Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantificering og helgenomkarakterisering af SARS-CoV-2 RNA i spildevands- og luftprøver

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Denne protokol har til formål at kvantificere SARS-CoV-2 RNA i spildevands- og luftprøver, der skal anvendes til spildevandsbaserede epidemiologiske undersøgelser, og at vurdere eksponeringsrisikoen for SARS-CoV-2 i indendørs og udendørs aerosoler. Denne protokol beskriver også en flisebelagt amplicon langskabelonsekventeringstilgang til SARS-CoV-2 helgenomkarakterisering.

Abstract

Spildevandsbaseret epidemiologi har vist sig som et lovende og effektivt overvågningssystem for SARS-CoV-2 og andre smitsomme sygdomme i mange nationer. Processen involverer typisk spildevandskoncentration, nukleinsyreekstraktion, amplifikation af udvalgte genomiske segmenter og påvisning og kvantificering af det amplificerede genomsegment. Denne metode kan ligeledes udnyttes til at detektere og kvantificere infektiøse agenser, såsom SARS-CoV-2, i luftprøver. Oprindeligt blev SARS-CoV-2 formodet at sprede sig primært gennem tæt personlig kontakt med dråber genereret af et inficeret individ, mens han talte, nyser, hoster, synger eller trækker vejret. Imidlertid har et stigende antal undersøgelser rapporteret tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 RNA i luften i sundhedsfaciliteter, hvilket etablerer luftbåren transmission som en levedygtig rute for virussen. Denne undersøgelse præsenterer en sammensætning af etablerede protokoller for at lette miljødetektion, kvantificering og sekventering af vira fra både spildevands- og luftprøver.

Introduction

I december 2019 opstod en ny sygdom kaldet COVID-19 forårsaget af et tidligere ukendt coronavirus, SARS-CoV-21. Den deraf følgende globale pandemi har udgjort en betydelig udfordring for kliniske laboratorier og folkesundhedslaboratorier verden over, da et stort antal individer kræver test for nøjagtigt at vurdere virusoverførsel og prævalens i samfundet. I mange regioner er det imidlertid ikke økonomisk muligt at opnå det nødvendige testniveau rettidigt og rumligt omfattende 2,3. De nuværende overvågningssystemer baseret på individuel klinisk diagnostik er stærkt afhængige af symptomernes sværhedsgrad og individuel rapportering, samt i hvilket omfang disse symptomer overlapper eksisterende sygdomme, der cirkulerer i befolkningen 4,5,6,7,8,9,10. Derfor bidrager et stort antal asymptomatiske tilfælde til en signifikant undervurdering af sygdomsbyrden 7,11.

På grund af disse udfordringer blev spildevandsbaseret epidemiologi (WBE) til COVID-19-overvågning foreslået som en supplerende overvågningsstrategi. WBE blev først beskrevet i 200112 og blev oprindeligt brugt til at spore kokain og andre ulovlige stoffer13. Denne tilgang bygger på den antagelse, at det er muligt at beregne den oprindelige koncentration af ethvert stof, der er stabilt i spildevand og udskilles af mennesker 8,12. WBE er med succes implementeret i mange lande som et komplementært og effektivt overvågningssystem for SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. De fleste metoder til påvisning af humane vira i vandmiljøer følger disse trin: koncentration, nukleinsyreekstraktion, amplifikation af det eller de valgte genomsegmenter og påvisning/kvantificering af det amplificerede genomsegment3.

Et andet vigtigt miljø til påvisning og kvantificering af SARS-CoV-2 er i luftprøver. Oprindeligt blev SARS-CoV-2 antaget at blive overført hovedsageligt gennem tæt personlig kontakt med åndedrætsdråber fra aerosoler genereret af en inficeret person, mens han talte, nyser, hoster, synger eller trækker vejret17. Imidlertid begyndte flere undersøgelser at rapportere tilstedeværelsen af SARS-CoV-2 RNA i luften, især i sundhedsfaciliteter og andre lukkede rum 18,19,20,21. Der er fundet bevis for SARS-CoV-2-levedygtighed i luftprøver taget indendørs på hospitaler og andre lukkede rum, når viruskoncentrationen var tilstrækkelig høj22,23,2 4. Udendørs undersøgelser har generelt ikke fundet tegn på SARS-CoV-2, undtagen i overfyldte udendørs rum 21,25,26,27,28,29. Fra nu af er luftbåren transmission af SARS-CoV-2 blevet anerkendt som en transmissionsform30,31. En nylig gennemgangsundersøgelse viser forskellene mellem udendørs, hvor risikoen for luftbåren transmission er minimal uden for overfyldte områder, og indendørs, hvor større risici kan være til stede i dårligt ventilerede miljøer, hvor stærke kilder (dvs. antal inficerede mennesker) kan være til stede. En nylig omfattende undersøgelse har fremhævet de betydelige forskelle mellem risikoen for luftbåren transmission i udendørs versus indendørs miljøer, især i overfyldte områder med dårlig ventilation. Undersøgelsen indikerer, at risikoen for luftbåren transmission er minimal i udendørs miljøer, hvor der er en større mængde luft til rådighed til fortynding og spredning af viruspartikler32. Disse resultater har vigtige konsekvenser for folkesundhedspolitikker og retningslinjer relateret til COVID-19. Ved at anerkende de betydelige forskelle i transmissionsrisici mellem indendørs og udendørs miljøer kan politikere udvikle mere effektive strategier til at afbøde spredningen af virussen og beskytte folkesundheden.

Der er en række forskellige metoder og protokoller til påvisning, kvantificering og sekventering af SARS-CoV-2 fra forskellige miljøprøver. Denne metodeartikel har til formål at præsentere en kombination af veletablerede protokoller, der gør det muligt for laboratorier med forskellige kapacitetsniveauer at udføre miljødetektion, kvantificering og sekventering af vira fra spildevands- og luftprøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er publiceret andetsteds og indeholder små modifikationer fra de oprindelige metoder.

1. Opsamling og prøvebehandling af spildevand

BEMÆRK: På grund af de lave koncentrationer af SARS-CoV-2 RNA i miljøprøver er implementeringen af et koncentrationstrin afgørende for en vellykket detektion33,34,35. Her beskrives den første rapporterede metode til påvisning af SARS-CoV-2 i spildevand36.

  1. Opsamling og koncentration af spildevandsprøve(r)
    1. Der indsamles 1 liter 24 timers sammensat spildevandsprøve. Prøven opbevares ved 4 °C, og protokollen følges op inden for 24 timer.
    2. Homogeniser prøven ved forsigtigt at ryste flasken. 70 ml samles i et 100 ml centrifugalrør eller opdeles i to centrifugalglas på 50 ml.
    3. Spike 20 μL mengovirus (3,2 x 103 kopier/μL) til 70 ml af hver prøve som intern kontrol af koncentrationsprocessen. Alternativt spikes 10 μL mengovirus (3,2 x 103 kopier/μL) i hvert 50 ml centrifugeglas.
    4. Homogeniser prøven og centrifuger ved 700 x g i 10 minutter for at fjerne store partikler og organismer (pellet).
    5. Den resulterende supernatant anvendes til koncentrering med centrifugale ultrafiltreringsanordninger med en afskæring på 10 KDa ved centrifugering ved 4 000 x g i 40 minutter ved 4 °C. Eluer koncentratet ved centrifugering ved 700 x g i 40 minutter og invertering af ultrafiltreringsanordningens position.
    6. Mål volumenet af det resulterende koncentrat. Volumenet ændres afhængigt af mængden af faste stoffer i prøven, der tilstopper centrifugalfiltrene. I denne undersøgelse var de opnåede koncentratvolumener mellem 200-1.200 μL.
    7. Brug det resulterende koncentrat til RNA-ekstraktion ved hjælp af et kommercielt kit eller en intern metode. Til de prøver, der anvendes i denne undersøgelse, anvendes et specifikt kommercielt kit til viral RNA-ekstraktion med et elueringsvolumen på 50 μL.
    8. Mål koncentrationen af det ekstraherede RNA med et fluorometrisk RNA-kvantificeringssæt. Det ekstraherede RNA opdeles i alikvoter og fryses ved -80 °C indtil yderligere analyse.
      BEMÆRK: For hvert RNA-isolationsproceduresæt skal der inkluderes en negativ isolationskontrol (NCI), der kun indeholder buffere til påvisning af mulig kontaminering under ekstraktionen.
  2. Indsamling af luftprøver ved hjælp af en Coriolis kompakt luftprøveudtager
    1. Vælg en prøveudtagningsstrategi i henhold til forskningsmålet ved at definere prøveudtagningshyppighed og prøveudtagningssteder.
    2. Indstil flowhastigheden på luftprøveudtageren (her 50 L/min i 30 min). Bemærk, at en strømningshastighed på mere end 200 l / min kan nedbryde viralt RNA, så det anbefales at bruge en strømningshastighed under 200 l / min.
    3. Anbring en steril kegle i luftprøveudtageren, inden opsamlingen påbegyndes ved at pulsere starten. Når prøveudtagningen er færdig, tilsættes 5-15 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) i keglen. Forsigtigt hvirvel eller ryst prøven i hånden i 15 s. Prøverne opbevares i op til 24 timer ved 4 °C eller ved -80 °C i kryotuber.
    4. Et valgfrit koncentrationstrin kan udføres. Rens og dekontaminer keglerne efter hvert forsøg ved hjælp af blegemiddel.
    5. Uddrag RNA ved hjælp af et kommercielt kit eller en intern metode. Til prøverne i denne undersøgelse anvendes et specifikt kommercielt kit til viral RNA-ekstraktion med et elueringsvolumen på 50 μL.
    6. Mål koncentrationen af det ekstraherede RNA med et fluorometrisk RNA-kvantificeringssæt. Det ekstraherede RNA opdeles i alikvoter og fryses ved -80 °C indtil yderligere analyse.
      BEMÆRK: For hvert RNA-isolationsproceduresæt skal der inkluderes en negativ isolationskontrol (NCI), der kun indeholder buffere til påvisning af mulig kontaminering under ekstraktionen.

2. Kvantificering af SARS-CoV-2 RNA ved kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR)

BEMÆRK: Nedenstående protokol er i henhold til CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR diagnostisk panel37. Opdel primer/sondeblandingen i flere delprøver for at undgå frysning og optøning.

  1. Forbered reaktionsmasterblandingen for hvert mål (mengovirus; SARS-CoV-2 [N1- og N2-gener]) som i tabel 1 i en ren hætte i reagensopsætningsrummet. Bland primere/sondeblandingen og enzymet ved invertering fem gange. Alternativt kan lyspulshvirvel primere/sondeblandingen og enzymet fem gange.
    BEMÆRK: Hold alle reagenser kolde under tilberedning og brug. For at minimere fryse-optøningscyklusser anbefales det stærkt at fryse i alikvoter.
  2. Drej rørene ned (1.000 x g i 15-30 s) for at samle indholdet i bunden og læg rørene i et koldt stativ eller på is.
  3. Mærk 1,5 ml mikrocentrifugeglas for hvert mål. Til hvert mikrocentrifugeglas tilsættes den nødvendige mængde af hvert reagens (volumen pr. reaktion gange antallet af reaktioner, inklusive de nødvendige kontroller). Bland ved pipettering op og ned og centrifuger i 5 s for at opsamle indholdet i bunden.
  4. Opbevar mikrocentrifugerørene i en kold rist og fordel 15 μL i bånd-PCR-rør eller en 96-brøndplade i et kølestativ. Dæk pladen til, og flyt den til nukleinsyrehåndteringsområdet (opbevar den i et kølestativ).
  5. Optø en alikvote af ekstraheret RNA og hvirvl forsigtigt i 5 s. Pipette 5 μL RNA (ud over 5 μL ikke-skabelonkontrol [NTC], negativ isolationskontrol [NCI] og positiv kontrol [PC]) til hvert reaktionshul eller rør indeholdende den tidligere fremstillede mastermix. Skift handsker ofte efter behov for at undgå krydskontaminering.
  6. Dæk hele reaktionspladen eller rørene og hvirvlen forsigtigt. Centrifuger (1.000 x g i 15-30 s) pladen eller PCR-rørene.
  7. Start 25 μL RT-qPCR med følgende cykelbetingelser: omvendt transkriptase ved 45 °C i 10 min; polymeraseaktivering ved 95 °C i 10 minutter 45 denatureringscyklusser ved 95 °C i 15 sek. og udglødning/forlængelse ved 60 °C i 45 sek.
  8. Beregn restitutionseffektiviteten af mengoviruskontroller som rapporteret af Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Sekventering af varianter i spildevand og dataanalyse

BEMÆRK: Den beskrevne protokol er en modificeret protokol oprettet af Quick et al.39,40. Det bruger to sæt primere til SARS-CoV-2 genomamplifikation ved PCR-flisemetode-ARTIC-primere og VarSkip-primere. En kombination af primere bruges til at garantere den bedste genomdækning og til at minimere muligheden for, at nye mutationer får primere af en type til at svigte. Generelt er protokollen opdelt i tre dele: omvendt transkription (RT) og amplicon generation, sekventering af biblioteksforberedelse og sekventering og dataanalyse.

