Summary
Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu, öncelikle virüslerin tanımlanması ve miktarının belirlenmesi için gerçekleştirilen zorlu bir görevdir. Çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri geliştirilmiş ve test edilmiş olsa da, burada farklı numune tiplerine sahip RNA virüsleri için ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaşmasının etkinliğini gösteriyoruz.
Abstract
Su ve atık su bazlı epidemiyoloji, topluluklardaki salgınların seyrini izlemek ve tahmin etmek için alternatif yöntemler olarak ortaya çıkmıştır. Atık su ve çevresel su örneklerinden virüsler, bakteriler ve mikroökaryotlar dahil olmak üzere mikrobiyal fraksiyonların geri kazanımı, bu yaklaşımlardaki zorlu adımlardan biridir. Bu çalışmada, diğer bazı çalışmalarda da kontrol olarak kullanılan Armored RNA'yı test virüsü olarak kullanan sıralı ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaştırma (SMF) yöntemlerinin geri kazanım etkinliğine odaklandık. Ultrafiltrasyon cihazlarının tıkanmasını önlemek için ultrafiltrasyondan önce katı partikülleri ortadan kaldırmak için 0,45 μm ve 0,2 μm membran disk filtreleri ile ön filtreleme uygulanmıştır. Sıralı ultrafiltrasyon yöntemi ile işlenen test numuneleri iki farklı hızda santrifüj edildi. Artan hız, Zırhlı RNA'nın daha düşük iyileşme ve pozitiflik oranlarına neden oldu. Öte yandan, SMF, Zırhlı RNA'nın nispeten tutarlı iyileşme ve pozitiflik oranları ile sonuçlandı. Çevresel su örnekleri ile yapılan ek testler, SMF'nin diğer mikrobiyal fraksiyonları konsantre etmek için faydasını göstermiştir. Virüslerin katı parçacıklara bölünmesi, atık su numunelerinin ultrafiltrasyonundan önce uygulanan ön filtreleme adımı göz önüne alındığında, genel geri kazanım oranları üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Ön filtrelemeli SMF, numunelerdeki daha düşük katı konsantrasyonları ve dolayısıyla katılara daha düşük bölümleme oranları nedeniyle çevresel su numunelerine uygulandığında daha iyi performans göstermiştir. Bu çalışmada, sıralı bir ultrafiltrasyon yönteminin kullanılması fikri, yaygın olarak kullanılan ultrafiltrasyon cihazlarının tedarikinin sınırlı olduğu ve alternatif viral konsantrasyon yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu COVID-19 pandemisi sırasında viral konsantrelerin nihai hacminin azaltılması gerekliliğinden doğmuştur.
Introduction
Mikrobiyal topluluk analizi ve epidemiyoloji çalışmaları için yüzey ve atık su numunelerinde mikroorganizmaların etkin konsantrasyonunun belirlenmesi, topluluklardaki salgınların seyrinin izlenmesi ve tahmin edilmesi için önemli adımlardan biridir 1,2. COVID-19 pandemisi, konsantrasyon yöntemlerinin iyileştirilmesinin önemini ortaya koydu. COVID-19, 2019'un sonlarında ortaya çıktı ve Mart 2023 itibariyle hala insan sağlığı, sosyal yaşam ve ekonomi için bir tehdit oluşturuyor. COVID-19 salgınlarının toplumlardaki etkilerini hafifletmek için etkili sürveyans ve kontrol stratejileri, virüsün hızlı bulaşması ve yayılmasının yanı sıra bildirilmemiş ve teşhis edilmemiş asemptomatik vakaların yanı sıra COVID-19'un yeni dalgaları ve varyantları ortaya çıktığı için önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir 3,4,5. Sivil toplum kuruluşları, devlet kurumları ve kamu veya özel kuruluşlar tarafından COVID-19 için atık su bazlı epidemiyolojinin kullanılması, salgınla ilgili hızlı bilgi sağlamada ve COVID-19 salgınlarının etkilerini azaltmada yardımcı olmuştur 6,7,8,9. Bununla birlikte, zarflı bir RNA virüsü olan SARS-CoV-2'nin atık su numunelerindeki konsantrasyonu hala zorluklar yaratmaktadır10. Örneğin, bu zorluklardan biri, SARS-CoV-2'nin atık su katılarında bölünmesidir ve bu da konsantrasyon11 sırasında katılar elimine edildiğinde geri kazanımı etkileyebilir. Bu durumda, niceleme/değerlendirmenin odak noktası, yalnızca sulu faz yerine, çevresel su numunelerinin hem katı hem de sulu fazları üzerinde olmalıdır. Ayrıca, konsantrasyon yönteminin seçimi, çıkış yönündeki testlere ve analizlere dayanarak değiştirilebilir. Çevresel örneklerden virüs partiküllerinin ve patojenlerin konsantrasyonu, dizileme ve mikrobiyom alanlarındaki gelişmelerle birlikte acil bir araştırma konusu haline gelmiştir.
Çevresel su ve atık su örneklerinden virüs konsantrasyonu alanında çeşitli virüs konsantrasyon yöntemleri uygulanmıştır. Yaygın olarak kullanılan bazı yöntemler filtrasyon, yağsız süt flokülasyonu (SMF), adsorpsiyon / elüsyon ve polietilen glikol çökeltme12-17'dir. Bunlar arasında SMF, ucuz ve etkili bir yöntem olarak kabul edilmiş, başarıyla test edilmiş ve SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere virüslerin atık sulardan ve yüzey sularından geri kazanılması için uygulanmıştır12,15,16,18. SMF prosedürü, birçok çevresel çalışma arasında, virüsler, bakteriler ve protozoonlar gibi geniş bir mikroorganizma dizisini her türlü su numunesinden, yani çamur, ham kanalizasyon, atık su ve atık su numunelerinden aynı anda geri kazanmak için uygun bir metodoloji olarak artan bir tanıma sahip olan nispeten yeni bir yaklaşımdır19. Ultrafiltrasyon ve glisin-alkali elüsyonu, liyofilizasyona dayalı yaklaşım veya ultrasantrifüjleme ve glisin-alkali elüsyonu gibi çevresel örneklerden virüsleri kurtarmak için bilinen diğer metodolojilerle karşılaştırıldığında, SMF'nin daha yüksek viral geri kazanım ve tespit oranlarına sahip en etkili yöntem olduğu bildirilmiştir 18,20. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 geri kazanımını değerlendirmek için testler de dahil olmak üzere virüs konsantrasyon yöntemlerinin geri kazanım verimliliğini değerlendirmek için Zırhlı RNA'yı bir test virüsü olarak kullandık21,22.
Burada, SMF'nin faydasını göstermek için atık su ve çevresel su örneklerini ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), sekans tabanlı metagenomik ve derin amplikon dizilemesi için mikrobiyal fraksiyonları konsantre etmek için sıralı bir ultrafiltrasyon yöntemini test ettik. SMF nispeten daha ucuz bir yöntemdir ve ultrafiltrasyon yöntemlerine kıyasla daha büyük miktarda numune için idealdir. Sıralı bir ultrafiltrasyon yöntemi kullanma fikri, yaygın olarak kullanılan ultrafiltrasyon cihazlarının tedarikinin sınırlı olduğu ve alternatif viral konsantrasyon yöntemlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğu COVID-19 pandemisi sırasında viral konsantrelerin nihai hacminin azaltılması gerekliliğinden doğmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seri ultrafiltrasyon ve yağsız süt topaklaşmasının atık su numunelerindeki virüsleri konsantre etmek için karşılaştırılması
- Numune hazırlama
- 2 L 24 saatlik akışla orantılı kompozit ham (akışlı) atık su numunesi toplayın. Kanada'nın Winnipeg kentindeki üç büyük atık su arıtma tesisinden (WWTP) 2020 yazında ve sonbaharında numuneler toplanmıştır (Tablo 1).
- Numuneleri bir buz kutusunda ışık geçirmez şişelerde laboratuvara taşıyın ve 24 saat içinde işleyin. Atık su fiziko-kimyasal ve biyolojik özellik verilerini toplar.
- Virüs konsantrasyonu tahlilleri
NOT: Test virüsü olarak Zırhlı RNA kullanılarak her yöntemin toplam geri kazanım verimliliğini değerlendirmek için sıralı bir ultrafiltrasyon yöntemi ve organik bir topaklaştırma yöntemi, yani yağsız süt topaklaştırma (SMF) uygulanmıştır23. Diğer araştırmacılar ayrıca Zırhlı RNA'yı, aile gibi zarflı virüsler için konsantrasyon yöntemlerinin geri kazanılmasını değerlendirmek için bir kontrol virüsü olarak kullandılar Coronaviridae22,24,25,26.- Zırhlı RNA ilavesi için, ultrafiltrasyon ve SMF yöntemleri için atık su test hacimlerini sırasıyla 140 mL ve 500 mL olarak ayarlayın. Bir pipetör kullanarak, her ultrafiltrasyon yöntemi için 5 x 104 kopya Zırhlı RNA'yı bir tarihte toplanan altı taze atık su örneğine ve başka bir tarihte altı taze atık su örneğine yerleştirin; Ayrıca, SMF için üçüncü, daha sonraki bir tarihte toplanan ve günler sonra işlenen altı depolanmış (4 ° C'de) atık su örneğini yükseltin.
NOT: Farklı tarihlerde toplanan altı numune setinin her biri, üç WWTP'nin her birinden iki numuneden oluşuyordu. Çalışmamızda ilk set taze atıksu numunesi 8 Temmuz 2020 tarihinde, ikincisi 30 Eylül 2020 tarihinde, SMF için depolanacak atıksu numuneleri ise 14 Ekim 2020 tarihinde toplanmıştır. - Manyetik bir karıştırıcı kullanarak numunelerdeki Zırhlı RNA'yı aşılamak ve homojenize etmek için 4 ° C'de 30 dakika karıştırın.
- 0,2 μm'den büyük tüm parçacıkları veya hücreleri çıkarın ve ultrafiltrasyon gerçekleştirin.
- Büyük parçacıkları, tortuları, ökaryotları ve bakterileri gidermek için çivili atık su numunelerini (her 140 mL çivili numuneden 120 mL) tülbentten ve düşük proteinli bağlama, sırasıyla 0,45 μm ve 0,2 μm, 47 mm membran disk filtrelerinden geçirin27. Aşağıda açıklanan ultrafiltrasyon yöntemlerini kullanarak filtrelenmiş numuneleri işleyin.
NOT: 8 Temmuz ve 30 Eylül tarihlerinde toplanan atık sunumuneleri sırasıyla 3.000 x g ve 7.500 x g ile ultrafiltrasyon yöntemleri için kullanılmıştır. - 3.000 x g'de (UF-3k x g) sıralı ultrafiltrasyon için, ilk tarihte toplanan test numunesinin toplam 120 mL'sini 30 dakika boyunca 3.000 x g'de, A marka bir santrifüj cihazı (30-kDa) kullanarak numunenin 60 mL'sini iki kez yaklaşık 5 mL'ye yükleyerek 30 dakika boyunca konsantre edin. Ardından, B marka bir santrifüj cihazı olan 30-kDa'yı kullanarak 5 mL hacmini 30 dakika boyunca 3.000 x g'de 500-1.200 μL'ye düşürün.
- 7.500 x g'de (UF-7.5k x g) sıralı ultrafiltrasyon için, üreticinin tavsiyelerine göre daha küçük nihai hacimler elde etmek için B marka santrifüj cihazının santrifüj hızını 3.000 x g'den 7.500 x g'ye değiştirin ve A marka santrifüj cihazının santrifüj hızını aynı tutun.
NOT: Testler 30 Eylül'de toplanan örneklerlegerçekleştirilmiştir.
- Büyük parçacıkları, tortuları, ökaryotları ve bakterileri gidermek için çivili atık su numunelerini (her 140 mL çivili numuneden 120 mL) tülbentten ve düşük proteinli bağlama, sırasıyla 0,45 μm ve 0,2 μm, 47 mm membran disk filtrelerinden geçirin27. Aşağıda açıklanan ultrafiltrasyon yöntemlerini kullanarak filtrelenmiş numuneleri işleyin.
- SMF için aşağıda özetlenen adımları uygulayın.
- Atık su numunelerini (her biri 500 mL), SMF protokolü16,18'i kullanarak, tülbentle ve düşük proteinli bağlayıcı membran disk filtrelerle ön filtreleme yapmadan doğrudan konsantre etmek için aşağıda açıklandığı gibi yükseltin.
- % 1 (w / v) yağsız süt çözeltisi elde etmek için 0,5 g yağsız süt tozunu 50 mL sentetik deniz suyunda çözün ve çözeltinin pH'ını 1 N HCl kullanarak dikkatlice 3,5'e ayarlayın.
NOT: Asitleştirme, virüslerin izoelektrik noktaları16'daki değişiklik nedeniyle sudan birikmesini ve çökelmesini sağlar ve süt tozu28'in çözünürlüğünü arttırır. - 500 mL ham atık su numunesine 5 mL yağsız süt çözeltisi ekleyerek %0,01'lik (w/v) nihai yağsız süt konsantrasyonu elde edin.
- Numuneleri orta hızda 8 saat karıştırın ve oluşan flokların oda sıcaklığında 8 saat daha yerleşmesine izin verin.
- Yerleşmiş flikleri rahatsız etmeden serolojik pipetler kullanarak süpernatantları dikkatlice çıkarın. Flokları içeren 50 mL'lik son hacmi santrifüj tüplerine aktarın ve 8.000 x g'de santrifüjü 8 ° C'de 30 dakika boyunca aktarın.
- Peletleri sterilize edilmiş bir spatula kullanarak dikkatlice kazıyın ve süpernatant çıkarıldıktan sonra tüplerde kalan peletleri 250 μL 0.2 M sodyum fosfat tamponunda (pH 7.5) yeniden askıya alın. Kazınmış ve yeniden askıya alınmış peletleri aynı 1,5 mL mini santrifüj tüplerine aktarın.
- Zırhlı RNA ilavesi için, ultrafiltrasyon ve SMF yöntemleri için atık su test hacimlerini sırasıyla 140 mL ve 500 mL olarak ayarlayın. Bir pipetör kullanarak, her ultrafiltrasyon yöntemi için 5 x 104 kopya Zırhlı RNA'yı bir tarihte toplanan altı taze atık su örneğine ve başka bir tarihte altı taze atık su örneğine yerleştirin; Ayrıca, SMF için üçüncü, daha sonraki bir tarihte toplanan ve günler sonra işlenen altı depolanmış (4 ° C'de) atık su örneğini yükseltin.
- Ekstraksiyon verimliliğini artırmak için üreticinin talimatlarına göre, atık su numunelerinin viral konsantrelerinden viral RNA ekstraksiyonu ve 25: 24: 1 fenol: kloroform: izoamil alkol ve β-merkaptoetanol oranına sahip bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak geri kazanım verimliliği testleri gerçekleştirin. Son olarak, RNA'yı 50 μL elüsyon tamponunda boşaltın.
- Gerçek zamanlı-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi
- Sentetik tek sarmallı bir DNA veya gBlock yapısının on kat seyreltmesini (7.8 x 10,4 ila 7.8 gen kopyaları) kullanarak Zırhlı RNA'yı sayısallaştırın. Zırhlı RNA'yı tespit eden ve ölçen primerler ve prob setleri için Tablo 2'ye bakınız.
- Astar tasarım aracı29'u kullanarak astar ve prob setleri tasarlayın ve Zırhlı RNA genomu içinde 95 bp'lik bir bölgeyi (gBlock yapısı) hedefleyin.
- Her RT-qPCR çalıştırması için kalibrasyon eğrileri edinin. Her qPCR çalışmasına negatif kontroller ekleyin. Standartları, örnekleri ve şablon olmayan denetimleri üçlü olarak çalıştırın.
- Her 10 μL RT-qPCR karışımını aşağıdaki sırayla hazırlayın: 2,5 μL 4x ana karışım, her bir astarın 400 nM'si, 200 nM prob ve 2,5 μL şablonun yanı sıra ultra saf DNAse / RNAse içermeyen damıtılmış su.
- Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde 5 dakika boyunca 50 ° C'de termal döngü reaksiyonları gerçekleştirin, ardından 10 s için 95 ° C'lik 45 döngü ve 30 s için 60 ° C'lik döngü gerçekleştirin. BT <40 ise, örnek Zırhlı RNA pozitifini düşünün.
- İnhibitörlerin veya hümik asitler gibi kirleticilerin olasılığını değerlendirmek için ham kanalizasyon numuneleri ile sığır serum albümini kullanarak qPCR ve RT-qPCR testleri yapın24. Enzimli ve enzimsiz örnekler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi.
- Konsantrasyonları standart eğriden hesaplayın. Geri kazanılan konsantrasyonu çivili konsantrasyona bölerek geri kazanım verimliliği yüzdesini hesaplayın.
- Analiz için log10 işlevini kullanarak gen kopya numaralarını dönüştürün. qPCR verileri üzerinde istatistiksel bir analiz aracı kullanarak genel bir doğrusal model çalıştırın. Yöntemler ve tedaviler arasındaki farklılıkları tespit etmek için Tukey'in testini uygulayın. Test için minimum anlamlılık düzeyi olması için 0,05 p değerini alın.
2. Su bazlı epidemiyoloji için DNA ve RNA virüslerinin filtrasyonu ve konsantrasyonu
- Çevresel yüzey suyu toplama için, 10 L çevresel yüzey suyu numunesi toplayın ve arka plan kontrolü için 10 L deiyonize su numunesi kullanın. Numune toplanmasını takiben 24 saat içinde işlenene kadar tüm numuneleri 4 °C'lik bir odada saklayın.
- Aşağıda açıklanan adımları kullanarak SMF ile çevresel örneklerden virüs konsantrasyonu gerçekleştirin.
- Metagenomik dizileme sırasında mikro-ökaryotlar ve bakteriler gibi daha büyük fraksiyonlardan virüsler gibi daha küçük fraksiyonlara kadar gürültüyü en aza indirmek için yüksek kapasiteli yeraltı suyu örnekleme kapsülleri ve 0,45 μm, 0,2 μm ve 0,1 μm boyutlarında membran disk filtreleri kullanarak kapsül ve vakum filtrasyonu gerçekleştirin.
- 13,2 g yağsız süt tozu ile 1,32 L sentetik deniz suyunda hacimce ağırlıkça %1 önceden topaklanmış yağsız süt çözeltisi hazırlayın. Bu süspansiyonun pH'ını 1 N HCl kullanarak 3,5'e ayarlayın.
- Çevresel yüzey suyu numunelerinin pH'ını 1 N HCl kullanarak 3,5'e ayarlayın.
- Önceden topaklaştırılmış asitleştirilmiş yağsız süt çözeltisinin 100 mL'sini 10 L asitleştirilmiş (pH 3,5) çevresel su numunelerine aktarın (nihai yağsız süt konsantrasyonu %0,01 [w/v]).
- Manyetik bir karıştırıcı ve manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, numuneleri oda sıcaklığında 8 saat karıştırın ve topakların yerçekimi ile 8 saat daha çökelmesine izin verin. Flikleri rahatsız etmeden, bir vakum pompası kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Kalan flokları 50 mL santrifüj tüplerindeki ağırlığa göre dengeleyin ve dengeleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 8.000 x g'de döndürün.
- Süpernatantı atın ve elde edilen peleti (teorik olarak ilgilenilen virüsleri içeren) 200 μL 0.2 M sodyum fosfat tamponunda çözün.
- Nükleik asit ekstraksiyonu için kullanılan kit nedeniyle birlikte çökeltilebilecek serbest DNA ve RNA varlığını ortadan kaldırmak için üreticinin talimatlarını izleyerek çözünmüş peleti DNaz I ve RNase A ile tedavi edin. DNase I ve RNase A'yı üreticinin yönergelerini izleyerek devre dışı bırakın.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir DNA / RNA ekstraksiyon kiti kullanarak çözünmüş peletten toplam nükleik asitleri çıkarın.
- Bir florometre kullanarak atık su örneklerinden ekstrakte edilen DNA ve RNA'nın toplam miktarını ölçün. Konsantrasyonları >1 ng / μL olan örnekler, DNA nicelleştirme ve dizileme için en uygun olarak kabul edilir.
- İlgilenilen enterik virüsleri hedeflemek için qPCR analizi ve viral topluluk yapısını tanımlamak için yüksek verimli dizileme yapın.
3. Su bazlı epidemiyoloji için doğrudan çökeltme ve mikrobiyal fraksiyonların konsantrasyonu
- Korunan ve etkilenen su yollarından 2 L su örneği toplayın. Numune önemli miktarda döküntü içeriyorsa, bunları çıkarmak için bir tülbent kullanın.
NOT: Numune başına biyolojik bir kopyanın toplanması şiddetle tavsiye edilir. - 4,4 g yağsız süt tozunu 440 mL sentetik deniz suyunda çözerek %1 (w/v) yağsız süt çözeltisi hazırlayın. Bu süspansiyonun pH'ını 1 N HCl ile 3,5'e ayarlayın.
- Tatlı su numunelerinin pH'ını 1 N HCl kullanarak 3,5'e ayarlayın.
- Daha önce pH ayarlı 2 L tatlı su numunelerine 20 mL yağsız süt çözeltisi ekleyin (nihai yağsız süt konsantrasyonu %0,01 [w/v]). Numuneleri oda sıcaklığında 8 saat karıştırın.
- Flokların 8 saat daha yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Süpernatantları peristaltik bir pompa ile dikkatlice çıkarın. Tortullanmış flokları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika boyunca 8.000 x g'de döndürün.
- Süpernatantı atın ve peletleri 200 μL 0.2 M sodyum fosfat tamponu ile yeniden askıya alın. Numuneleri -20 ° C'de saklayın veya üreticinin talimatlarını izleyerek tercih edilen nükleik asit izolasyon kitini kullanarak mikrobiyal DNA ekstraksiyonu için ~ 0.5 g flok seçmeye devam edin.
- DNA nükleik asit konsantrasyonunu ve saflığını yüksek hassasiyetli bir florometre ile belirleyin. Konsantrasyonları >1 ng/μL olan numuneler, DNA nicelleştirmesi ve dizilemesi için en uygun olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Viral RNA konsantrasyon yöntemlerinin değerlendirilmesi
UF-3k x g ile işlenen altı numunenin tümü pozitifti ve% 13.38 ±% 8.14 iyileşme ile sonuçlandı (Şekil 1). Numuneler UF-7.5k x g ile işlendiğinde sadece bir numune pozitifti. SMF ile işlenen tüm örnekler pozitifti ve% 15.27 ±% 2.65 iyileşme ile sonuçlandı (Şekil 1). UF-3K x g ve SMF'nin ortalama iyileşme oranları UF-7.5K x g'den anlamlı ve tutarlı bir şekilde (p < 0.0001) daha yüksekti. Öte yandan, UF-3K x g ve SMF'nin geri kazanım oranları arasında anlamlı bir fark (p = 0.6240) yoktu. B marka santrifüj cihazının santrifüj hızının 3.000 x g'den 7.500 x g'ye çıkarılması, muhtemelen Zırhlı RNA'nın filtrelerden artan bir oranda geçmesi ve Zırhlı RNA parçacıklarının filtrelere artan bir santrifüj hızında bağlanması nedeniyle daha düşük geri kazanımla sonuçlandı. Katı parçacıkların ultrafiltrasyon yöntemleri ile ortadan kaldırılması, Zırhlı RNA'nın atık su katılarına potansiyel olarak bölünmesi göz önüne alındığında, ultrafiltrasyon yöntemlerinin SMF'ye karşı daha düşük geri kazanım oranlarını açıklayabilir30. Ek olarak, fizikokimyasal ve biyolojik atıksu parametreleri (meta veriler) Tablo 1'de özetlenmiştir. SMF'nin yüzey suları ile test edilmesi (adım 2), virüslerin katı parçacıklara bölünmesinin, yüzey sularındaki düşük katı konsantrasyonları göz önüne alındığında geri kazanımı önemli ölçüde etkilemiş olabileceğini gösteren% 42.7 ±% 15.1 daha yüksek bir geri kazanım oranı ile sonuçlandı.
Seri filtrasyon ve virüs konsantrasyonu
Tablo 3 , Winnipeg'de üç mevsim boyunca toplanan çevresel su örneklerinden elde edilen su kalitesi parametrelerini ve nükleik asitleri özetlemektedir. DNA, tüm örnekleme yerlerinde ve mevsimler boyunca ölçülebilirdi. Ek Şekil 1 , çevresel yüzey suyu konumlarını içeren bir haritayı göstermektedir. Öte yandan, RNA değerleri çoğunlukla bir florometre (<0.025 ng / μL) kullanılarak tespit sınırının altındaydı. Bu RNA ekstraktları, yüksek verimli dizileme için ölçülebilir cDNA üretmek üzere rastgele çoğaltıldı (Tablo 3).
Çevresel su örneklerinden mikrobiyal fraksiyonların konsantrasyonu
Şekil 2 ve Şekil 3, çevresel yüzey suyu örneklerinden elde edilen mikrobiyal fraksiyonların metodolojisi ve konsantrasyonu için iş akışını göstermektedir. Tablo 4, bu araştırmada analiz edilen korunan (ormanlık) ve etkilenen (kentsel ve tarımsal) su yollarının örnekleme alanlarının ortalama DNA konsantrasyonunu, standart sapmasını ve pH, sıcaklık, çözünmüş oksijen, atmosferik basınç, yağış ve gün ışığı saatleri gibi çevresel koşulları içermektedir. Örnekler, Nisan 2022'den Ekim 2022'ye kadar Kanada'nın Manitoba kentindeki Assiniboine nehri boyunca Portage la Prairie Şehrini çevreleyen kentsel ve kırsal alanlarda aylık olarak toplanmıştır. En yüksek DNA konsantrasyonu ormanlık alan 1'de gözlendi ve 109.35-229.18 ng / μL verdi. Öte yandan, en düşük mikrobiyal DNA konsantrasyonu tarım alanı 3'ten geri kazanıldı ve ortalama 19.83-22.05 ng / μL konsantrasyona sahipti. Nisan-Ekim 2022 tarihleri arasında toplanan tüm örneklerin ortalama DNA konsantrasyonu, standart sapması ve meta verileri Tablo 4'te özetlenmiştir. Elde edilen DNA konsantrasyonları, PCR, qPCR ve dizilemeyi içeren diğer aşağı akış uygulamaları için optimumdu (veriler gösterilmemiştir).
Şekil 1: Atık su numuneleri için her bir yöntem için geri kazanım yüzdesi ve istatistiksel analiz. Kısaltmalar: SMF = yağsız süt flokülasyonu; UF-3K x g = 3.000 x g'de ultrafiltrasyon; UF-7.5K x g = 7.500 x g'de ultrafiltrasyon. Yıldız işaretli (*) araçlar, tedaviler arasında 0.05 seviyesinde önemli farklılıklar gösterir; n = 6. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Manitoba'nın atık su atıklarını alan kentsel su kütlelerinden virüsleri yoğunlaştırmak ve ölçmek için kullanılan metodolojinin şematik gösterimi. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DNA niceliği ve dizilimi için virüslerin, bakterilerin ve mikroökaryotların konsantrasyonunun grafiksel özeti. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: 11 çevresel su örneğinin yerleri. Örnekler, kırmızı noktalarla belirtildiği gibi Winnipeg, Manitoba'daki Kırmızı ve Assiniboine nehirleri boyunca toplandı. Winnipeg'in üç büyük kanalizasyon arıtma tesisi, hiçbir örnekleme olayı meydana gelmemesine rağmen, ziyaret edilen sitelerden biri olarak mavi renkle belirtilmiştir. Verilerin kaynakları Google haritalar ve Tableau yazılımıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: NESTP, SESTP ve WESTP'nin giriş numunelerinde su kalitesi parametreleri. Kısaltmalar: NESTP = North End Kanalizasyon Arıtma Tesisi; SESTP = South End Kanalizasyon Arıtma Tesisi; WESTP = West End Kanalizasyon Arıtma Tesisi; MLD = günde milyon litre; TS = toplam katılar; TSS = toplam askıda katı maddeler; BOD5 = 5 günlük biyokimyasal oksijen ihtiyacı; NH4-N = amonyum-azot; TP = toplam fosfor; TOC = toplam organik karbon; TN = toplam azot. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: RT-qPCR tahlillerinin primer/prob setleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: Kırmızı ve Assiniboine nehirleri, 16 Mayıs'ta İlkbaharda, 27 Ağustos'ta Yaz ve 21 Kasım 2021'de Güz'de numune toplama sırasında su kalitesi parametreleri ve toplam nükleik asitlerin (DNA ve RNA) florometre ölçümü. * RNA kitinin algılama sınırı 0.025 ng / μL'dir; ^ sayılar aralık değerlerini temsil eder. Kısaltmalar: DO = çözünmüş oksijen; BOD5= 5 günlük biyokimyasal oksijen ihtiyacı; TP = toplam fosfor. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: Numune toplama sırasında Assiniboine nehri su kalitesi parametreleri (Nisan-Ekim 2022). Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmadaki kritik adımlardan biri, 0,2 μm ve 0,45 μm membran filtrelerle bir ön filtreleme adımı uygulanarak katı partiküllerin elimine edilmesidir. Virüslerin katı parçacıklara, özellikle de zarflı virüslere bölünmesi göz önüne alındığında, ön filtrasyon viral iyileşmede önemli bir kayba neden olabilir30. Ultrafiltrasyon cihazlarının tıkanmasını önlemek için çevresel ve atık su numuneleri için ultrafiltrasyon yöntemleri için bir ön filtreleme adımı neredeyse her zaman gerekli olsa da, aşağı akış analizinin türüne bağlı olarak SMF için ön filtreleme gerekebilir. Hedeflenen PCR çalışmaları için ön filtreleme gerekmeyebilir. Öte yandan, prefiltrasyon viral metagenomiği önemli ölçüde iyileştirebilir, çünkü mikroökaryotlar ve bakteriler gibi daha büyük fraksiyonlardan viromlardaki arka plan gürültüsünü azaltır. Bu adım, daha büyük genomların viral sinyali sürmemesi için dizileme için kritik öneme sahiptir.
Sıralı ultrafiltrasyon ile işlenebilecek numune hacmi 140 mL ile sınırlıdır. Bu, düşük virüs sayısına sahip örnekler için önemli bir sınırlamadır. Öte yandan, SMF çok daha büyük numune hacimlerini işleyebilir ve virüslerin kurtarılma olasılığını artırabilir.
SMF'nin geri kazanım oranları, atık sudan viral parçacıkların konsantrasyonuna odaklanan diğer çalışmalarla uyumludur. Daha önce yayınlanmış makaleler, çeşitli test virüsleri ile benzer iyileşme oranları bildirmiştir. Bu çalışmalarda bildirilen ortalama iyileşme oranları %3,4 ile %14 arasında değişmiştir13,31,32. Mevcut metodoloji, Winnipeg33'teki vaka sayılarıyla ilişkili olarak atık sudaki SARS-CoV-2'yi araştıran başka bir çalışmanın bir parçasıydı. Burada açıklanan SMF yöntemi, laboratuvarımızda Manitoba'nın kırsal topluluklarından oksidasyon lagünlerinde SARS-CoV-2 RNA'sını taramak için de kullanılmıştır. SMF yönteminin faydası, laboratuvarımızda yüksek verimli dizileme kullanarak kentsel ortamlardan tatlı su örneklerinde viral toplulukları karakterize etmek için seri filtrasyon (0.45 μm ve ardından 0.2 μm ve 0.1 μm) ile birlikte de kullanılmıştır (metodolojinin ikinci bölümünde açıklanmıştır). Son olarak, SMF yöntemi, çevresel su örneklerinden mikroökaryotlar, bakteriler ve virüsler gibi mikrobiyal toplulukların çökeltilmesini yönlendirmek ve 18S rRNA ve 16S rRNA genlerinin derin amplikon dizilimi ile T4 benzeri virüsler (Zambrano ve Uyaguari-Díaz) gibi viral grupların ana kapsid protein genini (g23) kullanarak daha fazla karakterizasyon yapmak için de uygulanabilir. yayınlanmamış veriler). SMF yöntemi, su numunelerinde bulunan mikrobiyal fraksiyonların büyük giriş hacimlerinden (yani, 10-40 L) nispeten daha küçük hacimlere (yani 1-5 mL) konsantre edilmesini sağlar. Bu metodolojinin bir parçası olarak, ultra saf su da negatif / arka plan kontrolü olarak dahil edilmiştir. Mikrobiyal fraksiyonlar konsantre edildikten sonra, nükleik asit ekstraksiyonu ticari ekstraksiyon kitleri veya şirket içi protokoller kullanılarak gerçekleştirilebilir. SMF, ultrafiltrasyon veya teğetsel akış filtrasyon yaklaşımlarına kıyasla önemli bir fark olmadan, mikrobiyal fraksiyonları veya viral parçacıkları konsantre etmek için çok yönlü, nispeten ucuz ve kolay / eller kapalı bir yöntemi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek bilinen rakip finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma NSERC Alliance Covid-19 Grant (Ödül No. 431401363, 2020-2021, Dr. Yuan ve Uyaguari-Díaz) tarafından desteklenmiştir. MUD, Üniversite Araştırma Hibeleri Programına (Ödül No. 325201) teşekkür eder. Hem JF hem de JZA, Görsel ve Otomatik Hastalık Analitiği (VADA) lisansüstü eğitim programı tarafından desteklenmektedir. KY ve JF, Mitacs Accelerate programından burs aldı. MUD ve laboratuvar üyeleri (KY, JF, JZA), NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) ve Research Manitoba New Investigator Operating grant (No 5385) tarafından desteklenmektedir. Winnipeg, Manitoba Şehri'ne özel teşekkürler. Bu araştırma Manitoba Üniversitesi'nde yapılmıştır. Manitoba Üniversitesi kampüslerinin Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota ve Dene halklarının orijinal topraklarında ve Métis Ulusunun anavatanında bulunduğunu kabul etmek isteriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 | Alfa Aesar | J62041AP | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| 0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 66234 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters | VWR | 60043 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| 4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444432 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control | Asuragen | 49650 | Asuragen, Austin, TX, USA |
| Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | OD030C65 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa | Pall | MCP010C46 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050PK | Thermo Fisher Scientific |
| DNAse I | Invitrogen | 18047019 | Thermo Fisher Scientific |
| Dyna Mag-2 | Invitrogen | 12027 | Thermo Fisher Scientific |
| GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm | Pall | 12179 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| Hydrochloric acid, 1N standard solution | Thermo Fisher Scientific | AC124210025 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit | Applied biosystems | A42358 | Thermo Fisher Scientific |
| Nuclease free water | Promega | P1197 | Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA |
| Peristaltic pump | Masterflex, Cole-Parmer instrument | 7553-20 | Thermo Fisher Scientific |
| pH meter | Denver instrument | RK-59503-25 | Cole-Parmer. This product has been discontinued |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 | Invitrogen | 15593031 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Primers and probe sets | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit | Qiagen | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A34322 | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA |
| Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q33231 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit 4 Fluorometer, with WiFi | Invitrogen | Q33238 | Thermo Fisher Scientific |
| Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit | Invitrogen | Q32855 | Thermo Fisher Scientific |
| RNAse A | Invitrogen | EN0531 | Thermo Fisher Scientific |
| RNeasy PowerMicrobiome Kit | Qiagen | 26000-50 | Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA |
| Skim milk powder | Difco (BD Life Sciences) | DF0032173 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
| Sodium phosphate buffer | Alfa Aesar | Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada | |
| Synthetic seawater | VWR | RC8363-1 | RICCA chemical company |
| Synthetic single-stranded DNA gBlock | IDT | Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA | |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4621 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated | Pall | 4622 | Pall Corporation, Ann Arbor, MI |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA |
References
- Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
- Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
- Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
- Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
- Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P.
- Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
- Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
- Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
- Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
- Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
- Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
- Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
- Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
- Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
- Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
- Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
- Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
- Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
- Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
- Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
- Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
- Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
- Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
- Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
- Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
- Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
- Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
- Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
- Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).
