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Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

La concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales es una tarea desafiante, llevada a cabo principalmente para la identificación y cuantificación de virus. Si bien se han desarrollado y probado varios métodos de concentración de virus, demostramos aquí la efectividad de la ultrafiltración y la floculación de leche desnatada para virus de ARN con diferentes tipos de muestras.

Abstract

La epidemiología basada en el agua y las aguas residuales ha surgido como métodos alternativos para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades. La recuperación de fracciones microbianas, incluidos virus, bacterias y microeucariotas de aguas residuales y muestras de agua ambiental es uno de los pasos desafiantes en estos enfoques. En este estudio, nos centramos en la eficiencia de recuperación de los métodos secuenciales de ultrafiltración y floculación de leche desnatada (SMF) utilizando ARN blindado como virus de prueba, que también se utiliza como control en algunos otros estudios. Se aplicó prefiltración con filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm para eliminar las partículas sólidas antes de la ultrafiltración para evitar la obstrucción de los dispositivos de ultrafiltración. Las muestras de prueba, procesadas con el método de ultrafiltración secuencial, se centrifugaron a dos velocidades diferentes. Una mayor velocidad resultó en menores tasas de recuperación y positividad de ARN blindado. Por otro lado, SMF resultó en tasas de recuperación y positividad relativamente consistentes de ARN blindado. Pruebas adicionales realizadas con muestras de agua ambiental demostraron la utilidad de SMF para concentrar otras fracciones microbianas. La partición de los virus en partículas sólidas podría tener un impacto en las tasas generales de recuperación, teniendo en cuenta el paso de prefiltración aplicado antes de la ultrafiltración de muestras de aguas residuales. SMF con prefiltración funcionó mejor cuando se aplicó a muestras de agua ambiental debido a las concentraciones de sólidos más bajas en las muestras y, por lo tanto, a las tasas de partición más bajas a sólidos. En el presente estudio, la idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración comúnmente utilizados era limitado, y existía la necesidad del desarrollo de métodos alternativos de concentración viral.

Introduction

La determinación de la concentración efectiva de microorganismos en muestras de superficie y aguas residuales para análisis de comunidades microbianas y estudios epidemiológicos, es uno de los pasos importantes para monitorear y predecir el curso de los brotes en las comunidades 1,2. La pandemia de COVID-19, puso de manifiesto la importancia de mejorar los métodos de concentración. COVID-19 surgió a fines de 2019 y, a partir de marzo de 2023, todavía representa una amenaza para la salud humana, la vida social y la economía. Las estrategias efectivas de vigilancia y control para aliviar los impactos de los brotes de COVID-19 en las comunidades se han convertido en un importante tema de investigación, ya que han surgido nuevas olas y variantes de COVID-19, además de la rápida transmisión y propagación del virus, así como casos asintomáticos no notificados y no diagnosticados 3,4,5. El uso de la epidemiología basada en las aguas residuales para COVID-19 por parte de organizaciones de la sociedad civil, agencias gubernamentales y servicios públicos o privados ha sido útil para proporcionar información rápida relacionada con el brote y mitigar los impactos de los brotes de COVID-19 6,7,8,9. Sin embargo, la concentración de SARS-CoV-2, un virus de ARN envuelto, en muestras de aguas residuales todavía plantea desafíos10. Por ejemplo, uno de estos desafíos es la partición del SARS-CoV-2 en los sólidos de aguas residuales, lo que puede afectar la recuperación cuando los sólidos se eliminan durante la concentración11. Si este es el caso, el enfoque de la cuantificación / evaluación debe estar en las fases sólida y acuosa de las muestras de agua ambiental, en lugar de la fase acuosa solamente. Además, la elección del método de concentración puede modificarse en función de ensayos y análisis posteriores. La concentración de partículas de virus y patógenos de muestras ambientales se ha convertido en un tema de investigación urgente con desarrollos en los campos de secuenciación y microbioma.

Se han aplicado varios métodos de concentración de virus en el campo de la concentración de virus a partir de muestras ambientales de agua y aguas residuales. Algunos métodos comúnmente utilizados son la filtración, la floculación de leche desnatada (SMF), la adsorción/elución y la precipitación de polietilenglicol12-17. Entre ellos, SMF ha sido considerado un método barato y eficaz, probado con éxito y aplicado para recuperar virus, incluido el SARS-CoV-2, de aguas residuales y superficiales12,15,16,18. El procedimiento SMF es un enfoque relativamente nuevo que ha ganado un mayor reconocimiento entre muchos estudios ambientales como una metodología apropiada para recuperar simultáneamente una amplia gama de microorganismos como virus, bacterias y protozoos de todo tipo de muestras de agua, a saber, lodos, aguas residuales sin tratar, aguas residuales y muestras de efluentes19. En comparación con otras metodologías conocidas para recuperar virus de muestras ambientales como la ultrafiltración y la elución glicina-alcalina, el enfoque basado en la liofilización o la ultracentrifugación y la elución glicina-alcalina, la SMF ha sido reportada como el método más eficiente con mayores tasas de recuperación y detección viral18,20. En el presente estudio, utilizamos ARN blindado como virus de prueba para evaluar la eficiencia de recuperación de los métodos de concentración del virus, incluidas las pruebas para evaluar la recuperación del SARS-CoV-221,22.

Aquí, probamos muestras de aguas residuales y agua ambiental para demostrar la utilidad de SMF y un método de ultrafiltración secuencial para concentrar fracciones microbianas para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), la metagenómica basada en secuencias y la secuenciación de amplicones profundos. SMF es un método relativamente más barato y óptimo para un mayor volumen de muestras en comparación con los métodos de ultrafiltración. La idea de utilizar un método de ultrafiltración secuencial surgió de la necesidad de disminuir el volumen final de los concentrados virales durante la pandemia de COVID-19, cuando el suministro de los dispositivos de ultrafiltración de uso común era limitado, y existía la necesidad de desarrollar métodos alternativos de concentración viral.

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Protocol

1. Comparación de la ultrafiltración en serie y la floculación de la leche desnatada para concentrar virus en muestras de aguas residuales

  1. Preparación de muestras
    1. Recolectar 2 L de muestras compuestas de aguas residuales crudas (afluentes) proporcionales al caudal de 24 h. Se recogieron muestras de las tres principales plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) en Winnipeg, Canadá, durante el verano y el otoño de 2020 (Tabla 1).
    2. Transportar las muestras al laboratorio en botellas a prueba de luz en una nevera y procesarlas en 24 h. Recopilar datos de características físico-químicas y biológicas de las aguas residuales.
  2. Ensayos de concentración de virus
    NOTA: Se aplicaron un método de ultrafiltración secuencial y un método de floculación orgánica, a saber, floculación de leche desnatada (SMF), para evaluar la eficiencia de recuperación total de cada método utilizando ARN blindado como virus de prueba.23. Otros investigadores también han utilizado el ARN blindado como virus de control para evaluar la recuperación de métodos de concentración para virus envueltos, como la familia. Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Para la adición de ARN blindado, establezca los volúmenes de prueba de aguas residuales para los métodos de ultrafiltración y SMF como 140 ml y 500 ml, respectivamente. Usando un pipetero, pinchar 5 x 104 copias de ARN blindado en seis muestras de aguas residuales frescas recolectadas en una fecha y seis muestras de aguas residuales frescas en otra fecha, para cada método de ultrafiltración; además, se aumentaron seis muestras de aguas residuales almacenadas (a 4 °C) recogidas en una tercera fecha posterior y procesadas días después para SMF.
      NOTA: Cada uno de los seis conjuntos de muestras recogidos en diferentes fechas estaba compuesto por dos muestras de cada una de las tres EDAR. En nuestro estudio, el primer conjunto de muestras frescas de aguas residuales se recolectó el 8 de julio de 2020, el segundo el 30 de septiembre de 2020 y las muestras de aguas residuales se almacenarán para SMF el 14 de octubrede 2020.
    2. Remover durante 30 min a 4 °C para inocular y homogeneizar el ARN blindado en las muestras utilizando un agitador magnético.
    3. Eliminar todas las partículas o células mayores de 0,2 μm y realizar la ultrafiltración.
      1. Filtrar las muestras de aguas residuales con púas (120 ml de cada muestra con púas de 140 ml) a través de gasa y unión de baja proteína, filtros de disco de membrana de 0,45 μm y 0,2 μm, 47 mm, respectivamente, para eliminar partículas grandes, sedimentos, eucariotas y bacterias27. Procesar las muestras filtradas utilizando los métodos de ultrafiltración que se describen a continuación.
        NOTA: Las muestras de aguas residuales recogidas el 8 de julio y el 30 deseptiembre se utilizaron para métodos de ultrafiltración con 3.000 xg y 7.500 x g, respectivamente.
      2. Para la ultrafiltración secuencial a 3.000 x g (UF-3k x g), concentrar un total de 120 ml de la muestra problema recogida en la primera fecha a 3.000 x g durante 30 min cargando 60 ml de la muestra dos veces a aproximadamente 5 ml utilizando un dispositivo centrífugo de marca A, 30 kDa. Luego, concentre el volumen de 5 ml a 3,000 x g durante 30 minutos usando un dispositivo centrífugo de marca B, 30 kDa, a 500-1,200 μL.
      3. Para la ultrafiltración secuencial a 7.500 x g (UF-7,5k x g), cambie la velocidad de centrifugación para el dispositivo centrífugo de la marca B de 3.000 x g a 7.500 x g para obtener volúmenes finales más pequeños, según las recomendaciones del fabricante, y mantenga la misma velocidad de centrifugación del dispositivo centrífugo de la marca A.
        NOTA: Las pruebas se realizaron con las muestras recogidas el 30 deseptiembre.
    4. Para SMF, realice los pasos que se describen a continuación.
    5. Aumentar las muestras de aguas residuales (500 ml cada una) para concentrarlas directamente utilizando el protocolo SMF16,18, sin prefiltración con gasa y filtros de disco de membrana de unión baja en proteínas, como se describe a continuación.
    6. Disolver 0,5 g de leche desnatada en polvo en 50 ml de agua de mar sintética para obtener una solución de leche desnatada al 1% (p/v) y ajustar cuidadosamente el pH de la solución a 3,5 utilizando 1 N HCl.
      NOTA: La acidificación hace que los virus se agreguen y precipiten fuera del agua debido al cambio en su punto isoeléctrico16 y mejora la solubilidad de la leche en polvo28.
    7. Añadir 5 ml de solución de leche desnatada a 500 ml de muestras de aguas residuales crudas para obtener una concentración final de leche desnatada del 0,01% (p/v).
    8. Revuelva las muestras durante 8 h a velocidad media y deje que los flóculos formados se asienten durante otras 8 h a temperatura ambiente.
    9. Retirar los sobrenadantes con cuidado utilizando pipetas serológicas sin alterar los flóculos asentados. Transfiera un volumen final de 50 ml que contenga los flóculos a los tubos de centrifugación y centrifugar a 8.000 x g durante 30 min a 8 °C.
    10. Desechar cuidadosamente los gránulos con una espátula esterilizada y volver a suspender los gránulos restantes en los tubos en 250 μL de tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7,5) después de retirar el sobrenadante. Transfiera los gránulos raspados y resuspendidos a los mismos tubos de minicentrífuga de 1,5 ml.
  3. Realice la extracción de ARN viral de concentrados virales de muestras de aguas residuales y ensayos de eficiencia de recuperación utilizando un kit de extracción de ARN con una proporción de 25:24:1 de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y β-mercaptoetanol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para mejorar la eficiencia de extracción. Finalmente, eluye el ARN en 50 μL de tampón de elución.
  4. Análisis cuantitativo en tiempo real de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR)
    1. Cuantificar el ARN blindado utilizando diluciones diez veces (7.8 x 104 a 7.8 copias de genes) de una construcción sintética de ADN monocatenario o gBlock. Consulte la Tabla 2 para los cebadores y conjuntos de sondas que detectan y cuantifican el ARN blindado.
    2. Diseñe conjuntos de cebadores y sondas utilizando la herramienta de diseño de cebadores29 y apunte a una región de 95 pb (construcción gBlock) dentro del genoma de ARN blindado.
    3. Obtenga curvas de calibración para cada ejecución de RT-qPCR. Incluya controles negativos en cada ejecución de qPCR. Ejecute estándares, ejemplos y controles que no sean de plantilla por triplicado.
    4. Prepare cada mezcla RT-qPCR de 10 μL en el siguiente orden: 2,5 μL de mezcla maestra 4x, 400 nM de cada cebador, sonda de 200 nM y 2,5 μL de plantilla, así como agua destilada ultrapura libre de DNAsa/ARNasa.
    5. Realice reacciones de ciclo térmico a 50 °C durante 5 min, seguidas de 45 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 30 s en un sistema de PCR en tiempo real. Si la TC fue <40, considere la muestra de ARN blindado positivo.
    6. Realizar pruebas de qPCR y RT-qPCR utilizando albúmina sérica bovina con muestras de aguas residuales crudas para evaluar la posibilidad de inhibidores o contaminantes como ácidos húmicos24. No se observaron diferencias significativas entre las muestras con y sin la enzima.
  5. Calcular las concentraciones a partir de la curva estándar. Calcule el porcentaje de eficiencia de recuperación dividiendo la concentración recuperada por la concentración con picos.
  6. Transforme el número de copias de genes utilizando la función log10 para el análisis. Ejecute un modelo lineal general utilizando una herramienta de análisis estadístico sobre los datos de qPCR. Aplicar la prueba de Tukey para detectar diferencias entre los métodos y tratamientos. Tome un valor p de 0.05 para ser un nivel mínimo de significación para la prueba.

2. Filtración y concentración de virus de ADN y ARN para la epidemiología basada en el agua

  1. Para la recolección de agua superficial ambiental, recolecte 10 L de muestras ambientales de agua superficial y use 10 L de muestras de agua desionizada para el control de fondo. Almacenar todas las muestras en una sala de 4 °C hasta su procesamiento dentro de las 24 h siguientes a la recogida de la muestra.
  2. Realice la concentración de virus de muestras ambientales con SMF siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Realice filtración de cápsulas y vacío utilizando cápsulas de muestreo de agua subterránea de alta capacidad y filtros de disco de membrana de tamaños de 0,45 μm, 0,2 μm y 0,1 μm para minimizar el ruido durante la secuenciación metagenómica, desde fracciones más grandes como microeucariotas y bacterias hasta fracciones más pequeñas como virus.
    2. Preparar una solución de leche desnatada prefloculada al 1% peso por volumen en 1,32 L de agua de mar sintética con 13,2 g de leche desnatada en polvo. Ajuste el pH de esta suspensión a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  3. Ajustar el pH de las muestras de agua superficial ambiental a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  4. Transfiera 100 ml de la solución de leche desnatada acidificada prefloculada a 10 L de muestras de agua ambiental acidificada (pH 3,5) (concentración final de leche desnatada de 0,01% [p/v]).
  5. Usando un agitador magnético y una barra de agitación magnética, agite las muestras durante 8 h a temperatura ambiente y permita que los flóculos sedimenten por gravedad durante 8 h adicionales. Sin molestar los flóculos, retire con cuidado el sobrenadante con una bomba de vacío.
  6. Alícuota y equilibrar los flóculos restantes según el peso en tubos de centrífuga de 50 ml y hacerlos girar hacia abajo a 8.000 x g durante 30 min a 4 °C.
  7. Desechar el sobrenadante y disolver el pellet resultante (que teóricamente contiene virus de interés) en 200 μL de tampón fosfato de sodio 0,2 M.
  8. Tratar el pellet disuelto con DNasa I y RNasa A, siguiendo las instrucciones del fabricante, para eliminar el ADN y el ARN libres presentes que pueden ser coprecipitados debido al kit utilizado para la extracción de ácidos nucleicos. Desactive la DNasa I y la RNasa A siguiendo las instrucciones del fabricante.
  9. Extraiga los ácidos nucleicos totales del pellet disuelto utilizando un kit de extracción de ADN / ARN, según las instrucciones del fabricante.
  10. Cuantificar la cantidad total de ADN y ARN extraídos de muestras de efluentes utilizando un fluorómetro. Las muestras con concentraciones >1 ng/μL se consideran óptimas para la cuantificación y secuenciación del ADN.
  11. Realice análisis de qPCR para atacar virus entéricos de interés y secuenciación de alto rendimiento para identificar la estructura de la comunidad viral.

3. Precipitación directa y concentración de fracciones microbianas para la epidemiología basada en el agua

  1. Recoja 2 L de muestras de agua de vías fluviales protegidas e impactadas. Si la muestra contiene una cantidad considerable de residuos, use una gasa para eliminarlos.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente recolectar un duplicado biológico por muestra.
  2. Preparar una solución de leche desnatada al 1% (p/v) disolviendo 4,4 g de leche desnatada en polvo en 440 ml de agua de mar sintética. Ajuste el pH de esta suspensión a 3,5 con 1 N HCl.
  3. Ajustar el pH de las muestras de agua dulce a 3,5 utilizando 1 N HCl.
  4. Añadir 20 ml de solución de leche desnatada a las muestras de agua dulce de 2 L previamente ajustadas al pH (concentración final de leche desnatada de 0,01% [p/v]). Remover las muestras a temperatura ambiente durante 8 h.
  5. Deje que los flóculos sedimenten por gravedad durante otras 8 h. Retire con cuidado los sobrenadantes con una bomba peristáltica. Transfiera los flóculos sedimentados a un tubo de centrífuga de 50 ml y gírelos a 8.000 x g durante 30 min.
  6. Desechar el sobrenadante y resuspender los pellets con 200 μL de tampón fosfato sódico 0,2 M. Almacene las muestras a -20 °C o proceda a seleccionar ~ 0,5 g del flóculo para la extracción de ADN microbiano utilizando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos de su elección, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  7. Determine la concentración y pureza del ácido nucleico de ADN con un fluorómetro de alta sensibilidad. Las muestras con concentraciones >1 ng/μL deben ser óptimas para la cuantificación y secuenciación del ADN.

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Representative Results

Evaluación de métodos de concentración de ARN viral
Las seis muestras procesadas con UF-3k x g fueron positivas y resultaron en una recuperación del 13,38% ± 8,14% (Figura 1). Solo una muestra fue positiva cuando las muestras se procesaron con UF-7.5k x g. Todas las muestras procesadas con SMF fueron positivas y resultaron en una recuperación del 15,27% ± del 2,65% (Figura 1). Las tasas promedio de recuperación de UF-3K x g y SMF fueron significativa y consistentemente (p < 0.0001) más altas que UF-7.5K x g. Por otro lado, no hubo diferencia significativa (p = 0,6240) entre las tasas de recuperación de UF-3K x g y SMF. El aumento de la velocidad de centrifugación del dispositivo centrífugo de la marca B a 7.500 x g de 3.000 x g resultó en una menor recuperación, probablemente debido al paso de ARN blindado a través de filtros a una mayor velocidad y la unión de partículas de ARN blindado a los filtros a una mayor velocidad centrífuga. La eliminación de partículas sólidas con métodos de ultrafiltración podría explicar las menores tasas de recuperación de los métodos de ultrafiltración contra SMF, considerando la posible partición del ARN blindado a los sólidos de aguas residuales30. Además, los parámetros fisicoquímicos y biológicos de las aguas residuales (metadatos) se resumen en la Tabla 1. Las pruebas de SMF con aguas superficiales (paso 2) dieron como resultado una mayor tasa de recuperación, 42.7% ± 15.1%, lo que indica que la partición de los virus en partículas sólidas podría haber afectado significativamente la recuperación considerando bajas concentraciones sólidas en aguas superficiales.

Filtración en serie y concentración de virus
La Tabla 3 resume los parámetros de calidad del agua y los ácidos nucleicos extraídos de muestras de agua ambiental recolectadas dentro de Winnipeg a lo largo de tres estaciones. El ADN fue cuantificable en todos los lugares de muestreo y a través de las estaciones. La Figura suplementaria 1 indica un mapa con las ubicaciones ambientales de las aguas superficiales. Por otro lado, los valores de ARN estaban en su mayoría por debajo del límite de detección utilizando un fluorómetro (<0,025 ng/μL). Estos extractos de ARN se amplificaron aleatoriamente para generar ADNc cuantificable para la secuenciación de alto rendimiento (Tabla 3).

Concentración de fracciones microbianas de muestras de agua ambiental
La Figura 2 y la Figura 3 muestran el flujo de trabajo para la metodología y la concentración de fracciones microbianas de muestras ambientales de aguas superficiales. La Tabla 4 contiene la concentración promedio de ADN, la desviación estándar y las condiciones ambientales, como el pH, la temperatura, el oxígeno disuelto, la presión atmosférica, la precipitación y los tiempos de luz de los sitios de muestreo de las vías fluviales protegidas (boscosas) e impactadas (urbanas y agrícolas) analizadas en esta investigación. Las muestras se recolectaron mensualmente desde abril de 2022 hasta octubre de 2022 en áreas urbanas y rurales que rodean la ciudad de Portage la Prairie a lo largo del río Assiniboine en Manitoba, Canadá. La mayor concentración de ADN se observó en el sitio boscoso 1 y produjo 109.35-229.18 ng / μL. Por otro lado, la concentración más baja de ADN microbiano se recuperó del sitio agrícola 3 y tuvo una concentración promedio de 19.83-22.05 ng / μL. La concentración promedio de ADN, la desviación estándar y los metadatos de todas las muestras recolectadas de abril a octubre de 2022 se resumen en la Tabla 4. Las concentraciones de ADN obtenidas fueron óptimas para otras aplicaciones posteriores, que incluyen PCR, qPCR y secuenciación (datos no mostrados).

Figure 1
Figura 1: Porcentaje de recuperación y análisis estadístico para cada método para muestras de aguas residuales. Abreviaturas: SMF = floculación de leche desnatada; UF-3K x g = ultrafiltración a 3.000 x g; UF-7.5K x g = ultrafiltración a 7,500 x g. Las medias con un asterisco (*) indican diferencias significativas en el nivel de 0,05 entre los tratamientos; n = 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de la metodología utilizada para concentrar y cuantificar virus de cuerpos de agua urbanos de Manitoba que reciben efluentes de aguas residuales. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resumen gráfico de la concentración de virus, bacterias y microeucariotas para la cuantificación y secuenciación del ADN. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Ubicación de 11 muestras ambientales de agua. Las muestras se recogieron a lo largo de los ríos Rojo y Assiniboine en Winnipeg, Manitoba, como lo indican los puntos rojos. Las tres principales plantas de tratamiento de aguas residuales de Winnipeg están indicadas en azul como uno de los sitios visitados, a pesar de que no se produjeron eventos de muestreo. Las fuentes de los datos son Google Maps y el software Tableau. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 1: Parámetros de calidad del agua en muestras afluentes de NESTP, SESTP y WESTP. Abreviaturas: NESTP = North End Sewage Treatment Plant; SESTP = Planta de Tratamiento de Aguas Residuales del extremo sur; WESTP = Planta de tratamiento de aguas residuales de West End; MLD = millones de litros por día; TS = sólidos totales; TSS = sólidos suspendidos totales; DBO5 = demanda bioquímica de oxígeno a los 5 días; NH4-N = nitrógeno amónico; TP = fósforo total; TOC = carbono orgánico total; TN = nitrógeno total. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Conjuntos de cebadores/sondas de ensayos RT-qPCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Parámetros de calidad del agua de los ríos Red y Assiniboine durante la recolección de muestras en la primavera el 16 de mayo, el verano el 27 de agosto y el otoño el 21 de noviembre de 2021) y cuantificación con fluorómetro de ácidos nucleicos totales (ADN y ARN). * El límite de detección del kit de ARN es de 0,025 ng/μL; ^ Los números representan valores de rango. Abreviaturas: DO = oxígeno disuelto; DBO5= demanda bioquímica de oxígeno a los 5 días; TP = fósforo total. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Parámetros de calidad del agua del río Assiniboine durante la recolección de muestras (abril a octubre de 2022). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Uno de los pasos críticos en este estudio es la eliminación de partículas sólidas mediante la aplicación de un paso de prefiltración con filtros de membrana de 0,2 μm y 0,45 μm. Considerando la partición de los virus en partículas sólidas, especialmente los virus envueltos, la prefiltración puede causar una pérdida significativa en la recuperación viral30. Si bien un paso de prefiltración para los métodos de ultrafiltración casi siempre es necesario para las muestras ambientales y de aguas residuales para evitar que los dispositivos de ultrafiltración se obstruyan, la prefiltración para SMF puede ser necesaria dependiendo del tipo de análisis posterior. Para los estudios de PCR dirigidos, es posible que no se requiera prefiltración. Por otro lado, la prefiltración podría mejorar significativamente la metagenómica viral, ya que reduce el ruido de fondo en viromes de fracciones más grandes como microeucariotas y bacterias. Este paso es crítico para la secuenciación para que los genomas más grandes no pululen la señal viral.

El volumen de muestra que se puede procesar con ultrafiltración secuencial está limitado a 140 ml. Esta es una limitación importante para muestras con recuentos bajos de virus. Por otro lado, SMF puede procesar volúmenes de muestra mucho mayores, lo que aumenta la probabilidad de recuperar virus.

Las tasas de recuperación de la SMF están de acuerdo con otros estudios centrados en la concentración de partículas virales de las aguas residuales. Los artículos publicados anteriormente informaron tasas de recuperación similares con una variedad de virus de prueba. Las tasas medias de recuperación informadas en estos estudios variaron entre 3,4% y 14%13,31,32. La presente metodología fue parte de otro estudio que investigó el SARS-CoV-2 en aguas residuales en relación con el número de casos en Winnipeg33. El método SMF descrito aquí también se ha utilizado para detectar ARN del SARS-CoV-2 en lagunas de oxidación de comunidades rurales de Manitoba en nuestro laboratorio. La utilidad del método SMF también se ha utilizado en combinación con la filtración en serie (0,45 μm seguido de 0,2 μm y 0,1 μm) para caracterizar comunidades virales en muestras de agua dulce de entornos urbanos utilizando secuenciación de alto rendimiento en nuestro laboratorio (descrito en la segunda sección de la metodología). Finalmente, el método SMF también se puede aplicar para dirigir la precipitación de comunidades microbianas, como microeucariotas, bacterias y virus de muestras de agua ambiental, y una caracterización adicional utilizando la secuenciación de amplicones profundos de los genes 18S rRNA y 16S rRNA, así como el gen principal de la proteína de la cápside (g23) de grupos virales como los virus similares a T4 (Zambrano y Uyaguari-Díaz, datos no publicados). El método SMF permite concentrar las fracciones microbianas presentes en las muestras de agua desde grandes volúmenes de entrada (es decir, 10-40 L) hasta volúmenes relativamente más pequeños (es decir, 1-5 ml). Como parte de esta metodología, el agua ultrapura también se incluye como control negativo / de fondo. Una vez que las fracciones microbianas se concentran, la extracción de ácidos nucleicos se puede realizar utilizando kits de extracción comerciales o protocolos internos. SMF representa un método versátil, relativamente barato y fácil de no intervenir para concentrar fracciones microbianas o partículas virales, sin diferencias significativas en comparación con los enfoques de ultrafiltración o filtración de flujo tangencial.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales contradictorias conocidos que podrían haber parecido influir en el trabajo reportado en este documento.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NSERC Alliance Covid-19 Grant (Premio No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan y Uyaguari-Díaz). MUD desea agradecer al Programa de Becas de Investigación Universitaria (Premio No. 325201). Tanto JF como JZA cuentan con el apoyo del programa de capacitación de posgrado Visual and Automated Disease Analytics (VADA). KY y JF recibieron becas del programa Mitacs Accelerate. MUD y los miembros de su laboratorio (KY, JF, JZA) cuentan con el apoyo de NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) y la subvención Research Manitoba New Investigator Operating (No 5385). Un agradecimiento especial a la ciudad de Winnipeg, Manitoba. Esta investigación se llevó a cabo en la Universidad de Manitoba. Nos gustaría reconocer que los campus de la Universidad de Manitoba están ubicados en las tierras originales de los pueblos Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota y Dene y en la patria de la Nación Métis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

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References

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Concentración de partículas de virus de muestras ambientales de agua y aguas residuales mediante floculación y ultrafiltración de leche desnatada
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Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

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