  1. Omvendt transkription og amplicon generering
    1. Sørg for, at inputprøverne har en kendt qPCR-cykeltærskelværdi (Ct) for korrekt fortynding i vand af PCR-kvalitet. Ct-værdien opnås under kvantificeringen med qPCR. Fortyndingerne er som følger: hvis Ct-værdien er 12-15, fortyndes prøverne 1:100; hvis Ct-værdien er 15-18, fortyndes prøverne 1:10; hvis Ct-værdien er 18-35, må prøven ikke fortyndes. Prøver over en Ct-værdi på 35 har stor chance for ikke at fungere.
    2. I en PCR-plade pipetteres 16 μL af hver prøve til dens position på pladen. Der tilsættes 4 μL omvendt transkription (RT) mastermix (5x). Dæk pladen til, og start PCR-reaktionen med følgende betingelser: 25 °C i 2 min, 55 °C i 20 minutter og 95 °C i 1 min.
    3. Forbered 10 μM fortyndinger af hvert primersæt (ARTIC pool A og pool B og VarSkip pool A og pool B). Forbered mastermixet for hvert sæt primere (ARTIC-sæt A og B og VarSkip-sæt A og B) som i tabel 2. Fire mastermixes vil blive resultatet af dette.
    4. På en ny PCR-plade pipetteres 20 μL af masterblandingen til hvert tilsvarende hul. Der tilsættes 5 μL af RT-prøven til hver blanding.
      BEMÆRK: Hver prøve vil have fire reaktionsblandinger-ARTIC pool A og B og VarSkip pool A og B.
    5. Pladen dækkes, og PCR-reaktionen startes på følgende måde: polymeraseaktivering ved 98 °C i 30 s; 35 denatureringscyklusser ved 98 °C i 15 sek. og udglødning/forlængelse ved 65 °C i 4 min. Drej pladen ned (1.000 x g i 15-30 s). Kombiner ARTIC-reaktionspuljerne, og kombiner VarSkip-reaktionspuljerne separat. Hver prøve vil have to 50 μL amplicon reaktioner.
    6. Tilsæt 50 μL perlebaseret reagens til PCR-rensning til hvert hul og bland godt ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
      BEMÆRK: Før hver brug blandes PCR-rensningsreagenset kraftigt for at resuspendere perlerne.
    7. Placer pladen på et magnetisk separationsstativ, og vent på, at perlerne danner en pellet og væsken er klar (~ 5 min). Supernatanten pipetteres og kasseres. Opbevar PCR-pladen på magnetstativet.
    8. Ved at opretholde PCR-pladen på magnetstativet tilsættes 200 μL 80% ethanol til hver prøve uden at røre perlepellet. Fjern ethanolen.
    9. Gentag det forrige trin. Lad pladen stå på magnetstativet uden låg i 30 s for at lade ethanolen fordampe.
    10. Pladen fjernes fra magnetstativet, og der tilsættes 15 μL vand af PCR-kvalitet til hver prøve. Resuspender pellet ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min.
    11. Sæt pladen tilbage på magnetstativet, og lad perlerne pille (2 min). Der pipetteres forsigtigt 15 μL supernatant fra hver prøve til en ny PCR-plade.
    12. Mål koncentrationen af hver prøve med et fluorometrisk RNA-kvantificeringssæt . Der udtages ca. 50 ng af hver prøve i 12,5 μL til næste trin. Fortynd om nødvendigt prøven i vand af PCR-kvalitet.
  2. Forberedelse af biblioteket
    1. Tilsæt 1,75 μL reaktionsbuffer fra Illumina DNA-bibliotekets præparationssæt og 0,75 μL enzymblanding til hver prøve. Dæk pladen, hvirvlen kort og drej ned (1.000 x g i 15-30 s). Inkuber ved 21 °C i 5 minutter og ved 65 °C i 5 minutter.
    2. I en ny plade pipetteres 3 μL vand af PCR-kvalitet for hver prøve til en ny PCR-plade. Der tilsættes 0,75 μL af de forberedte prøver, 1,25 μL stregkoder til sekventering af biblioteksforberedelse og 5 μL T4 DNA-ligasemastermix. Bland godt ved pipettering, drej kortvarigt ned (1.000 x g i 15-30 s) i en centrifuge og inkuber ved 21 °C i 20 minutter og ved 65 °C i 10 minutter.
      BEMÆRK: Hvis du bruger mindre end 25 prøver, skal du fordoble alle diskenheder i dette trin.
