Summary
Este protocolo proporciona un método rápido para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen en cultivares de cítricos.
Abstract
Los cítricos utilizan la autoincompatibilidad basada en S-RNasa para rechazar el autopolen y, por lo tanto, requieren árboles polinizadores cercanos para una polinización y fertilización exitosas. Sin embargo, la identificación de variedades adecuadas para servir como polinizadores es un proceso que requiere mucho tiempo. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método rápido para identificar cultivares de cítricos compatibles con la polinización que utiliza electroforesis en gel de agarosa y tinción de azul de anilina. La compatibilidad del polen se determina en función de la identificación de genotipos S mediante la extracción de ADN total y la realización de ensayos de genotipado basados en PCR con cebadores específicos. Además, los estilos se recolectan 3-4 días después de la polinización manual y se realiza la tinción de azul de anilina. Finalmente, el estado de crecimiento de los tubos polínicos se observa con un microscopio de fluorescencia. La compatibilidad e incompatibilidad del polen se puede establecer observando si el crecimiento del tubo polínico es normal o suprimido, respectivamente. Debido a su simplicidad y rentabilidad, este método es una herramienta eficaz para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen de diferentes variedades de cítricos para establecer grupos de incompatibilidad y relaciones de incompatibilidad entre diferentes cultivares. Este método proporciona información esencial para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados y, por lo tanto, facilita el establecimiento de nuevos huertos y la selección de padres apropiados para los programas de reproducción.
Introduction
La autoincompatibilidad (IS) es un mecanismo genéticamente controlado presente en aproximadamente el 40% de las especies de angiospermas. En este proceso, el pistilo rechaza el polen de una planta con el mismo genotipo SI y, por lo tanto, impide la autofertilización 1,2. Ma jia pummelo es una variedad local en la provincia de Jinagsu, China, con las excelentes cualidades de fruta grande y rosada, un rico contenido de jugo, un sabor agridulce y una cáscara gruesa3. Aunque la IS promueve el cruzamiento, afecta negativamente el rendimiento y la calidad de las frutas4 y requiere árboles polinizadores adecuados con genotipos IS distintos para tasas confiables de cuajado de frutos y altos rendimientos. En la actualidad, hay dos tipos principales de SI, la autoincompatibilidad esporofítica (SSI), representada por Brassicaceae, y la autoincompatibilidad gametofítica (GSI), representada por Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae y Solanaceae 5,6,7,8.
Los cítricos son uno de los cultivos frutales más importantes del mundo. El sistema GSI basado en S-RNasa se encuentra en muchas accesiones de cítricos e influye negativamente en la tasa de cuajado de frutos9. En este sistema, el SI está controlado por el locus S, un único locus polimórfico con dos alelos complejos que transportan determinantes de pistilo S y determinantes de polen S 7. El determinante femenino es la S ribonucleasa (S-RNasa), y el determinante masculino es el locus S F-box (SLF)7. Las células del pistilo secretan proteínas S-RNasa. Las S-RNasas no propias son reconocidas por las proteínas SLF, lo que conduce a la ubiquitinación y degradación de las S-RNasas no propias por la vía del proteasoma 26S. En contraste, las auto-RNasas S son capaces de acumular e inhibir el crecimiento del tubo polínico (PT) porque evaden las proteínas SLF y, por lo tanto, se les impide la ubiquitinzación10,11,12,13.
Aquí, informamos una técnica in vivo que es útil para identificar genotipos S y grados de compatibilidad e incompatibilidad del polen. El protocolo consiste en extraer ADN total de las hojas y predecir el genotipo S utilizando cebadores específicos de S. Además, la tinción con azul de anilina y la microscopía de fluorescencia seguida de polinización manual proporcionan evidencia del grado de compatibilidad e incompatibilidad. El procedimiento de polinización semi in vivo, que consiste en la polinización manual de flores en el laboratorio14,15, también ha sido adaptado para evaluar los grados de autocompatibilidad e incompatibilidad. Sin embargo, también hemos utilizado la polinización de campo seguida del embolsado de flores para evitar la contaminación del polen no deseado para permitir que los tubos de polen se desarrollen en condiciones naturales. Este protocolo es simple y directo y proporciona la información necesaria para la selección exitosa de árboles polinizadores adecuados.
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Protocol
1. Preparación para la tinción de azul de anilina
- Prepare los siguientes reactivos y herramientas para el experimento: un pincel polinizador, pinzas, un lápiz, papel sulfato, una bolsa de polinización, bolsas con cierre hermético, clips, formaldehído, ácido acético glacial, etanol absoluto, tubos de centrífuga, pinzas, goteros de pegamento, portaobjetos, cubreobjetos, bisturís y polietilenglicol.
- Preparar un medio de germinación in vitro que contenga 0,02% de MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% de Ca(NO 3)2, 0,01% deH3 BO 3, 20% de PEG-4000 y 15% de sacarosa. Ajuste el pH a 6.0-6.2 con KOH. Use un agitador magnético ya que PEG-4,000 es difícil de disolver.
- Prepare la solución fijadora de Carnoy, que es etanol absoluto y ácido acético glacial mezclados en una proporción de 3: 1. Prepare la solución de fijación FAA, que es 40% de formaldehído, 80% de etanol y ácido acético glacial (1: 8: 1). Prepare 4 M de hidróxido de sodio (NaOH) y solución de azul de anilina, que es 0.1% de azul de anilina en 0.1 M K3PO4. Use una botella de color ámbar para almacenar la solución azul de anilina porque es sensible a la luz.
2. Recolección de polen
- Conozca el período de floración de los árboles experimentales (Ma jia pummelo en este estudio) de antemano. Recoja flores maduras sin abrir desde el comienzo del período de floración hasta la etapa máxima de floración, y colóquelas en una bolsa con cierre hermético. Las flores se pueden conservar a 4 °C en la nevera durante 24 h.
- Lleve las flores al laboratorio. Use pinzas para recoger las anteras y colóquelas en una placa de Petri que contenga papel de filtro. Recolecta anteras de 20 a 30 flores.
- Colocar la placa de Petri que contiene las anteras en un horno a 28 °C durante 24 h hasta que los granos de polen se sequen. Para la organización detallada de las flores, véase Hu et al.9.
- Coloque el polen seco en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Guarde el polen en una bolsa hermética con cierre hermético que contenga gel de sílice que cambia de color (desecante). Cierre la bolsa y etiquétela con el nombre de la variedad de polen y la fecha de almacenamiento. El polen seco se puede almacenar en un refrigerador de -20 °C durante 96 semanas16.
3. Prueba de germinación de polen in vitro
- Vierta 300 μL de medio líquido en una placa de cultivo celular o en la tapa de un tubo de centrífuga de 2 ml, y espolvoree el polen uniformemente con la ayuda de un cepillo de polinización. Incubar el polen a 28 °C en un ambiente oscuro humidificado durante 12 h.
- Retire la parte superior de 1 mm de la punta de una pipeta de 1.000 μL. Use la pipeta para absorber el polen con una pequeña cantidad de solución de cultivo y muévala al centro del portaobjetos del microscopio. Cúbralo con un cubreobjetos. Observe la muestra con un microscopio invertido utilizando un objetivo 10x.
- Realizar tres réplicas independientes utilizando aproximadamente la misma densidad de polen para cada réplica17. Administre visualmente la cantidad de polen, asegurándose de que toda la placa de Petri esté cubierta de polen y que cada placa de Petri tenga una cantidad casi igual de polen.
- El polen germinado produce un tubo polínico con una longitud de aproximadamente el doble de su diámetro. Calcule la tasa de germinación a partir de 20 campos visuales, lo que da el porcentaje de polen germinado en todos los campos de polen.
4. Polinización
- Elija un día soleado sin viento para la polinización. Seleccione 10 cogollos completamente desarrollados a punto de abrirse, retire los pétalos con cuidado y tenga cuidado de no magullarlos.
- Use un cepillo de polinización para esparcir una cantidad suficiente de polen viable sobre la superficie del estigma y tenga cuidado de no dañar el pistilo. Para la autopolinización, use el polen de la misma planta / cultivar. Para la polinización cruzada, use el polen de una planta con un genotipo diferente.
- Cubra las flores polinizadas con una bolsa de papel de sulfato. Use un clip para sellar la bolsa y evitar la polinización por polen genotípicamente distinto.
- Escriba el nombre de la especie y el número y el tiempo de polinización en la etiqueta. Cuelgue la etiqueta en las ramas cerca de las flores polinizadas.
5. Muestreo, fijación y conservación
- Retire las bolsas de polinización aproximadamente 3-4 días después de la polinización y recoja las flores polinizadas en bolsas con cierre hermético.
- Retire inmediatamente los pétalos, receptáculos y ovarios de las flores, y sumerja los estigmas fusionados a los estilos en un tubo de centrífuga que contenga una solución fijadora recién preparada. Incubar los estigmas y estilos en la solución fijadora durante la noche a 4 °C.
- Al día siguiente, deseche la solución fijadora y lave los estigmas y estilos dos o tres veces en etanol al 95%.
- Transfiera los estilos a una solución de etanol al 70%. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en la solución. Los estilos en esta etapa se pueden almacenar a 4 °C durante 1-2 meses.
6. Tinción de azul de anilina
- Lave las muestras de estilo almacenadas en etanol al 70% con agua destilada de tres a cuatro veces. Sumergir en una solución de NaOH 4 M, sellar e incubar en un baño maría a 65 °C durante 60 min. Durante este paso, el color del estilo cambia de amarillo-blanco a naranja-rojo.
- Remojar los estilos en agua destilada durante 30 min. Deseche el agua destilada y lave los estilos con agua destilada tres o cuatro veces o hasta que el color del estilo se vuelva amarillo.
- Coloque la muestra en un tubo de 10 ml, agregue el azul de anilina hasta que la muestra se haya sumergido y teñir durante 12 h en la oscuridad.
- Observe el crecimiento del tubo polínico con un microscopio de fluorescencia.
7. Microscopía de fluorescencia
- Antes de observar las muestras, coloque la diapositiva sobre una mesa plana y agregue de dos a tres gotas de polietilenglicol a la superficie de la diapositiva.
- Lavar el estilo a observar con agua destilada. Use un bisturí para dividirlo en dos mitades a lo largo del eje longitudinal. Coloque la mitad del estilo en el portaobjetos de vidrio y cúbralo con un cubreobjetos.
- Coloque el portaobjetos en el escenario del microscopio por encima de la abertura y visualice usando un objetivo de 10x. Utilice el filtro DAPI (excitación: 325-375 nm; emisión: 435-485 nm). Observe cinco estilos para cada tipo de polinización. Observe el crecimiento del tubo polínico.
8. Identificación del genotipo S basado en PCR
- Extraer el ADN genómico de la muestra de estigma utilizando el método CTAB18.
- Coloque las hojas recolectadas en un tubo de centrífuga de 2 ml y congele rápidamente en nitrógeno líquido. Preparar HCl:EDTA:NaCl:H2O tampón en una proporción de 1:1:3:5 y una mezcla de alcohol isoamílico cloroformo en una proporción de 24:1
- Añadir 10 ml del tampón preparado, 0,2 g de TALAB y 200 μL de mercaptoetanol a un tubo de centrífuga de 50 ml, y ponerlos en un baño maría a 65 °C durante 5 minutos hasta que la solución se vuelva clara y transparente.
- Coloque las cuchillas en un mortero, agregue las muestras congeladas, agregue nitrógeno líquido y muela. Coloque la muestra molida en un tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 600 μL de mezcla CTAB, póngala en un baño maría a 65 ° C durante 60 minutos y mezcle boca abajo cada 30 minutos.
- Añadir 700 μL de la mezcla de alcohol isoamílico cloroformo (24:1) y mezclar boca abajo durante 10 min. Centrifugar a 24 °C a 12.000 x g durante 10 min, pipetear el sobrenadante y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 60 μL de solución de NaCl 5 M y 1 ml de etanol absoluto, y mezclar boca abajo. Congelar a -20 °C durante 30 min, y centrifugar a 24 °C y 9.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de solución de etanol al 70% y déjelo a temperatura ambiente durante 1-2 h. Centrifugar a 24 °C, 9.000 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante, aspirar el exceso de solución de etanol y secar al aire durante 5 min.
- Agregue 100 μL de agua estéril para disolver, mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro y congélela en un congelador de -4 °C para su almacenamiento a largo plazo.
- Configure el sistema de reacción RT-PCR. Prepare la siguiente mezcla de reacción para 10 μL que contengan 5 μL de PCRMix 2x, 0,25 μL de cebador directo e inverso, 1 μL de ADN (100 ng/μL) y 3,5 μL deH2O.
- Configure el programa de PCR según la Tabla 1. El programa de PCR para todas las isoformas fue de 95 °C durante 5 min 32x (95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min) y 72 °C durante 5 min. Separe los productos en geles de TAE-agarosa al 1,5% y fotografíe9. Verifique el genotipo S especificado utilizando ADN genómico.
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Representative Results
Para los experimentos realizados aquí, se seleccionaron flores maduras, se recolectaron las anteras, se secaron en un horno y el polen se germinó a 28 ° C durante 12 h. La viabilidad del polen y las tasas de germinación se cuantificaron como se muestra en la Figura 1.
Los cítricos se polinizaron manualmente, y la compatibilidad e incompatibilidad del polen se evaluó mediante tinción de azul de anilina y microscopía de fluorescencia. El polen compatible podría germinar en la superficie del estigma y producir un tubo polínico normal que podría crecer y finalmente conducir a la fertilización en el ovario. En contraste, los tubos de polen incompatibles crecieron a través de aproximadamente dos tercios del estilo y luego dejaron de crecer (Figura 2).
Para identificar el genotipo S , se extrajo ADN total de la planta. Se diseñaron cebadores específicos basados en la secuencia del locus S que fueron útiles para amplificar parte del locus S en las reacciones de PCR. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Se detectaron las bandas amplificadas (entre 500-1.000 pb). Se identificó el genotipo S correspondiente (Figura 3). Por este método, hemos identificado los genotipos S de 63 recursos de germoplasma de pummelo7. Nuestro grupo ha identificado 21 haplotipos S en diferentes especies de cítricos utilizando este método19 (Tabla 2).
Figura 1: Diferentes tasas de germinación del polen. Germinación y crecimiento del polen. (A) El polen viable tiene una tasa de germinación más alta, y se puede cultivar un tubo polínico normal. (B) El polen no viable o menos viable tiene una tasa de germinación mucho menor, y pocos tubos de polen pueden crecer. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de microscopía de fluorescencia de tubos polínicos en pistilos después de la polinización. (A) Pistilo autocompatible con numerosos tubos de polen en crecimiento. (B) Pistilo autoincompatible con crecimiento de tubo polínico detenido dentro del estilo. Abreviaturas: Pt = tubo polínico; VB = haz vascular. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Amplificación específica del gen S-RNasa de Ma jia pummelo. Después de la amplificación por PCR y la electroforesis en gel, se encontró que las dos bandas amplificadas S10 y S16 eran las más brillantes. Estos datos indican que el genotipo de Ma jia pummelo fue S10 y S16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: El sistema de reacción utilizado para la identificación del genotipo S basado en PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Lista de los cebadores para los genotipos 21 S en cítricos identificados por nuestro grupo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En los cultivos frutales, tanto la partenocarpia como la IS son rasgos importantes porque allanan el camino para las frutas sin semillas, un rasgo muy apreciado por los consumidores. La autoincompatibilidad promueve el rechazo del autopolen y, por lo tanto, previene la endogamia20. Entre los cítricos, el pummelo es una variedad autoincompatible7. Casi el 40% de todas las especies de angiospermas exhiben SI21. Este rasgo evita el cuajado de la fruta, reduce el rendimiento y trae enormes pérdidas económicas a los productores. Para resolver este problema, los agricultores incluyen árboles polinizadores en todos sus huertos. Sin embargo, la selección de árboles polinizadores adecuados es una tarea desafiante que requiere experimentos de laboratorio que requieren mucho tiempo. Para resolver estos problemas, hemos desarrollado un método rápido para identificar genotipos de SI y determinar las compatibilidades e incompatibilidades de polen de diferentes variedades de cítricos para facilitar la selección precisa de árboles polinizadores. Además, la viabilidad del polen y las tasas de germinación también se pueden determinar utilizando el método in vitro descrito en este protocolo.
Existen algunos informes sobre la determinación de genotipos del SI y auto-(in)compatibilidad e inter-(in)compatibilidad utilizando una combinación de diferentes métodos en ciruela japonesa y albaricoque22,23. El desarrollo de cebadores específicos S se basa en la identificación del genotipo S. En cítricos, el análisis del transcriptoma del estigma y el polen de 64 accesiones de pummelo ha identificado nueve S-RNasas específicamente expresadas en los estilos y una variante de la S-RNasa. Otros 12 pares de cebadores específicos de S fueron desarrollados posteriormente en cítricos por Liang et al.7 y Wei et al.19. Sin embargo, en relación con la pera y la manzana, se han identificado menos genotipos S en los cítricos4. La identificación de genotipos S basados en PCR es un paso crítico, ya que proporciona una base para combinaciones compatibles/incompatibles. También hay algunas limitaciones a este protocolo. Los genotipos S de algunas variedades de cítricos no pueden identificarse utilizando este método. Este hallazgo indica que se requiere una mayor expansión de la biblioteca de genotipos S en los cítricos. Además, los cebadores específicos de S no pueden distinguir los genotipos S de cultivares con secuencias S muy similares y, por lo tanto, amplifican de manera no específica secuencias S similares.
En conjunto, debido a su rentabilidad y facilidad de uso, este método es una herramienta eficaz para determinar la compatibilidad e incompatibilidad del polen para diferentes variedades de cítricos. Este protocolo se puede utilizar para la selección de árboles polinizadores adecuados y en programas de investigación de cría. Se puede aplicar a varias especies de la familia Rutaceae (por ejemplo, Citrus trifoliata y Fortunella japonica) para la selección de árboles polinizadores.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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