Summary
Bu protokol, narenciye çeşitlerinde polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için hızlı bir yöntem sağlar.
Abstract
Narenciye, kendi kendine poleni reddetmek için S-RNaz bazlı kendi kendine uyumsuzluğu kullanır ve bu nedenle başarılı tozlaşma ve gübreleme için yakındaki tozlaştırıcı ağaçları gerektirir. Bununla birlikte, tozlaştırıcı olarak hizmet etmek için uygun çeşitlerin belirlenmesi zaman alıcı bir süreçtir. Bu sorunu çözmek için, agaroz jeli elektroforezi ve anilin mavisi boyama kullanan tozlaşma uyumlu narenciye çeşitlerini tanımlamak için hızlı bir yöntem geliştirdik. Polen uyumluluğu, toplam DNA'nın çıkarılması ve spesifik primerlerle PCR tabanlı genotipleme testlerinin yapılması ile S genotiplerinin tanımlanmasına dayanarak belirlenir. Ek olarak, stiller manuel tozlaşmadan 3-4 gün sonra toplanır ve anilin mavisi boyama yapılır. Son olarak, polen tüplerinin büyüme durumu floresan mikroskobu ile gözlemlenir. Polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu, polen tüpü büyümesinin sırasıyla normal mi yoksa baskılanmış mı olduğu gözlemlenerek belirlenebilir. Sadeliği ve maliyet etkinliği nedeniyle, bu yöntem, farklı çeşitler arasında uyumsuzluk grupları ve uyumsuzluk ilişkileri kurmak için farklı narenciye çeşitlerinin polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için etkili bir araçtır. Bu yöntem, uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar ve böylece yeni meyve bahçelerinin kurulmasını ve ıslah programları için uygun ebeveynlerin seçilmesini kolaylaştırır.
Introduction
Kendine uyumsuzluk (SI), anjiyosperm türlerinin yaklaşık %40'ında bulunan genetik olarak kontrol edilen bir mekanizmadır. Bu süreçte, pistil aynı SI genotipine sahip bir bitkiden poleni reddeder ve böylece kendi kendine döllenmeyi önler 1,2. Ma jia pummelo, Çin'in Jinagsu eyaletinde, büyük, pembe meyve, zengin meyve suyu içeriği, tatlı ve ekşi bir tat ve kalın bir kabuğun mükemmel nitelikleri ile yerel bir çeşittir3. SI, geçişi teşvik etmesine rağmen, meyvelerin verimini ve kalitesini olumsuz yönde etkiler4 ve güvenilir meyve tutum oranları ve yüksek verim için farklı SI genotiplerine sahip uygun tozlaştırıcı ağaçlar gerektirir. Şu anda, Brassicaceae tarafından temsil edilen sporofitik öz uyumsuzluk (SSI) ve Rosaceae, Papaveraceae, Rutaceae ve Solanaceae 5,6,7,8 tarafından temsil edilen gametofitik öz uyumsuzluk (GSI) olmak üzere iki ana SI türü vardır.
Narenciye dünyanın en önemli meyve bitkilerinden biridir. S-RNaz bazlı GSI sistemi birçok narenciye katılımında bulunur ve meyve verme oranını olumsuz yönde etkiler9. Bu sistemde SI, pistil S determinantlarını ve polen S determinantlarını taşıyan iki karmaşık aleli olan tek bir polimorfik lokus olan S lokusu tarafından kontrol edilir7. Dişi determinant S ribonükleazdır (S-RNase) ve erkek determinant S lokus F-kutusu (SLF)7'dir. Pistilin hücreleri S-RNaz proteinlerini salgılar. Kendinden olmayan S-RNazlar, SLF proteinleri tarafından tanınır, bu da 26S proteazom yolu tarafından kendinden olmayan S-RNazların ubikitinasyonuna ve bozulmasına yol açar. Buna karşılık, kendi kendine S-RNazlar polen tüpü (PT) büyümesini biriktirebilir ve inhibe edebilir, çünkü SLF proteinlerinden kaçınırlar ve bu nedenle ubikitinzasyondan 10,11,12,13 önlenirler.
Burada, S-genotiplerini ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğunun derecelerini tanımlamak için yararlı olan bir in vivo tekniği sunuyoruz. Protokol, yapraklardan toplam DNA'nın çıkarılmasını ve S'ye özgü primerler kullanılarak S genotipinin tahmin edilmesini içerir. Ayrıca, anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu ve ardından el tozlaşması, uyumluluk ve uyumsuzluk derecesi için kanıt sağlar. Laboratuarda çiçeklerin manuel olarak tozlaşmasını içeren yarı in vivo tozlaşma prosedürü14,15, kendi kendine uyumluluk ve uyumsuzluk derecelerini değerlendirmek için de uyarlanmıştır. Bununla birlikte, polen tüplerinin doğal koşullarda gelişmesine izin vermek için istenmeyen polenlerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için tarla tozlaşmasını ve ardından çiçeklerin torbalanmasını da kullandık. Bu protokol basit ve anlaşılırdır ve uygun tozlaştırıcı ağaçların başarılı bir şekilde seçilmesi için gerekli bilgileri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anilin mavisi boyama için hazırlık
- Deney için aşağıdaki reaktifleri ve araçları hazırlayın: tozlayıcı fırça, cımbız, kurşun kalem, sülfat kağıdı, tozlaşma torbası, fermuarlı kilit torbaları, ataşlar, formaldehit, buzul asetik asit, mutlak etanol, santrifüj tüpleri, forseps, tutkal damlalıkları, cam slaytlar, örtüler, neşterler ve polietilen glikol.
- % 0.02 MgSO4,% 0.01 KNO 3,% 0.03 Ca (NO 3)2,% 0.01 H 3 BO 3,% 20 PEG-4000 ve% 15 sakkaroz içeren in vitro çimlenme ortamını hazırlayın. KOH ile pH'ı 6.0-6.2'ye ayarlayın. PEG-4.000'in çözülmesi zor olduğu için manyetik bir karıştırıcı kullanın.
- Carnoy'un mutlak etanol ve 3: 1 oranında karıştırılmış buzul asetik asit olan fiksatif çözeltisini hazırlayın. % 40 formaldehit,% 80 etanol ve buzul asetik asit (1: 8: 1) olan FAA fiksasyon çözeltisini hazırlayın. 0.1 MK3PO 4'te% 0.1 anilin mavisi olan 4 M sodyum hidroksit (NaOH) ve anilin mavisi çözeltisi hazırlayın. Anilin mavisi çözeltisini saklamak için kehribar bir şişe kullanın, çünkü ışığa duyarlıdır.
2. Polen toplama
- Deney ağaçlarının çiçeklenme dönemini (bu çalışmada Ma jia pummelo) önceden bilin. Çiçeklenme döneminin başlangıcından en yüksek çiçeklenme aşamasına kadar olgun açılmamış çiçekleri toplayın ve bir fermuarlı kilit torbasına koyun. Çiçekler buzdolabında 4 ° C'de 24 saat saklanabilir.
- Çiçekleri laboratuvara götürün. Anterleri toplamak için cımbız kullanın ve bunları filtre kağıdı içeren bir Petri kabına yerleştirin. 20 ila 30 çiçek arasında anterler toplayın.
- Anterleri içeren Petri kabını, polen taneleri kuruyana kadar 24 saat boyunca 28 ° C'lik bir fırına koyun. Ayrıntılı çiçek organizasyonu için Hu et al.9'a bakınız.
- Kurutulmuş poleni 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun. Polenleri, renk değiştiren silika jel (kurutucu) içeren hava geçirmez fermuarlı kilitli bir torbada saklayın. Torbayı kapatın ve torbayı polen çeşidinin adı ve depolama tarihi ile etiketleyin. Kurutulmuş polenler -20 °C buzdolabında 96 hafta16 saklanabilir.
3. In vitro polen çimlenme testi
- Bir hücre kültürü kabına veya 2 mL'lik bir santrifüj tüpünün kapağına 300 μL sıvı ortam dökün ve poleni bir tozlaşma fırçası yardımıyla eşit şekilde serpin. Polenleri 28 ° C'de nemlendirilmiş karanlık bir ortamda 12 saat boyunca inkübe edin.
- 1.000 μL pipet ucunun ucunun üst 1 mm'sini çıkarın. Polenleri az miktarda kültür çözeltisiyle emmek için pipeti kullanın ve mikroskop slaytının ortasına taşıyın. Bir kapak fişi ile örtün. 10x objektif kullanarak numuneyi ters çevrilmiş bir mikroskopla gözlemleyin.
- Her replika17 için yaklaşık olarak aynı polen yoğunluğunu kullanarak üç bağımsız replika gerçekleştirin. Polen miktarını görsel olarak yönetin, Petri kabının tamamının polenle kaplı olduğundan ve her Petri kabının neredeyse eşit miktarda polen içerdiğinden emin olun.
- Çimlenmiş polen, çapının yaklaşık iki katı uzunluğunda bir polen tüpü üretir. Tüm polen alanlarındaki çimlenmiş polenlerin yüzdesini veren 20 görsel alandan çimlenme oranını hesaplayın.
4. Tozlaşma
- Tozlaşma için rüzgarsız güneşli bir gün seçin. Açılmak üzere olan 10 tam gelişmiş tomurcuk seçin, yaprakları dikkatlice soyun ve çürümemeye dikkat edin.
- Stigmanın yüzeyine yeterli miktarda canlı polen yaymak için bir tozlaşma fırçası kullanın ve pistile zarar vermemeye dikkat edin. Kendi kendine tozlaşma için, polenleri aynı bitki / çeşitten kullanın. Çapraz tozlaşma için, poleni farklı bir genotipe sahip bir bitkiden kullanın.
- Tozlaşan çiçekleri bir sülfat kağıt torba ile örtün. Torbayı kapatmak ve genotipik olarak farklı polenler tarafından tozlaşmayı önlemek için bir ataş kullanın.
- Etikete türlerin adını ve tozlaşma sayısını ve zamanını yazın. Etiketi tozlaşmış çiçeklerin yakınındaki dallara asın.
5. Örnekleme, sabitleme ve koruma
- Tozlaşmadan yaklaşık 3-4 gün sonra tozlaşma torbalarını çıkarın ve tozlaşan çiçekleri fermuarlı torbalarda toplayın.
- Yaprakları, kapları ve yumurtalıkları çiçeklerden derhal çıkarın ve stillere kaynaşmış damgaları, taze hazırlanmış bir fiksatif çözelti içeren bir santrifüj tüpüne batırın. Fiksatif çözeltideki stigmaları ve stilleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, fiksatif çözeltiyi atın ve stigmaları ve stilleri% 95 etanol içinde iki ila üç kez yıkayın.
- Stilleri% 70'lik bir etanol çözeltisine aktarın. Numunenin çözeltiye tamamen daldırıldığından emin olun. Bu aşamadaki stiller 1-2 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
6. Anilin mavisi boyama
- %70 etanol içinde saklanan stil numunelerini damıtılmış suyla üç ila dört kez yıkayın. 4 M NaOH çözeltisine daldırın, kapatın ve 60 dakika boyunca 65 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin. Bu adımda, stilin rengi sarı-beyazdan turuncu-kırmızıya değişir.
- Stilleri damıtılmış suda 30 dakika bekletin. Damıtılmış suyu atın ve stilleri üç ila dört kez veya stilin rengi sarı olana kadar damıtılmış suyla yıkayın.
- Numuneyi 10 mL'lik bir tüpe yerleştirin, numune daldırılana kadar anilin mavisini ekleyin ve karanlıkta 12 saat boyayın.
- Polen tüpü büyümesini floresan mikroskobu ile gözlemleyin.
7. Floresan mikroskobu
- Örnekleri gözlemlemeden önce, slaydı düz bir masaya yerleştirin ve slaydın yüzeyine iki ila üç damla polietilen glikol ekleyin.
- Dikkat edilecek stili damıtılmış su ile yıkayın. Uzunlamasına eksen boyunca iki yarıya bölmek için bir neşter kullanın. Stilin yarısını cam slayta yerleştirin ve bir kapak kayması ile örtün.
- Slaytı mikroskop sahnesine diyafram açıklığının üzerine yerleştirin ve 10x hedef kullanarak görselleştirin. DAPI filtresini kullanın (uyarım: 325-375 nm; emisyon: 435-485 nm). Her tozlaşma türü için beş stile dikkat edin. Polen tüpü büyümesini gözlemleyin.
8. PCR tabanlı S genotipi tanımlama
- CTAB yöntemi18'i kullanarak stigma örneğinden genomik DNA'yı çıkarın.
- Toplanan yaprakları 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun ve sıvı azotta tutturun. HCl:EDTA:NaCl:H2O tamponunu 1:1:3:5 oranında ve kloroform izoamil alkol karışımını 24:1 oranında hazırlayın
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne hazırlanan tampondan 10 mL, 0.2 g CTAB ve 200 μL merkaptoetanol ekleyin ve çözelti berrak ve şeffaf hale gelene kadar 5 dakika boyunca 65 ° C'de bir su banyosuna koyun.
- Bıçakları bir harç içine koyun, dondurulmuş numuneleri ekleyin, sıvı azot ekleyin ve öğütün. Öğütülmüş numuneyi 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun, 600 μL CTAB karışımı ekleyin, 60 dakika boyunca 65 ° C'de bir su banyosuna koyun ve her 30 dakikada bir baş aşağı karıştırın.
- 700 μL kloroform izoamil alkol karışımı (24:1) ekleyin ve 10 dakika boyunca baş aşağı karıştırın. 10 dakika boyunca 12.000 x g'de 24 °C'de santrifüj, süpernatanı pipet edin ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 60 μL 5 M NaCl çözeltisi ve 1 mL mutlak etanol ekleyin ve baş aşağı karıştırın. 30 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun ve 5 dakika boyunca 24 ° C ve 9.000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatanı atın, 1 mL% 70 etanol çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1-2 saat bekletin. 24 ° C'de santrifüj, 5 dakika boyunca 9.000 x g , süpernatanı atın, fazla etanol çözeltisini aspire edin ve 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
- Çözünmesi için 100 μL steril su ekleyin, DNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile ölçün ve uzun süreli depolama için -4 ° C'lik bir dondurucuda dondurun.
- RT-PCR reaksiyon sistemini yapılandırın. Aşağıdaki reaksiyon karışımını, 5 μL 2x PCRMix, her biri 0,25 μL ileri ve geri astar, 1 μL DNA (100 ng / μL) ve 3,5 μLH2O içeren 10 μL için hazırlayın.
- PCR programını Tablo 1'e göre ayarlayın. Tüm izoformlar için PCR programı 5 dakika 32x için 95 °C (30 s için 95 °C, 30 s için 55 °C ve 1 dakika için 72 °C) ve 5 dakika boyunca 72 °C idi. Ürünleri %1,5 TAE-agaroz jelleri üzerinde ayırın ve fotoğraf9. Genomik DNA kullanarak belirtilen S genotipini doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada yapılan deneyler için olgun çiçekler seçildi, anterler toplandı, bir fırında kurutuldu ve polenler 12 saat boyunca 28 ° C'de çimlendi. Polen canlılığı ve çimlenme oranları Şekil 1'de gösterildiği gibi ölçülmüştür.
Narenciye manuel olarak tozlaştırıldı ve polen uyumluluğu ve uyumsuzluğu anilin mavisi boyama ve floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi. Uyumlu polen, stigmanın yüzeyinde çimlenebilir ve büyüyebilecek ve sonuçta yumurtalıkta döllenmeye yol açabilecek normal bir polen tüpü üretebilir. Buna karşılık, uyumsuz polen tüpleri stilin yaklaşık üçte ikisinde büyüdü ve daha sonra büyümeyi durdurdu (Şekil 2).
S genotipini tanımlamak için, bitkiden toplam DNA çıkarıldı. Spesifik primerler, PCR reaksiyonlarında S lokusunun bir kısmını yükseltmek için yararlı olan S lokusunun dizisine dayanarak tasarlanmıştır. Amplifikasyon ürünleri agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi. Güçlendirilmiş bantlar tespit edildi (500-1.000 bp arasında). Karşılık gelen S genotipi tanımlandı (Şekil 3). Bu yöntemle, 63 pummelo germplazma kaynağının S genotiplerini tanımladık7. Grubumuz bu yöntemi kullanarak farklı narenciye türlerinde 21 S-haplotip tanımlamıştır19 (Tablo 2).
Şekil 1: Farklı polen çimlenme oranları. Polenlerin çimlenmesi ve büyümesi. (A) Canlı polen daha yüksek bir çimlenme oranına sahiptir ve normal bir polen tüpü yetiştirilebilir. (B) Canlı olmayan veya daha az canlı polen çok daha düşük çimlenme oranına sahiptir ve az sayıda polen tüpü büyüyebilir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tozlaşma sonrası pistillerdeki polen tüplerinin floresan mikroskobu görüntüleri. (A) Çok sayıda büyüyen polen tüpü ile kendi kendine uyumlu pistil. (B) Polen tüpü büyümesi ile kendi kendine uyumsuz pistil, stil içinde tutuklandı. Kısaltmalar: Pt = polen tüpü; vb = vasküler demet. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ma jia pummelo'dan S-RNaz geninin spesifik amplifikasyonu. PCR amplifikasyonu ve jel elektroforezinden sonra, iki amplifikasyonlu bant S10 ve S16'nın en parlak olduğu bulundu. Bu veriler Ma jia pummelo'nun genotipinin S10 veS 16 olduğunu göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: PCR tabanlı S genotipinin tanımlanması için kullanılan reaksiyon sistemi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Grubumuz tarafından tanımlanan narenciyedeki 21 S genotipleri için primerlerin listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meyve bitkilerinde, hem partenokarpi hem de SI önemli özelliklerdir, çünkü çekirdeksiz meyvelerin yolunu açarlar - tüketiciler tarafından çok takdir edilen bir özellik. Kendi kendine uyumsuzluk, kendi kendine polenin reddedilmesini teşvik eder ve böylece akrabalığı önler20. Narenciye arasında, pummelo kendi kendine uyumsuz bir çeşittir7. Tüm anjiyosperm türlerinin neredeyse% 40'ı SI21 sergiler. Bu özellik meyve tutumunu önler, verimi düşürür ve yetiştiricilere büyük ekonomik kayıplar getirir. Bu sorunu çözmek için, çiftçiler meyve bahçeleri boyunca tozlaştırıcı ağaçları içerir. Bununla birlikte, uygun tozlaştırıcı ağaçların seçimi, zaman alıcı laboratuvar deneyleri gerektiren zorlu bir iştir. Bu sorunları çözmek için, tozlaştırıcı ağaçların doğru seçimini kolaylaştırmak için SI genotiplerini tanımlamak ve farklı narenciye çeşitlerinin polen uyumluluklarını ve uyumsuzluklarını belirlemek için hızlı bir yöntem geliştirdik. Ayrıca, polen canlılığı ve çimlenme oranları, bu protokolde açıklanan in vitro yöntem kullanılarak da belirlenebilir.
Japon erik ve kayısısında farklı yöntemlerin bir kombinasyonu kullanılarak SI genotiplerinin belirlenmesi ve kendi kendine (uyumsuz) uyumluluk ve karşılıklı (in) uyumluluğun belirlenmesi hakkında bazı raporlar vardır22,23. S-spesifik primerlerin geliştirilmesi, S genotipinin tanımlanmasına dayanır. Narenciyede, 64 pummelo katılımından stigma ve polenin transkriptom analizi, stillerde özel olarak ifade edilen dokuz S-RNaz'ı ve S-RNaz'ın bir varyantını tanımlamıştır. Diğer 12 çift S-spesifik primerler daha sonra narenciyede Liang ve ark.7 ve Wei ve ark.19 tarafından geliştirilmiştir. Bununla birlikte, armut ve elmaya göre, narenciye4'te daha az S genotipi tanımlanmıştır. PCR tabanlı S genotiplerinin tanımlanması, uyumlu/uyumsuz kombinasyonlar için bir temel oluşturduğu için kritik bir adımdır. Bu protokolde bazı sınırlamalar da vardır. Bazı narenciye çeşitlerinin S genotipleri bu yöntem kullanılarak tanımlanamaz. Bu bulgu, turunçgillerdeki S genotip kütüphanesinin daha da genişletilmesi gerektiğini göstermektedir. Ek olarak, S'ye özgü primerler, oldukça benzer S dizilerine sahip çeşitlerin S genotiplerini ayırt edemez ve bu nedenle benzer S dizilerini spesifik olmayan bir şekilde yükseltir.
Toplamda, maliyet etkinliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem farklı narenciye çeşitleri için polen uyumluluğunu ve uyumsuzluğunu belirlemek için etkili bir araçtır. Bu protokol, uygun tozlaştırıcı ağaçların seçiminde ve ıslah araştırma programlarında kullanılabilir. Tozlaştırıcı ağaçların seçimi için Rutaceae familyasından çeşitli türlere (örneğin, Citrus trifoliata ve Fortunella japonica) uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32122075, 32072523) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| absolute ethanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | |
| Aniline blue | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | ||
| Boric acid, H3BO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10004818 | |
| Brown bottle | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO3 )2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 80029062 | |
| Centrifugal tube | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| centrifuge tubes | Labgic Technology Co., Ltd | ||
| CTAB | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 57-09-0(CAS) | |
| Dropping | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009617 | |
| Forceps | LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd | ||
| formaldehyde | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10010018 | |
| Fully automatic sample fast grinder | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | Tissuelyser-96 | |
| glacial acetic acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | |
| Grinding Tube | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd | ||
| Isoamyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10003218 | |
| Isopropyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80109218 | |
| label | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| Leica DMi8 | Shanghai Leica Co.,Ltd | 21903797 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10013018 | |
| MICROSCOPE Cover glass | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | |
| paper clips | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pencil | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| pollinator brush | Shanghai Yimei Plastics Co., Ltd | ||
| Polyethylene glycol, PEG 6000 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | DH229-1 | |
| Polyethylene glycol, PEG-4000 | Guangzhou saiguo biotech Co., Ltd | 1521GR500 | |
| Potassium hydroxide, KOH | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017008 | |
| Potassium nitrate, KNO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10017218 | |
| Scalpel | Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd | ||
| Slide | Zhejiang Shitai Industrial Co., Ltd | ||
| Sodium hydroxide, NAOH | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019718 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10021418 | |
| sulfate paper | Taizhou Jinnong Mesh Factory | ||
| Thermostat water bath | Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd | L-909193 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10006818 | |
| Tripotassium phosphate tribasic trihydrate, K3PO4 | Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co.,Ltd | 20032318 | |
| Tris-HCl | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 1185-53-1 | |
| zip lock bags | M&G Chenguang Stationery Co., Ltd. | ||
| β-Mercaptoethanol | GEN-VIEW SCIENTIFIC INC | 60-24-2(CAS) |
References
- Matsumoto, D., Tao, R. Recognition of S-RNases by an S locus F-box like protein and an S haplotype-specific F-box like protein in the Prunus-specific self-incompatibility system. Plant Molecular Biology. 100 (4-5), 367-378 (2019).
- Goldberg, E. E., et al.
- Zhang, L., Wang, R., Zhao, G., Wang, A., Lin, G. Comparative study on fruit quality of Guangfeng Ma jia pummelo and Pinghe red pummelo. China Agricultural Science Bulletin. 37 (22), 126-130 (2021).
- Min, H. E., Chao, G. U., Juyou, W. U., Shaoling, Z. Recent advances on self-incompatibility mechanism in fruit trees. Acta Horticulturae Sinica. 48 (4), 759-777 (2021).
- Fujii, S., Kubo, K., Takayama, S. Non-self- and self-recognition models in plant self-incompatibility. Nature Plants. 2 (9), 2-9 (2016).
- Meng, X., Sun, P., Kao, T.
- Liang, M., et al. Evolution of self-compatibility by a mutant Sm-RNase in citrus. Nature Plants. 6 (2), 131-142 (2020).
- Thomas, S. G., Franklin-Tong, V. E. Self-incompatibility triggers programmed cell death in Papaver pollen. Nature. 429, 305-309 (2004).
- Hu, J., et al. Downregulated expression of S2-RNase attenuates self-incompatibility in "Guiyou No. 1" pummelo. Horticulture Research. 8 (1), 199 (2021).
- Guo, H., Halitschke, R., Wielsch, N., Gase, K., Baldwin, I. T. Mate selection in self-compatible wild tobacco results from coordinated variation in homologous self-Incompatibility genes. Current Biology. 29 (12), 2020-2030 (2019).
- Sun, P., Li, S., Lu, D., Williams, J. S., Kao, T. Pollen S-locus F-box proteins of petunia involved in S-RNase-based self-incompatibility are themselves subject to ubiquitin-mediated degradation. The Plant Journal. 83 (2), 213-223 (2015).
- Hua, Z., Kao, T. Identification and characterization of components of a putative petunia S-locus F-box-containing E3 ligase complex involved in S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell. 18 (10), 2531-2553 (2006).
- Entani, T., et al. Ubiquitin-proteasome-mediated degradation of S-RNase in a solanaceous cross-compatibility reaction. The Plant Journal. 78 (6), 1014-1021 (2014).
- Abdallah, D. Analysis of self-incompatibility and genetic diversity in diploid and hexaploid plum genotypes. Frontiers in Plant Science. 10, 896 (2019).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Herrero, M., Rodrigo, J. Optimizing production in the new generation of apricot cultivars: self-incompatibility, S-RNase allele identification, and incompatibility group assignment. Frontiers in Plant Science. 9, 527 (2018).
- Yuan, S. C., Chin, S. W., Lee, C. Y., Chen, F. C. Phalaenopsis pollinia storage at sub-zero temperature and its pollen viability assessment. Botanical Studies. 59 (1), 1 (2018).
- Liang, M. Identification and evolution of genes related to self-incompatibility in citrus. , Huazhong Agricultural University. Wu'han, China. PhD Thesis (2019).
- Cheng, Y. J., Guo, W. W., Yi, H. L., Pang, X. M., Deng, X. X. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology Reporter. 21 (2), 177-178 (2003).
- Wei, Z., et al. Identification of S-genotypes of 63 pummelo germplasm resources. Acta Horticulturae Sinica. 49 (5), 1111-1120 (2021).
- de Nettancourt, D.
- Igic, B., Lande, R., Kohn, J. R. Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences. 169 (1), 93-104 (2008).
- Guerrero, B. I., Guerra, M. E., Rodrigo, J. Establishing pollination requirements in Japanese plum by phenological monitoring, hand pollinations, fluorescence microscopy and molecular genotyping. Journal of Visualized Experiments. (165), e61897 (2020).
- Herrera, S., Lora, J., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Determination of self- and inter-(in)compatibility relationships in apricot combining hand-pollination, microscopy and genetic analyses. Journal of Visualized Experiments. (160), e60241 (2020).
