision Instruments WPI M3301R
Mouse anti-Dld  Abcam AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon Thermofisher Scientific Z25008
NaCl Sigma-Aldrich S3014
Phenol red Sigma-Aldrich P0290
Stemi 2000   Zeiss  N/A
Tricaine Sigma-Aldrich E10521
UltraPureTM low melting point agarose  Invitrogen 16520050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
  2. Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
  3. Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
  4. Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
  5. Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
  6. Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
  7. Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
  8. Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
  9. Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
  10. Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
  11. Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
  12. Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
  13. Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
  14. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).
  15. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  16. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
  17. Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).

Tags

נסיגה גיליון 191 ספיגת נוגדנים DeltaD אנדוציטוזה הדמיה חיה
בדיקת ספיגת נוגדנים למעקב אחר אנדוציטוזה מסוג חריץ / דלתא במהלך החלוקה הא-סימטרית של אבות גליה רדיאלית של דגי זברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, X., Guo, S. Antibody Uptake… More

Zhao, X., Guo, S. Antibody Uptake Assay for Tracking Notch/Delta Endocytosis During the Asymmetric Division of Zebrafish Radial Glia Progenitors. J. Vis. Exp. (191), e65030, doi:10.3791/65030 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter