Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

القياس الكمي وتوصيف الجينوم الكامل للحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تحديد كمية الحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء لاستخدامها في دراسات علم الأوبئة القائمة على مياه الصرف الصحي وتقييم مخاطر التعرض ل SARS-CoV-2 في الهباء الجوي الداخلي والخارجي. يصف هذا البروتوكول أيضا نهج تسلسل القالب الطويل المبلط لتوصيف الجينوم الكامل ل SARS-CoV-2.

Abstract

برز علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي كنظام مراقبة واعد وفعال ل SARS-CoV-2 والأمراض المعدية الأخرى في العديد من الدول. تتضمن العملية عادة تركيز مياه الصرف الصحي ، واستخراج الحمض النووي ، وتضخيم الأجزاء الجينومية المختارة ، والكشف عن الجزء الجينومي المضخم وتحديده كميا. وبالمثل ، يمكن الاستفادة من هذه المنهجية للكشف عن العوامل المعدية وتحديدها كميا ، مثل SARS-CoV-2 ، في عينات الهواء. في البداية ، كان من المفترض أن ينتشر SARS-CoV-2 بشكل أساسي من خلال الاتصال الشخصي الوثيق مع القطرات الناتجة عن شخص مصاب أثناء التحدث أو العطس أو السعال أو الغناء أو التنفس. ومع ذلك ، فقد أبلغ عدد متزايد من الدراسات عن وجود الحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 في هواء مرافق الرعاية الصحية ، مما يجعل الانتقال المحمول جوا طريقا قابلا للتطبيق للفيروس. تقدم هذه الدراسة مجموعة من البروتوكولات المعمول بها لتسهيل الكشف البيئي والقياس الكمي وتسلسل الفيروسات من كل من عينات مياه الصرف الصحي والهواء.

Introduction

في ديسمبر 2019 ، ظهر مرض جديد يسمى COVID-19 ، ناجم عن فيروس تاجي غير معروف سابقا ، SARS-CoV-21. وقد شكلت الجائحة العالمية الناتجة عن ذلك تحديا كبيرا للمختبرات السريرية ومختبرات الصحة العامة في جميع أنحاء العالم، حيث يحتاج عدد كبير من الأفراد إلى إجراء اختبارات لتقييم انتقال الفيروس وانتشاره في المجتمع بدقة. ومع ذلك ، في العديد من المناطق ، فإن تحقيق المستوى اللازم من الاختبار في الوقت المناسب وبطريقة شاملة مكانيا غير ممكن اقتصاديا 2,3. تعتمد أنظمة الترصد الحالية القائمة على التشخيص السريري الفردي اعتمادا كبيرا على شدة الأعراض والإبلاغ الفردي ، فضلا عن مدى تداخل هذه الأعراض مع الأمراض الحالية المنتشرة في السكان4،5،6،7،8،9،10. وبالتالي ، فإن عددا كبيرا من الحالات التي لا تظهر عليها أعراض يساهم في التقليل بشكل كبير من عبء المرض 7,11.

وبسبب هذه التحديات، تم اقتراح علم الأوبئة القائم على مياه الصرف الصحي (WBE) لترصد كوفيد-19 كاستراتيجية ترصد تكميلية. تم وصف WBE لأول مرة في عام 200112 ، وكان يستخدم في البداية لتتبع الكوكايين والمخدرات غير المشروعةالأخرى 13. يعتمد هذا النهج على افتراض أنه من الممكن حساب التركيز الأولي لأي مادة مستقرة في مياه الصرف الصحي ويفرزها البشر 8,12. تم تنفيذ WBE بنجاح في العديد من البلدان كنظام ترصد تكميلي وفعال ل SARS-CoV-23،8،14،15،16. تتبع غالبية طرق الكشف عن الفيروسات البشرية في البيئات المائية الخطوات التالية: التركيز ، واستخراج الحمض النووي ، وتضخيم الجزء الجينومي (أو الأجزاء) المختارة ، والكشف / القياس الكمي للجزء الجينوميالمضخم 3.

بيئة مهمة أخرى للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه كميا هي في عينات الهواء. في البداية ، كان يعتقد أن SARS-CoV-2 ينتقل بشكل أساسي من خلال الاتصال الشخصي الوثيق مع قطرات الجهاز التنفسي من الهباء الجوي الناتج عن شخص مصاب أثناء التحدث أو العطس أو السعال أو الغناء أو التنفس17. ومع ذلك ، بدأت العديد من الدراسات في الإبلاغ عن وجود SARS-CoV-2 RNA في الهواء ، خاصة في مرافق الرعاية الصحية والأماكن المغلقة الأخرى18،19،20،21. تم العثور على أدلة على صلاحية SARS-CoV-2 في عينات الهواء المأخوذة في الداخل في المستشفيات والأماكن المغلقة الأخرى عندما كان تركيز الفيروس مرتفعا بما فيه الكفاية22،23،24. لم تجد الدراسات الخارجية عموما أي دليل على وجود SARS-CoV-2 ، باستثناء الأماكن الخارجية المزدحمة21،25،26،27،28،29. اعتبارا من الآن ، تم التعرف على انتقال SARS-CoV-2 المحمول جوا كوسيلة انتقال30,31. تظهر دراسة مراجعة حديثة الاختلافات بين الهواء الطلق ، حيث تكون مخاطر انتقال العدوى المحمولة جوا ضئيلة خارج المناطق المزدحمة ، وفي الداخل ، حيث يمكن أن توجد مخاطر أكبر في بيئات سيئة التهوية يمكن أن توجد فيها مصادر قوية (أي عدد المصابين). وقد أبرزت دراسة مراجعة شاملة حديثة الاختلافات الجوهرية بين مخاطر انتقال العدوى المحمولة جوا في البيئات الخارجية مقابل البيئات الداخلية، لا سيما في المناطق المزدحمة ذات التهوية السيئة. تشير الدراسة إلى أن خطر انتقال العدوى المحمولة جوا ضئيل في البيئات الخارجية ، حيث يوجد حجم أكبر من الهواء المتاح لتخفيف وتشتت جزيئات الفيروس32. هذه النتائج لها آثار مهمة على سياسات الصحة العامة والمبادئ التوجيهية المتعلقة ب COVID-19. من خلال الاعتراف بالاختلافات الكبيرة في مخاطر انتقال العدوى بين البيئات الداخلية والخارجية ، يمكن لواضعي السياسات تطوير استراتيجيات أكثر فعالية للتخفيف من انتشار الفيروس وحماية الصحة العامة.

هناك مجموعة متنوعة من الطرق والبروتوكولات للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه وتسلسله من عينات بيئية مختلفة. تهدف مقالة الطريقة هذه إلى تقديم مجموعة من البروتوكولات الراسخة التي تسمح للمختبرات ذات مستويات السعة المختلفة بإجراء الكشف البيئي والقياس الكمي وتسلسل الفيروسات من عينات مياه الصرف الصحي والهواء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم نشر جميع الطرق الموضحة هنا في مكان آخر وتحتوي على تعديلات صغيرة من الطرق الأصلية.

1. جمع مياه الصرف الصحي والمعالجة المسبقة للعينات

ملاحظة: نظرا للتركيزات المنخفضة للحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في العينات البيئية ، فإن تنفيذ خطوة التركيز أمر بالغ الأهمية للكشف الناجحعن 33،34،35. الموصوفة هنا هي أول طريقة تم الإبلاغ عنها للكشف عن SARS-CoV-2 في مياه الصرف الصحي36.

  1. جمع وتركيز عينة (عينات) مياه الصرف الصحي
    1. اجمع 1 لتر من عينة مياه الصرف الصحي المركبة لمدة 24 ساعة. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية وتابع البروتوكول في غضون 24 ساعة.
    2. تجانس العينة عن طريق هز الزجاجة برفق. اجمع 70 mL في أنبوب طرد مركزي سعة 100 mL أو قسم العينة إلى أنبوبي طرد مركزي سعة كل منهما 50 mL.
    3. ارتفاع 20 ميكرولتر من فيروس mengovirus (3.2 × 103 نسخ / ميكرولتر) إلى 70 مل من كل عينة كتحكم داخلي في عملية التركيز. بدلا من ذلك ، قم برفع 10 ميكرولتر من فيروس mengovirus (3.2 × 103 نسخ / ميكرولتر) في كل أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    4. تجانس العينة وأجهزة الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الجسيمات والكائنات الحية الكبيرة (الحبيبات).
    5. استخدم المادة الطافية الناتجة للتركيز مع أجهزة الترشيح الفائق بالطرد المركزي مع قطع 10 كيلو دالون أمبير عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بسحب التركيز عن طريق الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 40 دقيقة وعكس موضع جهاز الترشيح الفائق.
    6. قياس حجم التركيز الناتج. سيتغير الحجم اعتمادا على كمية المواد الصلبة في العينة التي تسد مرشحات الطرد المركزي. في هذه الدراسة ، كانت أحجام التركيز التي تم الحصول عليها بين 200-1200 ميكرولتر.
    7. استخدم المركز الناتج لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تجارية أو طريقة داخلية. بالنسبة للعينات المستخدمة في هذه الدراسة ، يتم استخدام مجموعة تجارية محددة لاستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي بحجم شطف يبلغ 50 ميكرولتر.
    8. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي الريبي الفلوري. قسم الحمض النووي الريبي المستخرج إلى قسوم وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
      ملاحظة: لكل مجموعة إجراءات عزل الحمض النووي الريبي ، يجب تضمين عنصر تحكم سلبي في العزل (NCI) ، يحتوي فقط على مخازن مؤقتة للكشف عن التلوث المحتمل أثناء الاستخراج.
  2. جمع عينات الهواء باستخدام جهاز أخذ عينات الهواء المضغوط Coriolis
    1. اختر استراتيجية أخذ العينات وفقا لهدف البحث من خلال تحديد تكرار أخذ العينات ومواقع أخذ العينات.
    2. اضبط معدل التدفق على جهاز أخذ عينات الهواء (هنا ، 50 لترا / دقيقة لمدة 30 دقيقة). يرجى ملاحظة أن معدل التدفق الذي يزيد عن 200 لتر / دقيقة يمكن أن يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي الفيروسي ، لذلك يوصى باستخدام معدل تدفق أقل من 200 لتر / دقيقة.
    3. ضع مخروطا معقما في جهاز أخذ عينات الهواء قبل بدء المجموعة عن طريق نبض البداية. بمجرد الانتهاء من أخذ العينات ، أضف 5-15 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS) في المخروط. دوامة بلطف أو هز العينة باليد لمدة 15 ثانية. قم بتخزين العينات لمدة تصل إلى 24 ساعة عند 4 درجات مئوية أو عند -80 درجة مئوية في أنابيب التبريد.
    4. يمكن إجراء خطوة تركيز اختيارية. نظف المخاريط وقم بتطهيرها بعد كل تجربة باستخدام المبيض.
    5. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تجارية أو طريقة داخلية. بالنسبة للعينات في هذه الدراسة ، يتم استخدام مجموعة تجارية محددة لاستخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي بحجم شطف 50 ميكرولتر.
    6. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي الريبي الفلوري. قسم الحمض النووي الريبي المستخرج إلى قسوم وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
      ملاحظة: لكل مجموعة إجراءات عزل الحمض النووي الريبي ، يجب تضمين عنصر تحكم سلبي في العزل (NCI) ، يحتوي فقط على مخازن مؤقتة للكشف عن التلوث المحتمل أثناء الاستخراج.

2. القياس الكمي للحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (RT-qPCR)

ملاحظة: البروتوكول أدناه يتوافق مع لوحة تشخيص CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR37. قسم مزيج البرايمر / المسبار إلى عدة حصص لتجنب دورات التجميد والذوبان.

  1. تحضير مزيج التفاعل الرئيسي لكل هدف (mengovirus; SARS-CoV-2 [جينات N1 و N2]) كما في الجدول 1 ، في غطاء نظيف في غرفة إعداد الكاشف. امزج مزيج البادئات / المسبار والإنزيم عن طريق الانقلاب خمس مرات. بدلا من ذلك ، دوامة النبض الخفيفة مزيج الاشعال / المسبار والإنزيمخمس مرات.
    ملاحظة: حافظ على برودة جميع الكواشف أثناء التحضير والاستخدام. من أجل تقليل دورات التجميد والذوبان ، يوصى بشدة بالتجميد في القسامة.
  2. قم بتدوير الأنابيب لأسفل (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية) لجمع المحتويات في الأسفل ووضع الأنابيب في رف بارد أو على الجليد.
  3. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لكل هدف. أضف إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق كمية كل كاشف مطلوب (الحجم لكل تفاعل مضروبا في عدد التفاعلات بما في ذلك عناصر التحكم المطلوبة). امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثوان لجمع المحتويات في الأسفل.
  4. احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيقة في رف بارد وقم بتوزيع 15 ميكرولتر في أنابيب PCR الشريطية أو لوحة 96 بئرا في رف التبريد. قم بتغطية اللوحة وانقلها إلى منطقة معالجة الحمض النووي (احتفظ بها في رف التبريد).
  5. قم بإذابة حصة من الحمض النووي الريبي المستخرج ودوامة بلطف لمدة 5 ثوان. ماصة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (بالإضافة إلى 5 ميكرولتر من التحكم غير القالب [NTC] ، والتحكم السلبي في العزل [NCI] ، والتحكم الإيجابي [PC]) لكل بئر تفاعل أو أنبوب يحتوي على المزيج الرئيسي المعد مسبقا. قم بتغيير القفازات كثيرا حسب الحاجة لتجنب التلوث المتبادل.
  6. قم بتغطية لوحة أو أنابيب التفاعل بالكامل ودوامة برفق. أجهزة الطرد المركزي (1000 × ز لمدة 15-30 ثانية) اللوحة أو أنابيب PCR.
  7. ابدأ 25 ميكرولتر RT-qPCR بظروف الدورة التالية: النسخ العكسي عند 45 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ تنشيط البلمرة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ 45 دورة من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ؛ والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
  8. احسب كفاءة استرداد ضوابط فيروس mengovirus كما أبلغ عنها Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. تسلسل المتغيرات في مياه الصرف الصحي وتحليل البيانات

ملاحظة: البروتوكول الموصوف هو بروتوكول معدل تم إنشاؤه بواسطة Quick et al.39,40. يستخدم مجموعتين من البادئات لتضخيم جينوم SARS-CoV-2 بواسطة منهجية تبليط PCR - بادئات ARTIC وبادئات VarSkip. يتم استخدام مزيج من البادئات لضمان أفضل تغطية للجينوم وتقليل احتمالية حدوث طفرات جديدة تتسبب في فشل الاشعال من نوع واحد. بشكل عام ، ينقسم البروتوكول إلى ثلاثة أجزاء: النسخ العكسي (RT) وتوليد amplicon ، وإعداد مكتبة التسلسل ، والتسلسل وتحليل البيانات.

  1. النسخ العكسي وتوليد amplicon
    1. تأكد من أن عينات الإدخال لها قيمة معروفة لعتبة دورة qPCR (Ct) لتخفيفها بشكل صحيح في ماء درجة PCR. يتم الحصول على قيمة Ct أثناء القياس الكمي باستخدام qPCR. التخفيفات هي كما يلي: إذا كانت قيمة Ct هي 12-15 ، قم بتخفيف العينات 1: 100 ؛ إذا كانت قيمة Ct هي 15-18 ، فقم بتخفيف العينات 1:10 ؛ إذا كانت قيمة Ct هي 18-35 ، فلا تخفف العينة. العينات التي تزيد عن قيمة Ct البالغة 35 لديها فرصة كبيرة لعدم العمل.
    2. في لوحة PCR ، ماصة 16 ميكرولتر من كل عينة إلى موضعها على اللوحة. أضف 4 ميكرولتر من النسخ العكسي (RT) mastermix (5x). قم بتغطية اللوحة وابدأ تفاعل تفاعل PCR بالشروط التالية: 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 55 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    3. تحضير 10 ميكرومتر تخفيفات لكل مجموعة أولية (تجمع ARTIC A والمسبح B ، وتجمع VarSkip A والمسبح B). قم بإعداد المزيج الرئيسي لكل مجموعة من البادئات (مجموعة ARTIC A و B ، ومجموعة VarSkip A و B) كما في الجدول 2. سينتج عن هذا أربعة ماسترمكس.
    4. على لوحة PCR جديدة ، ماصة 20 ميكرولتر من mastermix لكل بئر المقابلة. أضف 5 ميكرولتر من عينة RT إلى كل مزيج.
      ملاحظة: ستحتوي كل عينة على أربعة مخاليط تفاعل - تجمع ARTIC A و B ، وتجمع VarSkip A و B.
    5. قم بتغطية اللوحة وابدأ تفاعل تفاعل PCR على النحو التالي: تنشيط البلمرة عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 35 دورة من التمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ؛ والتلدين / التمديد عند 65 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. تدور لأسفل (1000 × غرام لمدة 15-30 ثانية) اللوحة. اجمع بين تجمعات تفاعل ARTIC وادمج بشكل منفصل تجمعات تفاعل VarSkip. سيكون لكل عينة تفاعلان أمبليكون 50 ميكرولتر.
    6. أضف 50 ميكرولتر من الكاشف القائم على الخرز لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى كل بئر واخلطه جيدا عن طريق الماصة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: قبل كل استخدام ، امزج كاشف تنقية PCR بقوة لإعادة تعليق الخرزات.
    7. ضع اللوحة على حامل فصل مغناطيسي وانتظر حتى تشكل الخرزات حبيبات والسائل لمسح (~ 5 دقائق). ماصة وتجاهل طاف. احتفظ بلوحة PCR على الحامل المغناطيسي.
    8. الحفاظ على لوحة PCR على الحامل المغناطيسي ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ إلى كل عينة دون لمس حبيبات الخرزة. إزالة الإيثانول.
    9. كرر الخطوة السابقة. اترك اللوحة على الحامل المغناطيسي مكشوفة لمدة 30 ثانية للسماح للإيثانول بالتبخر.
    10. قم بإزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي وأضف 15 ميكرولتر من الماء بدرجة PCR إلى كل عينة. أعد تعليق الحبيبات عن طريق الماصة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    11. ضع اللوحة مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واترك الخرزات تلتيت (2 دقيقة). ماصة بعناية 15 ميكرولتر من المادة الطافية من كل عينة إلى لوحة PCR جديدة.
    12. قم بقياس تركيز كل عينة باستخدام مجموعة قياس كمية الحمض النووي الريبي الفلوري . خذ ما يقرب من 50 نانوغرام من كل عينة في 12.5 ميكرولتر إلى الخطوة التالية. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف العينة في ماء درجة PCR.
  2. إعداد المكتبة
    1. أضف 1.75 ميكرولتر من مخزن التفاعل من مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي Illumina و 0.75 ميكرولتر من مزيج الإنزيم لكل عينة. قم بتغطية اللوحة ، الدوامة لفترة وجيزة ، وقم بتدويرها لأسفل (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية). احتضان في 21 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. في لوحة جديدة ، ماصة 3 ميكرولتر من الماء من درجة PCR لكل عينة إلى لوحة PCR جديدة. أضف 0.75 ميكرولتر من العينات المحضرة ، و 1.25 ميكرولتر من الرموز الشريطية لإعداد مكتبة التسلسل ، و 5 ميكرولتر من مزيج T4 DNA ligase mastermix. تخلط جيدا عن طريق السحب ، ثم تدور لفترة وجيزة (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية) في جهاز طرد مركزي وتحتضن عند 21 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وعند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: في حالة استخدام أقل من 25 عينة، قم بمضاعفة جميع وحدات التخزين في هذه الخطوة.
    3. قم بتجميع جميع العينات معا عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من كل عينة إلى نفس الأنبوب منخفض الربط. خذ 480 ميكرولتر إلى الخطوة التالية.
    4. أضف 192 ميكرولتر من الكاشف القائم على الخرز لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى المسبح واخلطه جيدا عن طريق الماصة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي وانتظر حتى ينظف الطافي وتتشكل حبيبات الخرز. إزالة الطاف. أخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي.
    6. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للجزء القصير (SFB) واخلطه عن طريق الماصة. ضع مرة أخرى على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى تتشكل الحبيبات وينظف السائل (~ 5 دقائق). ماصة من طاف والتخلص منه.
    7. كرر الخطوة السابقة. اترك الأنبوب على الحامل المغناطيسي. أضف 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ دون لمس الخرزة. ماصة من الإيثانول والسماح للحبة لتجف لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: لا تدع الخرزة تجف أكثر من اللازم.
    8. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 35 ميكرولتر من الماء بدرجة PCR. تخلط عن طريق سحب العينات وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي واترك الخرزة تلتلى والسائل لتزول. ماصة 35 ميكرولتر من الطافية إلى أنبوب جديد.
    9. قياس تركيز الحمض النووي الريبي للمكتبة المجمعة. ماصة الحجم اللازم للوصول إلى كمية 30-50 نانوغرام من الحمض النووي الريبي وتعبئته بماء من درجة PCR للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 30 ميكرولتر.
    10. تحضير مزيج تفاعل ربط المحول: 30 ميكرولتر من المكتبة المجمعة ، و 5 ميكرولتر من مزيج المحول II ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الربط (5x) ، و 5 ميكرولتر من T4 DNA ligase. امزج عن طريق السحب والدوران لأسفل (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    11. أضف 20 ميكرولتر من الكاشف القائم على الخرزة لتنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل واخلطه عن طريق الماصة. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    12. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى تتشكل حبيبات الخرزة وتصبح المادة الطافية عديمة اللون. ماصة بعناية وتجاهل طاف .
    13. أخرجه من الحامل المغناطيسي وأضف 125 ميكرولتر من SFB. امزجه عن طريق السحب وضعه مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز. عندما يكون السائل صافيا ، ماصة وتجاهل الطاف.
    14. كرر الخطوة السابقة. اترك الأنبوب مفتوحا على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية حتى يتبخر بعض السائل المتبقي.
    15. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأضف 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف. تخلط جيدا عن طريق السحب والدوران لفترة وجيزة (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضعه على الحامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة.
    16. ماصة 15 ميكرولتر من المادة الطافية في أنبوب جديد منخفض الربط. هذه هي المكتبة النهائية. قم بقياس التركيز باستخدام مجموعة قياس الحمض النووي الفلورومتري.
      ملاحظة: في الخطوة التالية ، هناك حاجة إلى 12 ميكرولتر. إذا كان التركيز مرتفعا جدا وكانت هناك حاجة إلى أقل من 12 ميكرولتر من المكتبة ، املأ ما يصل إلى 12 ميكرولتر بكاشف المحلول العازل.
  3. تحميل خلية التدفق وتسلسلها
    1. أدخل خلية التدفق (R9.4.1) في جهاز تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي في الوقت الفعلي.
    2. قم بإعداد مزيج التحضير عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من كاشف حبل التدفق (FLT) إلى أنبوب كاشف المخزن المؤقت للتدفق (FB). دوامة للخلط والدوران لأسفل (1000 × جم لمدة 15-30 ثانية).
    3. افتح غطاء منفذ التحضير. باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، اضبط على 200 ميكرولتر وأدخل الطرف في منفذ التحضير. أدر عجلة ضبط مستوى الصوت وقم بزيادة مستوى الصوت حتى يظهر السائل الموجود في الطرف. تخلص من الحافة.
      ملاحظة: أدر العجلة فقط حتى يتم رؤية بضعة ميكرولتر من السائل في الطرف. قد يؤدي سحب كميات أكبر إلى إتلاف خلية التدفق.
    4. أضف ببطء 800 ميكرولتر من مزيج التحضير إلى منفذ التحضير ، مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات. انتظر لمدة 5 دقائق.
    5. في غضون ذلك ، قم بإعداد المكتبات للتحميل. امزج 37.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتسلسل ، و 25.5 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت ، و 12 ميكرولتر من المكتبة.
      ملاحظة: امزج المخزن المؤقت للتحميل قبل سحب الماصة. تستقر الخرزات الموجودة في هذا الكاشف بسرعة كبيرة.
    6. افتح غطاء المنفذ. ماصة 200 ميكرولتر من مزيج التحضير في منفذ التحضير.
      ملاحظة: أثناء السحب إلى منفذ التحضير مع فتح منفذ الغطاء ، سيلاحظ المرء قطرات صغيرة قادمة من منفذ العينة. ماصة بطيئة بما فيه الكفاية حتى يتمكن منفذ العينة من سحب القطرات دون انسكابها.
    7. قبل تحميل المكتبة المعدة ، امزج جيدا عن طريق الماصة. باستخدام ماصة 100 ميكرولتر مضبوطة على 75 ميكرولتر ، خذ المكتبة والماصة قطرة قطرة في منفذ العينة. لا تلمس المنفذ وانتظر حتى يتم امتصاص كل قطرة في المنفذ قبل تحميل القطرة التالية لتجنب فيضان السائل.
    8. أغلق منفذ الغطاء ومنفذ التحضير. افتح البرنامج وابدأ تجربة التسلسل. حدد تشغيل الاتصال الأساسي. بالنسبة للمكتبة التي تحتوي على 96 عينة متعددة الإرسال ، عادة ما يكون 10-12 ساعة من التسلسل كافيا لتوليد بيانات كافية.
      ملاحظة: باستخدام البرنامج ، يمكن للمرء إدراج ورقة العينة بتنسيق .csv. تتطلب ورقة العينة البيانات التالية: flow_cell_id ، position_id ، sample_id ، experiment_id ، flow_cell_product_code ، والمجموعة. مطلوب معرف خلية التدفق (مدرج على جانب خلية التدفق) مع المجموعة المستخدمة. بالنسبة للبروتوكول المقترح ، يجب تحديد مجموعة LSK109.
  4. تحليل بيانات التسلسل
    1. أدخل قراءات fastq المضغوطة في سير عمل wf-artic41. قم بتشغيل سير العمل بشكل منفصل باستخدام نظامين أوليين مختلفين (ARTIC / V4.1 و NEB-VarSkip / v1a). اثنان ". يتم إنشاء ملفات primertrimmed.rg.sorted.bam" لكل عينة.
    2. دمج ملفات BAM في ملف واحد باستخدام الأمر "samtools merge"42. أدخل ملف BAM المدمج في أداة Freyja ، مع ترك الإعدادات الافتراضية ، لاستعادة وفرة النسب النسبية43.
    3. لإنشاء ملف FASTA ، أدخل ملف BAM المدمج في أدوات "samtools mpileup" و "ivar" بالإعدادات الافتراضية44,45. لاستدعاء الطفرات ، قم بتحميل ملف FASTA في أداة Nextclade46,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تظهر النتائج الملخصة في الجدول 3 أمثلة على اكتشاف وقياس الحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء باستخدام الطريقة الموضحة في هذه المقالة. تم جمع عينات مياه الصرف الصحي من محطات معالجة مياه الصرف الصحي في إسبانيا وسلوفينيا واعتبرت إيجابية إذا كان Ct أقل من 40 في اثنين على الأقل من النسخ الثلاث المكررة ، مع اعتبار القياس الكمي صالحا إذا كان للقطط المقطعية اختلاف أقل من 5٪. في إسبانيا والبرتغال ، تم جمع عينات الهواء الداخلي والخارجي ، وتم تطبيق نفس القواعد. تم استخدام التكرارات لعينات الهواء ، وليس ثلاث نسخ كما هو الحال بالنسبة لعينات مياه الصرف الصحي ، حيث كان الهدف من الدراسة هو الكشف عن SARS-CoV-2 RNA وليس تحديده كميا. علاوة على ذلك ، تم اعتبار تشغيل RT-qPCR صالحا فقط إذا تصرفت جميع عناصر التحكم المستخدمة (كما هو موضح في هذا البروتوكول) كما هو متوقع وإذا لم يلاحظ أي انحرافات كبيرة في مكافحة الحمض النووي الريبي للفيروس mengovirus. بالنسبة لهذه العينات ، تراوحت كفاءة التعافي من فيروس mengovirus بين 13.7٪ و 19.7٪. تم تقييم التثبيط عن طريق تخفيف الحمض النووي الريبي المستخرج عشرة أضعاف و 100 ضعف ومقارنة نتائج RT-qPCR الناتجة ، وكذلك باستخدام مجموعة تجارية. يجب اتباع التعليمات الخاصة بكل مجموعة تحكم في التثبيط كما هو موضح من قبل الشركات المصنعة.

كان لعينات مياه الصرف الصحي انحراف معياري من 1.91٪ إلى 13.98٪ بين المواد الثلاثية وتراوحت من 3.05 × 10 3 إلى 2.83 × 108 نسخ جينية / لتر. تراوحت عينات الهواء من 6.17 × 103 إلى 5.48 × 10 9 مع انحراف معياري بين التكرارات بين 0.54٪ و 10.95٪. هذا وفقا للدراسات السابقة6،48،49،50.

كما هو موضح في هذا البروتوكول ، تم تسلسل العينات ويرد مثال على ثلاث نتائج عينات متسلسلة في الجدول 4 والشكل 1. في جميع العينات الثلاث ، تم تعيين النسب BA.5.x على أنه الأكثر انتشارا بواسطة أداة Freyja (95.3٪ و 95.4٪ و 99.8٪).

Figure 1
الشكل 1: انتشار سلالة SARS-CoV-2 في عينات مختارة من مياه الصرف الصحي. تم تعيين الأنساب باستخدام أداة Freyja. لا يصل ملخص أرقام الانتشار بالضرورة إلى 100٪ ، لأن بعض البيانات ليست ذات جودة كافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الكواشف والأحجام التي ستضاف لكل منها لإعداد المزيج الرئيسي للقياس الكمي ل SARS-CoV2 بواسطة RT-qPCR. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الكواشف والأحجام التي يجب إضافتها لكل منها لإعداد المزيج الرئيسي لتضخيم جينومات SARS-CoV-2 الكاملة في العينات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: ملخص نتائج القياس الكمي RT-qPCR للحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 من عينات مياه الصرف الصحي والهواء. تم استخدام الجين N1 للقياس الكمي وتم استخدام N2 للتأكيد (إيجابي أو سلبي). يتم التعبير عن النتائج كنسخ / L. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: الطفرات المكتشفة وانتشار النسب. تم تعيين الأنساب باستخدام أداة Freyja ووفقا للطفرات المثيرة للاهتمام التي تم العثور عليها باستخدام Nextclade. يتم عرض تغطية الجينوم لكل عينة. لا يصل ملخص أرقام الانتشار بالضرورة إلى 100٪ ، لأن بعض البيانات ليست ذات جودة كافية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حظي الكشف عن الميكروبات والفيروسات وقياسها الكمي باستخدام طرق (RT-) qPCR بقبول واسع النطاق بسبب حساسيتها الملحوظة. ومع ذلك ، تواجه هذه التقنيات العديد من التحديات عند تحليل العينات البيئية. تحتوي عينات مياه الصرف الصحي على وفرة من المواد المثبطة التي يمكن أن تحرف القياسات وتولد نتائج مضللة. لمعالجة هذه القيود وتعزيز الدقة ، تم تصميم بروتوكول معقد وتصميمه وتنفيذه. تم تصميم هذا البروتوكول من خلال الجمع بين البروتوكولات من الأدبيات العلمية ومعالجة القيود المتأصلة في طرق qPCR على وجه التحديد من خلال دمج سلسلة من الضوابط الصارمة في كل مرحلة من مراحل العملية. من خلال دمج تدابير مراقبة الجودة الصارمة هذه ، يقدم هذا البروتوكول حلا قويا للتحديات التي تواجهها طرق الكشف والقياس الكمي القائمة على qPCR في العينات البيئيةالمعقدة 51,52. يعد التحكم السلبي في العزل (NCI) والتحكم غير القالب (NTC) أدوات أساسية لتقييم احتمالية التلوث أثناء استخراج الحمض النووي الريبي وتفاعل RT-qPCR. علاوة على ذلك ، يوفر تكامل الحمض النووي الريبي لمكافحة فيروس mengovirus وسيلة حاسمة لتقييم التباين بين العينات ، وكذلك كفاءة خطوة التركيز والتأثيرات المثبطة للعوامل الموجودة في العينات البيئية المعقدة. في كل تفاعل RT-qPCR ، يجب تضمين عناصر تحكم إيجابية لتأكيد فعالية عملية التضخيم. من الأهمية بمكان مراقبة كل خطوة من خطوات البروتوكول بعناية ، بما في ذلك وقت تخزين العينات ومعالجتها. يمكن أن يتأثر تدهور العينات بدرجة الحرارة والتركيب المعقد لمياه الصرف الصحي ، مما يجعل من الضروري تخزين العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية ومعالجتها في غضون 24 ساعة. من خلال الالتزام بهذه التدابير الصارمة لمراقبة الجودة ، يمكن للباحثين والعاملين في مجال الصحة العامة تحليل العينات البيئية بثقة ودقة للكشف عن رؤى حيوية حول المجموعات الميكروبية والفيروسية وفهم تأثير العوامل البيئية على صحة الإنسان بشكل أفضل48.

يعد اختيار أهداف الحمض النووي الريبي للكشف عن SARS-CoV-2 عاملا حاسما يمكن أن يؤثر على حساسية مقايسات RT-qPCR. في هذه الدراسة ، قام المؤلفون بتقييم أهداف RdRp و E و N1 و N2 ووجدوا أن مقايسات RdRp و E لها حساسية أقل من مقايسات N1 و N2 ، بما يتفق مع البحث السابق53. تستخدم مقايسات N1 و N2 مجسات إخماد مزدوجة ، والتي ثبت أنها تعزز حساسيتها في مقايسات (RT-) qPCR54. تؤدي هذه الأسباب إلى قرار استخدام N1 للقياس الكمي و N2 كتأكيد لوجود الحمض النووي الريبي ، من أجل القضاء على الشكوك عند العثور على تركيزات منخفضة للغاية. تم الإبلاغ سابقا عن التناقضات الملحوظة بين أهداف RT-qPCR36.

استخدمت العديد من الدراسات بروتوكولات مماثلة وأبلغت عن الكشف الناجح عن الحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 وقياسه في مياه الصرف الصحي خلال جائحة COVID-19 المستمر6،48،49،55،56. تتوافق تركيزات الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 المبلغ عنها مع تلك المبلغ عنها في هذه الدراسة والبروتوكول48،50،55. استكشفت بعض هذه الدراسات العلاقة بين الحالات النشطة وتركيزات الجينات المستهدفة RT-qPCR ، وخاصة N1 و N26،36،49،50،55،57،58،59. لتقليل التباين في تركيزات الجينات التي تم الحصول عليها ، تم اقتراح مضاعفة التركيزات التجريبية بمعدل التدفق في وقت أخذ العينات للحصول على الحمل الفيروسي الأولي36. تم دمج هذا النهج في مشروع VATar COVID-19 في إسبانيا ، وهو نظام مراقبة وطني ل COVID-19 في مياه الصرف الصحي60.

باعتبارها المرحلة التالية من دراسات علم الأوبئة القائمة على مياه الصرف الصحي (WBE) ل COVID-19 ، حاول الباحثون اكتشاف طفرات SARS-CoV-2 في مياه الصرف الصحي لتقدير تداول المتغيرات المثيرة للقلق داخل المجتمعات. أظهرت الدراسات السابقة وجود علاقة قوية بين المتغيرات المحددة في مياه الصرف الصحي وتلك الموجودة في السكان في نفس الوقت. تشير هذه النتائج إلى أن المراقبة القائمة على مياه الصرف الصحي يمكن أن تكون بمثابة أداة قيمة في تتبع انتشار متغيرات SARS-CoV-261,62. أظهر WBE وعدا كبيرا في مراقبة SARS-CoV-2 ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات المراقبة المستقبلية للأوبئة. هذا النهج مفيد بشكل خاص في المراحل المبكرة من الجائحة، عندما تكون هناك اختبارات فردية محدودة وقد تكون العديد من الحالات بدون أعراض، ولديه استراتيجية تكميلية للترصد السريري. لذلك ، يمكن أن يكون WBE مفيدا بشكل خاص في الأماكن ذات القدرة الاقتصادية المنخفضة التي لا تستطيع تحمل استراتيجيات مراقبة أخرى أكثر تكلفة. يمكن تكييف الطريقة الموصوفة بسهولة مع الفيروسات الأخرى التي قد تكون ذات صلة بالمراقبة في المستقبل.

كشفت نتائج أخذ عينات الهواء في البيئات الداخلية والخارجية أن الحمض النووي الريبي ل SARS-CoV-2 موجود في كلتا البيئتين ، على الرغم من أنه بتركيزات أقل في البيئات الخارجية38،63،64. تشير هذه النتائج إلى أن الأنشطة والتعرض التي يصعب فيها الحفاظ على ارتداء الأقنعة والتباعد الاجتماعي ، مثل الأكل أو الشرب أو حضور المهرجانات الموسيقية ، يمكن أن تشكل خطرا أكبر لانتقال COVID-19. للتخفيف من هذه المخاطر، من الأهمية بمكان النظر في تدابير التهوية المناسبة واستخدام الأقنعة، خاصة مع ظهور متغيرات جديدة مثيرة للقلق أكثر قابلية للانتقال، مثل متغيرات دلتا (B.1.617.2) وأوميكرون (B.1.1.529). في ضوء رفع قيود COVID-19 في العديد من المناطق ، يوصى بالحفاظ على استخدام الأقنعة للحفاظ على انتقال المجتمع ل SARS-CoV-2 عند الحد الأدنى ومنع تفشي المرضفي المستقبل 5،21،26،65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس للمؤلفين مصالح اقتصادية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgments

تم تنفيذ هذا العمل بدعم مالي من الحكومة الإقليمية لكاستيا وليون وبرنامج FEDER (مشاريع CLU 2017-09 و UIC315 و VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405 (2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094 (2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226 (2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180 (2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404 (2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558 (2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14 (2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251 (2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787 (2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800 (2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540 (2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955 (2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200 (2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352 (2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732 (2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255 (2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326 (2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599 (2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932 (2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137 (2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773 (2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215 (2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942 (2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557 (2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926 (2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764 (2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002 (2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899 (2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614 (2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776 (2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098 (2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202 (2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574 (2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Tags

العلوم البيئية ، العدد 196 ، SARS-CoV-2 ، RNA ، RT-qPCR ، التسلسل ، المتغيرات المثيرة للقلق
القياس الكمي وتوصيف الجينوم الكامل للحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في عينات مياه الصرف الصحي والهواء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves, J., Gomes da Silva,… More

Gonçalves, J., Gomes da Silva, P., Koritnik, T., Bosilj, M., Torres-Franco, A., Diaz, I., Rodriguéz, E., Marcos, E., Mesquita, J. R., García-Encina, P. Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples. J. Vis. Exp. (196), e65053, doi:10.3791/65053 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter