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Quantificação e caracterização do genoma completo do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Este protocolo visa quantificar o ARN SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar a serem usadas para estudos epidemiológicos baseados em águas residuais e avaliar o risco de exposição ao SARS-CoV-2 em aerossóis interiores e exteriores. Este protocolo igualmente descreve uma aproximação do sequenciamento longo do modelo do amplicon tiled para a caracterização do genoma inteiro SARS-CoV-2.

Abstract

A epidemiologia baseada em águas residuais emergiu como um sistema de vigilância promissor e eficaz para SARS-CoV-2 e outras doenças infecciosas em muitas nações. O processo tipicamente envolve concentração de águas residuais, extração de ácidos nucleicos, amplificação de segmentos genômicos selecionados e detecção e quantificação do segmento genômico amplificado. Esta metodologia pode igualmente ser aproveitada para detectar e quantificar agentes infecciosos, tais como SARS-CoV-2, em amostras de ar. Inicialmente, presumia-se que o SARS-CoV-2 se espalhasse principalmente por meio do contato pessoal próximo com gotículas geradas por um indivíduo infectado enquanto falava, espirrava, tossia, cantava ou respirava. No entanto, um número crescente de estudos relatou a presença de RNA do SARS-CoV-2 no ar de instalações de saúde, estabelecendo a transmissão por via aérea como uma rota viável para o vírus. Este estudo apresenta um composto de protocolos estabelecidos para facilitar a detecção, quantificação e sequenciamento ambiental de vírus de amostras de águas residuárias e ar.

Introduction

Em dezembro de 2019, surgiu uma nova doença chamada COVID-19, causada por um coronavírus até então desconhecido, o SARS-CoV-21. A pandemia global resultante apresentou um desafio significativo para os laboratórios clínicos e de saúde pública em todo o mundo, já que um grande número de indivíduos requer testes para avaliar com precisão a transmissão e a prevalência do vírus na comunidade. No entanto, em muitas regiões, alcançar o nível necessário de testagem em tempo hábil e espacialmente abrangente é economicamente inviável 2,3. Os sistemas de vigilância atuais, baseados em diagnósticos clínicos individuais, dependem fortemente da gravidade dos sintomas e da notificação individual, bem como do grau em que esses sintomas se sobrepõem às doenças existentes circulantes na população4,5,6,7,8,9,10. Consequentemente, um número elevado de casos assintomáticos contribui para uma subestimação significativa da carga da doença7,11.

Devido a esses desafios, a epidemiologia baseada em águas residuais (WBE) para a vigilância COVID-19 foi proposta como uma estratégia de vigilância complementar. A EFC foi descrita pela primeira vez em 200112 e foi inicialmente utilizada para rastrear cocaína e outras drogas ilícitas13. Essa abordagem baseia-se no pressuposto de que é possível calcular a concentração inicial de qualquer substância estável em águas residuárias e excretada pelo ser humano 8,12. O WBE tem sido implementado com sucesso em muitos países como um sistema de vigilância complementar e eficiente para SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. A maioria dos métodos para detecção de vírus humanos em ambientes aquáticos segue estas etapas: concentração, extração de ácidos nucleicos, amplificação do segmento (ou segmentos) genômico escolhido e detecção/quantificação do segmento genômico amplificado3.

Outro ambiente importante para a detecção e quantificação do SARS-CoV-2 está em amostras de ar. Inicialmente, acreditava-se que o SARS-CoV-2 era transmitido principalmente por meio do contato pessoal próximo com gotículas respiratórias de aerossóis gerados por uma pessoa infectada enquanto falava, espirrava, tossia, cantava ou respirava17. No entanto, vários estudos começaram a relatar a presença do RNA do SARS-CoV-2 no ar, especialmente em estabelecimentos de saúde e outros espaços fechados 18,19,20,21. Evidências de viabilidade do SARS-CoV-2 em amostras de ar coletadas em ambientes fechados em hospitais e outros espaços fechados foram encontradas quando a concentração do vírus era suficientemente alta22,23,2 4. Estudos ao ar livre geralmente não encontraram evidências de SARS-CoV-2, exceto em espaços ao ar livre lotados 21,25,26,27,28,29. A partir de agora, a transmissão aérea do SARS-CoV-2 foi reconhecida como um modo de transmissão30,31. Um estudo de revisão recente mostra as diferenças entre ambientes externos, onde os riscos de transmissão pelo ar são mínimos fora de áreas lotadas, e em ambientes fechados, onde riscos maiores podem estar presentes em ambientes mal ventilados nos quais fontes fortes (ou seja, número de pessoas infectadas) podem estar presentes. Um recente estudo de revisão abrangente destacou as diferenças substanciais entre os riscos de transmissão pelo ar em ambientes externos versus internos, particularmente em áreas lotadas com ventilação deficiente. O estudo indica que o risco de transmissão pelo ar é mínimo em ambientes externos, onde há maior volume de ar disponível para diluição e dispersão de partículas virais32. Estes resultados têm implicações importantes para as políticas de saúde pública e directrizes relacionadas com COVID-19. Ao reconhecer as diferenças significativas nos riscos de transmissão entre ambientes internos e externos, os formuladores de políticas podem desenvolver estratégias mais eficazes para mitigar a propagação do vírus e proteger a saúde pública.

Há uma variedade de métodos e protocolos para a detecção, quantificação e sequenciamento de SARS-CoV-2 de diferentes amostras ambientais. Este artigo de método tem como objetivo apresentar uma combinação de protocolos bem estabelecidos que permitem que laboratórios com diferentes níveis de capacidade realizem detecção, quantificação e sequenciamento ambiental de vírus a partir de amostras de águas residuárias e ar.

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Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram publicados em outros lugares e contêm pequenas modificações dos métodos originais.

1. Coleta de águas residuais e pré-processamento de amostras

NOTA: Devido às baixas concentrações de RNA do SARS-CoV-2 em amostras ambientais, a implementação de uma etapa de concentração é crucial para uma detecção bem-sucedida33,34,35. Descrito aqui é o primeiro método relatado para a detecção de SARS-CoV-2 em águas residuais36.

  1. Recolha e concentração da(s) amostra(s) de águas residuais
    1. Coletar 1 L de amostra de águas residuais compostas de 24 h. Conservar a amostra a 4 °C e prosseguir com o protocolo no prazo de 24 horas.
    2. Homogeneizar a amostra agitando suavemente o frasco. Coletar 70 mL em um tubo centrífugo de 100 mL ou dividir a amostra em dois tubos centrífugos de 50 mL.
    3. Spike 20 μL de mengovírus (3,2 x 103 cópias/μL) para 70 mL de cada amostra como controle interno do processo de concentração. Alternativamente, spike 10 μL de mengovírus (3,2 x 103 cópias/μL) em cada tubo de centrífuga de 50 mL.
    4. Homogeneizar a amostra e centrifugar a 700 x g por 10 min para remover partículas grandes e organismos (pellet).
    5. Use o sobrenadante resultante para concentração com dispositivos centrífugos de ultrafiltração com um ponto de corte de 10 KDa por centrifugação a 4.000 x g por 40 min a 4 °C. Eluir o concentrado centrifugando a 700 x g por 40 min e invertendo a posição do dispositivo de ultrafiltração.
    6. Meça o volume do concentrado resultante. O volume mudará dependendo da quantidade de sólidos na amostra que obstruem os filtros centrífugos. Neste estudo, os volumes de concentrado obtidos ficaram entre 200-1.200 μL.
    7. Use o concentrado resultante para extração de RNA usando um kit comercial ou um método interno. Para as amostras utilizadas neste estudo, é utilizado um kit comercial específico para extração de RNA viral com volume de eluição de 50 μL.
    8. Medir a concentração do RNA extraído com um kit de quantificação de RNA fluorométrico. Divida o RNA extraído em alíquotas e congele a -80 °C até nova análise.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimentos de isolamento de RNA, deve ser incluído um controle negativo de isolamento (NCI), contendo apenas tampões para detectar possíveis contaminações durante a extração.
  2. Coleta de amostras de ar usando um amostrador de ar compacto Coriolis
    1. Escolha uma estratégia de amostragem de acordo com o objetivo da pesquisa, definindo a frequência de amostragem e os locais de amostragem.
    2. Ajuste a taxa de fluxo no amostrador de ar (aqui, 50 L/min por 30 min). Por favor, note que uma taxa de fluxo de mais de 200 L/min pode degradar o RNA viral, por isso recomenda-se usar uma taxa de fluxo abaixo de 200 L/min.
    3. Colocar um cone estéril no amostrador de ar antes de iniciar a colheita, pulsando o arranque. Uma vez terminada a amostragem, adicionar 5-15 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) no cone. Vórtice suavemente ou agite a amostra manualmente por 15 s. Conservar as amostras até 24 h a 4 °C ou a -80 °C em criotubos.
    4. Uma etapa de concentração opcional pode ser executada. Limpar e descontaminar os cones após cada experimento com água sanitária.
    5. Extraia o RNA usando um kit comercial ou um método interno. Para as amostras deste estudo, é utilizado um kit comercial específico para extração de RNA viral com volume de eluição de 50 μL.
    6. Medir a concentração do RNA extraído com um kit de quantificação de RNA fluorométrico. Divida o RNA extraído em alíquotas e congele a -80 °C até nova análise.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimentos de isolamento de RNA, deve ser incluído um controle negativo de isolamento (NCI), contendo apenas tampões para detectar possíveis contaminações durante a extração.

2. Quantificação do RNA do SARS-CoV-2 pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR)

NOTA: O protocolo abaixo está de acordo com o painel de diagnóstico RT-PCR do CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV)37. Divida a mistura primer/sonda em várias alíquotas para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.

  1. Preparar o mastermix de reação para cada alvo (mengovírus; SARS-CoV-2 [genes N1 e N2]) como na Tabela 1, em uma capela limpa na sala de configuração do reagente. Misturar cinco vezes a mistura primers/sonda e a enzima por inversão. Alternativamente, pulso-vórtice de luz a mistura primers/sonda e enzimacinco vezes.
    NOTA: Manter todos os reagentes frios durante a preparação e utilização. Para minimizar os ciclos de congelamento-descongelamento, é altamente recomendável congelar em alíquotas.
  2. Gire para baixo (1.000 x g para 15-30 s) os tubos para coletar o conteúdo no fundo e coloque os tubos em uma cremalheira fria ou no gelo.
  3. Rotular tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada alvo. Adicione a cada tubo de microcentrífuga a quantidade de cada reagente necessária (volume por reação vezes o número de reações, incluindo os controles necessários). Misture pipetando para cima e para baixo e centrifugando por 5 s para coletar o conteúdo na parte inferior.
  4. Mantenha os tubos de microcentrífuga em uma cremalheira fria e distribua 15 μL em tubos de tira PCR ou uma placa de 96 poços em um rack de resfriamento. Cubra a placa e mova-a para a área de manipulação de ácido nucleico (mantenha-a em uma prateleira de resfriamento).
  5. Descongelar uma alíquota de RNA extraído e suavemente vórtice por 5 s. Pipetar 5 μL de RNA (além de 5 μL de controle não-molde [NTC], controle negativo de isolamento [NCI] e controle positivo [PC]) para cada poço de reação ou tubo contendo a mastermix previamente preparada. Troque as luvas com frequência, conforme necessário, para evitar contaminação cruzada.
  6. Cubra toda a placa ou tubos de reação e vórtice suavemente. Centrífuga (1.000 x g para 15-30 s) da placa ou tubos de PCR.
  7. Iniciar a RT-qPCR de 25 μL com as seguintes condições de ciclagem: transcriptase reversa a 45 °C por 10 min; ativação da polimerase a 95 °C por 10 min; 45 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s; e recozimento/extensão a 60 °C por 45s.
  8. Calcule a eficiência de recuperação dos controles de mengovírus conforme relatado por Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Sequenciamento de variantes em águas residuais e análise de dados

NOTA: O protocolo descrito é um protocolo modificado criado por Quick et al.39,40. Ele usa dois conjuntos de primers para amplificação do genoma SARS-CoV-2 pela metodologia de PCR tiling - primers ARTIC e primers VarSkip. Uma combinação de primers é usada para garantir a melhor cobertura genômica e minimizar a possibilidade de novas mutações causarem falha em primers de um tipo. Em geral, o protocolo é dividido em três partes: transcrição reversa (TR) e geração de amplicon, preparação da biblioteca de sequenciamento, sequenciamento e análise dos dados.

  1. Transcrição reversa e geração de amplicon
    1. Certifique-se de que as amostras de entrada tenham um valor conhecido de limite de ciclagem (Ct) de qPCR para diluí-las corretamente em água de grau PCR. O valor de Ct é obtido durante a quantificação com qPCR. As diluições são as seguintes: se o valor de Ct for 12-15, diluir as amostras 1:100; se o valor de Ct for 15-18, diluir as amostras 1:10; se o valor de Ct for 18-35, não diluir a amostra. Amostras acima de um valor de Ct de 35 têm uma alta chance de não funcionar.
    2. Em uma placa de PCR, pipetar 16 μL de cada amostra para sua posição na placa. Adicionar 4 μL de mastermix de transcrição reversa (RT) (5x). Cubra a placa e inicie a reação de PCR com as seguintes condições: 25 °C por 2 min, 55 °C por 20 min e 95°C por 1 min.
    3. Prepare diluições de 10 μM de cada conjunto de primers (ARTIC pool A e pool B, e VarSkip pool A e pool B). Prepare o mastermix para cada conjunto de primers (ARTIC conjunto A e B e VarSkip conjunto A e B) como na Tabela 2. Quatro mastermixes resultarão disso.
    4. Em uma nova placa de PCR, pipetar 20 μL do mastermix para cada poço correspondente. Adicionar 5 μL da amostra de RT a cada mistura.
      NOTA: Cada amostra terá quatro misturas de reação - ARTIC pool A e B, e VarSkip pool A e B.
    5. Cobrir a placa e iniciar a reação de PCR da seguinte forma: ativação da polimerase a 98 °C por 30 s; 35 ciclos de desnaturação a 98 °C por 15 s; e aneio/extensão a 65 °C por 4 min. Gire para baixo (1.000 x g para 15-30 s) a placa. Combine os pools de reação ARTIC e combine separadamente os pools de reação VarSkip. Cada amostra terá duas reações de amplicon de 50 μL.
    6. Adicionar 50 μL de reagente à base de grânulos para purificação por PCR a cada poço e misturar bem por pipetagem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Antes de cada uso, misture vigorosamente o reagente de purificação PCR para ressuspender as contas.
    7. Coloque a placa em um suporte de separação magnética e espere que as contas formem um grânulo e o líquido limpe (~5 min). Pipetar e descartar o sobrenadante. Mantenha a placa de PCR no suporte magnético.
    8. Mantendo a placa de PCR no suporte magnético, adicionar 200 μL de etanol 80% a cada amostra sem tocar no grânulo. Retire o etanol.
    9. Repita a etapa anterior. Deixe a placa no suporte magnético descoberta por 30 s para permitir que o etanol evapore.
    10. Retire a placa do suporte magnético e adicione 15 μL de água de grau PCR a cada amostra. Ressuspenda o pellet por pipetagem. Incubar à temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Coloque a placa de volta no suporte magnético e deixe as contas em pellet (2 min). Pipetar cuidadosamente 15 μL do sobrenadante de cada amostra para uma nova placa de PCR.
    12. Medir a concentração de cada amostra com um kit de quantificação de RNA fluorométrico. Tomar aproximadamente 50 ng de cada amostra em 12,5 μL para a próxima etapa. Se necessário, diluir a amostra em água de grau PCR.
  2. Preparação da biblioteca
    1. Adicionar 1,75 μL de tampão de reacção do kit de preparação da biblioteca de ADN Illumina e 0,75 μL de mistura enzimática a cada amostra. Tampe a placa, vórtice brevemente e gire para baixo (1.000 x g por 15-30 s). Incubar a 21°C durante 5 min e a 65 °C durante 5 min.
    2. Em uma nova placa, pipetar 3 μL de água grau PCR para cada amostra para uma nova placa de PCR. Adicionar 0,75 μL das amostras preparadas, 1,25 μL de códigos de barras para a preparação da biblioteca de sequenciamento e 5 μL de T4 DNA ligase mastermix. Misture bem por pipetagem, gire brevemente para baixo (1.000 x g por 15-30 s) em uma centrífuga e incube a 21 °C por 20 min e a 65 °C por 10 min.
      Observação : se usando menos de 25 amostras, o dobro de todos os volumes nesta etapa.
    3. Agrupar todas as amostras adicionando 10 μL de cada amostra ao mesmo tubo de baixa ligação. Tome 480 μL para o próximo passo.
    4. Adicione 192 μL de reagente à base de grânulos para purificação por PCR à piscina e misture bem por pipetagem. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Coloque o tubo em um suporte magnético e espere que o sobrenadante se limpe e que um grânulo se forme. Remova o sobrenadante. Remova o tubo do suporte magnético.
    6. Adicionar 700 μL do tampão de fragmentos curtos (SFB) e misturar por pipetagem. Coloque novamente no suporte magnético e espere que o pellet se forme e o líquido limpe (~5 min). Pipetar o sobrenadante e descartá-lo.
    7. Repita a etapa anterior. Deixe o tubo no suporte magnético. Adicionar 100 μL de etanol a 80% sem tocar no talão. Pipetar o etanol e deixar o talão secar por 30 s.
      NOTA: Não permita que o talão seque demais.
    8. Retire o tubo do suporte magnético e adicione 35 μL de água de grau PCR. Misturar por pipetagem e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Coloque o tubo no suporte magnético e deixe o talão ser granulado e o líquido limpo. Pipetar 35 μL do sobrenadante para um novo tubo.
    9. Medir a concentração de RNA da biblioteca agrupada. Pipetar o volume necessário para atingir uma quantidade de 30-50 ng de RNA e preenchê-lo com água de grau PCR para atingir um volume final de 30 μL.
    10. Prepare a mistura de reação de ligadura do adaptador: 30 μL da biblioteca agrupada, 5 μL da mistura de adaptador II, 10 μL do tampão de reação de ligadura (5x) e 5 μL de T4 DNA ligase. Misture por pipetagem e spin-down (1.000 x g por 15-30 s). Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    11. Adicionar 20 μL do reagente à base de grânulos para purificação por PCR e misturar por pipetagem. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
    12. Coloque o tubo no suporte magnético e espere que o grânulo se forme e o sobrenadante fique incolor. Pipetar cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
    13. Retire do suporte magnético e adicione 125 μL de SFB. Misture por pipetagem e coloque novamente no suporte magnético para separar as contas. Quando o líquido estiver límpido, pipetar e descartar o sobrenadante.
    14. Repita a etapa anterior. Deixe o tubo aberto no suporte magnético por 30 s para que parte do líquido restante evapore.
    15. Retire o tubo do suporte magnético e adicione 15 μL do tampão de eluição. Misture bem por pipetagem e gire brevemente para baixo (1.000 x g por 15-30 s). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque no suporte magnético por 2 min.
    16. Pipetar 15 μL do sobrenadante para um novo tubo de baixa ligação. Esta é a biblioteca final. Meça a concentração com um kit de quantificação de DNA fluorométrico.
      NOTA: Na próxima etapa, 12 μL são necessários. Se a concentração for muito alta e for necessário menos de 12 μL da biblioteca, encha até 12 μL com o reagente tampão de eluição.
  3. Carregamento e sequenciamento de células de fluxo
    1. Inserir a célula de fluxo (R9.4.1) no dispositivo de sequenciação de ADN e ARN em tempo real.
    2. Preparar a mistura de escorvamento adicionando 30 μL de reagente flush tether (FLT) a um tubo de reagente flush buffer (FB). Vórtice para misturar e girar para baixo (1.000 x g para 15-30 s).
    3. Abra a tampa da porta de escorvamento. Usando uma pipeta de 1.000 μL, ajuste para 200 μL e insira a ponta na porta de escorvamento. Gire a roda de ajuste de volume e aumente o volume até que o líquido na ponta seja visto. Descarte a gorjeta.
      NOTA: Só gire a roda até que alguns μL de líquido na ponta sejam vistos. Puxar quantidades maiores pode danificar a célula de fluxo.
    4. Adicione lentamente 800 μL da mistura de priming ao orifício de escorvamento, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Aguarde 5 min.
    5. Enquanto isso, prepare as bibliotecas para carregamento. Misturar 37,5 μL do tampão de sequenciamento, 25,5 μL do tampão de carregamento e 12 μL da biblioteca.
      NOTA: Misture o buffer de carregamento antes de pipetar. As contas neste reagente se instalam muito rapidamente.
    6. Abra a tampa da porta. Pipetar 200 μL da mistura de escorvamento para a porta de escorvamento.
      NOTA: Ao pipetar para a porta de priming com a porta de tampa aberta, notar-se-á pequenas gotas provenientes da porta de amostra. Pipeta lenta o suficiente para que a porta de amostra possa puxar as gotas sem transbordar.
    7. Antes de carregar a biblioteca preparada, misture bem por pipetagem. Usando uma pipeta de 100 μL ajustada para 75 μL, pegue a biblioteca e a pipeta gota a gota na porta de amostra. Não toque na porta e espere que cada gota seja absorvida pela porta antes de carregar a próxima gota para evitar o transbordamento do líquido.
    8. Feche a porta de tampa e a porta de escorvamento. Abra o software e inicie o experimento de sequenciamento. Selecione basecalling On. Para uma biblioteca com 96 amostras multiplexadas, 10-12 h de sequenciamento geralmente são suficientes para gerar dados suficientes.
      NOTA: Usando o software, pode-se inserir a folha de exemplo em .csv formato. A folha de exemplo requer os seguintes dados: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code e kit. O ID da célula de fluxo é necessário (listado na lateral da célula de fluxo) juntamente com o kit usado. Para o protocolo sugerido, o kit LSK109 deve ser selecionado.
  4. Análise de dados de sequenciamento
    1. Insira as leituras fastq compactadas no fluxo de trabalho wf-artic41. Execute o fluxo de trabalho separadamente com dois esquemas de primer diferentes (ARTIC/V4.1 e NEB-VarSkip/v1a). Dois". primertrimmed.rg.sorted.bam" são criados para cada amostra.
    2. Mescle os arquivos BAM em um único arquivo com o comando "samtools merge"42. Insira o arquivo BAM mesclado na ferramenta Freyja, deixando as configurações padrão, para recuperar abundâncias de linhagem relativa43.
    3. Para criar um arquivo FASTA, insira o arquivo BAM mesclado nas ferramentas "samtools mpileup" e "ivar" com configurações padrão44,45. Para chamadas de mutação, carregue o arquivo FASTA na ferramenta Nextclade46,47.

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Representative Results

Os resultados resumidos na Tabela 3 mostram exemplos da detecção e quantificação do RNA do SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais e ar usando o método descrito neste artigo. Amostras de águas residuárias foram coletadas de estações de tratamento de águas residuais na Espanha e na Eslovênia e foram consideradas positivas se a Ct fosse inferior a 40 em pelo menos duas das três repetições, sendo a quantificação considerada válida se a Ct tivesse uma variação inferior a 5%. Em Espanha e Portugal, foram recolhidas amostras de ar interior e exterior, aplicando-se as mesmas regras. Duplicatas foram usadas para as amostras de ar, não triplicadas como para as amostras de águas residuais, pois o objetivo do estudo era detectar o RNA do SARS-CoV-2 e não quantificá-lo. Além disso, uma execução de RT-qPCR só foi considerada válida se todos os controles utilizados (conforme descrito neste protocolo) se comportassem como esperado e se nenhum desvio significativo fosse observado no controle do RNA do mengovírus. Para essas amostras, a eficiência de recuperação dos mengovírus variou entre 13,7% e 19,7%. A inibição foi avaliada diluindo-se dez vezes e 100 vezes o RNA extraído e comparando-se os resultados de RT-qPCR resultantes, bem como usando um kit comercial. As instruções para cada kit de controle de inibição devem ser seguidas conforme descrito pelos fabricantes.

As amostras de água residuária apresentaram desvio padrão de 1,91% a 13,98% entre as triplicatas e variaram de 3,05 x 10 3 a 2,83 x 108 cópias gênicas/L. As amostras de ar variaram de 6,17 x 103 a 5,48 x 109 com desvio padrão entre as duplicatas entre 0,54% e 10,95%. Isso está de acordo com estudos prévios 6,48,49,50.

Conforme descrito neste protocolo, as amostras foram sequenciadas e um exemplo de três resultados de amostras sequenciadas está resumido na Tabela 4 e Figura 1. Nas três amostras, a linhagem BA.5.x foi classificada como a mais prevalente pela ferramenta de Freyja (95,3%, 95,4% e 99,8%).

Figure 1
Figura 1: Prevalência da linhagem SARS-CoV-2 em amostras de águas residuais selecionadas. As linhagens foram atribuídas usando a ferramenta de Freyja. O resumo dos números de prevalência não chega necessariamente a 100%, pois alguns dos dados não são de qualidade suficiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Reagentes e volumes a serem adicionados de cada um para preparar o mastermix para quantificação de SARS-CoV2 por RT-qPCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Reagentes e volumes a serem adicionados de cada um para preparar o mastermix para amplificar os genomas completos do SARS-CoV-2 nas amostras. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Resumo dos resultados da quantificação RT-qPCR do RNA do SARS-CoV-2 de amostras de águas residuais e ar. O gene N1 foi utilizado para quantificação e o N2 para confirmação (positiva ou negativa). Os resultados são expressos em cópias/L. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Mutações detectadas e prevalência de linhagem. As linhagens foram atribuídas usando a ferramenta de Freyja e de acordo com as mutações de interesse encontradas usando Nextclade. A cobertura genômica para cada amostra é mostrada. O resumo dos números de prevalência não chega necessariamente a 100%, pois alguns dos dados não são de qualidade suficiente. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

A detecção e quantificação microbiana e viral usando métodos de (RT-)qPCR têm obtido ampla aceitação devido à sua notável sensibilidade. No entanto, essas técnicas enfrentam inúmeros desafios ao analisar amostras ambientais. As amostras de águas residuais contêm uma abundância de substâncias inibidoras que podem distorcer as medições e gerar resultados enganosos. Para enfrentar essas limitações e aumentar a precisão, um protocolo complexo foi concebido, projetado e implementado. Este protocolo foi adaptado combinando protocolos da literatura científica e para abordar especificamente as restrições inerentes aos métodos de qPCR, incorporando uma série de controles rigorosos em cada etapa do processo. Ao integrar essas rigorosas medidas de controle de qualidade, este protocolo oferece uma solução robusta para os desafios enfrentados pelos métodos de detecção e quantificação baseados em qPCR em amostras ambientais complexas51,52. O controle negativo de isolamento (NCI) e o controle não-molde (NTC) são ferramentas essenciais para avaliar a probabilidade de contaminação durante a extração de RNA e reação de RT-qPCR. Além disso, a integração do RNA de controle de mengovírus fornece um meio crucial para avaliar a variabilidade interamostral, bem como a eficiência da etapa de concentração e os efeitos inibitórios de agentes presentes em amostras ambientais complexas. Em toda reação de RT-qPCR, controles positivos devem ser incluídos para confirmar a eficácia do processo de amplificação. É fundamental monitorar cuidadosamente cada etapa do protocolo, incluindo o tempo de armazenamento e processamento das amostras. A degradação das amostras pode ser influenciada pela temperatura e pela complexa composição das águas residuais, tornando essencial armazenar as amostras a uma temperatura de 4 °C e processá-las dentro de 24 h. Ao aderir a essas rigorosas medidas de controle de qualidade, pesquisadores e profissionais de saúde pública podem analisar com confiança e precisão amostras ambientais para descobrir insights vitais sobre populações microbianas e virais e entender melhor o impacto dos fatores ambientais na saúde humana48.

A selecção dos alvos do RNA para a detecção SARS-CoV-2 é um factor crítico que pode afectar a sensibilidade dos ensaios de RT-qPCR. Neste estudo, os autores avaliaram os alvos RdRp, E, N1 e N2 e verificaram que os ensaios RdRp e E apresentaram menor sensibilidade do que os ensaios N1 e N2, consistente com pesquisas anteriores53. Os ensaios N1 e N2 utilizam sondas double quencher, que demonstraram aumentar sua sensibilidade em ensaios de (RT-)qPCR54. Essas razões levaram à decisão de usar N1 para quantificação e N2 como confirmação da presença de RNA, a fim de eliminar dúvidas quando concentrações muito baixas são encontradas. As discrepâncias observadas entre os alvos de RT-qPCR foram relatadas anteriormente36.

Vários estudos empregaram protocolos similares e relataram a detecção e quantificação bem-sucedidas do RNA de SARS-CoV-2 em águas residuais durante a pandemia COVID-19 em curso 6,48,49,55,56. As concentrações relatadas do RNA do SARS-CoV-2 estão de acordo com as relatadas neste estudo e no protocolo 48,50,55. Alguns desses estudos têm explorado a relação entre casos ativos e concentrações de genes alvo de RT-qPCR, particularmente N1 e N2 6,36,49,50,55,57,58,59. Para reduzir a variabilidade nas concentrações gênicas obtidas, foi proposto multiplicar as concentrações experimentais pelo fluxo no momento da amostragem para obter a carga viral inicial36. Esta abordagem foi incorporada no projeto VATar COVID-19 em Espanha, um sistema nacional de monitorização da COVID-19 em águas residuais60.

Como a próxima fase dos estudos da epidemiologia baseada em águas residuais COVID-19 (WBE), os pesquisadores tentaram detectar mutações SARS-CoV-2 nas águas residuais para estimar a circulação de variantes de preocupação dentro das comunidades. Estudos anteriores mostraram uma forte correlação entre as variantes identificadas nas águas residuais e aquelas presentes na população ao mesmo tempo. Estes resultados sugerem que a monitorização baseada nas águas residuais pode servir como uma ferramenta valiosa no rastreio da propagação das variantes SARS-CoV-261,62. O WBE tem se mostrado uma grande promessa no monitoramento do SARS-CoV-2 e pode ser usado para o desenvolvimento de futuras estratégias de vigilância para pandemias. Esta abordagem é particularmente útil nos estágios iniciais de uma pandemia, quando há testes individuais limitados e muitos casos podem ser assintomáticos, e tem uma estratégia complementar à vigilância clínica. Portanto, a EBAB pode ser especialmente útil em locais com baixa capacidade econômica que não podem arcar com outras estratégias de vigilância mais caras. O método descrito pode ser facilmente adaptado a outros vírus que possam ser relevantes para monitoramento no futuro.

Os resultados da amostragem de ar em ambientes internos e externos revelaram que o RNA do SARS-CoV-2 está presente em ambos os ambientes, embora em concentrações menores em ambientes externos 38,63,64. Esses resultados sugerem que atividades e exposições em que o uso de máscara e o distanciamento social são difíceis de manter, como comer, beber ou participar de festivais de música, podem representar um risco maior de transmissão da COVID-19. Para mitigar esses riscos, é fundamental considerar medidas adequadas de ventilação e o uso de máscaras, especialmente com o surgimento de novas variantes de preocupação mais transmissíveis, como as variantes Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529). À luz do levantamento das restrições COVID-19 em muitas áreas, a manutenção do uso de máscaras é recomendada para manter a transmissão comunitária do SARS-CoV-2 no mínimo e prevenir futuros surtos da doença 5,21,26,65.

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Disclosures

Os autores não têm interesses econômicos concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi realizado com apoio financeiro do Governo Regional de Castela e Leão e do programa FEDER (projetos CLU 2017-09, UIC315 e VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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