Summary
環境水および廃水サンプルからのウイルス濃度は困難な作業であり、主にウイルスの同定と定量のために実行されます。いくつかのウイルス濃縮法が開発およびテストされていますが、ここでは、異なるサンプルタイプのRNAウイルスに対する限外ろ過と脱脂粉乳凝集の有効性を示します。
Abstract
水と廃水に基づく疫学は、コミュニティでの発生の経過を監視および予測するための代替方法として浮上しています。廃水や環境水サンプルからウイルス、バクテリア、微小真核生物などの微生物画分を回収することは、これらのアプローチにおける困難なステップの1つです。本研究では、他の研究でも対照として使用されているArmorRNAを試験ウイルスとして使用した逐次限外ろ過および脱脂粉乳凝集(SMF)法の回収効率に着目しました。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、限外ろ過の前に固体粒子を除去するために、0.45μmおよび0.2μmのメンブレンディスクフィルターによる事前ろ過が適用されました。逐次限外ろ過法で処理された試験サンプルを、2つの異なる速度で遠心分離した。速度を上げると、アーマードRNAの回復率と陽性率が低下しました。一方、SMFは、アーマードRNAの比較的一貫した回収率と陽性率をもたらしました。環境水サンプルを用いて実施された追加の試験は、他の微生物画分を濃縮するためのSMFの有用性を実証した。ウイルスの固体粒子への分割は、廃水サンプルの限外ろ過の前に適用される事前ろ過ステップを考慮すると、全体的な回収率に影響を与える可能性があります。プレフィルトレーション付きSMFは、サンプル中の固形分濃度が低く、固形物への分配率が低いため、環境水サンプルに適用すると優れた性能を発揮しました。本研究では、逐次限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が限られていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。
Introduction
微生物群集分析および疫学研究のために、地表および廃水サンプル中の微生物の有効濃度を決定することは、群集における発生の経過を監視および予測するための重要なステップの1つです1,2。COVID-19のパンデミックは、濃縮方法を改善することの重要性を明らかにしました。COVID-19は2019年後半に出現し、2023年3月の時点で、依然として人間の健康、社会生活、および経済に脅威を与えています。ウイルスの急速な感染と拡散に加えて、COVID-19の新しい波と亜種、および報告されていない無症候性の症例が出現しているため、コミュニティでのCOVID-19の発生の影響を軽減するための効果的な監視および管理戦略が重要な研究トピックになっています3,4,5.市民社会組織、政府機関、および公的または民間の公益事業によるCOVID-19の廃水ベースの疫学の使用は、迅速な発生関連情報を提供し、COVID-19の発生の影響を軽減するのに役立ちました6,7,8,9。しかし、廃水サンプル中のエンベロープRNAウイルスであるSARS-CoV-2の濃度は、依然として課題10を提起しています。たとえば、これらの課題の1つは、廃水固形物中のSARS-CoV-2の分配であり、濃縮11中に固形物が除去されると、回収に影響を与える可能性があります。この場合、定量/評価の焦点は、水相のみではなく、環境水サンプルの固相と水相の両方にある必要があります。さらに、濃縮方法の選択は、下流の試験および分析に基づいて変更することができる。環境サンプルからのウイルス粒子と病原体の濃度は、シーケンシングとマイクロバイオーム分野の発展に伴い、緊急の研究トピックになっています。
環境水や廃水サンプルからのウイルス濃縮の分野では、さまざまなウイルス濃縮法が適用されています。一般的に使用される方法には、ろ過、スキムミルク凝集(SMF)、吸着/溶出、およびポリエチレングリコール沈殿があります12〜17。その中で、SMFは安価で効果的な方法と見なされており、テストに成功し、廃水や地表水からSARS-CoV-2などのウイルスを回収するために適用されています12,15,16,18。SMF法は比較的新しいアプローチであり、汚泥、生下水、廃水、排水サンプルなど、あらゆる種類の水サンプルからウイルス、細菌、原生動物などの幅広い微生物を同時に回収するための適切な方法論として、多くの環境研究で認識が高まっています19.限外ろ過やグリシンアルカリ溶出、凍結乾燥ベースのアプローチ、超遠心やグリシンアルカリ溶出など、環境サンプルからウイルスを回収する他の既知の方法論と比較すると、SMFはウイルスの回収率と検出率が高い最も効率的な方法として報告されています18,20.本研究では、SARS-CoV-2回収を評価するための試験を含むウイルス濃縮法の回収効率を評価するために、ArmedRNAを試験ウイルスとして使用しました21,22。
ここでは、廃水と環境水のサンプルをテストして、SMFの有用性と、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、シーケンスベースのメタゲノミクス、およびディープアンプリコンシーケンシングのために微生物画分を濃縮するためのシーケンシャル限外ろ過法を実証しました。SMFは比較的安価な方法であり、限外ろ過法と比較して大量のサンプルに最適です。シーケンシャル限外ろ過法を使用するというアイデアは、一般的に使用される限外ろ過装置の供給が制限されていたCOVID-19パンデミック時にウイルス濃縮物の最終量を減らす必要性から生じ、代替のウイルス濃縮法の開発が必要でした。
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Protocol
1.廃水サンプル中のウイルスを濃縮するための連続限外ろ過とスキムミルク凝集の比較
- サンプル調製
- 2 Lの24時間流量比例複合生(流入)廃水サンプルを収集します。サンプルは、2020年の夏から秋に、カナダのウィニペグにある3つの主要な廃水処理プラント(WWTP)から収集されました(表1)。
- サンプルをアイスボックス内の遮光ボトルに入れて実験室に輸送し、24時間以内に処理します。廃水の物理化学的および生物学的特性データを収集します。
- ウイルス濃度アッセイ
注:シーケンシャル限外ろ過法と有機フロキュレーション法、すなわちスキムミルクフロキュレーション(SMF)を適用して、ArmedRNAをテストウイルスとして使用する各方法の全体的な回収効率を評価しました23.他の研究者も、家族などのエンベロープウイルスの濃縮法の回復を評価するためのコントロールウイルスとしてArmedRNAを使用しています Coronaviridae22,24,25,26.- アーマードRNAを添加する場合は、限外ろ過法とSMF法の廃水試験量をそれぞれ140 mLと500 mLに設定します。ピペッターを使用して、限外ろ過方法ごとに、ある日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルと別の日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルに、5 x 104 コピーの装甲RNAをスパイクします。さらに、スパイク6は、3番目の日付に収集された(4°Cで)廃水サンプルを保管し、SMFのために数日後に処理しました。
注:異なる日付に収集された6つのサンプルセットのそれぞれは、3つのWWTPのそれぞれからの2つのサンプルで構成されていました。私たちの研究では、最初の新鮮な廃水サンプルのセットは2020年7月8日に収集され、2番目のセットは2020年9月30日に収集され、廃水サンプルは2020年10月14日にSMFのために保管されました。 - 4°Cで30分間撹拌し、マグネチックスターラーを用いてサンプル中の装甲RNAを接種し、ホモジナイズします。
- 0.2 μmを超えるすべての粒子または細胞を除去し、限外ろ過を実行します。
- 添加廃水サンプル(各140 mL添加サンプルから120 mL)をチーズクロスと低タンパク質結合、それぞれ0.45 μmおよび0.2 μm、47 mmメンブレンディスクフィルターでろ過して、大きな粒子、堆積物、真核生物、および細菌を除去します27。以下に説明する限外ろ過方法を使用して、ろ過されたサンプルを処理します。
注:7月8日と9月30日に収集された廃水サンプルは、それぞれ3,000 x gと7,500 x gの限外ろ過法に使用されました。 - 3,000 x g(UF-3k x g)での連続限外ろ過の場合、ブランドA遠心装置30-kDaを使用して、60 mLのサンプルを約5 mLに2回ロードすることにより、最初の日に収集された合計120 mLのテストサンプルを3,000 x gで30分間濃縮します。次に、ブランドBの遠心装置である30 kDaを使用して、3,000 x gで30分間、5 mLの容量を500〜1,200 μLに濃縮します。
- 7,500 x g(UF-7.5k x g)での連続限外ろ過の場合、ブランドB遠心装置の遠心分離速度を3,000 x gから7,500 x gに変更して、メーカーの推奨に従って最終容量を小さくし、ブランドA遠心装置の遠心分離速度を同じに保ちます。
注:テストは、9月30日に収集されたサンプルで実行されました。
- 添加廃水サンプル(各140 mL添加サンプルから120 mL)をチーズクロスと低タンパク質結合、それぞれ0.45 μmおよび0.2 μm、47 mmメンブレンディスクフィルターでろ過して、大きな粒子、堆積物、真核生物、および細菌を除去します27。以下に説明する限外ろ過方法を使用して、ろ過されたサンプルを処理します。