    3. Alle prøverne samles ved at tilsætte 10 μL af hver prøve til det samme lavbindende glas. Tag 480 μL til næste trin.
    4. Tilsæt 192 μL perlebaseret reagens til PCR-rensning til poolen og bland godt ved pipettering. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    5. Røret anbringes på et magnetstativ, og der ventes på, at supernatanten rydder og danner en perlepille. Supernatanten fjernes. Fjern røret fra magnetstativet.
    6. Der tilsættes 700 μL kort fragmentbuffer (SFB) og blandes ved pipettering. Placer tilbage på magnetstativet, og vent på, at pelleten dannes og væsken ryddes (~ 5 min). Supernatanten pipetteres ud, og den kasseres.
    7. Gentag det forrige trin. Lad røret stå på magnetstativet. Tilsæt 100 μL 80% ethanol uden at røre perlen. Pipetter ethanolen ud og lad perlen tørre i 30 sekunder.
      BEMÆRK: Lad ikke perlen tørre for meget.
    8. Fjern røret fra magnetstativet, og tilsæt 35 μL vand af PCR-kvalitet. Bland ved pipettering og inkuber ved stuetemperatur i 2 min. Placer røret på magnetstativet, og lad perlen pellet og væsken rydde. Der pipetteres 35 μl supernatant til et nyt glas.
    9. Mål RNA-koncentrationen af det samlede bibliotek. Pipette det volumen, der er nødvendigt for at nå en mængde på 30-50 ng RNA, og fyld det med vand af PCR-kvalitet for at nå et endeligt volumen på 30 μL.
    10. Forbered adapterligeringsreaktionsblandingen: 30 μL af det poolede bibliotek, 5 μL adapterblanding II, 10 μL af ligationsreaktionsbufferen (5x) og 5 μL T4 DNA-ligase. Bland ved pipettering og spin-down (1.000 x g i 15-30 s). Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    11. Der tilsættes 20 μL af det perlebaserede reagens til PCR-rensning og blandes ved pipettering. Inkuber i 10 min ved stuetemperatur.
    12. Anbring røret på magnetstativet, og vent på, at perlepillen dannes, og supernatanten bliver farveløs. Supernatanten pipetteres forsigtigt ud, og supernatanten kasseres.
    13. Fjern fra magnetstativet, og tilsæt 125 μL SFB. Bland ved pipettering og læg tilbage på magnetstativet for at adskille perlerne. Når væsken er klar, pipetteres supernatanten og kasseres.
    14. Gentag det forrige trin. Lad røret stå åbent på magnetstativet i 30 sekunder, så noget af den resterende væske kan fordampe.
    15. Røret fjernes fra magnetstativet, og der tilsættes 15 μL elueringsbuffer. Bland godt ved pipettering og kort spin-down (1.000 x g i 15-30 s). Inkuber ved stuetemperatur i 5 min. Placer på magnetstativet i 2 min.
    16. 15 μL af supernatanten pipetteres i et nyt lavbindende glas. Dette er det endelige bibliotek. Mål koncentrationen med et fluorometrisk DNA-kvantificeringssæt.
      BEMÆRK: I næste trin er der brug for 12 μL. Hvis koncentrationen er meget høj, og der er behov for mindre end 12 μL af biblioteket, fyldes op til 12 μL med elueringsbufferreagenset.
  3. Indlæsning og sekvensering af flowceller
    1. Indsæt flowcellen (R9.4.1) i DNA- og RNA-sekventeringsenheden i realtid.
    2. Primingblandingen fremstilles ved at tilsætte 30 μL skyllereagens (FLT) til et rør skyllebufferreagens (FB). Vortex til at blande og spinde ned (1.000 x g i 15-30 s).
    3. Åbn dækslet til primingporten. Brug en 1.000 μL pipette til at indstille til 200 μL og sæt spidsen i primingporten. Drej lydstyrkeindstillingshjulet, og øg lydstyrken, indtil væsken i spidsen ses. Kassér spidsen.
      BEMÆRK: Drej kun hjulet, indtil der ses et par μL væske i spidsen. Træk større mængder kan beskadige flowcellen.
    4. Tilsæt langsomt 800 μL af primingblandingen til primingporten, og pas på ikke at indføre bobler. Vent i 5 min.
    5. I mellemtiden skal du forberede bibliotekerne til indlæsning. Bland 37,5 μL af sekventeringsbufferen, 25,5 μL af indlæsningsbufferen og 12 μL af biblioteket.
      BEMÆRK: Bland påfyldningsbufferen inden pipettering. Perlerne i dette reagens sætter sig meget hurtigt.
    6. Åbn portdækslet. Der pipetteres 200 μL af grundingsblandingen i primingporten.
      BEMÆRK: Mens pipettering i primingporten med dækslet åbent, vil man bemærke små dråber, der kommer fra prøveporten. Pipetten er langsom nok til, at prøveporten kan trække dråberne ind uden at vælte.
    7. Før du lægger det forberedte bibliotek, blandes godt ved pipettering. Brug en 100 μL pipette indstillet til 75 μL, og tag biblioteket og pipetten dråbe for dråbe ind i prøveporten. Rør ikke ved porten, og vent på, at hver dråbe absorberes i porten, før du lægger den næste dråbe for at undgå overløb af væsken.
    8. Luk dækslet og primingporten. Åbn softwaren, og start sekventeringseksperimentet. Vælg basecalling Til. For et bibliotek med 96 multipleksede prøver er 10-12 timers sekventering normalt nok til at generere tilstrækkelige data.
      BEMÆRK: Ved hjælp af softwaren kan man indsætte prøvearket i .csv format. Eksempelarket kræver følgende data: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code og kit. Flowcelle-id'et er nødvendigt (angivet på siden af flowcellen) sammen med det anvendte sæt. For den foreslåede protokol skal LSK109-sættet vælges.
  4. Analyse af sekventeringsdata
    1. Indsæt de komprimerede fastq-læsninger i wf-artic-arbejdsgangen41. Kør arbejdsprocessen separat med to forskellige grundskemaer (ARTIC/V4.1 og NEB-VarSkip/v1a). To ". primertrimmed.rg.sorted.bam" filer oprettes for hver prøve.
    2. Flet BAM-filerne til en enkelt fil med kommandoen "samtools merge"42. Indsæt den flettede BAM-fil i Freyja-værktøjet, og efterlad standardindstillingerne, for at gendanne relative afstamningsmængder43.
    3. For at oprette en FASTA-fil skal du indsætte den flettede BAM-fil i værktøjerne "samtools mpileup" og "ivar" med standardindstillingerne44,45. For mutationsopkald skal du indlæse FASTA-filen i Nextclade-værktøjet46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultaterne opsummeret i tabel 3 viser eksempler på påvisning og kvantificering af SARS-CoV-2 RNA i spildevands- og luftprøver ved hjælp af metoden beskrevet i denne artikel. Spildevandsprøver blev indsamlet fra spildevandsrensningsanlæg i Spanien og Slovenien og blev betragtet som positive, hvis Ct var mindre end 40 i mindst to af de tre replikater, med kvantificering anset for gyldig, hvis Ct havde en variation på mindre end 5%. I Spanien og Portugal blev der indsamlet indendørs og udendørs luftprøver, og de samme regler blev anvendt. Duplikater blev brugt til luftprøverne, ikke tredobbelte som for spildevandsprøverne, da formålet med undersøgelsen var at detektere SARS-CoV-2 RNA og ikke at kvantificere det. Desuden blev en RT-qPCR-kørsel kun anset for gyldig, hvis alle anvendte kontroller (som beskrevet i denne protokol) opførte sig som forventet, og hvis der ikke blev observeret signifikante afvigelser i mengovirus-RNA-kontrollen. For disse prøver varierede mengovirusgendannelseseffektiviteten mellem 13,7% og 19,7%. Hæmningen blev vurderet ved at fortynde ti gange og 100 gange ekstraheret RNA og ved at sammenligne de resulterende RT-qPCR-resultater samt ved at anvende et kommercielt kit. Instruktionerne for hvert hæmningskontrolsæt skal følges som beskrevet af producenterne.

Spildevandsprøver havde en standardafvigelse fra 1,91% til 13,98% blandt de tredobbelte og varierede fra 3,05 x 10 3 til 2,83 x 108 genkopier/L. Luftprøver varierede fra 6,17 x 103 til 5,48 x 109 med en standardafvigelse mellem duplikaterne mellem 0,54% og 10,95%. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 6,48,49,50.

Som beskrevet i denne protokol blev prøverne sekventeret, og et eksempel på tre sekventerede prøveresultater er opsummeret i tabel 4 og figur 1. I alle tre prøver blev afstamningen BA.5.x tildelt som den mest udbredte af Freyja-værktøjet (95,3%, 95,4% og 99,8%).

Figure 1
Figur 1: SARS-CoV-2-afstamningsprævalens i udvalgte spildevandsprøver. Afstamninger blev tildelt ved hjælp af Freyja-værktøjet. Sammenfatningen af prævalenstallene når ikke nødvendigvis op på 100 %, da nogle af dataene ikke er af tilstrækkelig kvalitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Reagenser og volumener, der skal tilføjes af hver for at forberede mastermixet til SARS-CoV2-kvantificering ved RT-qPCR. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Reagenser og volumener, der skal tilføjes af hver for at forberede mastermixet til at forstærke de komplette SARS-CoV-2-genomer i prøverne. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Oversigt over RT-qPCR-kvantificeringsresultater af SARS-CoV-2 RNA fra spildevands- og luftprøver. N1-genet blev brugt til kvantificering, og N2 blev brugt til bekræftelse (positiv eller negativ). Resultaterne udtrykkes som kopier/L. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Påviste mutationer og afstamningsprævalens. Afstamninger blev tildelt ved hjælp af Freyja-værktøjet og i henhold til mutationerne af interesse fundet ved hjælp af Nextclade. Genomdækning for hver prøve vises. Sammenfatningen af prævalenstallene når ikke nødvendigvis op på 100 %, da nogle af dataene ikke er af tilstrækkelig kvalitet. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrobiel og viral detektion og kvantificering ved hjælp af (RT-) qPCR-metoder har opnået udbredt accept på grund af deres bemærkelsesværdige følsomhed. Disse teknikker står imidlertid over for adskillige udfordringer, når de analyserer miljøprøver. Spildevandsprøver indeholder en overflod af hæmmende stoffer, der kan skævvride målingerne og generere vildledende resultater. For at tackle disse begrænsninger og øge præcisionen blev en kompleks protokol udtænkt, designet og implementeret. Denne protokol blev skræddersyet ved at kombinere protokoller fra den videnskabelige litteratur og specifikt adressere de begrænsninger, der er forbundet med qPCR-metoder, ved at inkorporere en række strenge kontroller på hvert trin i processen. Ved at integrere disse strenge kvalitetskontrolforanstaltninger tilbyder denne protokol en robust løsning på de udfordringer, som qPCR-baserede detektions- og kvantificeringsmetoder i komplekse miljøprøver står over for51,52. Den negative kontrol af isolation (NCI) og ikke-skabelonkontrol (NTC) er vigtige værktøjer til at vurdere sandsynligheden for kontaminering under RNA-ekstraktion og RT-qPCR-reaktion. Desuden giver integrationen af mengoviruskontrol-RNA et afgørende middel til at evaluere variabilitet mellem prøver såvel som effektiviteten af koncentrationstrinnet og de hæmmende virkninger af midler, der er til stede i komplekse miljøprøver. I hver RT-qPCR-reaktion skal positive kontroller inkluderes for at bekræfte effektiviteten af amplifikationsprocessen. Det er vigtigt nøje at overvåge hvert trin i protokollen, herunder opbevaring og behandlingstid for prøverne. Nedbrydningen af prøverne kan påvirkes af temperaturen og spildevandets komplekse sammensætning, hvilket gør det absolut nødvendigt at opbevare prøverne ved en temperatur på 4 °C og behandle dem inden for 24 timer. Ved at overholde disse strenge kvalitetskontrolforanstaltninger kan forskere og folkesundhedsarbejdere trygt og præcist analysere miljøprøver for at afdække vital indsigt i mikrobielle og virale populationer og bedre forstå miljøfaktorernes indvirkning på menneskers sundhed48.

Udvælgelsen af RNA-mål til SARS-CoV-2-detektion er en kritisk faktor, der kan påvirke følsomheden af RT-qPCR-assays. I denne undersøgelse evaluerede forfatterne RdRp-, E-, N1- og N2-målene og fandt ud af, at RdRp- og E-assays havde lavere følsomhed end N1- og N2-assays, i overensstemmelse med tidligere forskning53. N1- og N2-assays bruger dobbelte quencherprober, som har vist sig at øge deres følsomhed i (RT-) qPCR-assays54. Disse grunde fører til beslutningen om at anvende N1 til kvantificering og N2 som bekræftelse af RNA-tilstedeværelsen for at fjerne tvivl, når der konstateres meget lave koncentrationer. De observerede uoverensstemmelser mellem RT-qPCR-mål blev tidligere rapporteret36.

Flere undersøgelser har anvendt lignende protokoller og har rapporteret om vellykket påvisning og kvantificering af SARS-CoV-2 RNA i spildevand under den igangværende COVID-19-pandemi 6,48,49,55,56. De rapporterede SARS-CoV-2 RNA-koncentrationer er i overensstemmelse med dem, der er rapporteret i denne undersøgelse og protokol 48,50,55. Nogle af disse undersøgelser har undersøgt forholdet mellem aktive tilfælde og koncentrationer af RT-qPCR-målgener, især N1 og N2 6,36,49,50,55,57,58,59. For at reducere variabiliteten i de opnåede genkoncentrationer er det blevet foreslået at multiplicere de eksperimentelle koncentrationer med strømningshastigheden på prøveudtagningstidspunktet for at opnå den oprindelige virale belastning36. Denne tilgang er blevet indarbejdet i VATar COVID-19-projektet i Spanien, et nationalt overvågningssystem for COVID-19 i spildevand60.

Som den næste fase af COVID-19 spildevandsbaseret epidemiologi (WBE) undersøgelser har forskere forsøgt at opdage SARS-CoV-2-mutationer i spildevand for at estimere cirkulationen af varianter af bekymring i samfund. Tidligere undersøgelser har vist en stærk sammenhæng mellem de varianter, der er identificeret i spildevand, og dem, der er til stede i befolkningen på samme tid. Disse resultater tyder på, at spildevandsbaseret overvågning kan tjene som et værdifuldt værktøj til at spore spredningen af SARS-CoV-2-varianter61,62. WBE har vist stort løfte om overvågning af SARS-CoV-2 og kan bruges til udvikling af fremtidige overvågningsstrategier for pandemier. Denne tilgang er særlig nyttig i de tidlige stadier af en pandemi, hvor der er begrænsede individuelle test, og mange tilfælde kan være asymptomatiske, og har en komplementær strategi til klinisk overvågning. Derfor kan WBE være særlig nyttig på steder med lav økonomisk kapacitet, der ikke har råd til andre dyrere overvågningsstrategier. Den beskrevne metode kan nemt tilpasses andre vira, der kan være relevante at overvåge i fremtiden.

Resultaterne af luftprøveudtagning i indendørs og udendørs miljøer afslørede, at SARS-CoV-2 RNA er til stede i begge miljøer, skønt i lavere koncentrationer i udendørs miljøer 38,63,64. Disse resultater tyder på, at aktiviteter og eksponeringer, hvor maskebrug og social afstand er vanskelige at opretholde, såsom at spise, drikke eller deltage i musikfestivaler, kan udgøre en højere risiko for COVID-19-transmission. For at afbøde sådanne risici er det afgørende at overveje passende ventilationsforanstaltninger og brug af masker, især med fremkomsten af nye varianter, der giver anledning til bekymring, og som er mere overførbare, såsom varianterne Delta (B.1.617.2) og Omicron (B.1.1.529). I lyset af ophævelsen af COVID-19-restriktioner i mange områder anbefales det at opretholde brugen af masker for at holde samfundsoverførsel af SARS-CoV-2 på et minimum og forhindre fremtidige udbrud af sygdommen 5,21,26,65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev udført med økonomisk støtte fra regionalregeringen i Castilla y León og FEDER-programmet (projekt CLU 2017-09, UIC315 og VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

Miljøvidenskab udgave 196 SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR sekventering varianter af bekymring
Kvantificering og helgenomkarakterisering af SARS-CoV-2 RNA i spildevands- og luftprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter