Summary
Этот протокол обеспечивает быстрый метод определения совместимости и несовместимости пыльцы у сортов цитрусовых.
Abstract
Цитрусовые используют самонесовместимость на основе S-РНКазы для отказа от самопыльцы и, следовательно, нуждаются в близлежащих деревьях-опылителях для успешного опыления и оплодотворения. Однако определение подходящих сортов для использования в качестве опылителей является трудоемким процессом. Чтобы решить эту проблему, мы разработали быстрый метод идентификации совместимых с опылением сортов цитрусовых, который использует электрофорез в агарозном геле и окрашивание анилиновым синим. Совместимость пыльцы определяется на основе идентификации S-генотипов путем выделения общей ДНК и проведения анализов генотипирования на основе ПЦР с конкретными праймерами. Дополнительно стайлы собирают через 3-4 дня после ручного опыления, и проводят окрашивание анилиновым синим. Наконец, состояние роста пыльцевых трубок наблюдается с помощью флуоресцентного микроскопа. Совместимость и несовместимость пыльцы можно установить, наблюдая за тем, является ли рост пыльцевой трубки нормальным или подавленным соответственно. Благодаря своей простоте и экономичности этот метод является эффективным инструментом для определения пыльцевой совместимости и несовместимости различных сортов цитрусовых для установления групп несовместимости и взаимосвязей несовместимости между различными сортами. Этот метод предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей, и, таким образом, облегчает создание новых садов и выбор подходящих родителей для селекционных программ.
Introduction
Самонесовместимость (СИ) является генетически контролируемым механизмом, присутствующим примерно у 40% покрытосеменных видов. В этом процессе пестик отторгает пыльцу растения с тем же генотипом SI и, таким образом, препятствует самооплодотворению 1,2. Ma jia pummelo — местный сорт в провинции Цзинагсу, Китай, с превосходными качествами крупных розовых плодов, богатым содержанием сока, кисло-сладким вкусом и толстой кожурой3. Несмотря на то, что СИ способствует ауткроссингу, он отрицательно влияет на урожайность и качество плодов4 и требует подходящих деревьев-опылителей с различными генотипами СИ для надежных темпов завязывания плодов и высоких урожаев. В настоящее время существует два основных типа СИ: спорофитная самонесовместимость (SSI), представленная Brassicaceae, и гаметофитная самонесовместимость (GSI), представленная Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae и Solanaceae 5,6,7,8.
Цитрусовые являются одной из самых важных фруктовых культур в мире. Система GSI на основе S-РНКазы содержится во многих образцах цитрусовых и отрицательно влияет на скорость завязывания плодов9. В этой системе SI контролируется локусом S, одним полиморфным локусом с двумя комплексными аллелями, которые несут S-детерминанты пестика и S-детерминанты пыльцы 7. Женский детерминант — S-рибонуклеаза (S-РНКаза), а мужской — F-бокс S-локуса (SLF)7. Клетки пестика секретируют белки S-РНКазы. Несобственные S-РНКазы распознаются белками SLF, что приводит к убиквитинированию и деградации несобственных S-РНКаз путем протеасомы 26S. Напротив, собственные S-РНКазы способны накапливать и ингибировать рост пыльцевой трубки (PT), поскольку они уклоняются от белков SLF и, следовательно, предотвращают убиквитинизацию10,11,12,13.
Здесь мы сообщаем о методе in vivo, который полезен для идентификации S-генотипов и степеней совместимости и несовместимости пыльцы. Протокол включает в себя извлечение общей ДНК из листьев и прогнозирование S-генотипа с использованием S-специфических праймеров. Кроме того, окрашивание анилиновым синим цветом и флуоресцентная микроскопия с последующим ручным опылением свидетельствуют о степени совместимости и несовместимости. Процедура опыления semi in vivo, которая включает ручное опыление цветов в лаборатории14,15, также была адаптирована для оценки степеней самосовместимости и несовместимости. Тем не менее, мы также использовали полевое опыление с последующим упаковыванием цветов в мешки, чтобы избежать загрязнения нежелательной пыльцой, чтобы пыльцевые трубки развивались в естественных условиях. Этот протокол прост и понятен и предоставляет информацию, необходимую для успешного выбора подходящих деревьев-опылителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка к окрашиванию анилиновым синим
- Подготовьте для эксперимента следующие реагенты и инструменты: кисть для опылителей, пинцет, карандаш, сульфатную бумагу, мешок для опыления, пакеты с застежкой-молнией, канцелярские скрепки, формальдегид, ледяную уксусную кислоту, абсолютный этанол, центрифужные трубки, щипцы, капельницы для клея, предметные стекла, покровные стекла, скальпели и полиэтиленгликоль.
- Приготовьте среду для проращивания in vitro, содержащую 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 и 15% сахарозы. Отрегулируйте pH до 6,0-6,2 с помощью KOH. Используйте магнитную мешалку, так как PEG-4,000 трудно растворить.
- Приготовьте фиксирующий раствор Карнуа, представляющий собой абсолютный этанол и ледяную уксусную кислоту, смешанные в соотношении 3:1. Приготовьте фиксирующий раствор FAA, который состоит из 40% формальдегида, 80% этанола и ледяной уксусной кислоты (1:8:1). Приготовьте 4 М гидроксида натрия (NaOH) и раствор анилинового синего, который представляет собой 0,1% анилинового синего в 0,1 М K3PO4. Используйте янтарную бутылку для хранения раствора анилинового синего, потому что он чувствителен к свету.
2. Сбор пыльцы
- Заранее знайте период цветения экспериментальных деревьев (Ma jia pummelo в этом исследовании). Соберите зрелые нераскрывшиеся цветки от начала периода цветения до пиковой стадии цветения, и положите их в пакет с застежкой-молнией. Цветы можно хранить при температуре 4 °C в холодильнике в течение 24 часов.
- Отнесите цветы в лабораторию. Используйте пинцет, чтобы собрать пыльники, и поместите их в чашку Петри, содержащую фильтровальную бумагу. Собирают пыльники от 20 до 30 цветков.
- Чашку Петри, содержащую пыльники, поместить в духовку с температурой 28 °C на 24 часа, пока пыльцевые зерна не высохнут. Подробную информацию об организации цветов см. в Hu et al.9.
- Поместите высушенную пыльцу в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Храните пыльцу в герметичном пакете с застежкой-молнией, содержащем меняющий цвет силикагель (влагопоглотитель). Закройте пакет, и пометьте пакет названием сорта пыльцы и датой хранения. Высушенную пыльцу можно хранить в холодильнике при температуре -20 °C в течение 96 недель16.
3. Тест на прорастание пыльцы in vitro
- Налейте 300 мкл жидкой среды в чашку для культивирования клеток или крышку центрифужной пробирки объемом 2 мл и равномерно посыпьте пыльцу с помощью щетки для опыления. Инкубируют пыльцу при 28 °C в увлажненной темной среде в течение 12 часов.
- Снимите верхний 1 мм наконечника наконечника пипетки объемом 1 000 мкл. С помощью пипетки поглотите пыльцу с небольшим количеством культурального раствора и переместите ее в центр предметного стекла микроскопа. Накройте его покровным стеклом. Наблюдайте за образцом с помощью перевернутого микроскопа, используя 10-кратный объектив.
- Выполните три независимые репликации, используя примерно одинаковую плотность пыльцы для каждой реплики17. Визуально управляйте количеством пыльцы, убедившись, что вся чашка Петри покрыта пыльцой и что каждая чашка Петри имеет почти равное количество пыльцы.
- Пророщенная пыльца образует пыльцевую трубку длиной примерно в два раза больше ее диаметра. Рассчитайте коэффициент прорастания по 20 полям зрения, что дает процент проросшей пыльцы во всех пыльцевых полях.
4. Опыление
- Выбирайте для опыления солнечный день без ветра. Выберите 10 полностью развитых бутонов, которые вот-вот раскроются, осторожно снимите лепестки и позаботьтесь о том, чтобы не повредить их.
- Используйте щетку для опыления, чтобы распространить достаточное количество жизнеспособной пыльцы на поверхность рыльца, и следите за тем, чтобы не повредить пестик. Для самоопыления используйте пыльцу того же растения/сорта. Для перекрестного опыления используют пыльцу растения с другим генотипом.
- Накройте опыляемые цветы сульфатным бумажным пакетом. Используйте канцелярскую скрепку, чтобы запечатать пакет и предотвратить опыление генотипически различными пыльцами.
- Напишите на этикетке название вида, а также количество и время опыления. Повесьте этикетку на ветки возле опыляемых цветков.
5. Отбор проб, фиксация и консервация
- Снимите пакеты для опыления примерно через 3-4 дня после опыления, а опыляемые цветы соберите в пакеты с застежкой-молнией.
- Немедленно удалите лепестки, цветоложи и завязи с цветков и погрузите сросшиеся в стигмы рыльца в центрифужную пробирку, содержащую свежеприготовленный фиксирующий раствор. Инкубируйте рыльца и стигмы в фиксирующем растворе в течение ночи при температуре 4 °C.
- На следующий день откажитесь от фиксирующего раствора и промойте рыльца и укладки два-три раза в 95% этаноле.
- Перенесите стили в 70% раствор этанола. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор. Стили на этом этапе можно хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 месяцев.
6. Окрашивание анилиновым синим цветом
- Промойте образцы стиля, хранящиеся в 70% этаноле, дистиллированной водой три-четыре раза. Погрузить в раствор NaOH 4 М, запечатать и инкубировать на водяной бане с температурой 65 °C в течение 60 минут. На этом этапе цвет стиля меняется с желто-белого на оранжево-красный.
- Замочите стили в дистиллированной воде на 30 минут. Откажитесь от дистиллированной воды и промойте стили дистиллированной водой три-четыре раза или до тех пор, пока цвет стиля не станет желтым.
- Поместите образец в пробирку объемом 10 мл, добавьте анилиновый синий до тех пор, пока образец не будет погружен, и красьте в течение 12 часов в темноте.
- Наблюдайте за ростом пыльцевой трубки с помощью флуоресцентного микроскопа.
7. Флуоресцентная микроскопия
- Перед наблюдением за образцами поместите предметное стекло на плоский стол и добавьте две-три капли полиэтиленгликоля на поверхность предметного стекла.
- Смойте стиль с дистилляцией. С помощью скальпеля разделите его на две половинки вдоль продольной оси. Положите одну половину стиля на предметное стекло и накройте покровным стеклом.
- Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа над апертурой и визуализируйте с помощью 10-кратного объектива. Используйте фильтр DAPI (возбуждение: 325-375 нм; излучение: 435-485 нм). Соблюдайте пять стилей для каждого типа опыления. Наблюдайте за ростом пыльцевой трубки.
8. Идентификация S-генотипа на основе ПЦР
- Извлеките геномную ДНК из образца стигмы, используя методCTAB 18.
- Собранные листья поместите в центрифужную пробирку объемом 2 мл и заморозьте в жидком азоте. Приготовьте буфер HCl:EDTA:NaCl:H2O в соотношении 1:1:3:5 и смесь хлороформного изоамилового спирта в соотношении 24:1
- Добавьте 10 мл приготовленного буфера, 0,2 г CTAB и 200 мкл меркаптоэтанола в центрифужную пробирку объемом 50 мл и поставьте их на водяную баню при 65 °C на 5 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и прозрачным.
- Положите лезвия в ступку, добавьте замороженные образцы, добавьте жидкий азот и измельчите. Поместите измельченный образец в центрифужную пробирку объемом 2 мл, добавьте 600 мкл смеси CTAB, поставьте на водяную баню при 65 °C на 60 минут и перемешивайте вверх дном каждые 30 минут.
- Добавьте 700 мкл смеси хлороформного изоамилового спирта (24:1) и перемешивайте вверх дном в течение 10 мин. Центрифугу при 24 °C при 12 000 x g в течение 10 мин, пипетку надосадочную жидкость и переложить в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 60 мкл 5 М раствора NaCl и 1 мл абсолютного этанола и перемешайте вверх дном. Замораживание при -20 °C в течение 30 мин и центрифуга при 24 °C и 9 000 x g в течение 5 мин.
- Надосадочную жидкость выбросить, добавить 1 мл 70% раствора этанола и оставить при комнатной температуре на 1-2 часа. Центрифугу при 24 °C, 9 000 x g в течение 5 мин, удалить надосадочную жидкость, отспирировать излишки раствора этанола и высушить на воздухе в течение 5 мин.
- Добавьте 100 мкл стерильной воды для растворения, измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра и заморозьте в морозильной камере с температурой -4 °C для длительного хранения.
- Настройте реакционную систему ОТ-ПЦР. Приготовьте следующую реакционную смесь для 10 мкл, содержащую 5 мкл 2x PCRMix, по 0,25 мкл прямого и обратного праймера, 1 мкл ДНК (100 нг/мкл) и 3,5 мкл H2O.
- Настройте программу ПЦР в соответствии с таблицей 1. Программа ПЦР для всех изоформ составляла 95 °C в течение 5 мин 32x (95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 мин) и 72 °C в течение 5 мин. Разделите продукты на 1,5% TAE-агарозные гели и сфотографируйте9. Проверьте указанный S-генотип с помощью геномной ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проведенных здесь экспериментов отбирали зрелые цветки, собирали пыльники, сушили в печи и проращивали пыльцу при 28°С в течение 12 часов. Жизнеспособность пыльцы и скорость прорастания были количественно определены, как показано на рисунке 1.
Цитрусовые опыляли вручную, а совместимость и несовместимость пыльцы оценивали с помощью окрашивания анилиновым синим цветом и флуоресцентной микроскопии. Совместимая пыльца может прорастать на поверхности рыльца и образовывать нормальную пыльцевую трубку, которая может расти и в конечном итоге приводить к оплодотворению в яичнике. Напротив, несовместимые пыльцевые трубки росли примерно через две трети стиля, а затем перестали расти (рис. 2).
Для идентификации S-генотипа из растения была выделена общая ДНК. На основе последовательности S-локуса были разработаны специфические праймеры, которые были полезны для амплификации части S-локуса в ПЦР-реакциях. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Были обнаружены усиленные полосы (от 500 до 1000.н.). Идентифицирован соответствующий S-генотип (рис. 3). С помощью этого метода мы идентифицировали S-генотипы 63 ресурсов зародышевой плазмы паммело7. С помощью этого метода наша группа идентифицировала 21 S-гаплотип у разных видов цитрусовых19 (табл. 2).
Рисунок 1: Разные скорости прорастания пыльцы. Прорастание и рост пыльцы. (A) Жизнеспособная пыльца имеет более высокую скорость прорастания, и можно вырастить нормальную пыльцевую трубку. (B) Нежизнеспособная или менее жизнеспособная пыльца имеет гораздо меньшую скорость прорастания, и немногие пыльцевые трубки могут расти. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Флуоресцентные микроскопические изображения пыльцевых трубок в пестиках после опыления. (A) Самосовместимый пестик с многочисленными растущими пыльцевыми трубками. (B) Самонесовместимый пестик с остановкой роста пыльцевой трубки в стиле. Сокращения: Pt = пыльцевая трубка; vb = сосудистый пучок. Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Специфическая амплификация гена S-РНКазы от Ma jia pummelo. После ПЦР-амплификации и гель-электрофореза было обнаружено, что две амплифицированные полосы S10 и S16 были самыми яркими. Эти данные указывают на то, что генотип Ma jia pummelo был S10 и S16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Реакционная система, используемая для идентификации S-генотипа на основе ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Список праймеров для генотипов 21 S в цитрусовых, идентифицированных нашей группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В плодовых культурах как партенокарпия, так и SI являются важными признаками, потому что они прокладывают путь к бессемянным плодам - черта, которая высоко ценится потребителями. Самонесовместимость способствует отторжению самопыльцы и, таким образом, предотвращает инбридинг20. Среди цитрусовых паммело является самонесовместимым сортом7. Почти 40% всех видов покрытосеменных проявляют SI21. Эта черта препятствует завязыванию плодов, снижает урожайность и приносит огромные экономические потери производителям. Чтобы решить эту проблему, фермеры включают деревья-опылители в свои сады. Однако выбор подходящих деревьев-опылителей — сложная задача, требующая трудоемких лабораторных экспериментов. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали быстрый метод идентификации генотипов СИ и определения совместимости и несовместимости пыльцы различных сортов цитрусовых, чтобы облегчить точный выбор деревьев-опылителей. Кроме того, жизнеспособность пыльцы и скорость прорастания также могут быть определены с использованием метода in vitro , описанного в этом протоколе.
Имеются некоторые сообщения об определении генотипов SI и само(не)совместимости и меж(не)совместимости с использованием комбинации различных методов у японской сливы и абрикоса22,23. Разработка S-специфических праймеров опирается на идентификацию S-генотипа. В цитрусовых транскриптомный анализ стигмы и пыльцы из 64 образцов пумело выявил девять S-РНКаз, специфически экспрессируемых в стилях, и один вариант S-РНКазы. Еще 12 пар S-специфических праймеров были разработаны позже в цитрусовых Liang et al.7 и Wei et al.19. Однако по сравнению с грушей и яблоками в цитрусовых4 было выявлено меньше генотипов S. Идентификация S-генотипов на основе ПЦР является критически важным шагом, поскольку она обеспечивает основу для совместимых/несовместимых комбинаций. У этого протокола также есть некоторые ограничения. S-генотипы некоторых сортов цитрусовых не могут быть идентифицированы с помощью этого метода. Это открытие указывает на необходимость дальнейшего расширения библиотеки S-генотипа в цитрусовых. Кроме того, S-специфические праймеры не могут различать S-генотипы сортов с очень похожими S-последовательностями и, таким образом, неспецифически амплифицировать сходные S-последовательности.
В целом, благодаря своей экономичности и простоте использования, этот метод является эффективным инструментом для определения совместимости и несовместимости пыльцы для разных сортов цитрусовых. Этот протокол может быть использован для выбора подходящих деревьев-опылителей и в программах селекционных исследований. Его можно применять к нескольким видам из семейства рутовых (например, Citrus trifoliata и Fortunella japonica) для выбора деревьев-опылителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что им нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект был финансово поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