- SMF の場合は、以下に概説するステップを実行します。
- 以下に説明するように、チーズクロスおよび低タンパク質結合メンブレンディスクフィルターによる事前ろ過なしで、SMFプロトコル16、18を使用して廃水サンプル(各500 mL)を直接濃縮するようにスパイクします。
- 0.5 gの脱脂粉乳を50 mLの合成海水に溶解して1%(w / v)の脱脂乳溶液を得、1 N HClを使用して溶液のpHを3.5に注意深く調整します。
注:酸性化により、等電点16 の変化によりウイルスが凝集して水から沈殿し、粉乳28の溶解度が向上します。 - 500 mLの生廃水サンプルに5 mLのスキムミルク溶液を加えて、0.01%(w / v)のスキムミルクの最終濃度を得ます。
- サンプルを中速で8時間撹拌し、形成されたフロックを室温でさらに8時間沈降させます。
- 血清学的ピペットを使用して、沈降したフロックを乱すことなく上清を注意深く除去します。フロックを含む最終容量50 mLを遠沈管に移し、8,000 x g で8°Cで30分間遠心分離します。
- 滅菌スパチュラを使用してペレットを注意深くスクラップし、上清を除去した後、残りのペレットを250 μLの0.2 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.5)にチューブに再懸濁します。掻き取り、再懸濁したペレットを同じ1.5 mLミニ遠心チューブに移します。
- アーマードRNAを添加する場合は、限外ろ過法とSMF法の廃水試験量をそれぞれ140 mLと500 mLに設定します。ピペッターを使用して、限外ろ過方法ごとに、ある日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルと別の日に収集された6つの新鮮な廃水サンプルに、5 x 104 コピーの装甲RNAをスパイクします。さらに、スパイク6は、3番目の日付に収集された(4°Cで)廃水サンプルを保管し、SMFのために数日後に処理しました。
- 廃水サンプルのウイルス濃縮物からのウイルスRNA抽出と回収効率アッセイは、製造元の指示に従って、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールとβ-メルカプトエタノールの比率が25:24:1のRNA抽出キットを使用して実行し、抽出効率を向上させます。最後に、50 μLの溶出バッファーでRNAを溶出します。
- リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)解析
- 合成一本鎖DNAまたはgBlockコンストラクトの10倍希釈(7.8 x 104 〜7.8遺伝子コピー)を使用して装甲RNAを定量します。ArmedRNAを検出および定量するプライマーおよびプローブセットについては、 表2 を参照してください。
- プライマー設計ツール29 を使用してプライマーおよびプローブセットを設計し、ArmedRNAゲノム内の95bp領域(gBlock構築物)を標的とする。
- 各RT-qPCR実行の検量線を取得します。各qPCRの実行にネガティブコントロールを含めます。標準、サンプル、およびテンプレート以外のコントロールを 3 重に実行します。
- 各10 μL RT-qPCR混合物を、2.5 μLの4xマスターミックス、400 nMの各プライマー、200 nMプローブ、2.5 μLのテンプレート、および超高純度DNAse/RNAseフリー蒸留水の順序で調製します。
- リアルタイムPCRシステムで50°Cで5分間の熱サイクル反応を行い、続いてリアルタイムPCRシステムで95°Cで10秒間、60°Cで30秒間の45サイクルを実行します。CTが<40の場合、サンプルの装甲RNA陽性を検討してください。
- ウシ血清アルブミンと生の下水サンプルを使用してqPCRおよびRT-qPCRテストを実施し、阻害剤またはフミン酸などの汚染物質の可能性を評価します24。酵素を含むサンプルと含まないサンプル間で有意差は観察されませんでした。
- 検量線から濃度を計算します。回収した濃度を添加濃度で割って回収効率のパーセンテージを計算します。
- 解析にlog10 関数を使用して遺伝子コピー数を変換します。qPCRデータに対して統計解析ツールを使用して一般線形モデルを実行します。テューキーの検定を適用して、方法と治療法の違いを検出します。 p値0.05を検定の最小有意水準とします。
2. 水系疫学のためのDNAおよびRNAウイルスのろ過と濃縮
- 環境地表水収集には、10 Lの環境地表水サンプルを収集し、10 Lの脱イオン水サンプルをバックグラウンドコントロールに使用します。サンプル収集後24時間以内に処理されるまで、すべてのサンプルを4°Cの部屋に保管してください。
- SMFで環境サンプルからウイルスを濃縮するには、以下の手順を使用します。
- 0.45 μm、0.2 μm、0.1 μmサイズの大容量地下水サンプリングカプセルとメンブレンディスクフィルターを使用してカプセルろ過と真空ろ過を行い、微小真核生物や細菌などの大きな画分からウイルスなどの小さな画分まで、メタゲノムシーケンシング中のノイズを最小限に抑えます。
- 13.2 gの脱脂粉乳を含む1.32 Lの合成海水中の1体積重量の凝集前脱脂乳溶液を調製します。1 N HClを使用してこの懸濁液のpHを3.5に調整します。
- 1 N HClを使用して、環境地表水サンプルのpHを3.5に調整します。
- 事前に凝集した酸性化脱脂乳溶液100 mLを10 Lの酸性化(pH 3.5)環境水サンプルに移します(最終脱脂乳濃度0.01% [w / v])。
- マグネチックスターラーとマグネチックスターバーを使用して、サンプルを室温で8時間攪拌し、フロックを重力でさらに8時間沈降させます。フロックを乱さずに、真空ポンプを使用して上澄み液を慎重に除去します。
- 50 mL 遠沈管で重量に応じて残りのフロックを分注してバランスを取り、8,000 x g で 4 °C で 30 分間スピンダウンします。
- 上清を捨て、得られたペレット(理論的には目的のウイルスを含む)を200μLの0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解します。
- 溶解したペレットをDNase IおよびRNase Aで処理し、製造元の指示に従って、核酸抽出に使用されるキットのために共沈する可能性のある遊離DNAおよびRNAを除去します。製造元の指示に従って、DNase IおよびRNase Aを不活性化します。
- 製造元の指示に従って、DNA/RNA抽出キットを使用して、溶解したペレットから全核酸を抽出します。
- 蛍光光度計を使用して、流出サンプルから抽出されたDNAおよびRNAの総量を定量します。>1 ng/μLの濃度のサンプルは、DNAの定量とシーケンシングに最適と考えられています。
- qPCR解析を実行して目的の腸内ウイルスを標的とし、ハイスループットシーケンシングを実行してウイルス群集構造を特定します。
3. 水系疫学のための微生物画分の直接沈降と濃縮
- 保護され影響を受けた水路から2Lの水サンプルを収集します。サンプルにかなりの量の破片が含まれている場合は、チーズクロスを使用してそれらを取り除きます。
注:サンプルごとに生物学的複製を収集することを強くお勧めします。 - 4.4 gの脱脂粉乳を440 mLの合成海水に溶解して、1%(w / v)の脱脂乳溶液を調製します。この懸濁液のpHを1 N HClで3.5に調整します。
- 1 N HClを使用して淡水サンプルのpHを3.5に調整します。
- 以前にpH調整した2 L淡水サンプル(最終スキムミルク濃度0.01%[w / v])に20 mLのスキムミルク溶液を追加します。サンプルを室温で8時間撹拌します。
- フロックをさらに8時間重力で沈降させます。蠕動ポンプで上清を慎重に取り除きます。沈降したフロックを50 mLの遠沈管に移し、8,000 x g で30分間スピンダウンします。
- 上清を廃棄し、ペレットを200 μLの0.2 Mリン酸ナトリウムバッファーで再懸濁します。サンプルを-20°Cで保存するか、製造元の指示に従って、選択した核酸分離キットを使用して、微生物DNA抽出用のフロック~0.5 gを選択します。
- 高感度蛍光光度計でDNA核酸濃度と純度を測定します。濃度>1 ng/μLのサンプルは、DNAの定量とシーケンシングに最適です。
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Representative Results
ウイルスRNA濃縮法の評価
UF-3k x gで処理された6つのサンプルはすべて陽性であり、13.38%±8.14%の回復をもたらしました(図1)。サンプルをUF-7.5k x gで処理した場合、1つのサンプルのみが陽性でした。SMFで処理されたすべてのサンプルは陽性であり、15.27%±2.65%の回復をもたらしました(図1)。UF-3K x gおよびSMFの平均回収率は、UF-7.5K x gよりも有意かつ一貫して高かった(p < 0.0001)。一方、UF-3K×gとSMFの回収率には有意差は認められなかった(p=0.6240)。ブランドB遠心装置の遠心分離速度を3,000 x gから7,500 x gに上げると、おそらくアーマードRNAがフィルターを通過する速度が増加し、アーマードRNA粒子が遠心速度でフィルターに結合したため、回収率が低下しました。限外ろ過法で固体粒子を排除することは、装甲RNAの廃水固形物への潜在的な分配を考慮すると、SMFに対する限外ろ過法のより低い回収率を説明するかもしれません30。さらに、物理化学的および生物学的廃水パラメータ(メタデータ)を表1にまとめた。地表水でSMFを検査(ステップ2)したところ、回収率は42.7%±15.1%と高く、地表水中の固形分濃度が低いことを考えると、ウイルスを固体粒子に分配することが回収に大きな影響を与えた可能性があることが示唆されました。
ウイルスの連続ろ過と濃縮
表 3は、ウィニペグ内で3つの季節にわたって収集された環境水サンプルから抽出された水質パラメータと核酸をまとめたものです。DNAは、すべてのサンプリング場所および季節にわたって定量可能でした。 補足図1 は、環境地表水の位置を含むマップを示しています。一方、RNA値は蛍光光度計を用いた場合の検出限界(<0.025 ng/μL)をほぼ下回っていた。これらのRNA抽出物をランダムに増幅して、ハイスループットシーケンシング用の定量可能なcDNAを生成しました(表3)。
環境水サンプルからの微生物画分の濃度
図2と図3は、環境地表水サンプルからの微生物画分の方法論と濃縮のワークフローを示しています。表4には、この研究で分析された保護(森林)および影響を受ける(都市および農業)水路のサンプリングサイトのpH、温度、溶存酸素、大気圧、降水量、日照時間などの環境条件の平均DNA濃度、標準偏差、および環境条件が含まれています。サンプルは、2022年4月から2022年10月まで、カナダのマニトバ州のアシニボイン川沿いのポーテージラプレーリー市周辺の都市部と農村部で毎月収集されました。最も高いDNA濃度は森林サイト1で観察され、109.35-229.18 ng / μLが得られました。一方、最も低い微生物DNA濃度は農業現場3から回収され、平均濃度は19.83-22.05 ng/μLであった。2022年4月から10月までに収集されたすべてのサンプルの平均DNA濃度、標準偏差、およびメタデータを表4にまとめました。得られたDNA濃度は、PCR、qPCR、およびシーケンシングを含む他のダウンストリームアプリケーションに最適でした(データは示されていません)。
図1:廃水サンプルの各方法の回収率と統計分析。略語:SMF =スキムミルク凝集;UF-3K x g = 3,000 x gでの限外ろ過;UF-7.5K x g = 7,500 x gでの限外ろ過。アスタリスク(*)の付いた平均値は、治療間で水準0.05の有意差を示します。n = 6です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:廃水を受け取るマニトバ州の都市水域からのウイルスを濃縮および定量するために使用される方法論の概略図。BioRender.com で作成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DNA定量とシーケンシングのためのウイルス、細菌、および微小真核生物の濃度のグラフィカルな要約。 BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:11の環境水サンプルの場所。 サンプルは、赤い点で示されているように、マニトバ州ウィニペグのレッド川とアシニボイン川に沿って収集されました。ウィニペグの3つの主要な下水処理場は、サンプリングイベントが発生していなくても、訪問したサイトの1つとして青色で示されています。データのソースは、GoogleマップとTableauソフトウェアです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表1:NESTP、SESTP、およびWESTPの流入サンプルの水質パラメータ。 略語: NESTP = ノースエンド下水処理場;SESTP = サウス エンド下水処理場;WESTP = ウエスト エンド下水処理場;MLD =1日あたり100万リットル。TS =全固形分。TSS =総懸濁固形物;BOD5 = 5日間の生化学的酸素要求量。NH4-N =アンモニウム - 窒素;TP =全リン;TOC = 全有機炭素;TN =全窒素。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:RT-qPCRアッセイのプライマー/プローブセット。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:2021年5月16日の春、8月27日の夏、11月21日の秋のサンプル収集中の赤川とアシニボイン川の水質パラメータ)および全核酸(DNAおよびRNA)の蛍光光度計の定量。* RNAキットの検出限界は0.025 ng/μLです。^ 数字は範囲値を表す。略語:DO =溶存酸素;BOD 5 =5日間の生化学的酸素要求量。TP =全リン。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:サンプル収集中のアシニボイン川の水質パラメータ(2022年4月から10月)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究の重要なステップの1つは、0.2 μmおよび0.45 μmのメンブレンフィルターを使用した事前ろ過ステップを適用することによる固体粒子の除去です。ウイルスの固体粒子、特にエンベロープウイルスへの分割を考慮すると、事前ろ過はウイルス回収の著しい損失を引き起こす可能性があります30。限外ろ過装置の目詰まりを防ぐために、環境サンプルや廃水サンプルには限外ろ過法の事前ろ過ステップがほとんど常に必要ですが、下流の分析の種類によってはSMFの事前ろ過が必要になる場合があります。ターゲットPCR研究では、事前ろ過は必要ないかもしれません。一方、プレフィルトレーションは、微小真核生物や細菌などのより大きな画分からのウイルスのバックグラウンドノイズを低減するため、ウイルスメタゲノミクスを大幅に改善する可能性があります。このステップは、より大きなゲノムがウイルスシグナルに群がらないようにするためのシーケンシングにとって重要です。
シーケンシャル限外ろ過で処理できるサンプル量は140mLに制限されています。これは、ウイルス数が少ないサンプルにとって重要な制限です。一方、SMF ははるかに大量のサンプルを処理できるため、ウイルスを回収できる可能性が高くなります。
SMFの回収率は、廃水からのウイルス粒子の濃度に焦点を当てた他の研究と一致しています。以前に発表された論文では、さまざまなテストウイルスで同様の回復率が報告されています。これらの研究で報告された平均回復率は3.4%から14%の範囲であった13,31,32。現在の方法論は、ウィニペグ33の症例数に関連して廃水中のSARS-CoV-2を調査する別の研究の一部でした。ここで説明するSMF法は、私たちの研究室でマニトバ州の農村コミュニティからの酸化ラグーン中のSARS-CoV-2RNAをスクリーニングするためにも使用されています。SMF法の有用性は、連続ろ過(0.45 μmの後に0.2 μmと0.1 μmが続く)と組み合わせて使用 され、私たちの研究室でのハイスループットシーケンシングを使用して、都市環境からの淡水サンプル中のウイルス群集を特徴付けます(方法論の2番目のセクションで説明)。最後に、SMF法は、環境水サンプルからの微小真核生物、細菌、ウイルスなどの微生物群集の沈殿を指示するためにも適用でき、18S rRNAおよび16S rRNA遺伝子のディープアンプリコンシーケンシングを使用したさらなる特性評価、ならびにT4様ウイルス(ザンブラノおよびウヤグアリ-ディアス、 未公開データ)。SMF法は、水サンプル中に存在する微生物画分を、大きな投入量(すなわち、10〜40 L)から比較的小さい容量(すなわち、1〜5 mL)まで濃縮することを可能にする。この方法論の一部として、超純水もネガティブ/バックグラウンドコントロールとして含まれています。微生物画分が濃縮されたら、市販の抽出キットまたは社内プロトコルを使用して核酸抽出を行うことができます。SMFは、微生物画分またはウイルス粒子を濃縮するための汎用性が高く、比較的安価で、簡単/ハンズオフの方法であり、限外ろ過またはタンジェンシャルフローろ過アプローチと比較して大きな違いはありません。
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Disclosures
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある既知の競合する金銭的利益や個人的な関係はないと宣言しています。
Acknowledgments
この作業は、NSERCアライアンスCovid-19助成金(賞番号431401363、2020-2021、ユアン博士とウヤグアリディアス博士)によってサポートされました。MUDは、大学研究助成プログラム(賞番号325201)に感謝します。JFとJZAはどちらも、視覚および自動疾病分析(VADA)大学院トレーニングプログラムによってサポートされています。KYとJFはどちらも、Mitacs Accelerate プログラムからフェローシップを受け取りました。MUDと彼の研究室のメンバー(KY、JF、JZA)は、NSERC-DG(RGPIN-2022-04508)および研究マニトバ新任研究者運営助成金(No 5385)によってサポートされています。マニトバ州ウィニペグ市に感謝します。この研究はマニトバ大学で行われました。マニトバ大学のキャンパスは、アニシナアベグ、クリー、オジクリー、ダコタ、ディネの人々の元の土地と、メティスネーションの故郷にあることを認めたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
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