Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

Abstract

אפידמיולוגיה מבוססת מים ושפכים התפתחה כשיטות חלופיות לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות. ההתאוששות של שברים מיקרוביאליים, כולל וירוסים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים מדגימות שפכים ומים סביבתיים היא אחד הצעדים המאתגרים בגישות אלה. במחקר זה, התמקדנו ביעילות ההתאוששות של שיטות אולטרה-סינון רציפות ופלוקולציית חלב דל שומן (SMF) באמצעות RNA משוריין כנגיף בדיקה, המשמש גם כבקרה על ידי כמה מחקרים אחרים. סינון מקדים עם מסנני דיסק ממברנות 0.45 מיקרומטר ו- 0.2 מיקרומטר יושמו כדי לחסל חלקיקים מוצקים לפני אולטרה-סינון כדי למנוע סתימה של מכשירי אולטרה-סינון. דגימות הבדיקה, שעובדו בשיטת אולטרה-סינון רציף, צוננו בשתי מהירויות שונות. מהירות מוגברת הביאה לשיעורי התאוששות וחיוביות נמוכים יותר של RNA משוריין. מצד שני, SMF הביא להתאוששות עקבית יחסית ושיעורי חיוביות של RNA משוריין. בדיקות נוספות שנערכו עם דגימות מים סביבתיות הדגימו את התועלת של SMF לריכוז שברים מיקרוביאליים אחרים. חלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה להשפיע על שיעורי ההתאוששות הכוללים, בהתחשב בשלב הסינון המוקדם המיושם לפני אולטרה-סינון של דגימות שפכים. SMF עם קדם-סינון הפגין ביצועים טובים יותר כאשר יושם על דגימות מים סביבתיים עקב ריכוזים מוצקים נמוכים יותר בדגימות ולכן שיעורי חלוקה נמוכים יותר למוצקים. במחקר הנוכחי עלה הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה מתוך הצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

Introduction

קביעת הריכוז האפקטיבי של מיקרואורגניזמים בדגימות פני השטח והשפכים לצורך ניתוח קהילות מיקרוביאליות ומחקרים אפידמיולוגיים, היא אחד הצעדים החשובים לניטור וחיזוי מהלך ההתפרצויות בקהילות 1,2. מגפת הקורונה, גילתה את החשיבות של שיפור שיטות הריכוז. נגיף הקורונה פרץ בסוף 2019 ונכון למרץ 2023 עדיין מהווה איום על בריאות האדם, חיי החברה והכלכלה. אסטרטגיות מעקב ובקרה יעילות להקלת ההשפעות של התפרצויות COVID-19 בקהילות הפכו לנושא מחקר חשוב, שכן גלים ווריאנטים חדשים של COVID-19 צצים בנוסף להעברה והתפשטות המהירה של הנגיף, כמו גם מקרים אסימפטומטיים לא מדווחים ולא מאובחנים 3,4,5. השימוש באפידמיולוגיה מבוססת שפכים עבור COVID-19 על ידי ארגוני חברה אזרחית, סוכנויות ממשלתיות ושירותים ציבוריים או פרטיים סייע לספק מידע מהיר הקשור להתפרצות ולמתן את ההשפעות של התפרצויות COVID-19 6,7,8,9. עם זאת, ריכוז SARS-CoV-2, נגיף RNA עטוף, בדגימות שפכים עדיין מציב אתגרים10. לדוגמה, אחד האתגרים האלה הוא חלוקה של SARS-CoV-2 במוצקי שפכים, אשר עשוי להשפיע על התאוששות כאשר מוצקים מסולקים במהלך ריכוז11. אם זה המקרה, מוקד הכימות/הערכה צריך להיות הן בפאזה מוצקה והן בפאזה מימית של דגימות מים סביבתיות, ולא בפאזה המימית בלבד. יתר על כן, ניתן לשנות את בחירת שיטת הריכוז בהתבסס על בדיקות וניתוחים במורד הזרם. ריכוז חלקיקי הנגיף והפתוגנים מדגימות סביבתיות הפך לנושא מחקר דחוף עם התפתחויות בתחומי הריצוף והמיקרוביום.

שיטות שונות לריכוז וירוסים יושמו בתחום ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים. כמה שיטות נפוצות הן סינון, חלב דל שומן flocculation (SMF), ספיחה / elution, ופוליאתילן גליקול משקעים12-17. ביניהם, SMF נחשב שיטה זולה ויעילה, נבדק בהצלחה ויישם עבור שחזור וירוסים, כולל SARS-CoV-2, משפכים ומים עיליים12,15,16,18. נוהל SMF הוא גישה חדשה יחסית שזכתה להכרה גוברת בקרב מחקרים סביבתיים רבים כמתודולוגיה מתאימה לשחזור בו זמנית של מגוון רחב של מיקרואורגניזמים כגון וירוסים, חיידקים ופרוטוזואנים מכל סוגי דגימות המים, כלומר דגימות בוצה, שפכים גולמיים, שפכים וקולחים19. בהשוואה למתודולוגיות ידועות אחרות לשחזור וירוסים מדגימות סביבתיות כגון אולטרה-סינון והדבקת גליצין-אלקליין, גישה מבוססת ליופיליזציה, או אולטרה-צנטריפוגה ופליטת גליצין-אלקליין, SMF דווח כשיטה היעילה ביותר עם שיעורי התאוששות וזיהוי נגיפיים גבוהים יותר18,20. במחקר הנוכחי, השתמשנו ב-RNA משוריין כנגיף בדיקה כדי להעריך את יעילות ההתאוששות של שיטות ריכוז הנגיף, כולל בדיקות להערכת התאוששות SARS-CoV-221,22.

כאן, בדקנו דגימות שפכים ומים סביבתיים כדי להדגים את התועלת של SMF ושיטת אולטרה-סינון רציפה לריכוז שברים מיקרוביאליים עבור תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR), מטגנומיקה מבוססת רצפים וריצוף אמפליקון עמוק. SMF היא שיטה זולה יחסית ואופטימלית לנפח גדול יותר של דגימות בהשוואה לשיטות אולטרה-סינון. הרעיון להשתמש בשיטת אולטרה-סינון רציפה נבע מהצורך להקטין את הנפח הסופי של תרכיזי הנגיפים בתקופת הקורונה, כאשר אספקת מכשירי האולטרה-סינון הנפוצים הייתה מוגבלת, והיה צורך בפיתוח שיטות חלופיות לריכוז הנגיף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. השוואה בין אולטרה-סינון סדרתי לבין פלוקולציית חלב דל שומן לריכוז וירוסים בדגימות שפכים

  1. הכנת דוגמאות
    1. יש לאסוף 2 ליטר של דגימות שפכים מרוכבים (משפיעים) ביחס זרימה של 24 שעות. דגימות נאספו משלושת מתקני טיהור השפכים הגדולים בוויניפג, קנדה, במהלך הקיץ והסתיו של 2020 (טבלה 1).
    2. העבירו את הדגימות למעבדה בבקבוקים חסיני אור בארגז קרח ועבדו אותן תוך 24 שעות. איסוף נתונים פיסיקליים-כימיים וביולוגיים של שפכים.
  2. בדיקות ריכוז וירוסים
    הערה: שיטת אולטרה-סינון רציפה ושיטת פלוקולציה אורגנית, כלומר פלוקולציית חלב דל שומן (SMF), יושמו כדי להעריך את יעילות ההתאוששות הכוללת של כל שיטה באמצעות RNA משוריין כוירוס בדיקה23. חוקרים אחרים השתמשו גם ב-RNA משוריין כנגיף בקרה להערכת התאוששות שיטות ריכוז לנגיפים עוטפים, כמו המשפחה Coronaviridae22,24,25,26.
    1. להוספת RNA משוריין, הגדר את נפחי בדיקת השפכים לשיטות אולטרה-סינון ו-SMF כ-140 מ"ל ו-500 מ"ל, בהתאמה. באמצעות פיפטור, ספייק 5 x 104 עותקים של RNA משוריין לשש דגימות שפכים מתוקים שנאספו בתאריך אחד ושש דגימות שפכים מתוקים בתאריך אחר, עבור כל שיטת אולטרה-סינון; יתר על כן, ספייק שש דגימות שפכים מאוחסנות (ב -4 מעלות צלזיוס) שנאספו בתאריך שלישי, מאוחר יותר, ועובדו ימים לאחר מכן עבור SMF.
      הערה: כל אחת משש ערכות הדגימות שנאספו בתאריכים שונים הורכבה משתי דגימות מכל אחד משלושת WWTPs. במחקר שלנו, הקבוצה הראשונה של דגימות שפכים מתוקים נאספה ב-8 ביולי 2020, השנייה ב-30 בספטמבר 2020, ודגימות השפכים יאוחסנו עבור SMF ב-14 באוקטובר 2020.
    2. יש לערבב במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לחסן וליצור הומוגניות של הרנ"א המשוריין בדגימות באמצעות מערבל מגנטי.
    3. הסר את כל החלקיקים או התאים הגדולים מ- 0.2 מיקרומטר ובצע אולטרה-סינון.
      1. סננו את דגימות השפכים הקוצניים (120 מ"ל מכל דגימה של 140 מ"ל) דרך בד גבינה וקשירה דלת חלבון, 0.45 מיקרומטר ו-0.2 מיקרומטר, מסנני דיסק ממברנות בקוטר 47 מ"מ, בהתאמה, כדי להסיר חלקיקים גדולים, משקעים, איקריוטים וחיידקים27. עבד את הדגימות המסוננות באמצעות שיטות אולטרה-סינון המתוארות להלן.
        הערה: דגימות השפכים שנאספו ב-8ביולי וב-30 בספטמבר שימשו לשיטותאולטרה-סינון עם 3,000 x g ו-7,500 x g, בהתאמה.
      2. עבור אולטרה-סינון רציף ב-3,000 x g (UF-3k x g), רכז סך של 120 מ"ל של דגימת הבדיקה שנאספה בתאריך הראשון ב-3,000 x g למשך 30 דקות על-ידי טעינת 60 מ"ל של הדגימה פעמיים לכ-5 מ"ל באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג A, 30-kDa. לאחר מכן, רכז את נפח 5 מ"ל ב- 3,000 x גרם למשך 30 דקות באמצעות התקן צנטריפוגלי מסוג B, 30-kDa, ל- 500-1,200 μL.
      3. עבור אולטרה-סינון רציף ב-7,500 x גרם (UF-7.5k x g), שנה את מהירות הצנטריפוגה עבור המכשיר הצנטריפוגלי של המותג B מ-3,000 x g ל-7,500 x g כדי לקבל נפחים סופיים קטנים יותר, בהתאם להמלצות היצרן, ולשמור על מהירות הצנטריפוגה של המכשיר הצנטריפוגלי של המותג A זהה.
        הערה: הבדיקות בוצעו עם הדגימות שנאספו ב-30 בספטמבר.
    4. עבור SMF, בצע את השלבים המפורטים להלן.
    5. יש להקפיץ את דגימות השפכים (500 מ"ל כל אחת) לריכוז ישיר באמצעות פרוטוקול SMF16,18, ללא סינון מוקדם עם בד גבינה ומסנני דיסק קשירה דלת חלבון, כמתואר להלן.
    6. יש להמיס 0.5 גרם אבקת חלב דל שומן ב-50 מ"ל מי ים סינתטיים לקבלת תמיסת חלב דל שומן במינון 1% (w/v) ולהתאים בזהירות את רמת החומציות של התמיסה ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
      הערה: החמצה גורמת לנגיפים להצטבר ולזרז מחוץ למים עקב השינוי בנקודה האיזואלקטרית שלהם16 ומשפרת את המסיסות של אבקת חלב28.
    7. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן ל 500 מ"ל של דגימות שפכים גולמיים כדי לקבל ריכוז סופי של חלב דל שומן של 0.01% (w / v).
    8. מערבבים את הדגימות במשך 8 שעות במהירות בינונית ומאפשרים לפלוקים שנוצרו להסתפק בעוד 8 שעות בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את supernatants בזהירות באמצעות פיפטות סרולוגיות מבלי להפריע flocs התיישבו. העבר נפח סופי של 50 מ"ל המכיל את flocs לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 8 ° C.
    10. יש לגרד בזהירות את הכדוריות באמצעות מרית מעוקרת, ולהשהות מחדש את הכדוריות הנותרות בצינורות ב-250 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M (pH 7.5) לאחר הסרת הסופרנאטנט. העבירו את הכדוריות המרוטשות והתלויות מחדש לאותם צינורות מיני-צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל.
  3. ביצוע מיצוי RNA נגיפי מתרכיזים נגיפיים של דגימות שפכים ומבחני יעילות התאוששות באמצעות ערכת מיצוי RNA עם יחס של 25:24:1 של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל ו-β-מרקפטואתנול, בהתאם להוראות היצרן, כדי לשפר את יעילות המיצוי. לבסוף, לטשטש את הרנ"א ב 50 μL של חיץ אלוציה.
  4. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR)
    1. כימות RNA משוריין באמצעות דילול פי עשרה (7.8 x 10,4 עד 7.8 עותקי גנים) של DNA סינתטי חד-גדילי או מבנה gBlock. ראו טבלה 2 עבור הפריימרים וערכות הגשושיות המזהות ומכמתות את הרנ"א המשוריין.
    2. תכננו ערכות פריימר וגשושית באמצעות כלי תכנון פריימר29 וכוונו לאזור של 95 bp (מבנה gBlock) בתוך גנום ה-RNA המשוריין.
    3. השג עקומות כיול עבור כל ריצת RT-qPCR. כלול בקרות שליליות בכל הפעלת qPCR. הפעל תקנים, דוגמאות ופקדים שאינם פקדים שאינם תבניות בשלושה שולשים.
    4. הכינו כל תערובת RT-qPCR של 10 μL בסדר הבא: 2.5 μL של תערובת מאסטר 4x, 400 ננומטר של כל פריימר, בדיקה של 200 ננומטר ו-2.5 מיקרוליטר של תבנית, כמו גם מים מזוקקים טהורים במיוחד ללא DNAse/RNAse.
    5. בצע תגובות מחזור תרמיות ב- 50 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן 45 מחזורים של 95 ° C עבור 10 שניות ו- 60 ° C במשך 30 שניות במערכת PCR בזמן אמת. אם ה- CT היה <40, שקול את הדגימה RNA משוריין חיובי.
    6. בצע בדיקות qPCR ו- RT-qPCR באמצעות אלבומין בסרום בקר עם דגימות ביוב גולמיות כדי להעריך את האפשרות של מעכבים או מזהמים כגון חומצות הומיות24. לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות עם ובלי האנזים.
  5. חישוב הריכוזים מהעקומה הסטנדרטית. חשב את אחוז יעילות ההתאוששות על ידי חלוקת הריכוז המשוחזר בריכוז הקוצני.
  6. שנה מספרי העתקי גנים באמצעות הפונקציה log10 לניתוח. הפעל מודל ליניארי כללי באמצעות כלי ניתוח סטטיסטי על נתוני qPCR. יישם את הבדיקה של טוקי כדי לזהות הבדלים בין השיטות והטיפולים. קח ערך p של 0.05 כדי להיות רמת מובהקות מינימלית עבור המבחן.

2. סינון וריכוז נגיפי DNA ו-RNA לאפידמיולוגיה מבוססת מים

  1. לאיסוף מים עיליים סביבתיים, אספו 10 ליטר של דגימות מים עיליים סביבתיים והשתמשו ב-10 ליטר של דגימות מים שעברו דה-יוניזציה לבקרת רקע. אחסנו את כל הדגימות בחדר בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד תוך 24 שעות לאחר איסוף הדגימות.
  2. בצע ריכוז של וירוסים מדגימות סביבתיות עם SMF באמצעות השלבים המתוארים להלן.
    1. בצע סינון קפסולות ואקום באמצעות קפסולות דגימת מי תהום בקיבולת גבוהה ומסנני דיסק ממברנה בגדלים 0.45 מיקרומטר, 0.2 מיקרומטר ו- 0.1 מיקרומטר כדי למזער רעש במהלך ריצוף מטאגנומי, משברים גדולים יותר כגון מיקרו-איקריוטים וחיידקים ועד קטנים יותר כגון וירוסים.
    2. הכינו תמיסת חלב דל שומן בנפח 1% לפי נפח ב-1.32 ליטר מי ים סינתטיים עם 13.2 גרם אבקת חלב דל שומן. התאם את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 באמצעות 1 N HCl.
  3. התאימו את רמת החומציות של דגימות המים העיליים הסביבתיים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
  4. העבירו 100 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן חומצי מראש לדגימות מים סביבתיות של 10 ליטר חומצה (pH 3.5) (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]).
  5. בעזרת מערבל מגנטי ומוט ערבוב מגנטי, ערבבו את הדגימות במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר ואפשרו לפלוקים לשקוע על ידי כוח הכבידה במשך 8 שעות נוספות. מבלי להפריע לפלוקים, הסירו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות משאבת ואקום.
  6. Aliquot ולאזן את שאר flocs על פי המשקל בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולסובב אותם למטה ב 8,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  7. השליכו את הסופרנאטנט והמיסו את הגלולה המתקבלת (המכילה באופן תיאורטי וירוסים בעלי עניין) ב-200 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 0.2 M.
  8. טפל בכדורית המומסת עם DNase I ו- RNase A, בהתאם להוראות היצרן, כדי לסלק DNA ו- RNA חופשיים נוכחים שעשויים להיות מואצים יחד בגלל הערכה המשמשת למיצוי חומצות גרעין. בטל את ההפעלה של DNase I ו- RNase A בהתאם להוראות היצרן.
  9. יש לחלץ את סך חומצות הגרעין מהגלולה המומסת באמצעות ערכת מיצוי DNA/RNA, בהתאם להוראות היצרן.
  10. כמת את הכמות הכוללת של DNA ו- RNA שחולצו מדגימות קולחים באמצעות פלואורומטר. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL נחשבות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.
  11. בצע ניתוח qPCR כדי להתמקד וירוסים אנטריים מעניינים וריצוף תפוקה גבוהה כדי לזהות את מבנה הקהילה הנגיפית.

3. משקעים ישירים וריכוז של שברים מיקרוביאליים לאפידמיולוגיה מבוססת מים

  1. אספו 2 ליטר דגימות מים מנתיבי מים מוגנים ומושפעים. אם הדגימה מכילה כמות ניכרת של פסולת, השתמש בבד גבינה כדי להסיר אותם.
    הערה: מומלץ מאוד לאסוף עותק ביולוגי לכל דגימה.
  2. הכינו תמיסת חלב דל שומן 1% (w/v) על ידי המסת 4.4 גרם אבקת חלב דל שומן ב-440 מ"ל מי ים סינתטיים. כוונן את ה- pH של מתלה זה ל- 3.5 עם 1 N HCl.
  3. התאימו את רמת החומציות של דגימות המים המתוקים ל-3.5 באמצעות 1 N HCl.
  4. הוסף 20 מ"ל של תמיסת חלב דל שומן לדגימות 2 ליטר מים מתוקים שהותאמו בעבר ל- pH (ריכוז חלב דל שומן סופי של 0.01% [w/v]). ערבבו את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 8 שעות.
  5. אפשרו לפלוקים לשקוע בכוח הכבידה למשך 8 שעות נוספות. בזהירות להסיר את supernatants עם משאבה פריסטלטית. מעבירים את הפלוקים המשוקעים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומסובבים אותם במהירות של 8,000 x גרם למשך 30 דקות.
  6. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הכדוריות עם 200 μL של חיץ נתרן פוספט 0.2 M. אחסן את הדגימות ב -20 ° C או המשך לבחור ~ 0.5 גרם של floc עבור מיצוי DNA מיקרוביאלי באמצעות ערכת בידוד חומצות גרעין לפי בחירה, בהתאם להוראות היצרן.
  7. לקבוע את ריכוז חומצת הגרעין DNA ואת טוהר עם פלואורומטר רגישות גבוהה. דגימות עם ריכוזים >1 ng/μL צריכות להיות אופטימליות לכימות וריצוף DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הערכת שיטות ריכוז RNA נגיפי
כל שש הדגימות שעובדו עם UF-3k x g היו חיוביות והביאו להתאוששות של 13.38% ± 8.14% (איור 1). רק דגימה אחת הייתה חיובית כאשר הדגימות עובדו עם UF-7.5k x g. כל הדגימות שעובדו עם SMF היו חיוביות והביאו להתאוששות של 15.27% ± 2.65% (איור 1). שיעורי ההתאוששות הממוצעים של UF-3K x g ו- SMF היו גבוהים באופן משמעותי ועקבי (p < 0.0001) מאשר UF-7.5K x g. מצד שני, לא היה הבדל משמעותי (p = 0.6240) בין שיעורי ההתאוששות של UF-3K x g ו- SMF. הגדלת מהירות הצנטריפוגה של המכשיר הצנטריפוגלי מסוג B מ-3,000 x גרם ל-7,500 x גרם הביאה להתאוששות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מעבר RNA משוריין דרך מסננים בקצב מוגבר וקשירה של חלקיקי RNA משוריין אל המסננים במהירות צנטריפוגלית מוגברת. סילוק חלקיקים מוצקים בשיטות אולטרה-סינון עשוי להסביר את שיעורי ההתאוששות הנמוכים יותר של שיטות האולטרה-סינון כנגד SMF, בהתחשב בחלוקה הפוטנציאלית של RNA משוריין למוצקי שפכים30. בנוסף, פרמטרים פיסיקוכימיים וביולוגיים של שפכים (מטה-נתונים) מסוכמים בטבלה 1. בדיקת SMF עם מים עיליים (שלב 2) הביאה לשיעור התאוששות גבוה יותר, 42.7% ± 15.1%, מה שמצביע על כך שחלוקת הנגיפים לחלקיקים מוצקים עשויה הייתה להשפיע באופן משמעותי על ההתאוששות בהתחשב בריכוזים מוצקים נמוכים במים עיליים.

סינון סדרתי וריכוז וירוסים
טבלה 3 מסכמת את הפרמטרים של איכות המים וחומצות הגרעין שהופקו מדגימות מים סביבתיות שנאספו בוויניפג לאורך שלוש עונות. הדנ"א היה ניתן לכימות בכל אתרי הדגימה ולאורך עונות השנה. איור משלים 1 מציין מפה עם מיקומי המים העיליים הסביבתיים. מצד שני, ערכי הרנ"א היו לרוב מתחת לגבול הגילוי באמצעות פלואורומטר (<0.025 ננוגרם/μL). תמציות רנ"א אלה הוגברו באופן אקראי כדי ליצור cDNA הניתן לכימות עבור ריצוף בתפוקה גבוהה (טבלה 3).

ריכוז שברים מיקרוביאליים מדגימות מים סביבתיות
איור 2 ואיור 3 מתארים את תהליך העבודה של המתודולוגיה והריכוז של שברים מיקרוביאליים מדגימות מים סביבתיים על פני השטח. טבלה 4 מכילה את ריכוז הדנ"א הממוצע, סטיית התקן והתנאים הסביבתיים, כגון pH, טמפרטורה, חמצן מומס, לחץ אטמוספרי, משקעים וזמני אור יום של אתרי הדגימה של נתיבי המים המוגנים (מיוערים) והמושפעים (עירוניים וחקלאיים) שנותחו במחקר זה. הדגימות נאספו מדי חודש מאפריל 2022 עד אוקטובר 2022 באזורים עירוניים וכפריים סביב העיר Portage la Prairie לאורך נהר Assiniboine במניטובה, קנדה. ריכוז הדנ"א הגבוה ביותר נצפה באתר המיוער 1 והניב 109.35-229.18 ננוגרם/מיקרוליטר. מצד שני, ריכוז הדנ"א המיקרוביאלי הנמוך ביותר נמצא באתר החקלאי 3 והיה בריכוז ממוצע של 19.83-22.05 ננוגרם/מיקרוליטר. ריכוז הדנ"א הממוצע, סטיית התקן והמטא נתונים של כל הדגימות שנאספו בחודשים אפריל-אוקטובר 2022 מסוכמים בטבלה 4. ריכוזי הדנ"א שהתקבלו היו אופטימליים עבור יישומים אחרים במורד הזרם, הכוללים PCR, qPCR וריצוף (נתונים שאינם מוצגים).

