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Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Este protocolo tiene como objetivo cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire para ser utilizado en estudios epidemiológicos basados en aguas residuales y evaluar el riesgo de exposición al SARS-CoV-2 en aerosoles interiores y exteriores. Este protocolo también describe un enfoque de secuenciación de plantilla larga de amplicón en mosaico para la caracterización del genoma completo del SARS-CoV-2.

Abstract

La epidemiología basada en las aguas residuales se ha convertido en un sistema de vigilancia prometedor y eficaz para el SARS-CoV-2 y otras enfermedades infecciosas en muchos países. El proceso suele implicar la concentración de aguas residuales, la extracción de ácidos nucleicos, la amplificación de segmentos genómicos seleccionados y la detección y cuantificación del segmento genómico amplificado. De manera similar, esta metodología se puede aprovechar para detectar y cuantificar agentes infecciosos, como el SARS-CoV-2, en muestras de aire. Inicialmente, se suponía que el SARS-CoV-2 se propagaba principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas generadas por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar. Sin embargo, un número creciente de estudios han informado de la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire de los centros sanitarios, estableciendo la transmisión aérea como una ruta viable para el virus. Este estudio presenta una combinación de protocolos establecidos para facilitar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

Introduction

En diciembre de 2019, surgió una nueva enfermedad llamada COVID-19, causada por un coronavirus previamente desconocido, el SARS-CoV-21. La pandemia mundial resultante ha presentado un desafío significativo para los laboratorios clínicos y de salud pública en todo el mundo, ya que un gran número de personas requieren pruebas para evaluar con precisión la transmisión y prevalencia del virus en la comunidad. Sin embargo, en muchas regiones, alcanzar el nivel necesario de pruebas de manera oportuna y espacialmente exhaustiva es económicamente inviable 2,3. Los sistemas de vigilancia actuales, basados en el diagnóstico clínico individual, dependen en gran medida de la gravedad de los síntomas y de la notificación individual, así como de la medida en que estos síntomas se solapan con las enfermedades existentes que circulan en la población 4,5,6,7,8,9,10. En consecuencia, un elevado número de casos asintomáticos contribuye a una subestimación significativa de la carga de enfermedad 7,11.

Debido a estos desafíos, se propuso la epidemiología basada en aguas residuales (WBE, por sus siglas en inglés) para la vigilancia de la COVID-19 como una estrategia de vigilancia complementaria. El WBE se describió por primera vez en 200112, y se utilizó inicialmente para rastrear cocaína y otras drogas ilegales13. Este enfoque se basa en la suposición de que es posible calcular la concentración inicial de cualquier sustancia que sea estable en las aguas residuales y excretada por los seres humanos 8,12. WBE se ha implementado con éxito en muchos países como un sistema de vigilancia complementario y eficiente para el SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. La mayoría de los métodos para detectar virus humanos en ambientes acuáticos siguen estos pasos: concentración, extracción de ácidos nucleicos, amplificación del segmento (o segmentos) genómicos elegidos y detección/cuantificación del segmento genómico amplificado3.

Otro entorno importante para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2 es en muestras de aire. Inicialmente, se pensaba que el SARS-CoV-2 se transmitía principalmente a través del contacto personal cercano con gotitas respiratorias de aerosoles generados por una persona infectada al hablar, estornudar, toser, cantar o respirar17. Sin embargo, varios estudios comenzaron a relatar la presencia de ARN del SARS-CoV-2 en el aire, especialmente en establecimientos de salud y otros espacios cerrados 18,19,20,21. Se han encontrado evidencias de viabilidad del SARS-CoV-2 en muestras de aire tomadas en interiores de hospitales y otros espacios cerrados cuando la concentración del virus era lo suficientemente alta22,23,2 4. En general, los estudios al aire libre no han encontrado evidencia de SARS-CoV-2, excepto en espacios al aire libre concurridos 21,25,26,27,28,29. Hasta el momento, la transmisión aérea del SARS-CoV-2 ha sido reconocida como un modo de transmisión30,31. Un estudio de revisión reciente muestra las diferencias entre el aire libre, donde los riesgos de transmisión aérea son mínimos fuera de las áreas concurridas, y el interior, donde los riesgos más grandes podrían estar presentes en entornos mal ventilados en los que podría haber fuentes fuertes (es decir, el número de personas infectadas). Un reciente estudio de revisión exhaustiva ha puesto de relieve las diferencias sustanciales entre los riesgos de transmisión aérea en entornos exteriores frente a interiores, especialmente en zonas concurridas con poca ventilación. El estudio indica que el riesgo de transmisión aérea es mínimo en ambientes exteriores, donde existe un mayor volumen de aire disponible para la dilución y dispersión de partículas virales32. Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para las políticas y directrices de salud pública relacionadas con la COVID-19. Al reconocer las diferencias significativas en los riesgos de transmisión entre ambientes interiores y exteriores, los responsables de la formulación de políticas pueden desarrollar estrategias más eficaces para mitigar la propagación del virus y proteger la salud pública.

