Summary
この研究では、ゼブラフィッシュの胚性脳の放射状グリア前駆細胞を分裂させる系統内Notch/DeltaDシグナル伝達をイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しています。
Abstract
運命の異なる2つの娘細胞を生成する非対称細胞分裂(ACD)は、細胞の多様性を生み出すための基本です。無脊椎動物と脊椎動物の両方の発達中の器官では、前駆細胞を非対称に分割すると、自己再生するNotchとNotchlo分化する娘が生成されます。ゼブラフィッシュの脳では、脊椎動物の主要な神経幹細胞である放射状グリア前駆細胞(RGP)が主にACDを受けて、1つのRGPニューロンと1つの分化ニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ胚の光学的明瞭さと容易なアクセス性により、ACD中にNotchシグナル伝達の非対称性がいつどのように確立されるかを直接視覚化するためのin vivoタイムラプスイメージングに最適です。最近の研究では、NotchリガンドΔDの動的エンドサイトーシスがACD中の細胞運命決定に重要な役割を果たし、その過程は進化的に保存された極性調節因子Par-3(Pard3としても知られる)とダイニンモーター複合体によって制御されることが示されています。有糸分裂RGPにおけるNotchシグナル伝達エンドソームのin vivo輸送パターンを視覚化するために、この抗体取り込みアッセイを開発しました。このアッセイを用いて、RGP分裂中のDeltaD含有エンドソームの動態を明らかにしました。
Introduction
Notchシグナル伝達は、後生動物の発生中の細胞運命の決定とパターン形成を制御しており1、最近の研究では、幹細胞分裂におけるNotchシグナル伝達は主にエンドサイトーシス輸送に依存していることが示されています2,3。エンドサイトーシスNotch/Deltaは、核内のNotchシグナル伝達を活性化し、Notch標的遺伝子の転写を増強することができます4,5,6。指向性Notch/Δエンドソーム輸送は、ショウジョウバエ感覚器官前駆体(SOP)細胞の非対称細胞分裂(ACD)中に最初に観察され、pIIbよりもpIIaで高いNotchシグナル伝達活性をもたらしました7,8。抗デルタ抗体および抗Notch抗体を用いた抗体取り込みアッセイは、有糸分裂SOP細胞のエンドサイトーシスプロセスをモニターするために適用されています。Notch/DeltaDエンドソームは、細胞質分裂中にキネシンモータータンパク質とともに中央紡錘体に移動し、細胞分裂の最後の瞬間に非対称中央紡錘体の逆平行配列によりpIIa細胞に非対称に転座します3,8。これらの研究は、ショウジョウバエSOP細胞における不斉分裂を制御する分子機構に光を当てたが、脊椎動物の放射状グリア前駆細胞(RGP)において同様のエンドサイトーシス過程が起こるかどうかは不明である。
さらに、脊椎動物のRGP分裂中に不斉Notch/DeltaDシグナル伝達を制御する分子機構はよくわかっていません。ゼブラフィッシュでは、NotchとΔの相互作用がΔDリガンド9のエンドサイトーシスを促進することが報告されている。DeltaDエンドサイトーシスが、発達中の脊椎動物の脳における娘細胞の細胞運命の選択に影響を与えることができるかどうかは不明です。最近の研究では、蛍光標識抗DeltaD抗体を神経管に注入すると、神経上皮細胞においてサラエンドソーム特異的に標識することができ、サラエンドソームを含む抗ΔDは増殖中の娘細胞に優先的に分離することができることが示されている10。エンドソームからのNotchシグナル伝達が娘細胞の運命を調節できることが示唆されています。以前の結果は、発達中の前脳のほとんどのゼブラフィッシュRGP細胞がACDを受け、娘細胞の運命決定が系統内のNotch/DeltaDシグナル伝達に依存することを示しています11。ゼブラフィッシュRGPにおける系統内Notch/DeltaDシグナルの性質を解明するために、ゼブラフィッシュ発生中の脳における抗ΔD抗体取り込みアッセイを開発しました。このプロトコルを使用して、有糸分裂RGPにおけるDeltaDエンドサイトーシス輸送のライブラベリングとイメージングに成功しました。
蛍光標識された抗DeltaD抗体は、前脳室に沿ってRGPに効率的に取り込まれます。これは、非対称に分割されたRGPにおけるDeltaDエンドソームの方向性のあるトラフィックの発見を大いに促進しました12,13。ショウジョウバエの培養およびゼブラフィッシュ脊髄10用に開発された以前の抗体取り込みプロトコルと比較して、このプロトコルは、特に10 nL未満のマイクロインジェクション抗体混合物で、脳室細胞層で長期的かつ高効率の抗DeltaD標識を達成しました。後脳室注射は、ゼブラフィッシュ胚では後脳室が十分に拡張され、発生初期段階で脳脊髄液で満たされるため、発達中の脳に抗体取り込みアッセイを適用するのに非常に便利です14。重要な発達中の組織を傷つけることなく抗体混合物を後脳室に注入することにより、プロトコルは前脳のイメージングゾーンへの損傷の可能性を可能な限り最小限に抑えました。注入された一次抗体の投与量を減らすことで、in vivoでの内因性Δ-Notchシグナル伝達を妨害する潜在的な副作用も回避されました。このプロトコルは、他の薬理学的または遺伝的摂動と容易に組み合わせることができ、さまざまな発生段階で利用でき、成人の脳やヒト多能性幹細胞由来の2D/3D脳オルガノイドに適応できる可能性があります。まとめると、このプロトコルにより、ACD中にNotchシグナリングの非対称性がいつどのように確立されるかを理解することが可能になりました。このプロトコルの実装を成功させるための主な課題は、特定の実験条件に基づいて適切な濃度の抗体を正確に送達することです。
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Protocol
研究にはAB野生型系統とトランスジェニック系統 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] を使用しました。すべての動物実験は、米国カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました(承認番号:AN179000)。
1.ゼブラフィッシュ胚の調製
- 午後5:00前の魚横断水槽を設置し、野生型魚1匹とオスTg [ef1a:Myr-Tdtomato] 魚1匹を仕切りで各水槽に分離します。
- 翌朝、午前11:00までにすべての交差タンクから仕切りを取り外します。静かにして、交尾中は魚を邪魔しないでください。産卵は通常、仕切りを取り除いてから30分以内に起こります。受精卵はタンクの底に残ります。
- メッシュフィルターでタンクから受精卵を集めます。卵を洗い流して卵水を入れたペトリ皿に移し、解剖顕微鏡で10倍から20倍の倍率で胚を調べます。
- 受精した胚を、大口径ガラス製パスツールピペットで約20 mLの胚培地(100 mLの1,000xストック溶液には、29.4 gのNaCl、1.27 gのKCl、4.85 gのCaCl 2.2H 2 O、および8.13 gのMgSO4.7H 2Oを含む)を含む清潔なペトリ皿に移します。胚を28°Cに保ちます。 28.5°Cで30mLの胚培地でペトリ皿あたり50個の受精胚を保管します。
注:1組の魚は通常100〜300個の胚を生産し、健康な胚の受精率と生存率は交配ごとに95%を超えます。 - 翌朝、受精後~18-20時間(hpf)の発生段階に達した午前8:00にインキュベーターから胚を取り出します。最初に白色光を使用して、20倍の倍率で落射蛍光顕微鏡でそれらを観察します。その時点で、ゼブラフィッシュの胚は20体節の段階にあります。
- ガラスピペットを使用して顕微鏡下で曇っているか破裂した死んだ胚を捨てます。
- 蛍光灯を点灯し、顕微鏡のRFPフィルター設定を選択します。次に、強い赤色蛍光の胚を選択し、卵水で新しい皿に移します。
- 白色光の下で2つの細かい鉗子(鉗子の先端は鋭くて損傷を受けていないはずです)を使用して手動で胚を脱絨毛します(材料の表)。
- 1対の鉗子で絨毛膜を保持し、もう一方の鉗子で絨毛膜を引き裂きます。鉗子を使って涙を丁寧に開き、他の鉗子の先端で胚をそっと押して、胚が通過するのに十分な大きさにします。
- 脱コリオン化した胚を新鮮な胚培地を入れた新しいペトリ皿に移し、マイクロインジェクションの前に素早くすすぎます。
2.マイクロインジェクションの調製
- キャピラリー(外径1.2 mm、内径0.9 mm、フィラメント付き)を使用して、プーラーの細い注射針を引きます。ハンドブックに従って引っ張りプログラムを設計および最適化します。
- 実体解剖顕微鏡下で鉗子で針の先端を開きます。先端の直径を約10μm、テーパー角度を約30°にします。
- 注射前に、マウスモノクローナル抗DLD抗体を抗マウスIgG-Atto647Nと結合させます。
- 各注射実験について、0.5 μLの抗DLD抗体(0.5 mg / mL)と2 μLの抗マウス-IgG-Atto647N抗体(1 mg / mL)を5〜10回ピペッティングして混合します。次に、室温で少なくとも30分間(または氷上で2〜3時間)インキュベートします。
- インキュベーション後、2.5 μLのブロッキングバッファー(10 mg/mLマウスIgG)と0.5 μLの0.5%フェノールレッドを抗体混合物に加え、ピペット10xで完全に混合し、混合物に残っている非結合抗体をブロックします。
注:試験ごとに、抗DLD抗体を含まない追加の混合物を1つ準備し、対照として使用します。
- 胚培地に1%低融点アガロースを調製する。アガロース含有混合物を透明になるまで70°Cで加熱します。
- アガロース溶液を2 mLの微量遠心チューブに分注します。アリコートを~40°Cのヒートブロックに保持します。
- 1%低融点アガロースを含むチューブで胚を3秒間すすぎます。
- 図1に示すように、胚をアガロース(~30-40 μL)の個々の滴と一緒に逆さのプラスチック製シャーレ蓋に置き、各胚を蓋に別々にマウントします。胚をアガロースに横方向に平らに置き、アガロースが室温で固まるまでこの位置を維持します。
- 上記のように12個の胚を3列に1つずつマウントします。アガロースにマウントされたすべての胚を卵培地で覆います。
3.マイクロインジェクション
- 埋め込まれた胚を実体顕微鏡の下に置き、アガロースを卵水で覆います。
- 図1に示すように、空気圧インジェクターをマイクロマニピュレーターと一緒にセットし、顕微鏡の近くに置きます。空気資源として高圧下のガス状窒素(N2)を含む鋼製ガスボンベを使用してください。
- 胚がアガロースに取り付けられた後にのみガスバルブを開きます。次に、マイクロインジェクターのフロントフィルモジュールを使用する場合は、 図1に示すように、2μLの抗体混合物を調製したガラス針をマイクロマニピュレーターにフロントロードします。
- 入力圧力を~80-90psiに、射出圧力を~20psiに調整します。
- 前述のように、顕微鏡下でマイクロメーターを用いて注入量を較正する15。針の開口部のサイズに応じて、チューニング時間を10ミリ秒から120ミリ秒に設定します。パドルをタップして、注入の各パルスを配信します。各送達の注入量を~4-5 nLに調整します。
- マイクロインジェクション針の先端を後脳後方の背側屋根板からr0/r1ヒンジポイントまで突っ込み、脳組織に当たらずに約10nL(2〜3パルス)の抗体混合物を注入します。脳室の赤い体液の流れを観察します。
注:後脳室は中脳後脳境界の後方にあります。注入されたフェノールレッド含有抗体混合物は、脳脊髄液で拡散することにより、後脳から前脳まで直ちに脳室を満たします。 - 注入後、マイクロマニピュレーターのつまみを回して針先を素早く胚から外します。注射を成功させるために、注入された混合物の赤い染料は、周囲のアガロースに漏れることなく安定して脳室に残ります。
- 顕微鏡下でマウントプレートを移動して、別のマウントされた胚を反復に適した位置に配置します。
- 6〜8個の胚を注入した後、顕微手術用ナイフでアガロースをはがし、埋め込まれたアガロースから胚を放出します。マイクロインジェクションした胚を30 mLの胚培地を入れた新しい皿に移し、次のステップのために室温に置きます。
4.取り付けとタイムラプスライブイメージング
- 30分後、選択した胚を10mLの胚培地に移す。420 μLのトリカインストック(4 mg / mL)を10 mLの胚培地に加えて、胚を麻酔します。
- 胚をマウントするには、チューブ内に同じ濃度のトリカインを含む0.8%低融点アガロースを準備します。アリコートを~40°Cのヒートブロックに保持します。
- ガラスピペットを使用して、注入した胚を温かいアガロースに3秒間浸します。その後、直ちに同じガラスピペットでアガロースから胚を取り出し、チューブからアガロースを一滴入れて35 mmガラス底培養皿の中央に胚を置きます。ガラスの上に一滴あたり1つの胚だけを置きます。
- ファイバープローブまたはローディングチップを使用して胚を穏やかに向け、胚脳の背側をガラス底にできるだけ近づけます。胚の位置を穏やかに調整して、アガロースが徐々に固まるにつれて、カールせずに胚を伸ばします。
- その後、ガラス底皿を裏返して胚の位置を確認します。正しく取り付けられた胚を持つ背側前脳全体が顕微鏡で見ることができることを確認してください。
- 胚を覆うために、トリカインを含む28.5°Cの予熱胚培地を2〜3mL加えます。 図1に示すように、共焦点顕微鏡の温度制御されたステージに皿を適切に置きます。イメージングチャンバーの温度を28.5°Cに調整します。 これで、胚をイメージングする準備が整いました。
- 40倍の水浸対物レンズを使用して、一定の時間間隔でタイムラプスライブイメージングを実行します。
- イメージングおよび顕微鏡制御ソフトウェア(μMANAGER:https://micro-manager.org/)16を使用します。
- 細胞内のMyR-Tdトマトトランスジェニックゼブラフィッシュおよびエンドソーム抗Dld-Atto647Nの膜蛍光をイメージングするために、564 nmおよび647 nmのイメージングチャネルを選択します(図1)。
- 両方のチャンネルでレーザー出力を30%に設定します。各チャンネルの Z プレーンあたりの露出時間を 200 ミリ秒に使用します。
- マウントされたゼブラフィッシュ胚ごとに、合計20個のz平面に対して1μmのスキャンzステップと、100時間枠のスキャンサイクルを使用します。
- 各スキャンサイクル間の時間間隔を20秒に設定し、スキャンモードをチャネル、スライスとして設定します。
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Representative Results
図2Aにおいて、Atto647Nを注射した胚は、一次抗体と結合することなく、脳室においてバックグラウンド蛍光を示した。細胞内にはごくわずかな取り込まれた蛍光粒子が観察されます。抗Dld-Atto647Nを注入したゼブラフィッシュ胚は、発達中の前脳のほとんどの細胞に大量の内在化蛍光粒子を示しました(図2A、右パネル)。図2Bに示すように、有糸分裂RGPに焦点を合わせるためにズームインした後、細胞分裂中の細胞内抗Dld-Atto647Nエンドソームの動的な動きを記録することができました(ビデオ1)。ほとんどの有糸分裂RGPは、抗Dld-Atto647Nエンドソームの2つの娘細胞への前後の非対称分離を示した12。また、後期末にかけて非対称性が安定し、その後娘細胞によるNotchシグナル伝達エンドソームの不斉遺伝がもたらされることにも気づきました12。
図1:実験ステップのフローチャート。 MyR-Tdトマトレポーターを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、1日目にAB野生型と交雑する。2日目に、赤色蛍光胚をマイクロインジェクション用に選択し、続いてタイムラッピングイメージングを行います。2日目 の実験全体は約8時間かかります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:発達中のゼブラフィッシュ脳における抗DLD-Atto-647N抗体取り込みのタイムラプスイメージング 。 (A)受精後1日(dpf)胚の前脳における30分間のマイクロインジェクション後の抗DLD-Atto-647N取り込み。左側のパネルは、Atto-647Nのみを注入された胚です。右側のパネルは、抗Dld-Atto-647Nを注射した胚です。破線は心室に沿った頂端層を示す。矩形ゾーンは Bに高倍率で示されています。スケールバー= 40μm。 略語:Di =間脳;テル=テレーンファロン;Ve =心室。(B)有糸分裂中の抗Dld-Atto-647Nダイナミクスのタイムラプスイメージングパネル。モンタージュの8つの時間枠は、分裂周期全体をカバーし、分裂するRGPの2つの娘細胞への抗Dld-Atto-647Nの取り込みと分離を描いています。スケールバー = 5 μm 細胞膜の輪郭が描かれています。 A と Bの両方で、膜上のMyR-Tdトマト標識は青色であり、抗Dld-Atto-647Nはマゼンタである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1: 有糸分裂全体を通して放射状グリア細胞を分裂させる際の内在化された抗Dld-Atto-647Nのダイナミクス(40時間枠と各フレーム間の30秒の間隔時間;合計20分)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞におけるエンドソームNotch/Delta輸送を高効率で標識およびイメージングするための抗体取り込みアッセイを開発しました。ショウジョウバエSOP細胞7,8で標識抗DeltaD抗体を追跡するために使用された以前の方法と比較して、私たちの方法は、結合抗体内のサンプルのインキュベーションの代わりにマイクロインジェクションを使用しました。蛍光標識抗DLD抗体を後脳室にマイクロインジェクションした。この技術は、注射後の胚の正常な発生および完全な回復によって証明されるように、傷害を引き起こさない。胚性心室は連続しており、注入された抗体はマイクロインジェクション後に前脳に向かって自由に分散することができます。注射された抗Dld-atto647Nは、脳内での継続的な抗体取り込みの安定したリソースとして24時間以上持続します。ゼブラフィッシュ後脳室注射は、前回の報告10で紹介した神経管注入と比較して、組織損傷を引き起こさず、in vivoで脳室を覆う有糸分裂RGPによる選択的な抗Dld-Atto647N取り込みを可能にします。脊髄の神経上皮細胞での抗体取り込みは確認していませんが、抗Dld-Atto647N抗体の取り込みは、脳と同様に適用できるはずです。後脳室に注入された結合抗体は、脊髄に沿っても拡散することが期待されます。
抗体取り込みアッセイの適用を成功させるためには、膜タンパク質標的の細胞外ドメインに対して高い結合親和性と特異性を有する一次抗体を使用することが最も重要な課題です。Notch/Deltaシグナル伝達の標識に加えて、このプロトコルは、同様の戦略を使用して他の膜タンパク質または細胞外タンパク質を標識するために適用できます。私たちのプロトコルは、抗Dld一次抗体の高品質と高い特異性により、ゼブラフィッシュ胚の発生において非常に効率的な抗Dld抗体の取り込みを実証しました。第二に、抗Dld一次抗体と蛍光二次抗体との結合は、生体内での抗体取り込み効率を高くするために重要です。Atto非漂白二次抗体は、ショウジョウバエの培養物で使用されているゼノンやAlexa二次抗体などの他の蛍光抗体よりも安定ではるかに明るいことがわかりました7,10。Atto647Nを蛍光標識として選択したのは、通常、GFPまたはRFPトランスジェニックゼブラフィッシュ、またはGFPまたはRFPと同様の励起波長を共有する他の蛍光マーカーと一緒に使用するためです。励起波長が異なる他の非漂白性二次抗体もプロトコルで動作するはずです。私たちのプロトコルでは、Atto二次抗体と混合した一次抗体のインキュベーション時間を12時間から30分に短縮し、最終的なマイクロインジェクション混合物中の抗DLD抗体の濃度を0.05 mg / mLに減らしました。高濃度の抗DLD抗体(0.25 mg/mL)は、ゼブラフィッシュ胚における抗体取り込み効率を増加させなかった。これが、蛍光二次抗体10による十分な標識を達成するために、長いインキュベーション時間を必要とする理由である可能性があります。注射された抗Dld-Atto647N抗体は、RGPの膜上のDeltaDリガンドに結合すると、内因的に発現したNotch/Deltaと競合し、それによってin vivoでのシスまたはトランスNotch/Δシグナル伝達を妨害する可能性があるため、以前の研究10のように高濃度の抗Dld抗体を使用しませんでした。また、一次抗体結合後に添加したブロッキングバッファーが、in vivoでの抗体取り込みアッセイの特異性を高めるのに役立つこともわかりました。図2に示すように、前脳のほとんどのRGPは、抗Dld-Atto647Nを積極的に内在化します。ブロッキングバッファーを添加しない場合、ほとんどの細胞は、インターナライズされた抗Dld-Atto647Nエンドソームをほとんど示さない(データは示さず)。
プロトコルの主な制限は、取り込みアッセイに使用できる抗体の入手可能性です。私たちのプロトコルは、細胞外ドメインに対する良好な抗体が利用可能である場合、膜発現タンパク質の標識に適用できます。細胞質および核タンパク質の場合、結合抗体は細胞膜を通過して細胞内結合標的に結合することができないため、抗体取り込みアッセイは適用できません。細胞内タンパク質のライブイメージングは、主に異なるタイプの蛍光トランスジェニックモデルに依存します。ここ数十年で、シリコンローダミン様(SiR)技術など、生細胞イメージング用により多くの蛍光色素が開発され、DNA、RNA、アクチン、チューブリン17のライブセルイメージングに大きく貢献しています。異なるライブ標識戦略の組み合わせは、生細胞における複雑なシグナル伝達経路を研究するための最良の方法であろう。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、NIH R01NS120218、UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation、およびChan Zuckerberg Biohubの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
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