Figure 1
תרשים 1: אחוזי התאוששות וניתוח סטטיסטי של כל שיטה לדגימות שפכים. קיצורים: SMF = חלב דל שומן; UF-3K x g = אולטרה-סינון ב-3,000 x גרם; UF-7.5K x g = אולטרה-סינון ב-7,500 x גרם. אמצעים עם כוכבית (*) מצביעים על הבדלים משמעותיים ברמה של 0.05 בין הטיפולים; n = 6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצוג סכמטי של המתודולוגיה המשמשת לריכוז וכימות וירוסים מגופי מים עירוניים של מניטובה הקולטים קולחים. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תקציר גרפי של ריכוז נגיפים, חיידקים ומיקרו-איקריוטים לצורך כימות וריצוף דנ"א. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים משלים 1: מיקומן של 11 דגימות מים סביבתיות. דגימות נאספו לאורך הנהרות אדום ואסיניבואין בוויניפג, מניטובה, כפי שמצוין על ידי הנקודות האדומות. שלושת מתקני טיהור השפכים הגדולים של ויניפג מסומנים בכחול כאחד האתרים שבהם ביקרו, למרות שלא התרחשו אירועי דיגום. מקורות הנתונים הם מפות גוגל ותוכנת Tableau. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה 1: פרמטרים של איכות המים בדגימות משפיעות של NESTP, SESTP ו-WESTP. קיצורים: NESTP = מתקן טיהור שפכים בקצה הצפוני; SESTP = מתקן טיהור שפכים בקצה הדרומי; WESTP = מתקן טיהור שפכים ווסט אנד; MLD = מיליון ליטר ליום; TS = סך כל המוצקים; TSS = סך כל המוצקים המרחפים ; BOD5 = דרישת חמצן ביוכימית של 5 ימים; NH4-N = אמוניום-חנקן; TP = סך הזרחן; TOC = סך כל הפחמן האורגני; TN = חנקן כולל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ערכות פריימר/בדיקה של מבחני RT-qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: פרמטרים של איכות המים בנהרות אדום ואסיניבואין במהלך איסוף הדגימות באביב ב-16 במאי, בקיץ ב-27 באוגוסט ובסתיו ב-21 בנובמבר 2021) וכימות פלואורומטר של סך חומצות הגרעין (DNA ו-RNA). * מגבלת הזיהוי של ערכת ה-RNA היא 0.025 ננוגרם/מיקרוליטר; ^ מספרים מייצגים ערכי טווח. קיצורים: DO = חמצן מומס; BOD 5 = דרישת חמצן ביוכימית של5 ימים; TP = זרחן כולל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: פרמטרים של איכות מי נחל אסיניבואין במהלך איסוף הדגימה (אפריל עד אוקטובר 2022). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד השלבים הקריטיים במחקר זה הוא חיסול חלקיקים מוצקים על ידי יישום שלב סינון מקדים עם מסנני קרום 0.2 מיקרומטר ו- 0.45 מיקרומטר. בהתחשב בחלוקה של וירוסים לחלקיקים מוצקים, במיוחד וירוסים עטופים, סינון מוקדם יכול לגרום לאובדן משמעותי בהתאוששות הנגיפים30. בעוד שלב טרום סינון עבור שיטות אולטרה-סינון הוא כמעט תמיד הכרחי עבור דגימות סביבתיות ומי שפכים כדי למנוע סתימה של התקני אולטרה-סינון, סינון מקדים עבור SMF עשוי להידרש בהתאם לסוג הניתוח במורד הזרם. עבור מחקרי PCR ממוקדים, ייתכן שלא יהיה צורך בסינון מוקדם. מצד שני, סינון מקדים עשוי לשפר באופן משמעותי את המטגנומיקה של הנגיף, שכן הוא מפחית את רעשי הרקע בווירומים משברים גדולים יותר כגון מיקרו-איקריוטים וחיידקים. שלב זה הוא קריטי לריצוף כך שגנומים גדולים יותר לא ינחילו את האות הנגיפי.

נפח הדגימה שניתן לעבד עם אולטרה-סינון רציף מוגבל ל -140 מ"ל. זוהי מגבלה חשובה עבור דגימות עם ספירת וירוסים נמוכה. מצד שני, SMF יכול לעבד נפחי דגימה גדולים בהרבה, מה שמגדיל את ההסתברות לשחזור וירוסים.

שיעורי ההתאוששות של SMF עולים בקנה אחד עם מחקרים אחרים המתמקדים בריכוז חלקיקים נגיפיים משפכים. מאמרים שפורסמו בעבר דיווחו על שיעורי החלמה דומים עם מגוון וירוסי בדיקה. שיעורי ההחלמה הממוצעים המדווחים במחקרים אלה נעו בין 3.4% ל-14%13,31,32. המתודולוגיה הנוכחית הייתה חלק ממחקר אחר שחקר את SARS-CoV-2 במי שפכים ביחס למספרי המקרים בוויניפג33. שיטת SMF המתוארת כאן שימשה גם לסינון RNA של SARS-CoV-2 בלגונות חמצון מקהילות כפריות של מניטובה במעבדה שלנו. התועלת של שיטת SMF שימשה גם בשילוב עם סינון טורי (0.45 מיקרומטר ואחריו 0.2 מיקרומטר ו-0.1 מיקרומטר) כדי לאפיין קהילות נגיפיות בדגימות מים מתוקים מסביבות עירוניות באמצעות ריצוף בתפוקה גבוהה במעבדה שלנו (המתואר בחלק השני של המתודולוגיה). לבסוף, ניתן ליישם את שיטת SMF גם כדי לכוון משקעים של קהילות מיקרוביות, כגון מיקרו-איקריוטים, חיידקים ווירוסים מדגימות מים סביבתיות, ואפיון נוסף באמצעות ריצוף אמפליקון עמוק של הגנים rRNA 18S ו-16S rRNA, כמו גם הגן העיקרי של חלבון קפסיד (g23) של קבוצות נגיפיות כגון וירוסים דמויי T4 (Zambrano ו-Uyaguari-Díaz, נתונים שלא פורסמו). שיטת SMF מאפשרת לרכז את השברים המיקרוביאליים הנמצאים בדגימות מים מנפחי קלט גדולים (כלומר, 10-40 ליטר) לנפחים קטנים יחסית (כלומר, 1-5 מ"ל). כחלק ממתודולוגיה זו, מים אולטרה-טהורים נכללים גם כבקרה שלילית/רקע. ברגע שהשברים המיקרוביאליים מרוכזים, מיצוי חומצות גרעין יכול להתבצע באמצעות ערכות מיצוי מסחריות או פרוטוקולים פנימיים. SMF מייצג שיטה רב-תכליתית, זולה יחסית וקלה/מעשית לריכוז שברים מיקרוביאליים או חלקיקים נגיפיים, ללא הבדלים משמעותיים בהשוואה לאולטרה-סינון או גישות סינון זרימה משיקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NSERC Alliance Covid-19 Grant (פרס מס '431401363, 2020-2021, ד"ר יואן ואויגווארי-דיאז). MUD רוצה להודות לתוכנית מענקי המחקר של האוניברסיטה (פרס מס '325201). הן JF והן JZA נתמכים על ידי תוכנית ההכשרה לתואר שני בניתוח מחלות חזותי ואוטומטי (VADA). KY ו-JF קיבלו שניהם מלגות מתוכנית Mitacs Accelerate. MUD וחברי המעבדה שלו (KY, JF, JZA) נתמכים על ידי NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ומענק החוקר החדש של מחקר מניטובה (No 5385). תודה מיוחדת לעיר ויניפג, מניטובה. מחקר זה נערך באוניברסיטת מניטובה. ברצוננו להכיר בכך שהקמפוסים של אוניברסיטת מניטובה ממוקמים על האדמות המקוריות של עמי אנישינבג, קרי, אוג'י-קרי, דקוטה ודיין ועל מולדת אומת מטיס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 193
ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanaç, K., Francis, J.,… More

Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter