Summary
Dette arbeidet utvikler en antistoffopptaksanalyse for avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering ved deling av radiale glia-forfedre til den embryonale sebrafiskhjernen.
Abstract
Asymmetrisk celledeling (ACD), som produserer to datterceller med forskjellige skjebner, er grunnleggende for å generere cellulært mangfold. I utviklingsorganene til både virvelløse dyr og virveldyr genererer asymmetrisk delende forfedre en Notchhi selvfornyelse og en Notchlo differensierende datter. I den embryonale sebrafiskhjernen gjennomgår radiale glia-forfedre (RP) - de viktigste virveldyrnevrale stamceller - for det meste ACD for å føde en RGP og en differensierende nevron. Den optiske klarheten og den enkle tilgjengeligheten til sebrafiskembryoer gjør dem ideelle for in vivo time-lapse-avbildning for direkte å visualisere hvordan og når asymmetrien til Notch-signalering etableres under ACD. Nylige studier har vist at dynamisk endocytose av Notch-liganden DeltaD spiller en avgjørende rolle i celleskjebnebestemmelse under ACD, og prosessen reguleres av den evolusjonært konserverte polaritetsregulatoren Par-3 (også kjent som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For å visualisere in vivo trafikkmønstre av Notch-signalendosomer i mitotiske RP-er, har vi utviklet denne antistoffopptaksanalysen. Ved hjelp av analysen har vi avdekket dynamikken til DeltaD-holdige endosomer under RGP-deling.
Introduction
Notch-signalering styrer celleskjebneavgjørelse og mønster under utvikling i metazoans1, og nyere studier har vist at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsakelig avhenger av endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch/Delta kan aktivere Notch-signalering i kjernen og forbedre transkripsjonen av Notch-målgener 4,5,6. Directional Notch/Delta endosomal trafficking ble først observert i Drosophila sensory organ precursor (SOP) celler under sin asymmetriske celledeling (ACD), noe som resulterte i en høyere Notch signaleringsaktivitet i pIIa enn i pIIb 7,8. Antistoffopptaksanalyser med anti-Delta og anti-Notch antistoffer har blitt brukt for å overvåke endocytisk prosess i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer beveger seg sammen med et kinesinmotorprotein til den sentrale spindelen under cytokinese, og blir asymmetrisk translokalisert til pIIa-cellen på grunn av den antiparallelle matrisen til den asymmetriske sentrale spindelen i siste øyeblikk av celledeling 3,8. Disse studiene har kastet lys over de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk deling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart om lignende endocytiske prosesser forekommer hos virveldyr radiale gliaprogenitorer (RP).
Videre er de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under vertebrate RGP-divisjon ikke godt forstått. I sebrafisk har det blitt rapportert at samspillet mellom Notch og Delta letter endocytosen av DeltaD-liganden9. Det er ukjent om DeltaD endocytose kan påvirke celleskjebnevalget til datterceller i den utviklende virveldyrhjernen. Nylige studier viser at injeksjon av fluorescerende konjugerte anti-DeltaD-antistoffer i nevrale røret kan merke Sara-endosomer spesifikt i nevroepitelceller, og anti-DeltaD som inneholder Sara-endosomer fortrinnsvis segregerer til prolifererende datterceller10. Det har blitt foreslått at Notch-signalering fra endosomene kunne regulere dattercelleskjebnen. Tidligere resultater har vist at de fleste sebrafisk RGP-celler i den utviklende forhjernen gjennomgår ACD, og dattercelleskjebnebestemmelsen er avhengig av intralineage Notch/DeltaD-signalering11. For å belyse arten av intralineage Notch/DeltaD-signalering hos fastleger for sebrafisk, har vi utviklet anti-DeltaD antistoffopptaksanalysen i den sebrafiskutviklende hjernen. Ved hjelp av denne protokollen har vi med hell utført live merking og avbildning av DeltaD endocytisk handel med mitotiske fastleger.
Det fluorescerende merkede anti-DeltaD-antistoffet internaliseres effektivt i fastlegene langs forhjerneventrikkelen. Det har i stor grad gjort det lettere å oppdage retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk delende fastlegene12,13. Sammenlignet med tidligere antistoffopptaksprotokoller utviklet for Drosophila notumkulturer og sebrafiskryggmargen 10, har denne protokollen oppnådd langvarig og svært effektiv anti-DeltaD-merking i hjerneventrikkelcellelaget, spesielt med mindre enn10 nL mikroinjisert antistoffblanding. Bakhjernens ventrikkelinjeksjon er veldig praktisk for påføring av antistoffopptaksanalysen i den utviklende hjernen, da bakhjernens ventrikkel er godt utvidet i sebrafiskembryoer og fylt opp med cerebrospinalvæske i tidlig utviklingsstadium14. Ved å injisere antistoffblandingen i bakhjernens ventrikkel uten å skade noe avgjørende utviklende vev, har protokollen minimert mulig skade på bildesonen i forhjernen så mye som mulig. Den reduserte dosen av det injiserte primære antistoffet har også unngått potensielle bivirkninger ved å forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokollen kan enkelt kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, utnyttes på forskjellige utviklingsstadier, og muligens tilpasses den voksne hjernen så vel som humane pluripotente stamcelleavledede 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet sett har protokollen gjort det mulig å forstå hvordan og når Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Hovedutfordringen for vellykket implementering av denne protokollen er å oppnå presis levering av passende konsentrasjoner av antistoffet basert på spesifikke eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vi har brukt AB villtypelinje og transgen linje Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] for studien. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco, USA (godkjenningsnummer: AN179000).
1. Fremstilling av sebrafiskembryoer
- Sett opp fiskekryssingstanker om ettermiddagen før kl. 17.00, med en hunnfisk av villtype og en hannfisk av villtype [ ef1a:Myr-Tdtomato] fisk ved å bruke skillevegger for å skille dem i hver tank.
- Fjern skilleveggene før kl. 11.00 fra alle krysstanker neste morgen. Hold deg stille og ikke forstyrr fisken mens de parrer seg. Gyting skjer vanligvis innen 30 minutter etter fjerning av skilleveggene. De befruktede eggene forblir på bunnen av tanken.
- Samle befruktede egg fra tankene med et maskefilter. Overfør eggene ved å vaske dem av i en petriskål full av eggevann og undersøke embryoene under et dissekerende mikroskop ved en 10x til 20x forstørrelse.
- Overfør de befruktede embryoene til en ren petriskål som inneholder ca. 20 ml embryomedium (100 ml 1000x stamoppløsning inneholder 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H2O og 8,13 g MgSO 4,7H2O) med pasteurpipetter med stor boring. Hold embryoene på 28 °C. Hold 50 befruktede embryoer per petriskål med 30 ml embryomedium ved 28,5 °C.
MERK: Ett par fisk produserer normalt 100-300 embryoer, og befruktning og overlevelse av friske embryoer er over 95% for hver parring. - Neste morgen, ta embryoene ut av inkubatoren klokken 8:00, når embryoene har nådd utviklingsstadiet på ~ 18-20 timer etter befruktning (hpf). Observer dem under et epifluorescensmikroskop ved en 20x forstørrelse, ved å bruke hvitt lys først. På den tiden er sebrafiskembryoene på 20 somittstadiet.
- Kast bort døde embryoer som er overskyet eller sprukket under mikroskopet ved hjelp av en glasspipette.
- Slå på lysrøret og velg RFP-filterinnstillingen til mikroskopet. Velg deretter embryoer med sterk rød fluorescens og overfør dem til en ny tallerken med eggevann.
- Dekorioner embryoene manuelt med to fine tang (spissene på tangen skal være skarpe og uskadede) under hvitt lys (materialfortegnelse).
- Hold korionen med en tang og lag en rift i korionen med de andre tangen. Åpne tåren forsiktig med tangen, og gjør den stor nok til at embryoet kan passere gjennom ved å skyve embryoet forsiktig med tuppen av de andre tangene.
- Overfør de dekorerte embryoene til en ny petriskål med ferskt embryonalt medium for en rask skylling før mikroinjeksjon.
2. Tilberedning av mikroinjeksjon
- Bruk kapillærene (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, med filament) for å trekke fine injeksjonsnåler på en avtrekker. Design og optimaliser trekkprogrammet i henhold til håndboken.
- Åpne spissen av nålen med tang under et stereodisseksjonsmikroskop. Lag diameteren på spissen rundt 10 μm, og avsmalningsvinkelen rundt 30°.
- Konjuger musens monoklonale anti-DLD-antistoff med antimus-IgG-Atto647N før injeksjon.
- For hvert injeksjonseksperiment blander du 0,5 μL av anti-Dld-antistoffet (0,5 mg/ml) med 2 μL av antimus-IgG-Atto647N-antistoffet (1 mg/ml) ved å pipettere 5-10 ganger. Inkuber deretter ved romtemperatur i minst 30 minutter (eller på is i 2-3 timer).
- Etter inkubering, tilsett 2,5 μL blokkeringsbuffer (10 mg/ml mus IgG) og 0,5 μL 0,5 % fenolrødt til antistoffblandingen, og pipett 10x for å blande grundig for å blokkere eventuelle ukonjugerte antistoffer som er igjen i blandingen.
MERK: For hvert forsøk, lag en ekstra blanding uten anti-DLD-antistoffet og bruk det som en kontroll.
- Forbered 1% lavsmeltepunkt agarose i embryomediet. Varm opp den agaroseholdige blandingen ved 70 °C til blandingen blir gjennomsiktig.
- Aliquot agaroseoppløsningen i 2 ml mikrosentrifugerør. Hold alikotene i en varmeblokk ved ~40 °C.
- Skyll embryoet i røret som inneholder 1% lavsmeltepunkt agarose i 3 s.
- Plasser embryoet på et omvendt petriskållokk av plast sammen med individuelle dråper agarose (~30-40 μL) for å montere hvert embryo separat på lokket som vist i figur 1. Legg embryoene flate lateralt i agarose og hold denne posisjonen til agarose har størknet ved romtemperatur.
- Monter 12 embryoer i tre rader en etter en som ovenfor. Dekk alle monterte embryoer i agarose med eggmedium.
3. Mikroinjeksjon
- Sett de innebygde embryoene under stereomikroskopet og dekk agarosen med eggvann.
- Sett lufttrykkinjektoren sammen med mikromanipulatorer, plasser dem nær mikroskopene som vist i figur 1. Bruk stålgassflasken som inneholder nitrogen i gassform (N2) under høyt trykk som luftressurs.
- Åpne gassventilen først etter at embryoene er montert i agarose. Deretter skyver du den klargjorte glassnålen med 2 μL antistoffblanding på mikromanipulatoren, som vist i figur 1, når du bruker frontfyllingsmodulen til mikroinjektoren.
- Still inn inngangstrykket til ~ 80-90 psi, og injeksjonstrykket til ~ 20 psi.
- Kalibrer injeksjonsvolumet ved hjelp av et mikrometer under mikroskopet, som beskrevet tidligere15. Sett innstillingstiden til å være fra 10 ms til 120 ms, i henhold til størrelsen på nåleåpningen. Lever hver injeksjonspuls ved å trykke på padlen. Still inn injeksjonsvolumet for hver levering til ~4-5 nL.
- Stikk tuppen av mikroinjeksjonsnålen gjennom ryggtakplaten på bakhjernen bakre til r0/r1-hengselpunktet, og injiser ca. 10 nL (to eller tre pulser) antistoffblanding uten å treffe hjernevevet. Vær oppmerksom på strømmen av røde væsker i hjerneventrikkelen.
MERK: Bakhjernens ventrikkel er bakre til midthjernens bakhjernegrense. Den injiserte fenolholdige antistoffblandingen fyller opp hjerneventrikkelen fra bakhjernen til forhjernen umiddelbart ved å diffundere med cerebrospinalvæske. - Etter injeksjon, fjern nålespissen fra embryoet raskt ved å rotere knappen på mikromanipulatoren. For en vellykket injeksjon forblir det røde fargestoffet av den injiserte blandingen i hjerneventrikkelen stabilt uten å lekke inn i den omkringliggende agarose.
- Flytt monteringsplaten under mikroskopet for å finne et annet montert embryo i en passende posisjon for gjentakelser.
- Etter å ha injisert seks til åtte embryoer, skrell agarosen med en mikrokirurgisk kniv for å frigjøre embryoene fra den innebygde agarose. Overfør de mikroinjiserte embryoene til en fersk tallerken med 30 ml embryomedium, og legg dem ved romtemperatur for de neste trinnene.
4. Montering og time-lapse live imaging
- Etter 30 min, overfør de valgte embryoene til 10 ml embryomedium. Tilsett 420 μl trikain (4 mg/ml) til 10 ml embryomedium for å bedøve embryoene.
- For å montere embryoene, lag 0,8% agarose med lavt smeltepunkt som inneholder samme konsentrasjon av trikain i røret. Hold alikotene i en varmeblokk ved ~40 °C.
- Bruk en glasspipette til å fordype de injiserte embryoene i den varme agarose i 3 s. Fjern deretter embryoene umiddelbart fra agarose med samme glasspipette og legg embryoene på midten av 35 mm glassbunnkulturfat med en dråpe agarose fra røret. Plasser bare ett embryo per dråpe på glasset.
- Orienter embryoene forsiktig med en fibersonde eller lastespiss for å holde den dorsale siden av den embryonale hjernen så nær glassbunnen som mulig. Juster embryoposisjonen forsiktig for å utvide embryoet uten å krølle ettersom agarose størkner gradvis.
- Etterpå sjekker du embryoposisjonen ved å snu glassbunnfatet. Sørg for at hele den dorsale forhjernen med de riktig monterte embryoene kan ses under mikroskopet.
- Tilsett 2-3 ml 28,5 °C forvarmet embryonalt medium som inneholder trikain for å dekke embryoet. Plasser parabolen riktig på det temperaturkontrollerte stadiet i konfokalmikroskopet, som vist i figur 1. Juster temperaturen i bildekammeret til 28,5 °C. Embryoet er nå klart for avbildning.
- Utfør time-lapse live imaging med et fast tidsintervall ved hjelp av et 40x vannnedsenkingsmål.
- Bruk programvaren for bilde- og mikroskopkontroll (μMANAGER: https://micro-manager.org/)16.
- Velg avbildningskanalene på 564 nm og 647 nm for avbildning av membranfluorescensen til MyR-Tdtomato transgen sebrafisk og endosomal anti-Dld-Atto647N i cellen (figur 1).
- Sett lasereffekten på 30 % for begge kanalene. Bruk en eksponeringstid per z-plan på 200 ms for hver kanal.
- For hvert montert sebrafiskembryo, bruk et skanning z-trinn på 1 μm for totalt 20 z-plan, og en skannesyklus på 100 tidsrammer.
- Sett tidsintervallet mellom hver skannesyklus på 20 s og skannemodus som kanal, stykke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2A viste embryoene injisert med Atto647N, uten binding med det primære antistoffet, bakgrunnsfluorescens i hjerneventrikkelen. Svært få oppslukte fluorescerende partikler kan observeres i cellene. De anti-Dld-Atto647N-injiserte sebrafiskembryoene viste store mengder internaliserte fluorescerende partikler i de fleste cellene i den utviklende forhjernen (figur 2A, høyre panel). Etter å ha zoomet inn for å fokusere på mitotiske fastleger, som vist i figur 2B, kunne vi registrere den dynamiske bevegelsen av intracellulære anti-Dld-Atto647N-endosomer under celledeling (Video 1). De fleste mitotiske fastlegene viste fremre eller bakre asymmetriske segregering av anti-Dld-Atto647N-endosomer i to datterceller12. Vi la også merke til at asymmetrien ble stabilisert mot slutten av anafasen, noe som resulterte i asymmetrisk arv av Notch-signalendosomer av dattercellene etterpå12.
Figur 1: Flytskjema over eksperimentelle trinn. Transgen sebrafisk som uttrykker MyR-Tdtomato-reporteren er utparret med AB villtype på dag 1. På dag 2 selekteres røde fluorescerende embryoer for mikroinjeksjon, etterfulgt av time-lapsing imaging. Hele eksperimentet på 2. dag tar ca 8 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Time-lapse-avbildning av anti-Dld-Atto-647N antistoffopptak i den utviklende sebrafiskhjernen. (A) Anti-Dld-Atto-647N opptak etter 30 min mikroinjeksjon i forhjernen til et 1 dag etter befruktning (DPF) embryo. På venstre panel injiseres embryoet kun med Atto-647N. På høyre panel injiseres embryoet med anti-Dld-Atto-647N. Streklinjer angir det apikale laget langs ventrikkelen. Rektangelsonen er vist i høy forstørrelse i B. Skala bar = 40 μm. Forkortelser: Di = Diencephalon; Tel = Telencephalon; Ve = ventrikkel. (B) Time-lapse-bildepaneler med anti-Dld-Atto-647N-dynamikk under mitose. De åtte tidsrammene i montasjen dekket hele den mitotiske syklusen, og skildret opptaket og segregeringen av anti-Dld-Atto-647N i to datterceller av en delende RGP. Skala bar = 5 μm Cellemembranen er skissert. I både A og B er MyR-Tdtomato-merkingen på membranen blå, og anti-Dld-Atto-647N er magenta. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Dynamikk av internalisert anti-Dld-Atto-647N ved å dele radiale gliaceller gjennom mitose (40 tidsrammer og en intervalltid på 30 s mellom hver ramme; 20 minutter totalt). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en antistoffopptaksanalyse for merking og avbildning av endosomal Notch/Delta-handel med sebrafisk radiale glia-forfedre med høy effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder brukt for sporing av merket anti-DeltaD antistoff i Drosophila SOP celler7,8, brukte vår metode mikroinjeksjon i stedet for inkubasjon av prøver i det konjugerte antistoffet. Fluorescerende konjugerte anti-Dld-antistoffer ble mikroinjisert i bakhjernens ventrikkel; Denne teknikken forårsaker ikke skade, som det fremgår av normal utvikling og full gjenoppretting av embryoer etter injeksjon. De embryonale ventriklene er kontinuerlige, slik at det injiserte antistoffet fritt kan spre seg mot forhjernen etter mikroinjeksjon. Den injiserte anti-Dld-atto647N varer i over 24 timer som en stabil ressurs for kontinuerlig antistoffopptak i hjernen. Sammenlignet med nevralrørsinjeksjon, introdusert i en tidligere rapport10, forårsaker zebrafisk bakhjerneventrikkelinjeksjon ikke vevsskade og muliggjør selektiv anti-Dld-Atto647N-opptak av mitotiske fastleger som fôrer hjerneventriklene in vivo. Selv om vi ikke har sjekket antistoffopptaket i nevroepitelceller i ryggmargen, bør anti-Dld-Atto647N antistoffopptak være aktuelt der, akkurat som i hjernen. De konjugerte antistoffene injisert i bakre ventrikkel forventes å diffundere langs ryggmargen også.
For vellykket anvendelse av antistoffopptaksanalysen er det viktigste problemet å bruke et primært antistoff som har høy bindingsaffinitet og spesifisitet for det ekstracellulære domenet til et membranproteinmål. I tillegg til merking av Notch / Delta-signalering, er protokollen anvendelig for merking av andre membranproteiner eller ekstracellulære proteiner ved å bruke lignende strategier. Vår protokoll har vist svært effektivt anti-Dld antistoffopptak i utvikling av sebrafiskembryoer på grunn av den høye kvaliteten og den høye spesifisiteten til anti-Dld primære antistoff. For det andre er konjugeringen av anti-Dld primærantistoff med det fluorescerende sekundære antistoffet avgjørende for å oppnå et høyt nivå av antistoffopptak i vivo. Vi har funnet Atto ikke-blekende sekundære antistoffer å være mer stabile og mye lysere enn andre fluorescerende antistoffer, slik som Zenon og Alexa sekundære antistoffer brukt i Drosophila notum kulturer 7,10. Vi valgte Atto647N som fluorescerende etikett, da vi normalt ville bruke den sammen med GFP eller RFP transgen sebrafisk eller noen andre fluorescerende markører som deler lignende eksitasjonsbølgelengder som GFP eller RFP. Andre ikke-blekbare sekundære antistoffer med forskjellige eksitasjonsbølgelengder bør også fungere med protokollen. I vår protokoll forkortet vi inkubasjonstiden for primære antistoffer blandet med Atto sekundært antistoff fra 12 timer til 30 minutter, og reduserte konsentrasjonen av Anti-Dld-antistoffer til 0,05 mg / ml i de endelige mikroinjeksjonsblandingene. En høyere konsentrasjon av anti-DLD antistoff (0,25 mg/ml) økte ikke antistoffopptakseffektiviteten i sebrafiskembryoer. Dette kan være grunnen til at man trenger lange inkubasjonstider for å oppnå tilstrekkelig merking med fluorescerende sekundære antistoffer10. Vi brukte ikke anti-DLD-antistoff i høyere konsentrasjon som i tidligere studier10, fordi det er en mulighet for at injiserte anti-Dld-Atto647N-antistoffer konkurrerer med det endogent uttrykte Notch/Delta når de binder DeltaD-ligand på membranen til RP-er, og dermed forstyrrer cis eller trans Notch/Delta-signalering in vivo. Vi fant også at blokkering av buffer lagt til etter primær antistoffkonjugering var nyttig for å øke spesifisiteten til antistoffopptaksanalysen in vivo. Som vist i figur 2 internaliserer de fleste fastleger i forhjernen anti-Dld-Atto647N aktivt. Uten å legge til blokkeringsbufferen viser de fleste celler svært få internaliserte anti-Dld-Atto647N-endosomer (data ikke vist).
Hovedbegrensningen i protokollen er tilgjengeligheten av antistoffene som kan brukes til opptaksanalysen. Vår protokoll gjelder for merking av membranuttrykte proteiner, hvis et godt antistoff mot det ekstracellulære domenet er tilgjengelig. For cytosoliske og nukleære proteiner er antistoffopptaksanalysen ikke anvendelig, da de konjugerte antistoffene ikke kan passere gjennom cellemembranen for å binde seg til deres intracellulære bindingsmål. Levende avbildning av intracellulære proteiner avhenger hovedsakelig av forskjellige typer fluorescerende transgene modeller. I de siste tiårene har flere fluorescerende fargestoffer blitt utviklet for levende celleavbildning, for eksempel silisiumrhodaminlignende (SiR) -teknologi, som har bidratt betydelig til levende celleavbildning av DNA, RNA, aktin og tubulin17. En kombinasjon av forskjellige levende merkingsstrategier ville være den beste måten å studere komplekse signalveier i levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet av NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation og Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H.
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit 14.20 (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