Existe una variedad de métodos y protocolos para la detección, cuantificación y secuenciación del SARS-CoV-2 a partir de diferentes muestras ambientales. Este artículo de método tiene como objetivo presentar una combinación de protocolos bien establecidos que permiten a los laboratorios con diferentes niveles de capacidad realizar la detección, cuantificación y secuenciación ambiental de virus a partir de muestras de aguas residuales y aire.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido publicados en otros lugares y contienen pequeñas modificaciones con respecto a los métodos originales.

1. Recogida de aguas residuales y preprocesamiento de muestras

NOTA: Debido a las bajas concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 en muestras ambientales, la implementación de un paso de concentración es crucial para una detección exitosa33,34,35. Aquí se describe el primer método reportado para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales36.

  1. Recogida y concentración de muestras de aguas residuales
    1. Recoja 1 L de muestra compuesta de aguas residuales de 24 h. Almacenar la muestra a 4 °C y continuar con el protocolo en un plazo de 24 h.
    2. Homogeneizar la muestra agitando suavemente el frasco. Recoja 70 ml en un tubo centrífugo de 100 ml o divida la muestra en dos tubos centrífugos de 50 ml.
    3. Espigar 20 μL de mengovirus (3,2 x 103 copias/μL) a 70 mL de cada muestra como control interno del proceso de concentración. Alternativamente, inyecte 10 μL de mengovirus (3,2 x 103 copias/μL) en cada tubo de centrífuga de 50 mL.
    4. Homogeneizar la muestra y centrifugar a 700 x g durante 10 min para eliminar partículas grandes y organismos (pellet).
    5. Utilizar el sobrenadante resultante para la concentración con dispositivos de ultrafiltración centrífuga con un corte de 10 KDa centrifugando a 4.000 x g durante 40 min a 4 °C. Eluir el concentrado centrifugando a 700 x g durante 40 min e invirtiendo la posición del dispositivo de ultrafiltración.
    6. Mide el volumen del concentrado resultante. El volumen cambiará dependiendo de la cantidad de sólidos en la muestra que obstruyan los filtros centrífugos. En este estudio, los volúmenes de concentrado obtenidos estuvieron entre 200-1.200 μL.
    7. Utilice el concentrado resultante para la extracción de ARN utilizando un kit comercial o un método interno. Para las muestras utilizadas en este estudio, se utiliza un kit comercial específico para la extracción de ARN viral con un volumen de elución de 50 μL.
    8. Mida la concentración del ARN extraído con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Divida el ARN extraído en alícuotas y congele a -80 °C hasta su posterior análisis.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimientos de aislamiento de ARN, se debe incluir un control negativo de aislamiento (NCI), que contenga solo tampones para detectar una posible contaminación durante la extracción.
  2. Recogida de muestras de aire con un muestreador de aire compacto Coriolis
    1. Elija una estrategia de muestreo de acuerdo con el objetivo de la investigación definiendo la frecuencia de muestreo y los lugares de muestreo.
    2. Ajuste el caudal en el muestreador de aire (en este caso, 50 L/min durante 30 min). Tenga en cuenta que un caudal superior a 200 L/min puede degradar el ARN viral, por lo que se recomienda utilizar un caudal inferior a 200 L/min.
    3. Coloque un cono estéril en el muestreador de aire antes de iniciar la recolección pulsando el botón de inicio. Una vez finalizada la toma de muestras, agregue 5-15 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en el cono. Agite suavemente la muestra con la mano durante 15 s. Almacenar las muestras durante un máximo de 24 h a 4 °C o a -80 °C en criotubos.
    4. Se puede realizar un paso de concentración opcional. Limpie y descontamine los conos después de cada experimento con lejía.
    5. Extraiga el ARN utilizando un kit comercial o un método interno. Para las muestras de este estudio se utiliza un kit comercial específico para la extracción de ARN viral con un volumen de elución de 50 μL.
    6. Mida la concentración del ARN extraído con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Divida el ARN extraído en alícuotas y congele a -80 °C hasta su posterior análisis.
      NOTA: Para cada conjunto de procedimientos de aislamiento de ARN, se debe incluir un control negativo de aislamiento (NCI), que contenga solo tampones para detectar una posible contaminación durante la extracción.

2. Cuantificación del ARN del SARS-CoV-2 mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)

NOTA: El siguiente protocolo está de acuerdo con el panel de diagnóstico RT-PCR37 de los CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV). Divida la mezcla de cebador/sonda en varias alícuotas para evitar ciclos de congelación y descongelación.

  1. Preparar la mezcla maestra de reacción para cada objetivo (mengovirus; SARS-CoV-2 [genes N1 y N2]) como en la Tabla 1, en una campana limpia en la sala de preparación de reactivos. Mezcle la mezcla de cebadores/sonda y la enzima por inversión cinco veces. Alternativamente, pulse la luz en el vórtice de la mezcla de cebadores / sonda y enzima cinco veces.
    NOTA: Mantenga todos los reactivos fríos durante la preparación y el uso. Con el fin de minimizar los ciclos de congelación-descongelación, se recomienda encarecidamente congelar en alícuotas.
  2. Girar hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s) los tubos para recoger el contenido en el fondo y colocarlos en una rejilla fría o sobre hielo.
  3. Etiquete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada objetivo. Añadir a cada tubo de microcentrífuga la cantidad de cada reactivo necesario (volumen por reacción multiplicado por el número de reacciones, incluidos los controles necesarios). Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugar durante 5 s para recoger el contenido en el fondo.
  4. Mantenga los tubos de microcentrífuga en una rejilla fría y dispense 15 μL en tubos de PCR en tiras o en una placa de 96 pocillos en una rejilla de enfriamiento. Cubra la placa y muévala al área de manipulación de ácidos nucleicos (manténgala en una rejilla de enfriamiento).
  5. Descongele una alícuota de ARN extraído y un vórtice suave durante 5 s. Pipetear 5 μL de ARN (además de 5 μL de control no molde [NTC], control negativo de aislamiento [NCI] y control positivo [PC]) a cada pocillo o tubo de reacción que contenga la mezcla maestra previamente preparada. Cámbiese los guantes con frecuencia según sea necesario para evitar la contaminación cruzada.
  6. Cubra toda la placa o tubos de reacción y haga un vórtice suave. Centrifugar (1.000 x g durante 15-30 s) la placa o los tubos de PCR.
  7. Iniciar la RT-qPCR de 25 μL con las siguientes condiciones cíclicas: transcriptasa inversa a 45 °C durante 10 min; activación de la polimerasa a 95 °C durante 10 min; 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s; y recocido/extensión a 60 °C durante 45 s.
  8. Calcular la eficiencia de recuperación de los controles de mengovirus según lo reportado por Conte et al.38:
    Equation 1 × 100

3. Variantes de secuenciación en aguas residuales y análisis de datos

NOTA: El protocolo descrito es un protocolo modificado creado por Quick et al.39,40. Utiliza dos juegos de cebadores para la amplificación del genoma del SARS-CoV-2 mediante la metodología de mosaico de PCR: cebadores ARTIC y cebadores VarSkip. Se utiliza una combinación de cebadores para garantizar la mejor cobertura del genoma y minimizar la posibilidad de nuevas mutaciones que provoquen el fallo de los cebadores de un tipo. En general, el protocolo se divide en tres partes: transcripción inversa (RT) y generación de amplicones, preparación de la biblioteca de secuenciación y secuenciación y análisis de datos.

  1. Transcripción inversa y generación de amplicones
    1. Asegúrese de que las muestras de entrada tengan un valor de umbral de ciclo (Ct) de qPCR conocido para diluirlas correctamente en agua de grado PCR. El valor de Ct se obtiene durante la cuantificación con qPCR. Las diluciones son las siguientes: si el valor de Ct es 12-15, diluir las muestras 1:100; si el valor de Ct es 15-18, diluir las muestras 1:10; si el valor de Ct es de 18-35, no diluya la muestra. Las muestras por encima de un valor de Ct de 35 tienen una alta probabilidad de no funcionar.
    2. En una placa de PCR, pipetear 16 μL de cada muestra hasta su posición en la placa. Añadir 4 μL de mezcla maestra de transcripción inversa (RT) (5x). Cubra la placa e inicie la reacción de PCR con las siguientes condiciones: 25 °C durante 2 min, 55 °C durante 20 min y 95 °C durante 1 min.
    3. Preparar diluciones de 10 μM de cada juego de cebadores (ARTIC pool A y pool B, y VarSkip pool A y pool B). Prepare la mezcla maestra para cada juego de cebadores (ARTIC set A y B, y VarSkip set A y B) como se muestra en la Tabla 2. De esto resultarán cuatro mastermixes.
    4. En una nueva placa de PCR, pipetear 20 μL de la mezcla maestra en cada pocillo correspondiente. Añadir 5 μL de la muestra RT a cada mezcla.
      NOTA: Cada muestra tendrá cuatro mezclas de reacción: el grupo ARTIC A y B, y el grupo VarSkip A y B.
    5. Cubra la placa e inicie la reacción de PCR de la siguiente manera: activación de la polimerasa a 98 °C durante 30 s; 35 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 15 s; y recocido/extensión a 65 °C durante 4 min. Girar hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s) el plato. Combine los grupos de reacción ARTIC y combine por separado los grupos de reacción VarSkip. Cada muestra tendrá dos reacciones de amplicón de 50 μL.
    6. Agregue 50 μL de reactivo a base de perlas para la purificación por PCR a cada pocillo y mezcle bien mediante pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: Antes de cada uso, mezcle vigorosamente el reactivo de purificación por PCR para resuspender las perlas.
    7. Coloque la placa en un soporte de separación magnética y espere a que las perlas formen un gránulo y el líquido se aclare (~ 5 min). Pipetear y desechar el sobrenadante. Mantenga la placa de PCR en el soporte magnético.
    8. Manteniendo la placa de PCR en el soporte magnético, agregue 200 μL de etanol al 80% a cada muestra sin tocar el gránulo de perlas. Retira el etanol.
    9. Repita el paso anterior. Deje la placa en el soporte magnético descubierta durante 30 s para permitir que el etanol se evapore.
    10. Retire la placa del soporte magnético y agregue 15 μL de agua de grado PCR a cada muestra. Vuelva a suspender el gránulo pipeteando. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    11. Vuelva a colocar la placa en el soporte magnético y deje que las cuentas se despeguen (2 min). Pipetear cuidadosamente 15 μL del sobrenadante de cada muestra en una nueva placa de PCR.
    12. Mida la concentración de cada muestra con un kit de cuantificación fluorométrica de ARN. Tome aproximadamente 50 ng de cada muestra en 12,5 μL para el siguiente paso. Si es necesario, diluya la muestra en agua apta para PCR.
  2. Preparación de la biblioteca
    1. Añadir 1,75 μL de tampón de reacción del kit de preparación de la biblioteca de ADN de Illumina y 0,75 μL de mezcla de enzimas a cada muestra. Cubra la placa, haga un vórtice brevemente y gire hacia abajo (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a 21 °C durante 5 min y a 65 °C durante 5 min.
    2. En una placa nueva, pipetee 3 μL de agua apta para PCR para cada muestra en una nueva placa de PCR. Agregue 0,75 μL de las muestras preparadas, 1,25 μL de códigos de barras para la preparación de la biblioteca de secuenciación y 5 μL de mezcla maestra de ADN ligasa T4. Mezclar bien pipeteando, centrifugar brevemente (1.000 x g durante 15-30 s) en una centrífuga e incubar a 21 °C durante 20 min y a 65 °C durante 10 min.
      NOTA: Si utiliza menos de 25 muestras, duplique todos los volúmenes en este paso.
    3. Agrupe todas las muestras añadiendo 10 μl de cada muestra al mismo tubo de baja unión. Lleve 480 μL al siguiente paso.
    4. Añadir 192 μL de reactivo a base de perlas para la purificación por PCR a la piscina y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Coloque el tubo en un soporte magnético y espere a que el sobrenadante se aclare y se forme una bolita de perlas. Retire el sobrenadante. Retire el tubo del soporte magnético.
    6. Añadir 700 μL del tampón de fragmentos cortos (SFB) y mezclar mediante pipeteo. Vuelva a colocarlo en el soporte magnético y espere a que se forme el gránulo y el líquido se aclare (~5 min). Pipetear el sobrenadante y desecharlo.
    7. Repita el paso anterior. Deje el tubo en el soporte magnético. Añadir 100 μL de etanol al 80% sin tocar la perla. Pipetear el etanol y dejar que la perla se seque durante 30 s.
      NOTA: No permita que el cordón se seque demasiado.
    8. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 35 μL de agua de grado PCR. Mezclar pipeteando e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Coloque el tubo en el soporte magnético y deje que la perla se granule y el líquido se aclare. Pipetear 35 μL del sobrenadante a un tubo nuevo.
    9. Mida la concentración de ARN de la biblioteca agrupada. Pipetear el volumen necesario para alcanzar una cantidad de 30-50 ng de ARN y llenarlo con agua de grado PCR para alcanzar un volumen final de 30 μL.
    10. Prepare la mezcla de reacción de ligadura del adaptador: 30 μL de la biblioteca agrupada, 5 μL de la mezcla adaptadora II, 10 μL del tampón de reacción de ligadura (5x) y 5 μL de ADN ligasa T4. Mezclar por pipeteo y centrifugado (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    11. Añadir 20 μL del reactivo a base de perlas para la purificación por PCR y mezclar mediante pipeteo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    12. Coloque el tubo en el soporte magnético y espere a que se forme la bolita de cuentas y el sobrenadante se vuelva incoloro. Pipetee con cuidado y deseche el sobrenadante.
    13. Retirar del soporte magnético y añadir 125 μL de SFB. Mezcle pipeteando y vuelva a colocar en el soporte magnético para separar las perlas. Cuando el líquido esté claro, pipetear y desechar el sobrenadante.
    14. Repita el paso anterior. Deje el tubo abierto en el soporte magnético durante 30 s para que se evapore parte del líquido sobrante.
    15. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 15 μL del tampón de elución. Mezclar bien pipeteando y centrifugar brevemente (1.000 x g durante 15-30 s). Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Coloque en el soporte magnético durante 2 min.
    16. Pipetear 15 μL del sobrenadante en un nuevo tubo de baja fijación. Esta es la biblioteca final. Mida la concentración con un kit de cuantificación fluorométrica de ADN.
      NOTA: En el siguiente paso, se necesitan 12 μL. Si la concentración es muy alta y se necesitan menos de 12 μL de la biblioteca, llene hasta 12 μL con el reactivo tampón de elución.
  3. Carga y secuenciación de celdas de flujo
    1. Inserte la celda de flujo (R9.4.1) en el dispositivo de secuenciación de ADN y ARN en tiempo real.
    2. Prepare la mezcla de cebado añadiendo 30 μL de reactivo de fijación de lavado (FLT) a un tubo de reactivo tampón de lavado (FB). Vórtice para mezclar y centrifugar (1.000 x g durante 15-30 s).
    3. Abra la tapa del puerto de cebado. Con una pipeta de 1.000 μL, ajústela a 200 μL e inserte la punta en el puerto de cebado. Gire la rueda de ajuste de volumen y aumente el volumen hasta que se vea el líquido en la punta. Deseche la punta.
      NOTA: Solo gire la rueda hasta que se vean unos pocos μL de líquido en la punta. Extraer cantidades más grandes podría dañar la celda de flujo.
    4. Agregue lentamente 800 μL de la mezcla de cebado al puerto de cebado, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Espere 5 min.
    5. Mientras tanto, prepare las bibliotecas para la carga. Mezcle 37,5 μL del tampón de secuenciación, 25,5 μL del tampón de carga y 12 μL de la biblioteca.
      NOTA: Mezcle el tampón de carga antes de pipetear. Las perlas de este reactivo se asientan muy rápidamente.
    6. Abra la tapa del puerto. Pipetear 200 μL de la mezcla de cebado en el puerto de cebado.
      NOTA: Al pipetear en el puerto de cebado con el puerto de la tapa abierto, se notarán pequeñas gotas que salen del puerto de muestra. Pipetea lo suficientemente lento como para que el puerto de muestra pueda aspirar las gotas sin que se derramen.
    7. Antes de cargar la biblioteca preparada, mezcle bien pipeteando. Con una pipeta de 100 μL ajustada a 75 μL, lleve la biblioteca y la pipeta gota a gota en el puerto de muestra. No toque el puerto y espere a que cada gota se absorba en el puerto antes de cargar la siguiente gota para evitar el desbordamiento del líquido.
    8. Cierre el puerto de la cubierta y el puerto de cebado. Abra el software e inicie el experimento de secuenciación. Seleccione Llamada base activada. Para una biblioteca con 96 muestras multiplexadas, 10-12 h de secuenciación suelen ser suficientes para generar datos suficientes.
      NOTA: Usando el software, se puede insertar la hoja de muestra en formato .csv. La hoja de muestra requiere los siguientes datos: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code y kit. Se necesita el ID de la celda de flujo (que aparece en el costado de la celda de flujo) junto con el kit utilizado. Para el protocolo sugerido, se debe seleccionar el kit LSK109.
  4. Análisis de datos de secuenciación
    1. Inserte las lecturas fastq comprimidas en el flujo de trabajo wf-artic41. Ejecute el flujo de trabajo por separado con dos esquemas de imprimación diferentes (ARTIC/V4.1 y NEB-VarSkip/v1a). Dos". primertrimmed.rg.sorted.bam" para cada ejemplo.
    2. Combine los archivos BAM en un solo archivo con el comando "samtools merge"42. Inserte el archivo BAM combinado en la herramienta Freyja, dejando la configuración predeterminada, para recuperar las abundancias relativas de linaje43.
    3. Para crear un archivo FASTA, inserte el archivo BAM combinado en las herramientas "samtools mpileup" e "ivar" con la configuración predeterminada44,45. Para la llamada de mutación, cargue el archivo FASTA en la herramienta Nextclade46,47.

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Representative Results

Los resultados resumidos en la Tabla 3 muestran ejemplos de detección y cuantificación de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire utilizando el método descrito en este artículo. Las muestras de aguas residuales se recogieron en plantas de tratamiento de aguas residuales de España y Eslovenia y se consideraron positivas si el Ct era inferior a 40 en al menos dos de las tres réplicas, considerándose válida la cuantificación si el Ct tenía una variación inferior al 5%. En España y Portugal se recogieron muestras de aire interior y exterior, y se aplicaron las mismas normas. Se utilizaron duplicados para las muestras de aire, no triplicados como para las muestras de aguas residuales, ya que el objetivo del estudio era detectar el ARN del SARS-CoV-2 y no cuantificarlo. Además, una prueba de RT-qPCR solo se consideró válida si todos los controles utilizados (como se describe en este protocolo) se comportaron como se esperaba y si no se observaron desviaciones significativas en el control del ARN del mengovirus. Para estas muestras, la eficiencia de recuperación de mengovirus varió entre 13,7% y 19,7%. La inhibición se evaluó diluyendo diez y 100 veces el ARN extraído y comparando los resultados de la RT-qPCR resultante, así como utilizando un kit comercial. Las instrucciones para cada kit de control de inhibición deben seguirse según lo descrito por los fabricantes.

Las muestras de aguas residuales tuvieron una desviación estándar de 1,91% a 13,98% entre los triplicados y variaron de 3,05 x 10 3 a 2,83 x 108 copias de genes/L. Las muestras de aire variaron de 6,17 x 103 a 5,48 x 109 con una desviación estándar entre los duplicados entre 0,54% y 10,95%. Esto está de acuerdo con estudios previos 6,48,49,50.

Como se describe en este protocolo, las muestras fueron secuenciadas y un ejemplo de los resultados de tres muestras secuenciadas se resume en la Tabla 4 y la Figura 1. En las tres muestras, el linaje BA.5.x fue asignado como el más prevalente por la herramienta de Freyja (95,3%, 95,4% y 99,8%).

Figure 1
Figura 1: Prevalencia del linaje del SARS-CoV-2 en muestras seleccionadas de aguas residuales. Los linajes se asignaron utilizando la herramienta Freyja. El resumen de las cifras de prevalencia no alcanza necesariamente el 100%, ya que algunos de los datos no son de calidad suficiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Reactivos y volúmenes a añadir de cada uno para preparar el mastermix para la cuantificación del SARS-CoV2 por RT-qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Reactivos y volúmenes a añadir de cada uno para preparar la mezcla maestra para amplificar los genomas completos del SARS-CoV-2 en las muestras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resumen de los resultados de la cuantificación de RT-qPCR del ARN del SARS-CoV-2 a partir de muestras de aguas residuales y aire. Se utilizó el gen N1 para la cuantificación y el N2 para la confirmación (positiva o negativa). Los resultados se expresan en copias/L. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Mutaciones detectadas y prevalencia de linaje. Los linajes se asignaron utilizando la herramienta de Freyja y de acuerdo con las mutaciones de interés encontradas utilizando Nextclade. Se muestra la cobertura del genoma de cada muestra. El resumen de las cifras de prevalencia no alcanza necesariamente el 100%, ya que algunos de los datos no son de calidad suficiente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La detección y cuantificación microbiana y viral mediante métodos de (RT-)qPCR ha obtenido una amplia aceptación debido a su notable sensibilidad. Sin embargo, estas técnicas se enfrentan a numerosos retos a la hora de analizar muestras ambientales. Las muestras de aguas residuales contienen una gran cantidad de sustancias inhibidoras que pueden sesgar las mediciones y generar resultados engañosos. Para hacer frente a estas limitaciones y mejorar la precisión, se concibió, diseñó e implementó un protocolo complejo. Este protocolo se adaptó combinando protocolos de la literatura científica y abordando específicamente las restricciones inherentes a los métodos de qPCR mediante la incorporación de una serie de controles estrictos en cada etapa del proceso. Al integrar estas rigurosas medidas de control de calidad, este protocolo ofrece una solución robusta a los desafíos que enfrentan los métodos de detección y cuantificación basados en qPCR en muestras ambientales complejas51,52. El control negativo de aislamiento (NCI) y el control sin plantilla (NTC) son herramientas esenciales para evaluar la probabilidad de contaminación durante la extracción de ARN y la reacción RT-qPCR. Además, la integración del ARN de control de mengovirus proporciona un medio crucial para evaluar la variabilidad entre muestras, así como la eficiencia de la etapa de concentración y los efectos inhibidores de los agentes presentes en muestras ambientales complejas. En cada reacción de RT-qPCR, se deben incluir controles positivos para confirmar la efectividad del proceso de amplificación. Es fundamental monitorear cuidadosamente cada paso del protocolo, incluido el tiempo de almacenamiento y procesamiento de las muestras. La degradación de las muestras puede verse influida por la temperatura y la compleja composición de las aguas residuales, por lo que es esencial almacenar las muestras a una temperatura de 4 °C y procesarlas en 24 h. Al adherirse a estas estrictas medidas de control de calidad, los investigadores y los trabajadores de la salud pública pueden analizar con confianza y precisión muestras ambientales para descubrir información vital sobre las poblaciones microbianas y virales y comprender mejor el impacto de los factores ambientales en la salud humana48.

La selección de dianas de ARN para la detección del SARS-CoV-2 es un factor crítico que puede afectar a la sensibilidad de los ensayos de RT-qPCR. En este estudio, los autores evaluaron las dianas RdRp, E, N1 y N2 y encontraron que los ensayos RdRp y E tenían menor sensibilidad que los ensayos N1 y N2, lo que concuerda con investigaciones previas53. Los ensayos N1 y N2 utilizan sondas de doble extinción, que han demostrado mejorar su sensibilidad en los ensayos de (RT-)qPCR54. Estas razones llevan a la decisión de utilizar N1 para la cuantificación y N2 como confirmación de la presencia de ARN, con el fin de eliminar dudas cuando se encuentran concentraciones muy bajas. Las discrepancias observadas entre las dianas de RT-qPCR fueron reportadas previamente36.

Varios estudios han empleado protocolos similares y han informado de la detección y cuantificación exitosa del ARN del SARS-CoV-2 en las aguas residuales durante la actual pandemia de COVID-19 6,48,49,55,56. Las concentraciones de ARN del SARS-CoV-2 reportadas están de acuerdo con las reportadas en este estudio y protocolo 48,50,55. Algunos de estos estudios han explorado la relación entre los casos activos y las concentraciones de genes diana de RT-qPCR, en particular N1 y N2 6,36,49,50,55,57,58,59. Para reducir la variabilidad en las concentraciones génicas obtenidas, se ha propuesto multiplicar las concentraciones experimentales por el caudal en el momento del muestreo para obtener la carga viral inicial36. Este enfoque se ha incorporado al proyecto VATar COVID-19 en España, un sistema nacional de monitorización de la COVID-19 en aguas residuales60.

Como la siguiente fase de los estudios epidemiológicos basados en aguas residuales (WBE, por sus siglas en inglés) de COVID-19, los investigadores han intentado detectar mutaciones del SARS-CoV-2 en las aguas residuales para estimar la circulación de variantes preocupantes dentro de las comunidades. Estudios previos han demostrado una fuerte correlación entre las variantes identificadas en las aguas residuales y las presentes en la población al mismo tiempo. Estos hallazgos sugieren que el monitoreo basado en aguas residuales podría servir como una herramienta valiosa para rastrear la propagación de las variantes del SARS-CoV-261,62. WBE ha demostrado ser muy prometedor en el seguimiento del SARS-CoV-2 y puede utilizarse para el desarrollo de futuras estrategias de vigilancia de pandemias. Este enfoque es particularmente útil en las primeras etapas de una pandemia, cuando las pruebas individuales son limitadas y muchos casos pueden ser asintomáticos, y tiene una estrategia complementaria a la vigilancia clínica. Por lo tanto, la WBE puede ser especialmente útil en lugares con baja capacidad económica que no pueden permitirse otras estrategias de vigilancia más costosas. El método descrito se puede adaptar fácilmente a otros virus que podrían ser relevantes para monitorear en el futuro.

Los resultados de la toma de muestras de aire en ambientes interiores y exteriores revelaron que el ARN del SARS-CoV-2 está presente en ambos ambientes, aunque en concentraciones más bajas en ambientes exteriores 38,63,64. Estos hallazgos sugieren que las actividades y exposiciones en las que el uso de mascarillas y el distanciamiento social son difíciles de mantener, como comer, beber o asistir a festivales de música, podrían representar un mayor riesgo de transmisión del COVID-19. Para mitigar estos riesgos, es fundamental considerar medidas de ventilación adecuadas y el uso de mascarillas, especialmente con la aparición de nuevas variantes preocupantes que son más transmisibles, como las variantes Delta (B.1.617.2) y Ómicron (B.1.1.529). Ante el levantamiento de las restricciones por COVID-19 en muchas zonas, se recomienda mantener el uso de mascarillas para mantener al mínimo la transmisión comunitaria del SARS-CoV-2 y prevenir futuros brotes de la enfermedad 5,21,26,65.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses económicos contrapuestos ni otros conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo se ha realizado con el apoyo financiero de la Junta de Castilla y León y del programa FEDER (proyectos CLU 2017-09, UIC315 y VA266P20).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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Ciencias Ambientales Número 196 SARS-CoV-2 ARN RT-qPCR secuenciación variantes preocupantes
Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire
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