Summary
Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.
Abstract
La división celular asimétrica (ACD), que produce dos células hijas de diferentes destinos, es fundamental para generar diversidad celular. En los órganos en desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados, la división asimétrica de progenitores genera una Notchhi auto-renovadora y una hija Notchlo diferenciadora. En el cerebro embrionario del pez cebra, los progenitores de la glía radial (RGP), las principales células madre neurales de vertebrados, se someten principalmente a ACD para dar a luz a un RGP y una neurona diferenciadora. La claridad óptica y la fácil accesibilidad de los embriones de pez cebra los hacen ideales para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo para visualizar directamente cómo y cuándo se establece la asimetría de la señalización Notch durante ACD. Estudios recientes han demostrado que la endocitosis dinámica del ligando Notch DeltaD juega un papel crucial en la determinación del destino celular durante la ACD, y el proceso está regulado por el regulador de polaridad conservado evolutivamente Par-3 (también conocido como Pard3) y el complejo motor de dineína. Para visualizar los patrones de tráfico in vivo de los endosomas de señalización de Notch en los RGP mitóticos, hemos desarrollado este ensayo de captación de anticuerpos. Usando el ensayo, hemos descubierto el dinamismo de los endosomas que contienen DeltaD durante la división RGP.
Introduction
La señalización de Notch controla la decisión y el patrón del destino celular durante el desarrollo en metazoos1, y estudios recientes han demostrado que la señalización de Notch en la división de células madre depende principalmente del tráfico endocítico 2,3. Endocytosed Notch/Delta puede activar la señalización de Notch en el núcleo y mejorar la transcripción de los genes diana de Notch 4,5,6. El tráfico endosomal direccional Notch/Delta se observó por primera vez en células precursoras de órganos sensoriales (SOP) de Drosophila durante su división celular asimétrica (ACD), lo que resultó en una mayor actividad de señalización de Notch en pIIa que en pIIb 7,8. Se han aplicado ensayos de captación de anticuerpos con anticuerpos anti-Delta y anti-Notch para monitorizar el proceso endocítico en células POE mitóticas. Los endosomas Notch/DeltaD se mueven junto con una proteína motora de quinesina al huso central durante la citocinesis, y se translocan asimétricamente en la célula pIIa debido a la matriz antiparalela del huso central asimétrico en el último momento de la división celular 3,8. Estos estudios han arrojado luz sobre los mecanismos moleculares que regulan la división asimétrica en las células SOP de Drosophila, pero no está claro si ocurren procesos endocíticos similares en progenitores de glía radial de vertebrados (RGP).
Además, los mecanismos moleculares que regulan la señalización asimétrica de Notch/DeltaD durante la división RGP de vertebrados no se conocen bien. En el pez cebra, se ha descrito que la interacción de Notch y Delta facilita la endocitosis del ligando DeltaD9. Se desconoce si la endocitosis DeltaD puede afectar la elección del destino celular de las células hijas en el cerebro de los vertebrados en desarrollo. Estudios recientes muestran que la inyección de anticuerpos anti-DeltaD conjugados fluorescentes en el tubo neural podría marcar los endosomas Sara específicamente en las células neuroepiteliales, y los endosomas Sara que contienen anti-DeltaD se segregan preferentemente en células hijas proliferantes10. Se ha sugerido que la señalización de Notch de los endosomas podría regular el destino de las células hijas. Resultados anteriores han demostrado que la mayoría de las células RGP de pez cebra en el cerebro anterior en desarrollo experimentan ACD, y la determinación del destino de las células hijas depende de la señalización intralinaje Notch / DeltaD11. Con el fin de dilucidar la naturaleza de la señalización intralinaje Notch / DeltaD en RGP de pez cebra, hemos desarrollado el ensayo de captación de anticuerpos anti-DeltaD en el cerebro en desarrollo del pez cebra. Usando este protocolo, hemos realizado con éxito el etiquetado en vivo y las imágenes del tráfico endocítico DeltaD en RGP mitóticos.
