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Quantifizierung und Charakterisierung des gesamten Genoms von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65053
Automatic Translation
1,2,3, 4,5,6, 3, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 4,5, 1,2
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben zu quantifizieren, um sie für abwasserbasierte epidemiologische Studien zu verwenden und das Expositionsrisiko gegenüber SARS-CoV-2 in Aerosolen in Innen- und Außenbereichen zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt auch einen gekachelten Amplikon-Long-Template-Sequenzierungsansatz für die Charakterisierung des gesamten SARS-CoV-2-Genoms.

Abstract

Die abwasserbasierte Epidemiologie hat sich in vielen Ländern zu einem vielversprechenden und wirksamen Überwachungssystem für SARS-CoV-2 und andere Infektionskrankheiten entwickelt. Der Prozess umfasst in der Regel die Abwasserkonzentration, die Nukleinsäureextraktion, die Amplifikation ausgewählter Genomsegmente sowie den Nachweis und die Quantifizierung des amplifizierten Genomsegments. Diese Methodik kann in ähnlicher Weise genutzt werden, um Infektionserreger wie SARS-CoV-2 in Luftproben nachzuweisen und zu quantifizieren. Ursprünglich ging man davon aus, dass sich SARS-CoV-2 vor allem durch engen persönlichen Kontakt mit Tröpfchen verbreitet, die von einer infizierten Person beim Sprechen, Niesen, Husten, Singen oder Atmen erzeugt werden. Eine wachsende Zahl von Studien berichtet jedoch über das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA in der Luft von Gesundheitseinrichtungen, was die Übertragung über die Luft als gangbaren Weg für das Virus etabliert. Diese Studie stellt eine Kombination etablierter Protokolle vor, um die Erkennung, Quantifizierung und Sequenzierung von Viren aus Abwasser- und Luftproben in der Umgebung zu erleichtern.

Introduction

Im Dezember 2019 trat eine neuartige Krankheit namens COVID-19 auf, die durch ein bisher unbekanntes Coronavirus, SARS-CoV-21, verursacht wurde. Die daraus resultierende globale Pandemie stellt eine große Herausforderung für klinische und öffentliche Gesundheitslabore weltweit dar, da eine große Anzahl von Personen Tests benötigt, um die Virusübertragung und -prävalenz in der Gemeinschaft genau zu bewerten. In vielen Regionen ist es jedoch wirtschaftlich nicht machbar, das erforderliche Testniveau zeitnah und räumlich umfassend zu erreichen 2,3. Derzeitige Surveillance-Systeme, die auf individueller klinischer Diagnostik basieren, stützen sich stark auf die Schwere der Symptome und die individuelle Berichterstattung sowie auf das Ausmaß, in dem sich diese Symptome mit bestehenden Krankheiten überschneiden, die in der Bevölkerung zirkulieren 4,5,6,7,8,9,10. Folglich trägt eine hohe Zahl asymptomatischer Fälle zu einer deutlichen Unterschätzung der Krankheitslast bei 7,11.

Aufgrund dieser Herausforderungen wurde die abwasserbasierte Epidemiologie (WBE) für die COVID-19-Überwachung als ergänzende Überwachungsstrategie vorgeschlagen. WBE wurde erstmals im Jahr 2001 beschrieben12 und wurde ursprünglich zur Aufspüren von Kokain und anderen illegalen Drogen verwendet13. Dieser Ansatz beruht auf der Annahme, dass es möglich ist, die Anfangskonzentration jeder Substanz zu berechnen, die im Abwasser stabil ist und vom Menschen ausgeschieden wird 8,12. WBE wurde in vielen Ländern erfolgreich als ergänzendes und effizientes Überwachungssystem für SARS-CoV-2 3,8,14,15,16 eingesetzt. Die meisten Methoden zum Nachweis menschlicher Viren in aquatischen Umgebungen folgen diesen Schritten: Konzentration, Nukleinsäureextraktion, Amplifikation des ausgewählten genomischen Segments (oder der ausgewählten Segmente) und Nachweis/Quantifizierung des amplifizierten genomischen Segments3.

Eine weitere wichtige Umgebung für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2 sind Luftproben. Ursprünglich ging man davon aus, dass SARS-CoV-2 hauptsächlich durch engen persönlichen Kontakt mit Atemtröpfchen aus Aerosolen übertragen wird, die von einer infizierten Person beim Sprechen, Niesen, Husten, Singen oder Atmen erzeugt werden17. Mehrere Studien berichteten jedoch über das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA in der Luft, insbesondere in Gesundheitseinrichtungen und anderen geschlossenen Räumen 18,19,20,21. Hinweise auf die Lebensfähigkeit von SARS-CoV-2 wurden in Luftproben gefunden, die in Innenräumen von Krankenhäusern und anderen geschlossenen Räumen entnommen wurden, wenn die Viruskonzentration ausreichend hoch war22,23,2 4. Studien im Freien haben im Allgemeinen keine Hinweise auf SARS-CoV-2 gefunden, außer in überfüllten Außenbereichen 21,25,26,27,28,29. Bisher ist die Übertragung von SARS-CoV-2 über die Luft als Übertragungsweg anerkannt30,31. Eine kürzlich durchgeführte Übersichtsstudie zeigt die Unterschiede zwischen dem Freien, wo das Risiko einer Übertragung über die Luft außerhalb von überfüllten Bereichen minimal ist, und Innenräumen, wo größere Risiken in schlecht belüfteten Umgebungen bestehen könnten, in denen starke Quellen (d. h. die Anzahl der infizierten Personen) vorhanden sein könnten. Eine kürzlich durchgeführte umfassende Übersichtsstudie hat die erheblichen Unterschiede zwischen den Risiken einer Übertragung über die Luft im Freien und in Innenräumen hervorgehoben, insbesondere in überfüllten Bereichen mit schlechter Belüftung. Die Studie zeigt, dass das Risiko einer Übertragung über die Luft in Außenumgebungen minimal ist, in denen ein größeres Luftvolumen für die Verdünnung und Ausbreitung von Viruspartikeln zur Verfügung steht32. Diese Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die Gesundheitspolitik und die Richtlinien im Zusammenhang mit COVID-19. Durch die Anerkennung der erheblichen Unterschiede bei den Übertragungsrisiken zwischen Innen- und Außenbereichen können politische Entscheidungsträger wirksamere Strategien entwickeln, um die Ausbreitung des Virus einzudämmen und die öffentliche Gesundheit zu schützen.

Es gibt eine Vielzahl von Methoden und Protokollen für den Nachweis, die Quantifizierung und die Sequenzierung von SARS-CoV-2 aus verschiedenen Umweltproben. Dieser Methodenartikel zielt darauf ab, eine Kombination etablierter Protokolle vorzustellen, die es Laboren mit unterschiedlichen Kapazitäten ermöglichen, den Umweltnachweis, die Quantifizierung und die Sequenzierung von Viren aus Abwasser- und Luftproben durchzuführen.

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Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden an anderer Stelle veröffentlicht und enthalten kleine Modifikationen gegenüber den ursprünglichen Methoden.

1. Abwassersammlung und Probenvorbehandlung

HINWEIS: Aufgrund der geringen Konzentrationen von SARS-CoV-2-RNA in Umweltproben ist die Durchführung eines Konzentrationsschrittes entscheidend für einen erfolgreichen Nachweis33,34,35. Hier wird die erste beschriebene Methode zum Nachweis von SARS-CoV-2 im Abwasserbeschrieben 36.

  1. Entnahme und Konzentration von Abwasserproben(n)
    1. Entnehmen Sie 1 l einer 24-Stunden-Mischwasserprobe. Lagern Sie die Probe bei 4 °C und fahren Sie innerhalb von 24 Stunden mit dem Protokoll fort.
    2. Homogenisieren Sie die Probe, indem Sie die Flasche vorsichtig schütteln. Sammeln Sie 70 ml in ein 100-ml-Zentrifugalröhrchen oder teilen Sie die Probe in zwei Zentrifugalröhrchen mit 50 ml auf.
    3. Spiken Sie 20 μl Mengovirus (3,2 x 103 Kopien/μl) auf 70 ml jeder Probe als interne Kontrolle des Konzentrationsprozesses. Alternativ können Sie 10 μl Mengovirus (3,2 x 103 Kopien/μl) in jedes 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
    4. Die Probe homogenisieren und 10 min bei 700 x g zentrifugieren, um große Partikel und Organismen (Pellets) zu entfernen.
    5. Verwenden Sie den resultierenden Überstand zur Konzentrierung mit Zentrifugal-Ultrafiltrationsgeräten mit einem Cutoff von 10 KDa, indem Sie bei 4.000 x g für 40 min bei 4 °C zentrifugieren. Das Konzentrat wird eluiert, indem es 40 Minuten lang bei 700 x g zentrifugiert und die Position des Ultrafiltrationsgeräts invertiert wird.
    6. Messen Sie das Volumen des resultierenden Konzentrats. Das Volumen ändert sich in Abhängigkeit von der Menge der Feststoffe in der Probe, die die Zentrifugalfilter verstopfen. In dieser Studie lagen die erhaltenen Konzentratvolumina zwischen 200 und 1.200 μl.
    7. Verwenden Sie das resultierende Konzentrat für die RNA-Extraktion mit einem kommerziellen Kit oder einer hauseigenen Methode. Für die in dieser Studie verwendeten Proben wird ein spezielles kommerzielles Kit für die virale RNA-Extraktion mit einem Elutionsvolumen von 50 μl verwendet.
    8. Messen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mit einem fluorometrischen RNA-Quantifizierungskit. Die extrahierte RNA wird in Aliquoten aufgeteilt und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C eingefroren.
      HINWEIS: Für jedes RNA-Isolierungsverfahren sollte eine Negativkontrolle der Isolierung (NCI) enthalten sein, die nur Puffer enthält, um eine mögliche Kontamination während der Extraktion zu erkennen.
  2. Entnahme von Luftproben mit einem Coriolis-Kompaktluftkeimsammler
    1. Wählen Sie eine Probenahmestrategie entsprechend dem Forschungsziel, indem Sie die Probenahmehäufigkeit und die Probenahmeorte definieren.
    2. Stellen Sie die Durchflussmenge am Luftkeimsammler ein (hier 50 l/min für 30 min). Bitte beachten Sie, dass eine Durchflussrate von mehr als 200 l/min die virale RNA abbauen kann, daher wird empfohlen, eine Durchflussrate unter 200 l/min zu verwenden.
    3. Legen Sie einen sterilen Kegel in den Luftkeimsammler, bevor Sie mit der Entnahme beginnen, indem Sie den Start pulsieren. Sobald die Probenahme abgeschlossen ist, geben Sie 5-15 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in den Kegel. Die Probe 15 s lang vorsichtig von Hand vortexen oder schütteln. Lagern Sie die Proben bis zu 24 h bei 4 °C oder bei -80 °C in Kryoröhrchen.
    4. Ein optionaler Konzentrationsschritt kann durchgeführt werden. Reinigen und dekontaminieren Sie die Zapfen nach jedem Experiment mit Bleichmittel.
    5. Extrahieren Sie RNA mit einem kommerziellen Kit oder einer internen Methode. Für die Proben in dieser Studie wird ein spezifisches kommerzielles Kit für die virale RNA-Extraktion mit einem Elutionsvolumen von 50 μl verwendet.
    6. Messen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mit einem fluorometrischen RNA-Quantifizierungskit. Die extrahierte RNA wird in Aliquoten aufgeteilt und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C eingefroren.
      HINWEIS: Für jedes RNA-Isolierungsverfahren sollte eine Negativkontrolle der Isolierung (NCI) enthalten sein, die nur Puffer enthält, um eine mögliche Kontamination während der Extraktion zu erkennen.

2. Quantifizierung von SARS-CoV-2-RNA mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

HINWEIS: Das folgende Protokoll entspricht dem CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR-Diagnosepanel37. Teilen Sie die Primer/Sondenmischung in mehrere Aliquots auf, um Gefrier- und Auftauzyklen zu vermeiden.

  1. Bereiten Sie den Reaktions-Mastermix für jedes Ziel vor (Mengovirus; SARS-CoV-2 [N1- und N2-Gen]) wie in Tabelle 1 in einer sauberen Haube im Reagenzien-Setup-Raum. Mischen Sie die Primer/Sondenmischung und das Enzym fünfmal durch Inversion. Alternativ können Sie die Mischung aus Primern und Sonden und das Enzym fünfmal mit einem Lichtimpuls verwirbeln.
    HINWEIS: Halten Sie alle Reagenzien während der Zubereitung und Verwendung kalt. Um Gefrier-Auftau-Zyklen zu minimieren, wird dringend empfohlen, Aliquoten einzufrieren.
  2. Schleudern Sie die Röhrchen herunter (1.000 x g für 15-30 s), um den Inhalt am Boden aufzufangen, und legen Sie die Röhrchen in ein kaltes Gestell oder auf Eis.
  3. Beschriften Sie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Ziel. In jedes Mikrozentrifugenröhrchen wird die Menge jedes benötigten Reagenzes gegeben (Volumen pro Reaktion multipliziert mit der Anzahl der Reaktionen einschließlich der erforderlichen Kontrollen). Durch Auf- und Abpipettieren mischen und 5 s zentrifugieren, um den Inhalt am Boden aufzufangen.
  4. Bewahren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Kühlregal auf und geben Sie 15 μl in Streifen-PCR-Röhrchen oder eine 96-Well-Platte in einem Kühlregal ab. Decken Sie die Platte ab und bringen Sie sie in den Bereich der Nukleinsäurehandhabung (bewahren Sie sie in einem Kühlgitter auf).
  5. Ein Aliquot der extrahierten RNA auftauen und 5 s lang vorsichtig vortexen. Pipettieren Sie 5 μl RNA (zusätzlich zu 5 μl Nicht-Template-Kontrolle [NTC], Negativkontrolle der Isolierung [NCI] und Positivkontrolle [PC]) in jede Reaktionsvertiefung oder jedes Röhrchen, das den zuvor hergestellten Mastermix enthält. Wechseln Sie die Handschuhe häufig nach Bedarf, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  6. Decken Sie die gesamte Reaktionsplatte(n) ab und wirbeln Sie sie vorsichtig vor. Zentrifugieren Sie (1.000 x g für 15-30 s) die Platte oder die PCR-Röhrchen.
  7. Starten Sie die 25-μl-RT-qPCR mit den folgenden Zyklusbedingungen: reverse Transkriptase bei 45 °C für 10 min; Polymeraseaktivierung bei 95 °C für 10 min; 45 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s; und Glühen/Verlängern bei 60 °C für 45 s.
  8. Berechnen Sie die Wiederherstellungseffizienz von Mengovirus-Kontrollen, wie von Conte et al.38 berichtet:
    Equation 1 × 100

3. Sequenzierungsvarianten im Abwasser und Datenanalyse

ANMERKUNG: Das beschriebene Protokoll ist ein modifiziertes Protokoll, das von Quick et al.39,40 erstellt wurde. Es verwendet zwei Sätze von Primern für die SARS-CoV-2-Genomamplifikation durch PCR-Kachelmethodik: ARTIC-Primer und VarSkip-Primer. Eine Kombination von Primern wird verwendet, um die beste Genomabdeckung zu gewährleisten und die Möglichkeit zu minimieren, dass neuartige Mutationen zum Versagen von Primern eines Typs führen. Im Allgemeinen ist das Protokoll in drei Teile unterteilt: reverse Transkription (RT) und Amplikongenerierung, Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek sowie Sequenzierung und Datenanalyse.

  1. Reverse Transkription und Amplikongenerierung
    1. Stellen Sie sicher, dass die Eingangsproben einen bekannten qPCR-Zyklusschwellenwert (Ct) aufweisen, um sie korrekt in PCR-Wasser zu verdünnen. Der Ct-Wert wird bei der Quantifizierung mit qPCR ermittelt. Die Verdünnungen sind wie folgt: Wenn der Ct-Wert 12-15 beträgt, verdünnen Sie die Proben im Verhältnis 1:100; wenn der Ct-Wert 15-18 beträgt, verdünnen Sie die Proben im Verhältnis 1:10; Wenn der Ct-Wert 18-35 beträgt, darf die Probe nicht verdünnt werden. Proben über einem Ct-Wert von 35 haben eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass sie nicht funktionieren.
    2. In einer PCR-Platte werden 16 μl jeder Probe an ihre Position auf der Platte pipettiert. Fügen Sie 4 μl Reverse Transkription (RT) Mastermix hinzu (5x). Decken Sie die Platte ab und starten Sie die PCR-Reaktion unter den folgenden Bedingungen: 25 °C für 2 Minuten, 55 °C für 20 Minuten und 95 °C für 1 Minute.
    3. Bereiten Sie 10 μM-Verdünnungen jedes Primer-Sets vor (ARTIC-Pool A und Pool B sowie VarSkip-Pool A und Pool B). Bereiten Sie den Mastermix für jeden Satz von Primern (ARTIC-Set A und B sowie VarSkip-Set A und B) vor, wie in Tabelle 2 dargestellt. Daraus entstehen vier Mastermixe.
    4. Auf einer neuen PCR-Platte werden 20 μl des Mastermixes in jede entsprechende Vertiefung pipettiert. Fügen Sie 5 μl der RT-Probe zu jeder Mischung hinzu.
      HINWEIS: Jede Probe enthält vier Reaktionsgemische: ARTIC-Pool A und B sowie VarSkip-Pool A und B.
    5. Decken Sie die Platte ab und starten Sie die PCR-Reaktion wie folgt: Polymeraseaktivierung bei 98 °C für 30 s; 35 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 15 s; und Glühen/Verlängern bei 65 °C für 4 min. Die Platte herunterschleudern (1.000 x g für 15-30 s). Kombinieren Sie die ARTIC-Reaktionspools und kombinieren Sie separat die VarSkip-Reaktionspools. Jede Probe enthält zwei 50-μl-Amplikonreaktionen.
    6. Geben Sie 50 μl Reagenz auf Perlbasis für die PCR-Aufreinigung in jede Vertiefung und mischen Sie die Vertiefung durch Pipettieren. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Mischen Sie das PCR-Reinigungsreagenz vor jedem Gebrauch kräftig, um die Kügelchen zu resuspendieren.
    7. Stellen Sie die Platte auf einen magnetischen Separationsständer und warten Sie, bis die Perlen ein Pellet gebildet haben und sich die Flüssigkeit geklärt hat (~5 min). Pipettieren und verwerfen Sie den Überstand. Bewahren Sie die PCR-Platte auf dem magnetischen Ständer auf.
    8. Halten Sie die PCR-Platte auf dem magnetischen Ständer und geben Sie 200 μl 80%iges Ethanol zu jeder Probe, ohne das Kügelchenpellet zu berühren. Entferne das Ethanol.
    9. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt. Lassen Sie die Platte auf dem magnetischen Ständer 30 s lang unbedeckt, damit das Ethanol verdampfen kann.
    10. Nehmen Sie die Platte vom magnetischen Ständer ab und geben Sie 15 μl Wasser in PCR-Qualität zu jeder Probe. Resuspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren. 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    11. Stellen Sie die Platte wieder auf den magnetischen Ständer und lassen Sie die Perlen pelletieren (2 min). Pipettieren Sie vorsichtig 15 μl des Überstandes von jeder Probe auf eine neue PCR-Platte.
    12. Messen Sie die Konzentration jeder Probe mit einem fluorometrischen RNA-Quantifizierungskit. Etwa 50 ng jeder Probe in 12,5 μl zum nächsten Schritt bringen. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Probe in PCR-Wasser.
  2. Vorbereitung der Bibliothek
    1. Geben Sie 1,75 μl Reaktionspuffer aus dem Illumina DNA-Bibliotheksvorbereitungskit und 0,75 μl Enzymmischung zu jeder Probe. Die Platte abdecken, kurz wirbeln und abschleudern (1.000 x g für 15-30 s). Bei 21 °C für 5 Minuten und bei 65 °C für 5 Minuten inkubieren.
    2. In einer neuen Platte werden 3 μl Wasser in PCR-Qualität für jede Probe auf eine neue PCR-Platte pipettiert. Fügen Sie 0,75 μl der vorbereiteten Proben, 1,25 μl Barcodes für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek und 5 μl T4-DNA-Ligase-Mastermix hinzu. Durch Pipettieren gut mischen, kurz schleudern (1.000 x g für 15-30 s) in einer Zentrifuge und bei 21 °C für 20 min und bei 65 °C für 10 min inkubieren.
      HINWEIS: Wenn Sie weniger als 25 Proben verwenden, verdoppeln Sie alle Volumina in diesem Schritt.
    3. Fassen Sie alle Proben zusammen, indem Sie 10 μl jeder Probe in dasselbe Röhrchen mit geringer Bindung geben. Nehmen Sie 480 μl zum nächsten Schritt.
    4. Geben Sie 192 μl Reagenz auf Perlbasis für die PCR-Aufreinigung in den Pool und mischen Sie es durch Pipettieren gut. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Stellen Sie das Röhrchen auf einen magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich der Überstand verzogen hat und sich ein Kügelchenpellet gebildet hat. Entfernen Sie den Überstand. Entferne den Schlauch vom magnetischen Ständer.
    6. 700 μl des kurzen Fragmentpuffers (SFB) zugeben und durch Pipettieren mischen. Stellen Sie es wieder auf den magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich das Pellet gebildet hat und die Flüssigkeit verschwunden ist (~5 min). Pipettieren Sie den Überstand heraus und entsorgen Sie ihn.
    7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt. Lassen Sie das Röhrchen auf dem magnetischen Ständer. Fügen Sie 100 μl 80%iges Ethanol hinzu, ohne die Perle zu berühren. Pipettieren Sie das Ethanol heraus und lassen Sie die Perle 30 s trocknen.
      HINWEIS: Lassen Sie die Perle nicht zu stark trocknen.
    8. Nehmen Sie das Röhrchen vom magnetischen Ständer und fügen Sie 35 μl Wasser in PCR-Qualität hinzu. Durch Pipettieren mischen und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Ständer und lassen Sie die Perle pelletieren und die Flüssigkeit klären. 35 μl des Überstandes in ein neues Röhrchen pipettieren.
    9. Messen Sie die RNA-Konzentration der gepoolten Bibliothek. Pipettieren Sie das Volumen, das benötigt wird, um eine Menge von 30-50 ng RNA zu erreichen, und füllen Sie es mit Wasser in PCR-Qualität, um ein Endvolumen von 30 μl zu erreichen.
    10. Bereiten Sie die Adapter-Ligationsreaktionsmischung vor: 30 μl der gepoolten Bibliothek, 5 μl Adaptermix II, 10 μl des Ligationsreaktionspuffers (5x) und 5 μl T4-DNA-Ligase. Durch Pipettieren und Schleudern mischen (1.000 x g für 15-30 s). 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    11. 20 μl des Reagenzes auf Perlbasis für die PCR-Aufreinigung zugeben und durch Pipettieren mischen. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    12. Legen Sie das Röhrchen auf den magnetischen Ständer und warten Sie, bis sich das Kügelchenpellet gebildet hat und der Überstand farblos geworden ist. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig heraus und entsorgen Sie ihn.
    13. Vom magnetischen Ständer nehmen und 125 μl SFB hinzufügen. Durch Pipettieren mischen und wieder auf den magnetischen Ständer stellen, um die Perlen zu trennen. Wenn die Flüssigkeit klar ist, pipettieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.
    14. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt. Lassen Sie das Röhrchen auf dem magnetischen Ständer 30 s lang geöffnet, damit ein Teil der übrig gebliebenen Flüssigkeit verdunstet ist.
    15. Nehmen Sie das Röhrchen vom magnetischen Ständer und fügen Sie 15 μl des Elutionspuffers hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und kurz schleudern (1.000 x g für 15-30 s). 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für 2 Min. auf den magnetischen Ständer stellen.
    16. Pipettieren Sie 15 μl des Überstandes in ein neues Röhrchen mit geringer Bindung. Dies ist die endgültige Bibliothek. Messen Sie die Konzentration mit einem fluorometrischen DNA-Quantifizierungskit.
      HINWEIS: Im nächsten Schritt werden 12 μL benötigt. Wenn die Konzentration sehr hoch ist und weniger als 12 μl der Bibliothek benötigt werden, füllen Sie bis zu 12 μl mit dem Elutionspufferreagenz.
  3. Laden und Sequenzieren von Durchflusszellen
    1. Setzen Sie die Durchflusszelle (R9.4.1) in das Echtzeit-DNA- und RNA-Sequenzierungsgerät ein.
    2. Bereiten Sie die Priming-Mischung vor, indem Sie 30 μl Flush Tether-Reagenz (FLT) in ein Röhrchen mit Flush Buffer (FB)-Reagenz geben. Vortex zum Mischen und Schleudern (1.000 x g für 15-30 s).
    3. Öffnen Sie die Abdeckung des Ansauganschlusses. Stellen Sie die Pipette mit einer 1.000-μl-Pipette auf 200 μl ein und stecken Sie die Spitze in den Priming-Port. Drehen Sie das Lautstärkeregler und erhöhen Sie die Lautstärke, bis die Flüssigkeit in der Spitze zu sehen ist. Werfen Sie die Spitze weg.
      HINWEIS: Drehen Sie das Rad nur so lange, bis einige μl Flüssigkeit in der Spitze zu sehen sind. Das Ziehen größerer Mengen könnte die Durchflusszelle beschädigen.
    4. Geben Sie langsam 800 μl der Priming-Mischung in den Priming-Port und achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen. Warten Sie 5 Minuten.
    5. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Bibliotheken für das Laden vor. Mischen Sie 37,5 μl des Sequenzierungspuffers, 25,5 μl des Ladepuffers und 12 μl der Bibliothek.
      HINWEIS: Mischen Sie den Ladepuffer vor dem Pipettieren. Die Kügelchen in diesem Reagenz setzen sich sehr schnell ab.
    6. Öffnen Sie die Anschlussabdeckung. Pipettieren Sie 200 μl der Priming-Mischung in den Priming-Port.
      HINWEIS: Beim Pipettieren in den Priming-Port bei geöffneter Abdeckungsöffnung werden kleine Tropfen aus der Probenöffnung kommen. Pipettieren Sie langsam genug, damit der Probenanschluss die Tropfen einziehen kann, ohne dass sie überlaufen.
    7. Bevor Sie die vorbereitete Bibliothek laden, mischen Sie sie gut durch Pipettieren. Verwenden Sie eine 100-μl-Pipette, die auf 75 μl eingestellt ist, und nehmen Sie die Bibliothek und die Pipette tropfenweise in den Probenanschluss. Berühren Sie den Anschluss nicht und warten Sie, bis jeder Tropfen in den Anschluss aufgenommen wurde, bevor Sie den nächsten Tropfen laden, um ein Überlaufen der Flüssigkeit zu vermeiden.
    8. Schließen Sie die Abdeckungsöffnung und die Ansaugöffnung. Öffnen Sie die Software und starten Sie das Sequenzierungsexperiment. Wählen Sie basecalling On aus. Für eine Bibliothek mit 96 gemultiplexten Proben reichen in der Regel 10-12 h Sequenzierung aus, um genügend Daten zu generieren.
      HINWEIS: Mit der Software kann man das Beispielblatt im .csv-Format einfügen. Für das Musterblatt sind folgende Daten erforderlich: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code und Kit. Die Durchflusszellen-ID (auf der Seite der Durchflusszelle angegeben) wird zusammen mit dem verwendeten Kit benötigt. Für das vorgeschlagene Protokoll sollte das LSK109-Kit ausgewählt werden.
  4. Analyse von Sequenzierungsdaten
    1. Fügen Sie die komprimierten fastq-Lesevorgänge in den wf-artic-Workflow41 ein. Führen Sie den Workflow separat mit zwei verschiedenen Primer-Schemata (ARTIC/V4.1 und NEB-VarSkip/v1a) aus. Zwei ". primertrimmed.rg.sorted.bam"-Dateien werden für jedes Beispiel erstellt.
    2. Führen Sie die BAM-Dateien mit dem Befehl "samtools merge"42 zu einer einzigen Datei zusammen. Fügen Sie die zusammengeführte BAM-Datei unter Beibehaltung der Standardeinstellungen in das Freyja-Tool ein, um relative Herkunftshäufigkeiten43 wiederherzustellen.
    3. Um eine FASTA-Datei zu erstellen, fügen Sie die zusammengeführte BAM-Datei mit den Standardeinstellungen44,45 in die Tools "samtools mpileup" und "ivar" ein. Laden Sie für den Aufruf der Mutation die FASTA-Datei in das Nextclade-Tool46,47.

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Representative Results

Die in Tabelle 3 zusammengefassten Ergebnisse zeigen Beispiele für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode. Abwasserproben wurden aus Kläranlagen in Spanien und Slowenien entnommen und wurden als positiv angesehen, wenn der Ct-Wert in mindestens zwei der drei Wiederholungen weniger als 40 betrug, wobei die Quantifizierung als gültig angesehen wurde, wenn der Ct-Wert eine Abweichung von weniger als 5 % aufwies. In Spanien und Portugal wurden Innenraum- und Außenluftproben entnommen, und es wurden die gleichen Regeln angewandt. Für die Luftproben wurden Duplikate verwendet, nicht Dreifache wie bei den Abwasserproben, da das Ziel der Studie darin bestand, SARS-CoV-2-RNA nachzuweisen und nicht zu quantifizieren. Darüber hinaus wurde ein RT-qPCR-Lauf nur dann als valide angesehen, wenn sich alle verwendeten Kontrollen (wie in diesem Protokoll beschrieben) wie erwartet verhielten und keine signifikanten Abweichungen in der Mengovirus-RNA-Kontrolle beobachtet wurden. Bei diesen Proben schwankte die Effizienz der Mengovirus-Rückgewinnung zwischen 13,7 % und 19,7 %. Die Hemmung wurde durch Verdünnung der zehnfachen und 100-fach extrahierten RNA und durch den Vergleich der resultierenden RT-qPCR-Ergebnisse sowie durch die Verwendung eines kommerziellen Kits untersucht. Die Anweisungen für jedes Inhibitionskontrollkit sollten wie von den Herstellern beschrieben befolgt werden.

Die Abwasserproben wiesen eine Standardabweichung von 1,91 % bis 13,98 % unter den Triplikaten auf und lagen zwischen 3,05 x 10 3 und 2,83 x 108 Genkopien/L. Die Luftproben lagen zwischen 6,17 x 103 und 5,48 x 109 mit einer Standardabweichung zwischen den Duplikaten zwischen 0,54 % und 10,95 %. Dies steht im Einklang mit früheren Studien 6,48,49,50.

Wie in diesem Protokoll beschrieben, wurden die Proben sequenziert, und ein Beispiel für drei sequenzierte Probenergebnisse ist in Tabelle 4 und Abbildung 1 zusammengefasst. In allen drei Stichproben wurde die Abstammungslinie BA.5.x vom Freyja-Tool als die am häufigsten vorkommende eingestuft (95,3 %, 95,4 % und 99,8 %).

Figure 1
Abbildung 1: Prävalenz der SARS-CoV-2-Linie in ausgewählten Abwasserproben. Die Abstammung wurde mit dem Freyja-Tool zugewiesen. Die Zusammenfassung der Prävalenzzahlen erreicht nicht unbedingt 100%, da einige der Daten nicht von ausreichender Qualität sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Reagenzien und Volumina, die jeweils zugegeben werden müssen, um den Mastermix für die SARS-CoV2-Quantifizierung mittels RT-qPCR herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Reagenzien und Volumina, die jeweils zugesetzt werden müssen, um den Mastermix zur Amplifikation der vollständigen SARS-CoV-2-Genome in den Proben herzustellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Zusammenfassung der RT-qPCR-Quantifizierungsergebnisse von SARS-CoV-2-RNA aus Abwasser- und Luftproben. Das N1-Gen wurde zur Quantifizierung und das N2-Gen zur Bestätigung (positiv oder negativ) verwendet. Die Ergebnisse sind in Kopien/L angegeben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Erkannte Mutationen und Prävalenz der Abstammungslinie. Die Abstammungslinien wurden mit dem Freyja-Tool und entsprechend den mit Nextclade gefundenen Mutationen von Interesse zugeordnet. Die Genomabdeckung für jede Probe wird angezeigt. Die Zusammenfassung der Prävalenzzahlen erreicht nicht unbedingt 100%, da einige der Daten nicht von ausreichender Qualität sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Der mikrobielle und virale Nachweis und die Quantifizierung mit (RT-)qPCR-Methoden haben aufgrund ihrer bemerkenswerten Sensitivität eine breite Akzeptanz gefunden. Diese Techniken stehen jedoch vor zahlreichen Herausforderungen bei der Analyse von Umweltproben. Abwasserproben enthalten eine Fülle von hemmenden Substanzen, die Messungen verzerren und irreführende Ergebnisse liefern können. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Präzision zu erhöhen, wurde ein komplexes Protokoll konzipiert, entworfen und implementiert. Dieses Protokoll wurde durch die Kombination von Protokollen aus der wissenschaftlichen Literatur und speziell auf die Einschränkungen der qPCR-Methoden zugeschnitten, indem in jeder Phase des Prozesses eine Reihe strenger Kontrollen eingeführt wurden. Durch die Integration dieser rigorosen Qualitätskontrollmaßnahmen bietet dieses Protokoll eine robuste Lösung für die Herausforderungen, mit denen qPCR-basierte Detektions- und Quantifizierungsmethoden in komplexen Umweltproben konfrontiert sind51,52. Die Negativkontrolle der Isolierung (NCI) und die Non-Template-Kontrolle (NTC) sind wesentliche Instrumente, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination während der RNA-Extraktion und der RT-qPCR-Reaktion zu bewerten. Darüber hinaus bietet die Integration von Mengovirus-Kontroll-RNA ein entscheidendes Mittel zur Bewertung der Variabilität zwischen den Proben sowie der Effizienz des Konzentrationsschritts und der hemmenden Wirkung von Wirkstoffen, die in komplexen Umweltproben vorhanden sind. In jede RT-qPCR-Reaktion müssen Positivkontrollen einbezogen werden, um die Wirksamkeit des Amplifikationsprozesses zu bestätigen. Es ist wichtig, jeden Schritt des Protokolls sorgfältig zu überwachen, einschließlich der Lager- und Verarbeitungszeit der Proben. Der Abbau der Proben kann durch die Temperatur und die komplexe Zusammensetzung des Abwassers beeinflusst werden, so dass es unerlässlich ist, die Proben bei einer Temperatur von 4 °C zu lagern und innerhalb von 24 h zu verarbeiten. Durch die Einhaltung dieser strengen Qualitätskontrollmaßnahmen können Forscher und Mitarbeiter des öffentlichen Gesundheitswesens Umweltproben sicher und genau analysieren, um wichtige Erkenntnisse über mikrobielle und virale Populationen zu gewinnen und die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die menschliche Gesundheit besser zu verstehen48.

Die Auswahl von RNA-Zielen für den SARS-CoV-2-Nachweis ist ein kritischer Faktor, der sich auf die Sensitivität von RT-qPCR-Assays auswirken kann. In dieser Studie bewerteten die Autoren die RdRp-, E-, N1- und N2-Ziele und stellten fest, dass die RdRp- und E-Assays eine geringere Sensitivität aufwiesen als die N1- und N2-Assays, was mit früheren Untersuchungen übereinstimmt53. Die N1- und N2-Assays verwenden Doppelquencher-Sonden, die nachweislich ihre Sensitivität in (RT-)qPCR-Assays erhöhen54. Diese Gründe führten zu der Entscheidung, N1 zur Quantifizierung und N2 zur Bestätigung des Vorhandenseins von RNA zu verwenden, um Zweifel auszuräumen, wenn sehr niedrige Konzentrationen gefunden werden. Die beobachteten Diskrepanzen zwischen den RT-qPCR-Zielen wurden zuvor berichtet36.

Mehrere Studien haben ähnliche Protokolle verwendet und über den erfolgreichen Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2-RNA im Abwasser während der anhaltenden COVID-19-Pandemie berichtet 6,48,49,55,56. Die berichteten SARS-CoV-2-RNA-Konzentrationen stimmen mit den in dieser Studie und im Protokoll 48,50,55 berichteten überein. Einige dieser Studien haben den Zusammenhang zwischen aktiven Fällen und den Konzentrationen von RT-qPCR-Zielgenen, insbesondere N1 und N2,untersucht 6,36,49,50,55,57,58,59. Um die Variabilität der erhaltenen Genkonzentrationen zu verringern, wurde vorgeschlagen, die experimentellen Konzentrationen mit der Flussrate zum Zeitpunkt der Probenahme zu multiplizieren, um die anfängliche Viruslast zu erhalten36. Dieser Ansatz wurde in das VATar COVID-19-Projekt in Spanien integriert, ein nationales Überwachungssystem für COVID-19 im Abwasser60.

In der nächsten Phase der COVID-19-Studien zur abwasserbasierten Epidemiologie (WBE) haben Forscher versucht, SARS-CoV-2-Mutationen im Abwasser nachzuweisen, um die Zirkulation besorgniserregender Varianten innerhalb von Gemeinschaften abzuschätzen. Frühere Studien haben eine starke Korrelation zwischen den im Abwasser identifizierten Varianten und den gleichzeitig in der Bevölkerung vorhandenen Varianten gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die abwasserbasierte Überwachung als wertvolles Instrument zur Verfolgung der Ausbreitung der SARS-CoV-2-Varianten dienen könnte61,62. WBE hat sich bei der Überwachung von SARS-CoV-2 als vielversprechend erwiesen und kann für die Entwicklung zukünftiger Überwachungsstrategien für Pandemien verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich in den frühen Stadien einer Pandemie, wenn es nur wenige Einzeltests gibt und viele Fälle asymptomatisch sein können, und hat eine ergänzende Strategie zur klinischen Überwachung. Daher kann WBE besonders an Orten mit geringer wirtschaftlicher Kapazität nützlich sein, die sich andere, teurere Überwachungsstrategien nicht leisten können. Die beschriebene Methode kann leicht an andere Viren angepasst werden, die in Zukunft für die Überwachung relevant sein könnten.

Die Ergebnisse von Luftproben in Innen- und Außenumgebungen zeigten, dass SARS-CoV-2-RNA in beiden Umgebungen vorhanden ist, wenn auch in geringeren Konzentrationen in Außenumgebungen 38,63,64. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Aktivitäten und Expositionen, bei denen das Tragen von Masken und die soziale Distanzierung schwer einzuhalten sind, wie Essen, Trinken oder der Besuch von Musikfestivals, ein höheres Risiko für die Übertragung von COVID-19 darstellen könnten. Um solche Risiken zu mindern, ist es von entscheidender Bedeutung, geeignete Belüftungsmaßnahmen und die Verwendung von Masken in Betracht zu ziehen, insbesondere angesichts des Auftretens neuer besorgniserregender Varianten, die leichter übertragbar sind, wie die Delta- (B.1.617.2) und Omikron-Varianten (B.1.1.529). Angesichts der Aufhebung der COVID-19-Beschränkungen in vielen Bereichen wird empfohlen, die Verwendung von Masken beizubehalten, um die Übertragung von SARS-CoV-2 in der Bevölkerung auf ein Minimum zu beschränken und zukünftige Ausbrüche der Krankheit zu verhindern 5,21,26,65.

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Disclosures

Die Autoren haben keine konkurrierenden wirtschaftlichen Interessen oder sonstige Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Regionalregierung von Kastilien und León und des ELDER-Programms (Projekte CLU 2017-09, UIC315 und VA266P20) durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19 Oxford Nanopore EXP-AMII001 Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit Qiagen 28000-50 RNA extraction kit
AMPure XP Beckman Coulter A63880 PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon Panel IDT 10011442 SARS-CoV-2 genome amplification
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S Library preparation
CENTRICON PLUS­70 10KDA. Fisher Scientific 10296062 Concentration filters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLER Bertin Technologies 083-DU001 Air sampler
Duran laboratory bottles Merck Z305200-10EA Sampling Bottles
Flow Cell (R9.4.1) Oxford Nanopore FLO-MIN106D Sequencing
General labarotory consumables (tubes, qPCR plates, etc)
Ligation Sequencing Kit Oxford Nanopore SQK-LSK109 Sequencing
LunaScript RT SuperMix Kit NEB E3010  cDNA synthesis
Mengovirus extraction control Kit Biomérieux KMG Concentration control
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes Thermofisher 5011-0012 Sample storage
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-free Oxford Nanopore EXP-NBD104 Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB E7595 DNA repair
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer Mixes NEB E7658 SARS-CoV-2 genome amplification
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer NEB B6058S Sequencing 
Phosphate buffered saline Merck P4474 Collection buffer
Phosphate-buffered saline (PBS, 1X), sterile-filtered Thermofisher J61196.AP Elution of air samples
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix NEB M0494S hot start DNA polymerase
Qubit RNA HS Assay Kit Thermofisher Q32852 RNA quantitation
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe Kit IDT 10006713 Primer-Probe mix and qPCR positive control
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master Mix Thermofisher A15299 RT-qPCR kit

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References

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