Summary
Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.
Abstract
Gli agrumi utilizzano l'auto-incompatibilità basata sulla S-RNasi per respingere l'auto-polline e, pertanto, richiedono alberi impollinatori vicini per un'impollinazione e una fecondazione di successo. Tuttavia, identificare le varietà adatte a fungere da impollinatori è un processo che richiede tempo. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare le cultivar di agrumi compatibili con l'impollinazione che utilizza l'elettroforesi su gel di agarosio e la colorazione blu all'anilina. La compatibilità del polline viene determinata sulla base dell'identificazione dei genotipi S estraendo il DNA totale ed eseguendo saggi di genotipizzazione basati sulla PCR con primer specifici. Inoltre, gli stili vengono raccolti 3-4 giorni dopo l'impollinazione manuale e viene eseguita la colorazione blu all'anilina. Infine, lo stato di crescita dei tubi pollinici viene osservato con un microscopio a fluorescenza. La compatibilità e l'incompatibilità del polline possono essere stabilite osservando se la crescita del tubo pollinico è normale o soppressa, rispettivamente. Grazie alla sua semplicità ed economicità, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per stabilire gruppi di incompatibilità e relazioni di incompatibilità tra diverse cultivar. Questo metodo fornisce informazioni essenziali per la selezione di successo di alberi impollinatori adatti e, quindi, facilita la creazione di nuovi frutteti e la selezione di genitori appropriati per i programmi di allevamento.
Introduction
L'autoincompatibilità (SI) è un meccanismo geneticamente controllato presente in circa il 40% delle specie di angiosperme. In questo processo, il pistillo respinge il polline da una pianta con lo stesso genotipo SI e, quindi, impedisce l'autofecondazione 1,2. Ma jia pummelo è una varietà locale nella provincia di Jinagsu, in Cina, con le eccellenti qualità di frutta grande e rosa, un ricco contenuto di succo, un sapore agrodolce e una buccia spessa3. Sebbene il SI promuova l'outcrossing, influisce negativamente sulla resa e sulla qualità dei frutti4 e richiede alberi impollinatori adatti con genotipi SI distinti per tassi di allegagione affidabili e rese elevate. Allo stato attuale, ci sono due tipi principali di SI, l'autoincompatibilità sporofica (SSI), rappresentata dalle Brassicaceae, e l'autoincompatibilità gametofitica (GSI), rappresentata dalle Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae e Solanaceae 5,6,7,8.
Gli agrumi sono una delle colture frutticole più importanti al mondo. Il sistema GSI basato sulla S-RNasi si trova in molte accessioni di agrumi e influenza negativamente il tasso di allegagione9. In questo sistema, SI è controllato dal locus S, un singolo locus polimorfico con due alleli complessi che trasportano determinanti del pistillo S e determinanti del polline S 7. Il determinante femminile è la ribonucleasi S (S-RNasi) e il determinante maschile è il locus S F-box (SLF)7. Le cellule del pistillo secernono proteine S-RNasi. Le S-RNasi non-self sono riconosciute dalle proteine SLF, il che porta all'ubiquitinazione e alla degradazione delle non-self S-RNasi da parte della via del proteasoma 26S. Al contrario, le S-RNasi self sono in grado di accumulare e inibire la crescita del tubo pollinico (PT) perché eludono le proteine SLF e, quindi, sono impedite dall'ubiquitinizzazione10,11,12,13.
Qui riportiamo una tecnica in vivo utile per identificare i genotipi S e i gradi di compatibilità e incompatibilità del polline. Il protocollo prevede l'estrazione del DNA totale dalle foglie e la previsione del genotipo S utilizzando primer specifici per S. Inoltre, la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluorescenza seguita dall'impollinazione manuale forniscono prove del grado di compatibilità e incompatibilità. Anche la procedura di impollinazione semi in vivo, che prevede l'impollinazione manuale dei fiori in laboratorio14,15, è stata adattata per valutare i gradi di autocompatibilità e incompatibilità. Tuttavia, abbiamo anche utilizzato l'impollinazione sul campo seguita dall'insaccamento dei fiori per evitare la contaminazione da polline indesiderato per consentire ai tubi pollinici di svilupparsi in condizioni naturali. Questo protocollo è semplice e diretto e fornisce le informazioni necessarie per la selezione di successo degli alberi impollinatori adatti.
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Protocol
1. Preparazione per la colorazione blu all'anilina
- Preparare i seguenti reagenti e strumenti per l'esperimento: un pennello impollinatore, una pinzetta, una matita, carta solfato, un sacchetto di impollinazione, sacchetti con chiusura a cerniera, graffette, formaldeide, acido acetico glaciale, etanolo assoluto, provette per centrifuga, pinze, contagocce di colla, vetrini, copertine, bisturi e glicole polietilenico.
- Preparare un mezzo di germinazione in vitro contenente 0,02% MgSO4, 0,01% KNO 3, 0,03% Ca(NO 3)2, 0,01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 e 15% saccarosio. Regolare il pH a 6,0-6,2 con KOH. Utilizzare un agitatore magnetico poiché PEG-4.000 è difficile da sciogliere.
- Preparare la soluzione fissativa di Carnoy, che è etanolo assoluto e acido acetico glaciale miscelati con un rapporto di 3: 1. Preparare la soluzione di fissazione FAA, che è 40% formaldeide, 80% etanolo e acido acetico glaciale (1: 8: 1). Preparare 4 M idrossido di sodio (NaOH) e soluzione di blu di anilina, che è blu di anilina allo 0,1% in 0,1 M K3PO4. Utilizzare una bottiglia ambrata per conservare la soluzione blu anilina perché è sensibile alla luce.
2. Raccolta del polline
- Conoscere in anticipo il periodo di fioritura degli alberi sperimentali (Ma jia pummelo in questo studio). Raccogli i fiori maturi non aperti dall'inizio del periodo di fioritura alla fase di massima fioritura e mettili in un sacchetto con chiusura a zip. I fiori possono essere conservati a 4 °C in frigorifero per 24 ore.
- Porta i fiori al laboratorio. Usa una pinzetta per raccogliere le antere e mettile in una piastra di Petri contenente carta da filtro. Raccogli antere da 20 a 30 fiori.
- Mettere la piastra di Petri contenente le antere in un forno a 28 °C per 24 ore fino a quando i grani di polline non si asciugano. Per l'organizzazione dettagliata dei fiori, vedi Hu et al.9.
- Mettere il polline essiccato in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Conservare il polline in un sacchetto con chiusura a zip ermetico contenente gel di silice che cambia colore (essiccante). Chiudere il sacchetto ed etichettarlo con il nome della varietà di polline e la data di conservazione. Il polline essiccato può essere conservato in frigorifero a -20 °C per 96 settimane16.
3. Test di germinazione del polline in vitro
- Versare 300 μL di mezzo liquido in una capsula di coltura cellulare o nel tappo di una provetta da centrifuga da 2 ml e cospargere uniformemente il polline con l'aiuto di un pennello per l'impollinazione. Incubare il polline a 28 °C in un ambiente buio umidificato per 12 ore.
- Rimuovere la parte superiore di 1 mm della punta di una punta di pipetta da 1.000 μL. Utilizzare la pipetta per assorbire il polline con una piccola quantità di soluzione di coltura e spostarla al centro del vetrino del microscopio. Coprilo con un foglietto. Osservare il campione con un microscopio invertito usando un obiettivo 10x.
- Eseguire tre repliche indipendenti utilizzando approssimativamente la stessa densità di polline per ciascuna replica17. Gestisci visivamente la quantità di polline, assicurandoti che tutta la piastra di Petri sia coperta di polline e che ogni capsula di Petri abbia una quantità quasi uguale di polline.
- Il polline germinato produce un tubo pollinico con una lunghezza circa doppia del suo diametro. Calcola il tasso di germinazione da 20 campi visivi, che fornisce la percentuale di polline germinato in tutti i campi pollinici.
4. Impollinazione
- Scegli una giornata di sole senza vento per l'impollinazione. Seleziona 10 gemme completamente sviluppate che stanno per aprirsi, stacca i petali con cura e fai attenzione a non ammaccarli.
- Utilizzare un pennello per l'impollinazione per diffondere una quantità sufficiente di polline vitale sulla superficie dello stigma e fare attenzione a non danneggiare il pistillo. Per l'autoimpollinazione, utilizzare il polline della stessa pianta / cultivar. Per l'impollinazione incrociata, utilizzare il polline di una pianta con un genotipo diverso.
- Coprire i fiori impollinati con un sacchetto di carta solfato. Utilizzare una graffetta per sigillare il sacchetto e prevenire l'impollinazione da polline genotipicamente distinti.
- Scrivi il nome della specie e il numero e il tempo di impollinazione sull'etichetta. Appendere l'etichetta sui rami vicino ai fiori impollinati.
5. Campionamento, fissazione e conservazione
- Rimuovere i sacchetti di impollinazione circa 3-4 giorni dopo l'impollinazione e raccogliere i fiori impollinati in sacchetti con chiusura a zip.
- Rimuovere immediatamente i petali, i recipienti e le ovaie dai fiori e immergere gli stimmi fusi agli stili in un tubo di centrifuga contenente una soluzione fissativa appena preparata. Incubare gli stimmi e gli stili nella soluzione fissativa per una notte a 4 °C.
- Il giorno dopo, scartare la soluzione fissativa e lavare gli stimmi e gli stili due o tre volte in etanolo al 95%.
- Trasferire gli stili in una soluzione di etanolo al 70%. Assicurarsi che il campione sia completamente immerso nella soluzione. I modelli in questa fase possono essere conservati a 4 °C per 1-2 mesi.
6. Colorazione blu all'anilina
- Lavare i campioni di stile conservati in etanolo al 70% con acqua distillata tre o quattro volte. Immergere in una soluzione di 4 M NaOH, sigillare e incubare in bagnomaria a 65 °C per 60 minuti. Durante questa fase, il colore dello stile cambia da giallo-bianco a rosso-arancio.
- Immergere gli stili in acqua distillata per 30 min. Scartare l'acqua distillata e lavare gli stili con acqua distillata tre o quattro volte o fino a quando il colore dello stile diventa giallo.
- Mettere il campione in una provetta da 10 ml, aggiungere il blu di anilina fino a quando il campione è stato immerso e colorare per 12 ore al buio.
- Osservare la crescita del tubo pollinico con un microscopio a fluorescenza.
7. Microscopia a fluorescenza
- Prima di osservare i campioni, posizionare il vetrino su un tavolo piano e aggiungere due o tre gocce di glicole polietilenico sulla superficie del vetrino.
- Lavare lo stile da osservare con acqua distillata. Usa un bisturi per dividerlo in due metà lungo l'asse longitudinale. Posiziona metà dello stile sul vetrino e copri con una copertina.
- Posiziona il vetrino sul palco del microscopio sopra l'apertura e visualizzalo utilizzando un obiettivo 10x. Utilizzare il filtro DAPI (eccitazione: 325-375 nm; emissione: 435-485 nm). Osserva cinque stili per ogni tipo di impollinazione. Osserva la crescita del tubo pollinico.
8. Identificazione del genotipo S basato sulla PCR
- Estrarre il DNA genomico dal campione di stigma utilizzando il metodo CTAB18.
- Mettere le foglie raccolte in una provetta da centrifuga da 2 ml e congelare a scatto in azoto liquido. Preparare un tampone HCl:EDTA:NaCl:H2O in rapporto 1:1:3:5 e una miscela di alcol isoamilico cloroformio in rapporto 24:1
- Aggiungere 10 ml del tampone preparato, 0,2 g di CTAB e 200 μL di mercaptoetanolo in una provetta da centrifuga da 50 mL e metterli a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti fino a quando la soluzione diventa limpida e trasparente.
- Mettere le lame in un mortaio, aggiungere i campioni congelati, aggiungere azoto liquido e macinare. Mettere il campione macinato in una provetta da centrifuga da 2 ml, aggiungere 600 μL di miscela CTAB, metterlo a bagnomaria a 65 °C per 60 minuti e mescolarlo capovolto ogni 30 minuti.
- Aggiungere 700 μL della miscela di alcol isoamilico cloroformio (24:1) e mescolare capovolto per 10 minuti. Centrifugare a 24 °C a 12.000 x g per 10 minuti, pipettare il surnatante e trasferire in una provetta da centrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 60 μL di soluzione 5 M di NaCl e 1 ml di etanolo assoluto e mescolare capovolto. Congelare a -20 °C per 30 minuti e centrifugare a 24 °C e 9.000 x g per 5 min.
- Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% e lasciare a temperatura ambiente per 1-2 ore. Centrifugare a 24 °C, 9.000 x g per 5 minuti, scartare il surnatante, aspirare la soluzione di etanolo in eccesso e asciugare all'aria per 5 minuti.
- Aggiungere 100 μL di acqua sterile per sciogliere, misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro e congelare in un congelatore a -4 °C per la conservazione a lungo termine.
- Configurare il sistema di reazione RT-PCR. Preparare la seguente miscela di reazione per 10 μL contenente 5 μL di 2x PCRMix, 0,25 μL ciascuno di primer diretto e inverso, 1 μL di DNA (100 ng/ μL) e 3,5 μL di H2O.
- Impostare il programma PCR come da Tabella 1. Il programma PCR per tutte le isoforme era di 95 °C per 5 min 32x (95 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min) e 72 °C per 5 min. Separare i prodotti su gel di agarosio TAE-1,5% e fotografare9. Verificare il genotipo S specificato utilizzando il DNA genomico.
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Representative Results
Per gli esperimenti fatti qui, sono stati selezionati fiori maturi, le antere sono state raccolte, essiccate in un forno e il polline è stato germinato a 28 ° C per 12 ore. La vitalità del polline e i tassi di germinazione sono stati quantificati come mostrato nella Figura 1.
Gli agrumi sono stati impollinati manualmente e la compatibilità e l'incompatibilità del polline sono state valutate utilizzando la colorazione blu all'anilina e la microscopia a fluorescenza. Il polline compatibile potrebbe germinare sulla superficie dello stigma e produrre un normale tubo pollinico che potrebbe crescere e alla fine portare alla fecondazione nell'ovaio. Al contrario, i tubi pollinici incompatibili sono cresciuti attraverso circa due terzi dello stile e poi hanno smesso di crescere (Figura 2).
Per identificare il genotipo S, è stato estratto il DNA totale dalla pianta. Sono stati progettati primer specifici basati sulla sequenza del locus S che sono stati utili per amplificare parte del locus S nelle reazioni PCR. I prodotti di amplificazione sono stati analizzati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio. Sono state rilevate le bande amplificate (tra 500-1.000 bp). È stato identificato il genotipo S corrispondente (Figura 3). Con questo metodo, abbiamo identificato i genotipi S di 63 risorse di germoplasma pummelo7. Il nostro gruppo ha identificato 21 aplotipi S in diverse specie di agrumi utilizzando questo metodo19 (Tabella 2).
Figura 1: Diversi tassi di germinazione del polline. Germinazione e crescita del polline. (A) Il polline vitale ha un tasso di germinazione più elevato e può essere coltivato un tubo pollinico normale. (B) Il polline non vitale o meno vitale ha un tasso di germinazione molto più basso e pochi tubi pollinici possono crescere. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini al microscopio a fluorescenza di tubi pollinici in pistilli dopo impollinazione. (A) Pistillo autocompatibile con numerosi tubi pollinici in crescita. (B) Pistillo auto-incompatibile con la crescita del tubo pollinico arrestato all'interno dello stile. Abbreviazioni: Pt = tubo pollinico; VB = fascio vascolare. Barre della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Amplificazione specifica del gene S-RNasi da Ma jia pummelo. Dopo l'amplificazione PCR e l'elettroforesi su gel, si è scoperto che le due bande amplificate S10 e S16 erano le più luminose. Questi dati indicano che il genotipo di Ma jia pummelo era S10 e S16. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Il sistema di reazione utilizzato per l'identificazione del genotipo S basato sulla PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Elenco dei primer per genotipi 21 S negli agrumi identificati dal nostro gruppo. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Nelle colture da frutto, sia la partenocarpia che l'SI sono tratti importanti perché aprono la strada a frutti senza semi - una caratteristica molto apprezzata dai consumatori. L'autoincompatibilità promuove il rifiuto dell'autopolline e, quindi, impedisce la consanguineità20. Tra gli agrumi, il pummelo è una varietà auto-incompatibile7. Quasi il 40% di tutte le specie di angiosperme presenta SI21. Questa caratteristica impedisce l'allegagione, riduce la resa e porta enormi perdite economiche ai coltivatori. Per risolvere questo problema, gli agricoltori includono alberi impollinatori in tutti i loro frutteti. Tuttavia, la selezione di alberi impollinatori adatti è un compito impegnativo che richiede lunghi esperimenti di laboratorio. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato un metodo rapido per identificare i genotipi SI e determinare le compatibilità e le incompatibilità del polline di diverse varietà di agrumi per facilitare la selezione accurata degli alberi degli impollinatori. Inoltre, la vitalità del polline e i tassi di germinazione possono anche essere determinati utilizzando il metodo in vitro descritto in questo protocollo.
Ci sono alcuni rapporti sulla determinazione dei genotipi SI e dell'auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità utilizzando una combinazione di metodi diversi nella prugna giapponese e nell'albicocca22,23. Lo sviluppo di primer S-specifici si basa sull'identificazione del genotipo S. Negli agrumi, l'analisi del trascrittoma dello stigma e del polline da 64 accessioni di pummelo ha identificato nove S-RNasi specificamente espresse negli stili e una variante della S-RNasi. Altre 12 coppie di primer S-specifici sono stati sviluppati successivamente negli agrumi da Liang et al.7 e Wei et al.19. Tuttavia, rispetto alla pera e alla mela, sono stati identificati meno genotipi S negli agrumi4. L'identificazione dei genotipi S basati sulla PCR è un passo critico, in quanto fornisce una base per combinazioni compatibili/incompatibili. Ci sono anche alcune limitazioni a questo protocollo. I genotipi S di alcune varietà di agrumi non possono essere identificati con questo metodo. Questa scoperta indica che è necessaria un'ulteriore espansione della libreria del genotipo S negli agrumi. Inoltre, i primer S-specifici non possono distinguere i genotipi S di cultivar con sequenze S molto simili e, quindi, non specificamente amplificare sequenze S simili.
Nel complesso, grazie alla sua economicità e facilità d'uso, questo metodo è uno strumento efficace per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline per diverse varietà di agrumi. Questo protocollo può essere utilizzato per la selezione di alberi impollinatori adatti e nei programmi di ricerca sull'allevamento. Può essere applicato a diverse specie della famiglia delle Rutaceae (ad esempio, Citrus trifoliata e Fortunella japonica) per la selezione di alberi impollinatori.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (32122075, 32072523).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
