Summary
Este trabalho desenvolve um ensaio de captação de anticorpos para obtenção de imagens da sinalização Notch/DeltaD intra-linhagem na divisão de progenitores radiais da glia do cérebro embrionário do peixe-zebra.
Abstract
A divisão celular assimétrica (DCA), que produz duas células-filhas de destinos diferentes, é fundamental para gerar diversidade celular. Nos órgãos em desenvolvimento de invertebrados e vertebrados, a divisão assimétrica dos progenitores gera um Notchhi auto-renovador e um Notchlo diferenciando-se. No cérebro embrionário do peixe-zebra, os progenitores radiais da glia (RGPs) - as principais células-tronco neurais dos vertebrados - são submetidos principalmente à DCA para dar origem a um RGP e um neurônio diferenciador. A clareza óptica e a fácil acessibilidade dos embriões de peixe-zebra os tornam ideais para imagens in vivo de lapso de tempo para visualizar diretamente como e quando a assimetria da sinalização Notch é estabelecida durante a DCA. Estudos recentes têm mostrado que a endocitose dinâmica do ligante Notch DeltaD desempenha um papel crucial na determinação do destino celular durante a DAC, e o processo é regulado pelo regulador de polaridade conservado evolutivamente Par-3 (também conhecido como Pard3) e pelo complexo motor dineína. Para visualizar os padrões de tráfego in vivo de endossomos de sinalização de Notch em RGPs mitóticos, desenvolvemos este ensaio de captação de anticorpos. Usando o ensaio, descobrimos a dinamicidade dos endossomos contendo DeltaD durante a divisão do RGP.
Introduction
A sinalização Notch controla a decisão e padronização do destino celular durante o desenvolvimento em metazoários1, e estudos recentes têm mostrado que a sinalização Notch na divisão de células-tronco depende principalmente do tráfego endocítico 2,3. O Notch endocitosado/Delta pode ativar a sinalização Notch no núcleo e aumentar a transcrição de genes alvo Notch 4,5,6. O tráfego endossômico Notch/Delta direcional foi observado pela primeira vez em células precursoras de órgãos sensoriais (SOP) de Drosophila durante sua divisão celular assimétrica (ACD), resultando em uma maior atividade de sinalização Notch em pIIa do que em pIIb 7,8. Ensaios de captação de anticorpos com anticorpos anti-Delta e anti-Notch têm sido aplicados para monitorar o processo endocítico em células POP mitóticas. Os endossomos Notch/DeltaD movem-se juntamente com uma proteína motora de cinesina para o fuso central durante a citocinese, e são translocados assimetricamente para dentro da célula pIIa devido à matriz antiparalela do fuso central assimétrico no último momento da divisão celular 3,8. Esses estudos lançaram luz sobre os mecanismos moleculares que regulam a divisão assimétrica em células de Drosophila SOP, mas não está claro se processos endocíticos semelhantes ocorrem em progenitores da glia radial de vertebrados (RGPs).
Além disso, os mecanismos moleculares que regulam a sinalização assimétrica Notch/DeltaD durante a divisão do RGP dos vertebrados não são bem compreendidos. Em zebrafish, tem sido relatado que a interação de Notch e Delta facilita a endocitose do ligante DeltaD9. Não se sabe se a endocitose DeltaD pode afetar a escolha do destino celular das células filhas no cérebro de vertebrados em desenvolvimento. Estudos recentes mostram que a injeção de anticorpos anti-DeltaD conjugados fluorescentemente no tubo neural poderia marcar os endossomos de Sara especificamente em células neuroepiteliais, e os endossomos anti-DeltaD contendo Sara segregam preferencialmente em células filhas em proliferação10. Tem sido sugerido que a sinalização de Notch dos endossomos poderia regular o destino das células filhas. Resultados anteriores mostraram que a maioria das células RGP do peixe-zebra no prosencéfalo em desenvolvimento sofre DCA, e a determinação do destino da célula filha é dependente da sinalização intralinhagem Notch/DeltaD11. A fim de elucidar a natureza da sinalização Notch/DeltaD intralinhagem em RGPs de peixe-zebra, desenvolvemos o ensaio de captação de anticorpos anti-DeltaD no cérebro em desenvolvimento do peixe-zebra. Usando este protocolo, realizamos com sucesso a marcação ao vivo e imagens do tráfego endocítico de DeltaD em RGPs mitóticos.
O anticorpo anti-DeltaD fluorescentemente marcado é eficientemente internalizado nos RGPs ao longo do ventrículo prosencéfalo. Isso facilitou sobremaneira a descoberta do tráfego direcional de endossomos DeltaD nos RGPs de divisão assimétrica12,13. Em comparação com protocolos anteriores de captação de anticorpos desenvolvidos para culturas de Drosophila notum e medula espinhal de peixe-zebra 10, este protocolo alcançou marcação anti-DeltaD de longa duração e altamente eficiente na camada de células do ventrículo cerebral, especificamente com menos de10 nL de mistura de anticorpos microinjetados. A injeção do ventrículo do rombencéfalo é muito conveniente para a aplicação do ensaio de captação de anticorpos no cérebro em desenvolvimento, pois o ventrículo do rombencéfalo é bem expandido em embriões de peixe-zebra e preenchido com líquido cefalorraquidiano no estágio inicial de desenvolvimento14. Ao injetar a mistura de anticorpos no ventrículo do rombencéfalo sem ferir nenhum tecido crucial em desenvolvimento, o protocolo minimizou ao máximo possíveis danos à zona de imagem no prosencéfalo. A dose reduzida do anticorpo primário injetado também evitou potenciais efeitos colaterais de interferir com a sinalização endógena Delta-Notch in vivo. Este protocolo pode ser facilmente combinado com outras perturbações farmacológicas ou genéticas, utilizado em diferentes estágios de desenvolvimento, e possivelmente adaptado ao cérebro adulto, bem como organoides cerebrais 2D/3D derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Em conjunto, o protocolo possibilitou entender como e quando a assimetria de sinalização de Notch é estabelecida durante a DCA. O principal desafio para a implementação bem-sucedida deste protocolo é alcançar a entrega precisa de concentrações apropriadas do anticorpo com base em condições experimentais específicas.
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Protocol
Utilizamos a linhagem selvagem AB e a linhagem transgênica Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] para o estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA (Número de aprovação: AN179000).
1. Preparação de embriões de peixe-zebra
- Configure tanques de travessia de peixes à tarde antes das 17:00, com uma fêmea de peixe selvagem e um macho Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] usando divisórias para separá-los em cada tanque.
- Remova as divisórias antes das 11:00 de todos os tanques de travessia na manhã seguinte. Mantenha o silêncio e não perturbe os peixes enquanto eles estão acasalando. A desova normalmente ocorre dentro de 30 minutos após a remoção das divisórias. Os ovos fertilizados permanecem no fundo do tanque.
- Coletar ovos fertilizados dos tanques com um filtro de malha. Transfira os ovos lavando-os em uma placa de Petri cheia de água do ovo e examine os embriões sob um microscópio dissecante em um aumento de 10x a 20x.
- Transferir os embriões fertilizados para uma placa de Petri limpa contendo aproximadamente 20 mL de meio embrionário (100 mL de solução-estoque de 1.000x contém 29,4 g de NaCl, 1,27 g de KCl, 4,85 g de CaCl 2,2H 2 O e 8,13 g de MgSO4,7H 2O) com pipetas de vidro Pasteur de grandecalibre. Manter os embriões a 28 °C. Manter 50 embriões fertilizados por placa de Petri com 30 mL de meio embrionário a 28,5 °C.
NOTA: Um par de peixes normalmente produz 100-300 embriões, e a taxa de fertilização e sobrevivência de embriões saudáveis é superior a 95% para cada acasalamento. - Na manhã seguinte, retire os embriões da incubadora às 8:00 da manhã, quando os embriões tiverem atingido o estágio de desenvolvimento de ~18-20 h pós-fertilização (hpf). Observá-los sob microscópio de epifluorescência com aumento de 20x, utilizando inicialmente luz branca. Nesse momento, os embriões do peixe-zebra estão no estágio de 20 somites.
- Descarte embriões mortos que estão turvos ou rompidos sob o microscópio usando uma pipeta de vidro.
- Ligue a lâmpada fluorescente e escolha a configuração do filtro RFP do microscópio. Em seguida, selecione os embriões com fluorescência vermelha forte e transfira-os para um novo prato com água de ovo.
- Descorionar os embriões manualmente com duas pinças finas (as pontas das pinças devem estar afiadas e intactas) sob luz branca (Tabela de Materiais).
- Segure o córion com um par de pinças e faça uma ruptura no córion com o outro fórceps. Abra a lágrima cuidadosamente usando a pinça e torne-a grande o suficiente para o embrião passar, empurrando suavemente o embrião com as pontas das outras pinças.
- Transfira os embriões descorionados para uma nova placa de Petri com meio embrionário fresco para um rápido enxágue antes da microinjeção.
2. Preparação da microinjeção
- Use os capilares (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, com filamento) para puxar agulhas de injeção fina em um puxador. Projete e otimize o programa de tração de acordo com o manual.
- Abra a ponta da agulha com pinça sob um microscópio de estereodissecção. Faça o diâmetro da ponta em torno de 10 μm e o ângulo de conicidade em torno de 30°.
- Conjugar o anticorpo monoclonal anti-Dld de camundongo com o anti-IgG-Atto647N de camundongo antes da injeção.
- Para cada experimento de injeção, misturar 0,5 μL do anticorpo anti-Dld (0,5 mg/mL) com 2 μL do anticorpo anti-Mouse-IgG-Atto647N (1 mg/mL) pipetando 5-10 vezes. Em seguida, incubar à temperatura ambiente por pelo menos 30 min (ou no gelo por 2-3 h).
- Após a incubação, adicionar 2,5 μL de tampão de bloqueio (10 mg/mL de IgG de camundongo) e 0,5 μL de vermelho de fenol a 0,5% à mistura de anticorpos, e pipetar 10x para misturar completamente, para bloquear quaisquer anticorpos não conjugados remanescentes na mistura.
NOTA: Para cada ensaio, prepare uma mistura extra sem o anticorpo anti-Dld e use-o como controle.
- Preparar 1% de agarose de baixo ponto de fusão no meio embrionário. Aqueça a mistura contida em agarose a 70 °C até que a mistura fique transparente.
- Alíquota da solução de agarose em tubos de microcentrífuga de 2 mL. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.
- Enxaguar o embrião no tubo contendo 1% de agarose de baixo ponto de fusão por 3 s.
- Coloque o embrião em uma tampa de placa de Petri de plástico invertida juntamente com gotas individuais de agarose (~30-40 μL) para montar cada embrião separadamente na tampa, como mostrado na Figura 1. Coloque os embriões lateralmente na agarose e mantenha esta posição até que a agarose se solidifique à temperatura ambiente.
- Monte 12 embriões em três fileiras, um a um, como acima. Cubra todos os embriões montados na agarose com meio de ovo.
3. Microinjeção
- Coloque os embriões embutidos sob o estereomicroscópio e cubra a agarose com água de ovo.
- Ajuste o injetor de pressão de ar juntamente com os micromanipuladores, colocando-os próximos aos microscópios como mostra a Figura 1. Utilizar como recurso ar o cilindro de gás de aço contendo nitrogênio gasoso (N2) sob alta pressão.
- Abra a válvula de gás somente depois que os embriões tiverem sido montados na agarose. Em seguida, carregar frontalmente a agulha de vidro preparada com 2 μL de mistura de anticorpos no micromanipulador, como mostra a Figura 1, ao usar o módulo de enchimento frontal do microinjetor.
- Ajuste a pressão de entrada para ~80-90 psi e a pressão de injeção para ~20 psi.
- Calibrar o volume de injeção utilizando um micrômetro ao microscópio, conforme descrito anteriormente15. Defina a duração do tempo de sintonia para ser de 10 ms a 120 ms, de acordo com o tamanho da abertura da agulha. Aplique cada pulso de injeção tocando no remo. Ajuste o volume de injeção de cada entrega para ~4-5 nL.
- Cutuque a ponta da agulha de microinjeção através da placa do teto dorsal do rombencéfalo posterior ao ponto de dobradiça r0/r1 e injete cerca de 10 nL (dois ou três pulsos) de mistura de anticorpos sem atingir o tecido cerebral. Observe o fluxo de fluidos vermelhos no ventrículo cerebral.
NOTA: O ventrículo do rombencéfalo é posterior ao limite do mesencéfalo. A mistura de anticorpos contendo vermelho fenol injetado preenche o ventrículo cerebral do rombencéfalo para o prosencéfalo imediatamente, difundindo-se com líquido cefalorraquidiano. - Após a injeção, remova a ponta da agulha do embrião rapidamente girando o botão do micromanipulador. Para uma injeção bem-sucedida, o corante vermelho da mistura injetada permanece no ventrículo cerebral de forma estável sem vazar para a agarose cercada.
- Mova a placa de montagem sob o microscópio para localizar outro embrião montado em uma posição adequada para repetições.
- Depois de injetar seis a oito embriões, descasque a agarose com uma faca microcirúrgica para liberar os embriões da agarose incorporada. Transfira os embriões microinjetados para uma placa fresca com 30 mL de meio embrionário e coloque-os em temperatura ambiente para as próximas etapas.
4. Montagem e time-lapse de imagens ao vivo
- Após 30 min, transferir os embriões selecionados para 10 mL de meio embrionário. Adicionar 420 μL de estoque de tricaína (4 mg/mL) a 10 mL de meio embrionário para anestesiar os embriões.
- Para montar os embriões, preparar agarose de baixo ponto de fusão a 0,8% contendo a mesma concentração de tricaína na trompa. Mantenha as alíquotas em um bloco de calor a ~40 °C.
- Use uma pipeta de vidro para imergir os embriões injetados na agarose quente por 3 s. Em seguida, remova imediatamente os embriões da agarose com a mesma pipeta de vidro e coloque os embriões no centro de placas de cultura de fundo de vidro de 35 mm com uma gota de agarose do tubo. Coloque apenas um embrião por gota no copo.
- Orientar os embriões suavemente com uma sonda de fibra ou ponta de carga para manter o lado dorsal do cérebro embrionário o mais próximo possível do fundo de vidro. Ajuste a posição do embrião suavemente para estender o embrião sem enrolar à medida que a agarose se solidifica gradualmente.
- Depois, verifique a posição do embrião virando o prato de fundo de vidro. Certifique-se de que todo o prosencéfalo dorsal com os embriões corretamente montados possa ser visto ao microscópio.
- Adicionar 2-3 mL de meio embrionário pré-aquecido a 28,5 °C contendo tricaína para cobrir o embrião. Coloque a placa adequadamente no estágio de temperatura controlada do microscópio confocal, como mostra a Figura 1. Ajuste a temperatura da câmara de imagem para 28,5 °C. O embrião já está pronto para exames de imagem.
- Execute imagens ao vivo com lapso de tempo com um intervalo de tempo fixo usando uma objetiva de imersão em água de 40x.
- Utilizar o software de controle de imagem e microscópio (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Selecionar os canais de imagem de 564 nm e 647 nm para obter imagens da fluorescência da membrana do peixe-zebra transgênico MyR-Tdtomato e anti-Dld-Atto647N endossômico na célula (Figura 1).
- Ajuste a potência do laser em 30% para ambos os canais. Use um tempo de exposição por plano z de 200 ms para cada canal.
- Para cada embrião de peixe-zebra montado, use um passo z de varredura de 1 μm para 20 planos z no total, e um ciclo de varredura de 100 períodos de tempo.
- Defina o intervalo de tempo entre cada ciclo de varredura em 20 s e o modo de varredura como canal, fatia.
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Representative Results
Na Figura 2A, os embriões injetados com Atto647N, sem ligação com o anticorpo primário, mostraram fluorescência de fundo no ventrículo cerebral. Pouquíssimas partículas fluorescentes engolidas podem ser observadas nas células. Os embriões de peixe-zebra injetados com anti-Dld-Atto647N mostraram grandes quantidades de partículas fluorescentes internalizadas na maioria das células do prosencéfalo em desenvolvimento (Figura 2A, painel direito). Após zoom para focalizar as RGPs mitóticas, como mostrado na Figura 2B, pudemos registrar o movimento dinâmico dos endossomos anti-Dld-Atto647N intracelulares durante a divisão celular (Vídeo 1). A maioria dos RGPs mitóticos mostrou segregação assimétrica anterior ou posterior dos endossomos anti-Dld-Atto647N em duas células-filhas12. Observamos também que a assimetria estabilizou-se no final da anáfase, resultando em herança assimétrica dos endossomos de sinalização de Notch pelas células filhasposteriormente12.
Figura 1: Fluxograma das etapas experimentais. Zebrafish transgênicos expressando o repórter MyR-Tdtomato são cruzados com AB selvagem-tipo no dia 1. No dia 2, embriões fluorescentes vermelhos são selecionados para microinjeção, seguida de imagens com lapso de tempo. Todo o experimento no2º dia leva cerca de 8 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de lapso de tempo da captação do anticorpo anti-Dld-Atto-647N no cérebro do peixe-zebra em desenvolvimento. (A) Captação de anti-Dld-Atto-647N após 30 min de microinjeção no prosencéfalo de um embrião 1 dia pós-fertilização (DPF). No painel esquerdo está o embrião injetado apenas com Atto-647N. No painel direito está o embrião injetado com anti-Dld-Atto-647N. As linhas de traço indicam a camada apical ao longo do ventrículo. A zona retangular é mostrada em alta ampliação em B. Barra de escala = 40 μm. Abreviações: Di = Diencéfalo; Tel = Telencéfalo; Ve = Ventrículo. (B) Painéis de imagem por lapso de tempo da dinâmica anti-Dld-Atto-647N durante a mitose. Os oito períodos de tempo na montagem cobriram todo o ciclo mitótico, retratando a absorção e segregação de anti-Dld-Atto-647N em duas células filhas de um RGP em divisão. Barra de escala = 5 μm A membrana celular é delineada. Tanto em A quanto em B, a marcação MyR-Tdtomato na membrana é azul, e anti-Dld-Atto-647N é magenta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Dinâmica do anti-Dld-Atto-647N internalizado na divisão das células da glia radial ao longo da mitose (40 períodos de tempo e um intervalo de 30 s entre cada quadro; 20 min no total). Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Desenvolvemos um ensaio de captação de anticorpos para marcação e obtenção de imagens endossômicas do tráfico de Notch/Delta em progenitores radiais da glia de peixe-zebra com alta eficiência. Em comparação com métodos anteriores usados para rastrear anticorpos marcados anti-DeltaD em células Drosophila SOP7,8, nosso método usou microinjeção em vez de incubação de amostras no anticorpo conjugado. Anticorpos anti-Dld conjugados fluorescentemente foram microinjetados no ventrículo do rombencéfalo; Esta técnica não causa lesões, como evidenciado pelo desenvolvimento normal e recuperação completa dos embriões após a injeção. Os ventrículos embrionários são contínuos, permitindo que o anticorpo injetado se disperse livremente em direção ao prosencéfalo após a microinjeção. O anti-Dld-atto647N injetado dura mais de 24 h como um recurso estável de captação contínua de anticorpos no cérebro. Comparada à injeção do tubo neural, introduzida em relato anterior10, a injeção do ventrículo do rombencéfalo do peixe-zebra não causa lesão tecidual e permite a captação seletiva de anti-Dld-Atto647N por RGPs mitóticos que revestem os ventrículos cerebrais in vivo. Embora não tenhamos verificado a captação de anticorpos em células neuroepiteliais na medula espinhal, a captação do anticorpo anti-Dld-Atto647N deve ser aplicável lá, assim como no cérebro. Espera-se que os anticorpos conjugados injetados no ventrículo do rombencéfalo também se difundam ao longo da medula espinhal.
Para a aplicação bem-sucedida do ensaio de captação de anticorpos, a questão mais importante é usar um anticorpo primário que tenha alta afinidade de ligação e especificidade para o domínio extracelular de um alvo de proteína de membrana. Além da marcação da sinalização Notch/Delta, o protocolo é aplicável para marcar outras proteínas de membrana ou proteínas extracelulares usando estratégias semelhantes. Nosso protocolo demonstrou captação de anticorpos anti-Dld altamente eficiente no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra devido à alta qualidade e alta especificidade do anticorpo primário anti-Dld. Em segundo lugar, a conjugação do anticorpo primário anti-Dld com o anticorpo secundário fluorescente é crítica para alcançar um alto nível de eficiência de captação de anticorpos in vivo. Encontramos anticorpos secundários não clareadores de Atto mais estáveis e muito mais brilhantes do que outros anticorpos fluorescentes, como os anticorpos secundários Zenon e Alexa usados em culturas de Drosophila notum 7,10. Escolhemos Atto647N como o rótulo fluorescente, pois normalmente o usaríamos em conjunto com o peixe-zebra transgênico GFP ou RFP ou alguns outros marcadores fluorescentes que compartilham comprimentos de onda de excitação semelhantes como GFP ou RFP. Outros anticorpos secundários não branqueáveis com diferentes comprimentos de onda de excitação também devem trabalhar com o protocolo. Em nosso protocolo, encurtamos o tempo de incubação dos anticorpos primários misturados com o anticorpo secundário Atto de 12 h para 30 min e diminuímos a concentração de anticorpos Anti-Dld para 0,05 mg/mL nas misturas finais de microinjeção. Uma maior concentração de anticorpo anti-Dld (0,25 mg/mL) não aumentou a eficiência de captação de anticorpos em embriões de zebrafish; Essa pode ser a razão da necessidade de longos tempos de incubação, a fim de se obter marcação suficiente com anticorpos secundários fluorescentes10. Não utilizamos o anticorpo anti-Dld em uma concentração mais elevada como em estudos anteriores10, pois existe a possibilidade de que os anticorpos anti-Dld-Atto647N injetados compitam com o Notch/Delta endogenamente expresso ao se ligarem ao ligante DeltaD na membrana dos RGPs, interferindo assim na sinalização cis ou trans Notch/Delta in vivo. Também descobrimos que o tampão de bloqueio adicionado após a conjugação primária de anticorpos foi útil para aumentar a especificidade do ensaio de captação de anticorpos in vivo. Como mostrado na Figura 2, a maioria dos RGPs no prosencéfalo internaliza ativamente o anti-Dld-Atto647N. Sem a adição do tampão de bloqueio, a maioria das células apresenta pouquíssimos endossomos anti-Dld-Atto647N internalizados (dados não mostrados).
A principal limitação do protocolo é a disponibilidade dos anticorpos que podem ser utilizados para o ensaio de captação. Nosso protocolo é aplicável para marcação de proteínas expressas por membrana, se um bom anticorpo para o domínio extracelular estiver disponível. Para proteínas citosólicas e nucleares, o ensaio de captação de anticorpos não é aplicável, pois os anticorpos conjugados não podem passar através da membrana celular para se ligar aos seus alvos de ligação intracelular. Imagens ao vivo de proteínas intracelulares dependem principalmente de diferentes tipos de modelos transgênicos fluorescentes. Nas últimas décadas, mais corantes fluorescentes foram desenvolvidos para imagens de células vivas, como a tecnologia Silicon Rhodamine-like (SiR), que contribuiu significativamente para a obtenção de imagens de DNA em células vivas, RNA, actina e tubulina17. Uma combinação de diferentes estratégias de marcação ao vivo seria a melhor maneira de estudar vias de sinalização complexas em células vivas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O projeto foi apoiado pelo NIH R01NS120218, pelo UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation e pelo Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