El anticuerpo anti-DeltaD marcado con fluorescencia se internaliza eficientemente en los RGP a lo largo del ventrículo del cerebro anterior. Ha facilitado enormemente el descubrimiento del tráfico direccional de endosomas DeltaD en los RGPs de división asimétrica12,13. En comparación con los protocolos anteriores de captación de anticuerpos desarrollados para cultivos de Drosophila notum y la médula espinal del pez cebra 10, este protocolo ha logrado un marcado anti-DeltaD duradero y altamente eficiente en la capa de células del ventrículo cerebral, específicamente con menos de10 nL de mezcla de anticuerpos microinyectados. La inyección del ventrículo del cerebro posterior es muy conveniente para aplicar el ensayo de captación de anticuerpos en el cerebro en desarrollo, ya que el ventrículo del cerebro posterior está bien expandido en embriones de pez cebra y lleno de líquido cefalorraquídeo en la etapa temprana de desarrollo14. Al inyectar la mezcla de anticuerpos en el ventrículo del cerebro posterior sin dañar ningún tejido en desarrollo crucial, el protocolo ha minimizado el posible daño a la zona de imágenes en el cerebro anterior tanto como sea posible. La dosis reducida del anticuerpo primario inyectado también ha evitado los posibles efectos secundarios de interferir con la señalización endógena de Delta-Notch in vivo. Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas, utilizarse en diferentes etapas de desarrollo y posiblemente adaptarse al cerebro adulto, así como a los organoides cerebrales 2D / 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. En conjunto, el protocolo ha permitido comprender cómo y cuándo se establece la asimetría de señalización Notch durante ACD. El principal desafío para la implementación exitosa de este protocolo es lograr la entrega precisa de concentraciones apropiadas del anticuerpo basadas en condiciones experimentales específicas.
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Protocol
Hemos utilizado la línea de tipo salvaje AB y la línea transgénica Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] para el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California, San Francisco, EE.UU. (Número de aprobación: AN179000).
1. Preparación de embriones de pez cebra
- Instale tanques de cruce de peces por la tarde antes de las 5:00 p.m., con un pez hembra de tipo salvaje y un pez macho Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] usando divisores para separarlos en cada tanque.
- Retire los divisores antes de las 11:00 a.m. de todos los tanques de cruce a la mañana siguiente. Manténgase callado y no moleste a los peces mientras se aparean. El desove generalmente ocurre dentro de los 30 minutos después de eliminar los divisores. Los huevos fertilizados permanecen en el fondo del tanque.
- Recoja los huevos fertilizados de los tanques con un filtro de malla. Transfiera los huevos lavándolos en una placa de Petri llena de agua de huevo y examine los embriones bajo un microscopio de disección con un aumento de 10x a 20x.
- Transfiera los embriones fertilizados a una placa de Petri limpia que contenga aproximadamente 20 ml de medio embrionario (100 ml de solución madre 1,000x contiene 29.4 g de NaCl, 1.27 g de KCl, 4.85 g de CaCl 2.2H 2 O y 8.13 g de MgSO4.7H 2O) con pipetas Pasteur de vidriode gran calibre. Mantener los embriones a 28 °C. Mantener 50 embriones fertilizados por placa de Petri con 30 mL de medio embrionario a 28.5 °C.
NOTA: Un par de peces normalmente produce 100-300 embriones, y la tasa de fertilización y supervivencia de embriones sanos es superior al 95% para cada apareamiento. - A la mañana siguiente, saque los embriones de la incubadora a las 8:00 a.m., cuando los embriones hayan alcanzado la etapa de desarrollo de ~ 18-20 h después de la fertilización (hpf). Obsérvelos bajo un microscopio de epifluorescencia con un aumento de 20x, usando luz blanca al principio. En ese momento, los embriones de pez cebra están en la etapa de somita 20.
- Deseche los embriones muertos que estén turbios o rotos bajo el microscopio usando una pipeta de vidrio.
- Encienda la lámpara fluorescente y elija la configuración del filtro RFP del microscopio. Luego, seleccione los embriones con fluorescencia roja fuerte y transfiéralos a un nuevo plato con agua de huevo.
- Decorionar los embriones manualmente con dos pinzas finas (las puntas de las pinzas deben ser afiladas y no dañadas) bajo luz blanca (Tabla de materiales).
- Sostenga el corion con un par de fórceps y haga un desgarro en el corion con los otros fórceps. Abra el desgarro con cuidado usando los fórceps y hágalo lo suficientemente grande para que el embrión pase empujando suavemente el embrión con las puntas de los otros fórceps.
- Transfiera los embriones descorionados a una nueva placa de Petri con medio embrionario fresco para un enjuague rápido antes de la microinyección.
2. Preparación de la microinyección
- Utilice los capilares (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, con filamento) para tirar de agujas finas de inyección en un extractor. Diseñar y optimizar el programa de extracción de acuerdo con el manual.
- Abra la punta de la aguja con fórceps bajo un microscopio de disección estéreo. Haga que el diámetro de la punta sea de alrededor de 10 μm y el ángulo cónico de alrededor de 30 °.
- Conjugar el anticuerpo monoclonal anti-Dld de ratón con el anti-Mouse-IgG-Atto647N antes de la inyección.
- Para cada experimento de inyección, mezclar 0,5 μL del anticuerpo anti-Dld (0,5 mg/ml) con 2 μL del anticuerpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/ml) pipeteando 5-10 veces. Luego, incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos (o en hielo durante 2-3 h).
- Después de la incubación, añadir 2,5 μL de tampón de bloqueo (10 mg/ml de IgG de ratón) y 0,5 μL de rojo de fenol al 0,5% a la mezcla de anticuerpos, y pipetear 10 veces para mezclar bien, para bloquear cualquier anticuerpo no conjugado que quede en la mezcla.
NOTA: Para cada ensayo, prepare una mezcla adicional sin el anticuerpo anti-Dld y úsela como control.
- Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% en el medio embrionario. Calentar la mezcla contenida en agarosa a 70 °C hasta que la mezcla se vuelva transparente.
- Alícuota de la solución de agarosa en tubos de microcentrífuga de 2 ml. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.
- Enjuague el embrión en el tubo que contiene un 1% de agarosa de bajo punto de fusión durante 3 s.
- Coloque el embrión en una tapa de placa de Petri de plástico invertida junto con gotas individuales de agarosa (~ 30-40 μL) para montar cada embrión por separado en la tapa como se muestra en la Figura 1. Coloque los embriones planos lateralmente en la agarosa y mantenga esta posición hasta que la agarosa se haya solidificado a temperatura ambiente.
- Monte 12 embriones en tres filas una por una como arriba. Cubra todos los embriones montados en la agarosa con medio de huevo.
3. Microinyección
- Coloque los embriones incrustados bajo el microscopio estereoscópico y cubra la agarosa con agua de huevo.
- Coloque el inyector de presión de aire junto con los micromanipuladores, colocándolos cerca de los microscopios como se muestra en la Figura 1. Utilice el cilindro de gas de acero que contiene nitrógeno gaseoso (N2) a alta presión como recurso de aire.
- Abra la válvula de gas solo después de que los embriones se hayan montado en la agarosa. Luego, cargue frontalmente la aguja de vidrio preparada con 2 μL de mezcla de anticuerpos en el micromanipulador, como se muestra en la Figura 1, cuando use el módulo de llenado frontal del microinyector.
- Sintoniza la presión de entrada a ~80-90 psi y la presión de inyección a ~20 psi.
- Calibre el volumen de inyección usando un micrómetro bajo el microscopio, como se describió anteriormente15. Establezca la duración del tiempo de sintonía para que sea de 10 ms a 120 ms, de acuerdo con el tamaño de la apertura de la aguja. Administre cada pulso de inyección golpeando la paleta. Sintonice el volumen de inyección de cada administración a ~4-5 nL.
- Introduzca la punta de la aguja de microinyección a través de la placa dorsal del techo del cerebro posterior al punto de bisagra r0/r1 e inyecte aproximadamente 10 nL (dos o tres pulsos) de mezcla de anticuerpos sin golpear el tejido cerebral. Observe el flujo de fluidos rojos en el ventrículo cerebral.
NOTA: El ventrículo del cerebro posterior es posterior al límite del cerebro posterior del mesencéfalo. La mezcla de anticuerpos inyectados que contienen rojo de fenol llena el ventrículo cerebral desde el cerebro posterior hasta el cerebro anterior inmediatamente al difundirse con líquido cefalorraquídeo. - Después de la inyección, retire la punta de la aguja del embrión rápidamente girando la perilla del micromanipulador. Para una inyección exitosa, el tinte rojo de la mezcla inyectada permanece en el ventrículo cerebral de manera estable sin filtrarse en la agarosa circundante.
- Mueva la placa de montaje bajo el microscopio para localizar otro embrión montado en una posición adecuada para repeticiones.
- Después de inyectar de seis a ocho embriones, pelar la agarosa con un cuchillo microquirúrgico para liberar los embriones de la agarosa incrustada. Transfiera los embriones microinyectados a un plato fresco con 30 ml de medio embrionario y colóquelos a temperatura ambiente para los próximos pasos.
4. Montaje e imágenes en vivo de lapso de tiempo
- Después de 30 min, transfiera los embriones seleccionados a 10 ml de medio embrionario. Agregue 420 μL de stock de tricaína (4 mg / ml) a 10 ml de medio embrionario para anestesiar los embriones.
- Para montar los embriones, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,8% que contenga la misma concentración de tricaína en el tubo. Mantener las alícuotas en un bloque de calor a ~40 °C.
- Utilice una pipeta de vidrio para sumergir los embriones inyectados en la agarosa caliente durante 3 s. Luego, retire inmediatamente los embriones de la agarosa con la misma pipeta de vidrio y coloque los embriones en el centro de los platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm con una gota de agarosa del tubo. Coloque solo un embrión por gota en el vidrio.
- Oriente los embriones suavemente con una sonda de fibra o punta de carga para mantener el lado dorsal del cerebro embrionario lo más cerca posible del fondo de vidrio. Ajuste la posición del embrión suavemente para extender el embrión sin curvarse a medida que la agarosa se solidifica gradualmente.
- Después, verifique la posición del embrión volteando el plato con fondo de vidrio. Asegúrese de que todo el prosencéfalo dorsal con los embriones montados correctamente se pueda ver bajo el microscopio.
- Añadir 2-3 ml de medio embrionario precalentado a 28,5 °C que contenga tricaína para cubrir el embrión. Coloque el plato correctamente en la etapa de temperatura controlada del microscopio confocal, como se muestra en la Figura 1. Ajuste la temperatura de la cámara de imágenes para que esté a 28,5 °C. El embrión ahora está listo para la obtención de imágenes.
- Realice imágenes en vivo de lapso de tiempo con un intervalo de tiempo fijo utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x.
- Utilice el software de control de imágenes y microscopios (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Seleccione los canales de imagen de 564 nm y 647 nm para obtener imágenes de la fluorescencia de membrana del pez cebra transgénico MyR-Tdtomato y el anti-Dld-Atto647N endosomal en la célula (Figura 1).
- Ajuste la potencia del láser al 30% para ambos canales. Utilice un tiempo de exposición por plano z de 200 ms para cada canal.
- Para cada embrión de pez cebra montado, use un paso z de escaneo de 1 μm para 20 planos z en total, y un ciclo de escaneo de 100 marcos de tiempo.
- Establezca el intervalo de tiempo entre cada ciclo de escaneo en 20 s y el modo de escaneo como canal, segmento.
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Representative Results
En la Figura 2A, los embriones inyectados con Atto647N, sin unirse con el anticuerpo primario, mostraron fluorescencia de fondo en el ventrículo cerebral. Se pueden observar muy pocas partículas fluorescentes engullidas en las células. Los embriones de pez cebra inyectados anti-Dld-Atto647N mostraron grandes cantidades de partículas fluorescentes internalizadas en la mayoría de las células del cerebro anterior en desarrollo (Figura 2A, panel derecho). Después de acercarnos para enfocarnos en los RGP mitóticos, como se muestra en la Figura 2B, pudimos registrar el movimiento dinámico de los endosomas intracelulares anti-Dld-Atto647N durante la división celular (Video 1). La mayoría de los RGP mitóticos mostraron segregación asimétrica anterior o posterior de endosomas anti-Dld-Atto647N en dos células hijas12. También notamos que la asimetría se estabilizó hacia el final de la anafase, lo que resultó en una herencia asimétrica de los endosomas de señalización de Notch por las células hijas después de12.
Figura 1: Diagrama de flujo de pasos experimentales. El pez cebra transgénico que expresa el reportero MyR-Tdtomato se cruza con el tipo salvaje AB el día 1. En el día 2, los embriones fluorescentes rojos se seleccionan para la microinyección, seguido de imágenes de lapso de tiempo. Todo el experimento en el2º día dura aproximadamente 8 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de lapso de tiempo de la captación de anticuerpos anti-Dld-Atto-647N en el cerebro del pez cebra en desarrollo. (A) Captación anti-Dld-Atto-647N después de 30 minutos de microinyección en el cerebro anterior de un embrión post-fertilización (DPF) de 1 día. En el panel izquierdo está el embrión inyectado con Atto-647N solamente. En el panel derecho está el embrión inyectado con anti-Dld-Atto-647N. Las líneas de guión indican la capa apical a lo largo del ventrículo. La zona rectangular se muestra con gran aumento en B. Barra de escala = 40 μm. Abreviaturas: Di = Diencéfalo; Tel = Telencéfalo; Ve = ventrículo. (B) Paneles de imágenes de lapso de tiempo de la dinámica anti-Dld-Atto-647N durante la mitosis. Los ocho marcos de tiempo en el montaje cubrieron todo el ciclo mitótico, representando la absorción y segregación de anti-Dld-Atto-647N en dos células hijas de un PGR en división. Barra de escala = 5 μm La membrana celular está delineada. Tanto en A como en B, el marcado de MyR-Tdtomato en la membrana es azul, y el anti-Dld-Atto-647N es magenta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Dinámica de anti-Dld-Atto-647N internalizado en la división de células gliales radiales a lo largo de la mitosis (40 marcos de tiempo y un tiempo de intervalo de 30 s entre cada cuadro; 20 min en total). Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado y la obtención de imágenes del tráfico endosomal de Notch/Delta en progenitores radiales de la glía del pez cebra con alta eficiencia. En comparación con los métodos anteriores utilizados para rastrear anticuerpos anti-DeltaD marcados en células SOP de Drosophila 7,8, nuestro método utilizó microinyección en lugar de incubaciónde muestras en el anticuerpo conjugado. Se microinyectaron anticuerpos anti-Dld conjugados fluorescentemente en el ventrículo del cerebro posterior; Esta técnica no causa lesiones, como lo demuestra el desarrollo normal y la recuperación completa de los embriones después de la inyección. Los ventrículos embrionarios son continuos, lo que permite que el anticuerpo inyectado se disperse libremente hacia el cerebro anterior después de la microinyección. El anti-Dld-atto647N inyectado dura más de 24 h como un recurso estable de captación continua de anticuerpos en el cerebro. En comparación con la inyección del tubo neural, introducida en un informe anterior10, la inyección del ventrículo del cerebro posterior del pez cebra no causa lesión tisular y permite la captación selectiva anti-Dld-Atto647N por los RGP mitóticos que recubren los ventrículos cerebrales in vivo. Aunque no hemos comprobado la captación de anticuerpos en las células neuroepiteliales de la médula espinal, la captación de anticuerpos anti-Dld-Atto647N debería ser aplicable allí, al igual que en el cerebro. Se espera que los anticuerpos conjugados inyectados en el ventrículo del cerebro posterior también se difundan a lo largo de la médula espinal.
Para la aplicación exitosa del ensayo de captación de anticuerpos, la cuestión más importante es utilizar un anticuerpo primario que tenga una alta afinidad y especificidad de unión para el dominio extracelular de un objetivo de proteína de membrana. Además de etiquetar la señalización Notch/Delta, el protocolo es aplicable para etiquetar otras proteínas de membrana o proteínas extracelulares mediante el uso de estrategias similares. Nuestro protocolo ha demostrado una captación de anticuerpos anti-Dld altamente eficiente en el desarrollo de embriones de pez cebra debido a la alta calidad y alta especificidad del anticuerpo primario anti-Dld. En segundo lugar, la conjugación del anticuerpo primario anti-Dld con el anticuerpo secundario fluorescente es fundamental para lograr un alto nivel de eficiencia de absorción de anticuerpos in vivo. Hemos encontrado que los anticuerpos secundarios no blanqueadores Atto son más estables y mucho más brillantes que otros anticuerpos fluorescentes, como los anticuerpos secundarios Zenon y Alexa utilizados en cultivos de Drosophila notum 7,10. Elegimos Atto647N como la etiqueta fluorescente, ya que normalmente la usaríamos junto con el pez cebra transgénico GFP o RFP o algunos otros marcadores fluorescentes que comparten longitudes de onda de excitación similares a GFP o RFP. Otros anticuerpos secundarios no blanqueables con diferentes longitudes de onda de excitación también deben trabajar con el protocolo. En nuestro protocolo, acortamos el tiempo de incubación de anticuerpos primarios mezclados con el anticuerpo secundario Atto de 12 h a 30 min, y disminuimos la concentración de anticuerpos Anti-Dld a 0,05 mg/ml en las mezclas finales de microinyección. Una mayor concentración de anticuerpos anti-Dld (0,25 mg/ml) no aumentó la eficiencia de absorción de anticuerpos en embriones de pez cebra; Esta puede ser la razón por la que se necesitan largos tiempos de incubación, con el fin de lograr un marcado suficiente con anticuerpos secundarios fluorescentes10. No utilizamos anticuerpos anti-Dld a una concentración mayor como en estudios previos10, porque existe la posibilidad de que los anticuerpos anti-Dld-Atto647N inyectados compitan con el notch / Delta expresado endógenamente cuando se unen al ligando DeltaD en la membrana de RGP, interfiriendo así con la señalización cis o trans Notch / Delta in vivo. También se encontró que el tampón de bloqueo agregado después de la conjugación primaria de anticuerpos fue útil para aumentar la especificidad del ensayo de captación de anticuerpos in vivo. Como se muestra en la Figura 2, la mayoría de los RGP en el cerebro anterior internalizan activamente anti-Dld-Atto647N. Sin agregar el tampón de bloqueo, la mayoría de las células muestran muy pocos endosomas anti-Dld-Atto647N internalizados (datos no mostrados).
La principal limitación del protocolo es la disponibilidad de los anticuerpos que se pueden utilizar para el ensayo de captación. Nuestro protocolo es aplicable para el etiquetado de proteínas expresadas en membrana, si se dispone de un buen anticuerpo contra el dominio extracelular. Para las proteínas citosólicas y nucleares, el ensayo de captación de anticuerpos no es aplicable, ya que los anticuerpos conjugados no pueden pasar a través de la membrana celular para unirse a sus objetivos de unión intracelular. Las imágenes en vivo de las proteínas intracelulares dependen principalmente de diferentes tipos de modelos transgénicos fluorescentes. En las últimas décadas, se han desarrollado más tintes fluorescentes para imágenes de células vivas, como la tecnología similar a la rodamina de silicio (SiR), que ha contribuido significativamente a la obtención de imágenes de células vivas de ADN, ARN, actina y tubulina17. Una combinación de diferentes estrategias de etiquetado en vivo sería la mejor manera de estudiar vías de señalización complejas en células vivas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por NIH R01NS120218, el Premio Mary Anne Koda-Kimble Seed a la Innovación de la UCSF y Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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