Summary
यह प्रोटोकॉल साइट्रस कल्टीवर्स में पराग संगतता और असंगति निर्धारित करने के लिए एक तेज़ विधि प्रदान करता है।
Abstract
साइट्रस स्व-पराग को अस्वीकार करने के लिए एस-आरएनएस-आधारित आत्म-असंगति का उपयोग करता है और इसलिए, सफल परागण और निषेचन के लिए आस-पास के परागण पेड़ों की आवश्यकता होती है। हालांकि, परागणक के रूप में सेवा करने के लिए उपयुक्त किस्मों की पहचान करना एक समय लेने वाली प्रक्रिया है। इस समस्या को हल करने के लिए, हमने परागण-संगत साइट्रस कल्टीवर्स की पहचान करने के लिए एक तेजी से विधि विकसित की है जो एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन और एनिलिन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करती है। पराग संगतता कुल डीएनए निकालने और विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग परख करके एस जीनोटाइप की पहचान के आधार पर निर्धारित की जाती है। इसके अतिरिक्त, मैनुअल परागण के 3-4 दिन बाद शैलियों को एकत्र किया जाता है, और एनिलिन ब्लू स्टेनिंग का प्रदर्शन किया जाता है। अंत में, पराग ट्यूबों की वृद्धि की स्थिति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ देखी जाती है। पराग संगतता और असंगति को यह देखकर स्थापित किया जा सकता है कि पराग ट्यूब की वृद्धि क्रमशः सामान्य या दबी हुई है या नहीं। इसकी सादगी और लागत-प्रभावशीलता के कारण, यह विधि विभिन्न खट्टे किस्मों की पराग संगतता और असंगति को निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है ताकि विभिन्न खेती के बीच असंगति समूहों और असंगति संबंधों को स्थापित किया जा सके। यह विधि उपयुक्त परागण पेड़ों के सफल चयन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करती है और इस प्रकार, नए बागों की स्थापना और प्रजनन कार्यक्रमों के लिए उपयुक्त माता-पिता के चयन की सुविधा प्रदान करती है।
Introduction
स्व-असंगति (एसआई) एक आनुवंशिक रूप से नियंत्रित तंत्र है जो लगभग 40% एंजियोस्पर्म प्रजातियों में मौजूद है। इस प्रक्रिया में, पिस्टिल एक ही एसआई जीनोटाइप वाले पौधे से पराग को अस्वीकार कर देता है और इस प्रकार, स्व-निषेचन 1,2 को रोकता है। मा जिया पुमेलो चीन के जिनाग्सू प्रांत में एक स्थानीय किस्म है, जिसमें बड़े, गुलाबी फल, एक समृद्ध रस सामग्री, एक मीठा और खट्टा स्वाद और एक मोटा छिलका3 के उत्कृष्ट गुण हैं। यद्यपि एसआई आउटक्रॉसिंग को बढ़ावा देता है,यह फलों की उपज और गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है और विश्वसनीय फल-सेटिंग दरों और उच्च पैदावार के लिए अलग-अलग एसआई जीनोटाइप के साथ उपयुक्त परागण पेड़ों की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, एसआई के दो मुख्य प्रकार हैं, स्पोरोफाइटिक आत्म-असंगति (एसएसआई), जिसे ब्रासिकेसी द्वारा दर्शाया गया है, और गैमेटोफाइटिक आत्म-असंगति (जीएसआई), जिसका प्रतिनिधित्व रोसैसी, पापावेरेसी, रुटेसी और सोलानासी 5,6,7,8 द्वारा किया जाता है।
साइट्रस दुनिया में सबसे महत्वपूर्ण फलों की फसलों में से एक है। एस-आरएनएस-आधारित जीएसआई प्रणाली कई साइट्रस परिग्रहणों में पाई जाती है और फल-सेटिंग दर9 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है। इस प्रणाली में, एसआई को एस लोकस द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो दो जटिल एलील के साथ एक एकल बहुरूपी टिड्डी है जो पिस्टिल एस निर्धारक ों और पराग एस निर्धारकोंको 7 ले जाता है। महिला निर्धारक एस राइबोन्यूक्लिज़ (एस-आरएनएस) है, और पुरुष निर्धारक एस लोकस एफ-बॉक्स (एसएलएफ) 7 है। पिस्टिल की कोशिकाएं एस-आरएनएस प्रोटीन का स्राव करती हैं। गैर-स्व एस-आरएनएस को एसएलएफ प्रोटीन द्वारा मान्यता प्राप्त है, जो 26 एस प्रोटीसम मार्ग द्वारा गैर-स्व एस-आरएनएस के सर्वव्यापी और क्षरण की ओर जाता है। इसके विपरीत, स्व एस-आरएनएस पराग ट्यूब (पीटी) के विकास को जमा करने और बाधित करने में सक्षम हैं क्योंकि वे एसएलएफ प्रोटीन से बचते हैं और इसलिए,10,11,12,13 से रोके जाते हैं।
यहां, हम एक इनविवो तकनीक की रिपोर्ट करते हैं जो एस-जीनोटाइप और पराग संगतता और असंगति की डिग्री की पहचान करने के लिए उपयोगी है। प्रोटोकॉल में पत्तियों से कुल डीएनए निकालना और एस-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके एस जीनोटाइप की भविष्यवाणी करना शामिल है। इसके अलावा, हाथ परागण के बाद एनिलिन ब्लू स्टेनिंग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी संगतता और असंगति की डिग्री के लिए सबूत प्रदान करते हैं। विवो परागण प्रक्रिया में अर्ध, जिसमें प्रयोगशाला14,15 में फूलों का मैनुअल परागण शामिल है, को आत्म-संगतता और असंगति की डिग्री का आकलन करने के लिए भी अनुकूलित किया गया है। हालांकि, हमने प्राकृतिक परिस्थितियों में पराग ट्यूबों को विकसित करने की अनुमति देने के लिए अवांछित पराग से संदूषण से बचने के लिए फूलों की बैगिंग के बाद क्षेत्र परागण का भी उपयोग किया है। यह प्रोटोकॉल सरल और सीधा है और उपयुक्त परागणक पेड़ों के सफल चयन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है।
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Protocol
1. एनिलिन ब्लू स्टेनिंग के लिए तैयारी
- प्रयोग के लिए निम्नलिखित अभिकर्मकों और उपकरण तैयार करें: एक परागण ब्रश, चिमटी, एक पेंसिल, सल्फेट पेपर, एक परागण बैग, ज़िप लॉक बैग, पेपर क्लिप, फॉर्मलाडेहाइड, ग्लेशियल एसिटिक एसिड, पूर्ण इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, फोर्सप्स, गोंद ड्रॉपर्स, ग्लास स्लाइड, कवरलिप्स, स्केलपेल्स और पॉलीथीन ग्लाइकोल।
- इन विट्रो अंकुरण माध्यम तैयार करें जिसमें 0.02% MgSO4, 0.01% KNO 3, 0.03% Ca (NO 3)2, 0.01% H 3 BO 3, 20% PEG-4000 और 15% सुक्रोज शामिल हैं। KOH के साथ pH को 6.0-6.2 पर समायोजित करें। एक चुंबकीय हलचल का उपयोग करें क्योंकि पीईजी -4,000 को भंग करना मुश्किल है।
- कार्नॉय का फिक्सेटिव समाधान तैयार करें, जो 3: 1 के अनुपात में मिश्रित पूर्ण इथेनॉल और ग्लेशियल एसिटिक एसिड है। एफएए निर्धारण समाधान तैयार करें, जो 40% फॉर्मलाडेहाइड, 80% इथेनॉल और ग्लेशियल एसिटिक एसिड (1: 8: 1) है। 4 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) और एनिलिन ब्लू समाधान तैयार करें, जो 0.1 एम के3पीओ 4 में 0.1% एनिलिन नीला है। एनिलिन नीले समाधान को स्टोर करने के लिए एक एम्बर बोतल का उपयोग करें क्योंकि यह प्रकाश-संवेदनशील है।
2. पराग संग्रह
- प्रयोगात्मक पेड़ों (इस अध्ययन में मा जिया पम्मेलो) के फूलों की अवधि को पहले से जानें। फूलों की अवधि की शुरुआत से चरम फूल चरण तक परिपक्व खुले फूलों को इकट्ठा करें, और उन्हें एक ज़िप लॉक बैग में रखें। फूलों को 24 घंटे के लिए रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- फूलों को प्रयोगशाला में ले जाएं। एथर को इकट्ठा करने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और उन्हें फिल्टर पेपर युक्त पेट्री डिश में रखें। 20 से 30 फूलों से एथर इकट्ठा करें।
- पराग कणों के सूखने तक 28 डिग्री सेल्सियस ओवन में 28 डिग्री सेल्सियस ओवन में एथेर युक्त पेट्री डिश रखें। विस्तृत फूल संगठन के लिए, हू एट अल.9 देखें।
- सूखे पराग को 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें। पराग को एक एयर-टाइट ज़िप लॉक बैग में सहेजें जिसमें रंग बदलने वाला सिलिका जेल (डेसिकेंट) हो। बैग बंद करें, और पराग किस्म के नाम और भंडारण की तारीख के साथ बैग को लेबल करें। सूखे पराग को 96 सप्ताह16 के लिए -20 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है।
3. इन विट्रो पराग अंकुरण परीक्षण
- एक सेल कल्चर डिश या 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की टोपी में तरल माध्यम के 300 μL डालें, और परागण ब्रश की मदद से पराग को समान रूप से छिड़कें। पराग को 12 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर अंधेरे वातावरण में 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- 1,000 μL पिपेट टिप की नोक के शीर्ष 1 मिमी को हटा दें। थोड़ी मात्रा में कल्चर समाधान के साथ पराग को अवशोषित करने के लिए पिपेट का उपयोग करें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में ले जाएं। इसे कवरस्लिप से कवर करें। 10x उद्देश्य का उपयोग करके उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ नमूने का निरीक्षण करें।
- प्रत्येक प्रतिकृति17 के लिए लगभग समान पराग घनत्व का उपयोग करके तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां करें। नेत्रहीन पराग की मात्रा का प्रबंधन करें, यह सुनिश्चित करें कि पूरे पेट्री डिश पराग से ढका हुआ है और प्रत्येक पेट्री डिश में पराग की लगभग समान मात्रा है।
- अंकुरित पराग एक पराग ट्यूब का उत्पादन करता है जिसकी लंबाई लगभग दोगुनी व्यास होती है। 20 दृश्य क्षेत्रों से अंकुरण दर की गणना करें, जो सभी पराग क्षेत्रों में अंकुरित पराग का प्रतिशत देता है।
4. परागण
- परागण के लिए हवा के बिना एक धूप वाला दिन चुनें। खोलने के लिए 10 पूरी तरह से विकसित कलियों का चयन करें, पंखुड़ियों को सावधानी से छीलें, और ध्यान रखें कि उन्हें चोट न पहुंचे।
- कलंक की सतह पर पर्याप्त मात्रा में व्यवहार्य पराग फैलाने के लिए परागण ब्रश का उपयोग करें, और पिस्टिल को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें। स्व-परागण के लिए, उसी पौधे / कल्टीवेटर से पराग का उपयोग करें। क्रॉस-परागण के लिए, एक अलग जीनोटाइप वाले पौधे से पराग का उपयोग करें।
- परागण वाले फूलों को सल्फेट पेपर बैग के साथ कवर करें। बैग को सील करने और जीनोटाइपिक रूप से अलग परागकणों द्वारा परागण को रोकने के लिए एक पेपर क्लिप का उपयोग करें।
- लेबल पर प्रजातियों का नाम और परागण की संख्या और समय लिखें। परागण वाले फूलों के पास शाखाओं पर लेबल लटकाएं।
5. नमूनाकरण, निर्धारण और संरक्षण
- परागण के लगभग 3-4 दिन बाद परागण बैग को हटा दें, और परागण वाले फूलों को ज़िप लॉक बैग में इकट्ठा करें।
- फूलों से पंखुड़ियों, रिसेप्टेकल्स और अंडाशय को तुरंत हटा दें, और एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में शैलियों से जुड़े कलंक को डुबोएं जिसमें ताजा तैयार फिक्सेटिव समाधान होता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर फिक्सेटिव समाधान में कलंक और शैलियों को इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, फिक्सेटिव समाधान को त्याग दें, और 95% इथेनॉल में दो से तीन बार कलंक और शैलियों को धोएं।
- शैलियों को 70% इथेनॉल समाधान में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से समाधान में डूबा हुआ है। इस स्तर पर शैलियों को 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
6. एनिलिन ब्लू धुंधला
- आसुत जल के साथ 70% इथेनॉल में संग्रहीत शैली के नमूने को तीन से चार बार धोएं। 4 एम एनएओएच घोल में डुबोएं, सील करें, और 60 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें। इस चरण के दौरान, शैली का रंग पीले-सफेद से नारंगी-लाल में बदल जाता है।
- शैलियों को आसुत जल में 30 मिनट के लिए भिगोदें। आसुत जल को त्याग दें, और शैलियों को आसुत जल से तीन से चार बार या शैली का रंग पीला होने तक धो लें।
- नमूने को 10 एमएल ट्यूब में रखें, एनिलिन ब्लू जोड़ें जब तक कि नमूना डूब न जाए, और अंधेरे में 12 घंटे के लिए डाई करें।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ पराग ट्यूब के विकास का निरीक्षण करें।
7. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
- नमूनों को देखने से पहले, स्लाइड को एक सपाट मेज पर रखें, और स्लाइड की सतह पर पॉलीथीन ग्लाइकॉल की दो से तीन बूंदें जोड़ें।
- आसुत जल के साथ देखी जाने वाली शैली को धो लें। अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ इसे दो हिस्सों में विभाजित करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। ग्लास स्लाइड पर शैली का आधा हिस्सा रखें, और कवरस्लिप के साथ कवर करें।
- स्लाइड को एपर्चर के ऊपर माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें, और 10x उद्देश्य का उपयोग करके कल्पना करें। DAPI फ़िल्टर का उपयोग करें (उत्तेजना: 325-375 nm; उत्सर्जन: 435-485 nm)। प्रत्येक प्रकार के परागण के लिए पांच शैलियों का निरीक्षण करें। पराग ट्यूब के विकास का निरीक्षण करें।
8. पीसीआर-आधारित एस जीनोटाइप पहचान
- सीटीएबी विधि18 का उपयोग करके कलंक नमूने से जीनोमिक डीएनए निकालें।
- एकत्रित पत्तियों को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, और तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें। 1: 1: 3: 5 के अनुपात में एचसीएल: ईडीटीए: NaCl: H2O बफर और 24: 1 के अनुपात में एक क्लोरोफॉर्म आइसोमाइल अल्कोहल मिश्रण तैयार करें
- तैयार बफर के 10 एमएल, सीटीएबी के 0.2 ग्राम, और मर्कैप्टोइथेनॉल के 200 μL को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, और उन्हें 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में डाल दें जब तक कि समाधान स्पष्ट और पारदर्शी न हो जाए।
- ब्लेड को मोर्टार में डालें, जमे हुए नमूने जोड़ें, तरल नाइट्रोजन जोड़ें, और पीस लें। जमीन के नमूने को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, सीटीएबी मिश्रण के 600 μL जोड़ें, इसे 60 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में डालें, और इसे हर 30 मिनट में उल्टा मिलाएं।
- क्लोरोफॉर्म आइसोमाइल अल्कोहल मिश्रण (24: 1) के 700 μL जोड़ें, और 10 मिनट के लिए उल्टा मिलाएं। 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर 24 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, सतह पर तैरने वाले को पिपेट करें, और 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 5 M NaCl घोल के 60 μL और पूर्ण इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और उल्टा मिलाएं। 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, और 5 मिनट के लिए 24 डिग्री सेल्सियस और 9,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, 70% इथेनॉल समाधान के 1 एमएल जोड़ें, और 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। 24 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट के लिए 9,000 एक्स जी , सतह पर तैरने वाला को छोड़ दें, अतिरिक्त इथेनॉल समाधान को एस्पिरेट करें, और 5 मिनट के लिए हवा में सुखाएं।
- घुलने के लिए बाँझ पानी के 100 μL जोड़ें, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता को मापें, और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -4 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में फ्रीज करें।
- आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली कॉन्फ़िगर करें। 10 μL के लिए निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें जिसमें 2x PCRMix के 5 μL, आगे और रिवर्स प्राइमर के 0.25 μL, DNA के 1 μL (100 ng / μL), और H2O के 3.5 μL शामिल हैं।
- तालिका 1 के अनुसार पीसीआर प्रोग्राम सेट करें। सभी आइसोफॉर्म के लिए पीसीआर कार्यक्रम 5 मिनट 32x के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस था। 1.5% टीएई-एगारोस जैल और फोटोग्राफ9 पर उत्पादों को अलग करें। जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके निर्दिष्ट एस जीनोटाइप को सत्यापित करें।
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Representative Results
यहां किए गए प्रयोगों के लिए, परिपक्व फूलों का चयन किया गया था, एथर्स को एकत्र किया गया था, एक ओवन में सुखाया गया था, और पराग को 12 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर अंकुरित किया गया था। पराग व्यवहार्यता और अंकुरण दर को चित्र 1 में दिखाए गए अनुसार परिमाणित किया गया था।
साइट्रस को मैन्युअल रूप से परागित किया गया था, और पराग संगतता और असंगति का मूल्यांकन एनिलिन ब्लू स्टेनिंग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया गया था। संगत पराग कलंक की सतह पर अंकुरित हो सकता है और एक सामान्य पराग ट्यूब का उत्पादन कर सकता है जो बढ़ सकता है और अंततः अंडाशय में निषेचन का कारण बन सकता है। इसके विपरीत, असंगत पराग ट्यूब शैली के लगभग दो-तिहाई हिस्से के माध्यम से बढ़े और फिर बढ़ना बंद हो गए (चित्रा 2)।
एस जीनोटाइप की पहचान करने के लिए, पौधे से कुल डीएनए निकाला गया था। विशिष्ट प्राइमरों को एस लोकस के अनुक्रम के आधार पर डिज़ाइन किया गया था जो पीसीआर प्रतिक्रियाओं में एस लोकस के हिस्से को बढ़ाने के लिए उपयोगी थे। प्रवर्धन उत्पादों का विश्लेषण एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके किया गया था। प्रवर्धित बैंड का पता लगाया गया (500-1,000 बीपी के बीच)। संबंधित एस जीनोटाइप की पहचान की गई थी (चित्रा 3)। इस विधि से, हमने 63 पुमेलो जर्मप्लाज्म संसाधनों के एस जीनोटाइप की पहचान कीहै। हमारे समूह ने इस विधि19 (तालिका 2) का उपयोग करके विभिन्न साइट्रस प्रजातियों में 21 एस-हैप्लोटाइप्स की पहचान की है।
चित्रा 1: पराग अंकुरण की विभिन्न दर। पराग का अंकुरण और विकास। (ए) व्यवहार्य पराग में अंकुरण दर अधिक होती है, और एक सामान्य पराग ट्यूब उगाया जा सकता है। (बी) गैर-व्यवहार्य या कम व्यवहार्य पराग में अंकुरण दर बहुत कम होती है, और कुछ पराग ट्यूब विकसित हो सकते हैं। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: परागण के बाद पिस्टिल में पराग ट्यूबों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियां। (ए) कई बढ़ते पराग ट्यूबों के साथ स्व-संगत पिस्टिल। (बी) पराग ट्यूब के विकास के साथ स्व-असंगत पिस्टिल शैली के भीतर गिरफ्तार किया गया। संक्षेप: पीटी = पराग ट्यूब; वीबी = संवहनी बंडल। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: मा जिया पुमेलो से एस-आरनेस जीन का विशिष्ट प्रवर्धन। पीसीआर प्रवर्धन और जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद, यह पाया गया कि दो प्रवर्धित बैंड एस10 और एस16 सबसे चमकीले थे। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि मा जिया पुमेलो का जीनोटाइप एस10 और एस16 था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: पीसीआर-आधारित एस जीनोटाइप पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रिया प्रणाली। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
तालिका 2: हमारे समूह द्वारा पहचाने गए साइट्रस में 21 एस जीनोटाइप के लिए प्राइमरों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
फलों की फसलों में, पार्थेनोकार्पी और एसआई दोनों महत्वपूर्ण लक्षण हैं क्योंकि वे बीज रहित फलों के लिए मार्ग प्रशस्त करते हैं - एक विशेषता जो उपभोक्ताओं द्वारा अत्यधिक सराहना की जाती है। आत्म-असंगति आत्म-पराग की अस्वीकृति को बढ़ावा देती है और इस प्रकार, इनब्रीडिंग20 को रोकती है। साइट्रस के बीच, पमेलो एक स्व-असंगत किस्महै 7. सभी एंजियोस्पर्म प्रजातियों में से लगभग 40% एसआई21 प्रदर्शित करते हैं। यह विशेषता फलों की सेटिंग को रोकती है, उपज को कम करती है, और उत्पादकों को भारी आर्थिक नुकसान पहुंचाती है। इस समस्या को हल करने के लिए, किसान अपने पूरे बागों में परागण के पेड़ों को शामिल करते हैं। हालांकि, उपयुक्त परागण पेड़ों का चयन एक चुनौतीपूर्ण कार्य है जिसके लिए समय लेने वाले प्रयोगशाला प्रयोगों की आवश्यकता होती है। इन मुद्दों को हल करने के लिए, हमने एसआई जीनोटाइप की पहचान करने और परागण पेड़ों के सटीक चयन की सुविधा के लिए विभिन्न साइट्रस किस्मों की पराग संगतता और असंगति का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से विधि विकसित की है। इसके अलावा, पराग व्यवहार्यता और अंकुरण दर भी इस प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो विधि का उपयोग करके निर्धारित की जा सकती है।
जापानी प्लम और खुबानी22,23 में विभिन्न तरीकों के संयोजन का उपयोग करके एसआई जीनोटाइप और आत्म-(इन) संगतता और अंतर-(इन) संगतता के निर्धारण पर कुछ रिपोर्टें हैं। एस-विशिष्ट प्राइमरों का विकास एस जीनोटाइप की पहचान पर निर्भर करता है। साइट्रस में, 64 पुमेलो परिग्रहणों से कलंक और पराग के प्रतिलेख विश्लेषण ने विशेष रूप से शैलियों में व्यक्त नौ एस-आरएनएस और एस-आरएनएस के एक संस्करण की पहचान की है। एस-विशिष्ट प्राइमरों के एक और 12 जोड़े बाद में साइट्रस में लियांग एट अल.7 और वेई एट अल.19 द्वारा विकसित किए गए थे। हालांकि, नाशपाती और सेब के सापेक्ष, साइट्रस4 में कम एस जीनोटाइप की पहचान की गई है। पीसीआर-आधारित एस जीनोटाइप की पहचान एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह संगत / असंगत संयोजनों के लिए एक आधार प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं भी हैं। इस विधि का उपयोग करके कुछ साइट्रस किस्मों के एस जीनोटाइप की पहचान नहीं की जा सकती है। यह खोज इंगित करती है कि साइट्रस में एस जीनोटाइप लाइब्रेरी के और विस्तार की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त, एस-विशिष्ट प्राइमर अत्यधिक समान एस अनुक्रमों के साथ खेती के एस जीनोटाइप को अलग नहीं कर सकते हैं और इस प्रकार, गैर-विशिष्ट रूप से समान एस अनुक्रमों को बढ़ाते हैं।
कुल मिलाकर, इसकी लागत-प्रभावशीलता और उपयोग में आसानी के कारण, यह विधि विभिन्न साइट्रस किस्मों के लिए पराग संगतता और असंगति निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी उपकरण है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग उपयुक्त परागण पेड़ों के चयन और प्रजनन अनुसंधान कार्यक्रमों में किया जा सकता है। परागण के पेड़ों के चयन के लिए इसे रूटेसी परिवार (जैसे, साइट्रस ट्राइफोलियाटा और फॉर्च्यूनला जैपोनिका) की कई प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस परियोजना को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32122075, 32072523) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
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