Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65058
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2
1Department of Civil Engineering, Price Faculty of Engineering, University of Manitoba, 2Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Manitoba

Summary

Virusconcentratie uit milieuwater- en afvalwatermonsters is een uitdagende taak, voornamelijk uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van virussen. Hoewel er verschillende virusconcentratiemethoden zijn ontwikkeld en getest, tonen we hier de effectiviteit aan van ultrafiltratie en magere melkvlokking voor RNA-virussen met verschillende monstertypen.

Abstract

Op water en afvalwater gebaseerde epidemiologie zijn naar voren gekomen als alternatieve methoden om het verloop van uitbraken in gemeenschappen te volgen en te voorspellen. Het terugwinnen van microbiële fracties, waaronder virussen, bacteriën en microeukaryoten uit afvalwater en milieuwatermonsters is een van de uitdagende stappen in deze benaderingen. In deze studie hebben we ons gericht op de herstelefficiëntie van sequentiële ultrafiltratie en magere melk flocculatie (SMF) -methoden met behulp van gepantserd RNA als een testvirus, dat ook wordt gebruikt als een controle door sommige andere studies. Voorfiltratie met 0,45 μm en 0,2 μm membraanschijffilters werden toegepast om vaste deeltjes te elimineren vóór ultrafiltratie om de verstopping van ultrafiltratie-apparaten te voorkomen. Testmonsters, verwerkt met de sequentiële ultrafiltratiemethode, werden met twee verschillende snelheden gecentrifugeerd. Een verhoogde snelheid resulteerde in lagere herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aan de andere kant resulteerde SMF in relatief consistente herstel- en positiviteitspercentages van gepantserd RNA. Aanvullende tests uitgevoerd met milieuwatermonsters toonden het nut aan van SMF om andere microbiële fracties te concentreren. De verdeling van virussen in vaste deeltjes kan van invloed zijn op de algehele terugwinningspercentages, gezien de voorfiltratiestap die wordt toegepast vóór de ultrafiltratie van afvalwatermonsters. SMF met voorfiltratie presteerde beter wanneer toegepast op milieuwatermonsters vanwege lagere vaste concentraties in de monsters en dus lagere verdelingssnelheden naar vaste stoffen. In de huidige studie ontstond het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.

Introduction

Het bepalen van de effectieve concentratie van micro-organismen in oppervlakte- en afvalwatermonsters voor microbiële gemeenschapsanalyse en epidemiologische studies, is een van de belangrijke stappen voor het monitoren en voorspellen van het verloop van uitbraken in gemeenschappen 1,2. De COVID-19-pandemie ontvouwde het belang van het verbeteren van concentratiemethoden. COVID-19 dook eind 2019 op en vormt vanaf maart 2023 nog steeds een bedreiging voor de menselijke gezondheid, het sociale leven en de economie. Effectieve surveillance- en controlestrategieën om de gevolgen van COVID-19-uitbraken in gemeenschappen te verlichten, zijn een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden, aangezien nieuwe golven en varianten van COVID-19 zijn ontstaan naast de snelle overdracht en verspreiding van het virus, evenals niet-gemelde en niet-gediagnosticeerde asymptomatische gevallen 3,4,5. Het gebruik van op afvalwater gebaseerde epidemiologie voor COVID-19 door maatschappelijke organisaties, overheidsinstanties en openbare of particuliere nutsbedrijven is nuttig geweest bij het verstrekken van snelle uitbraakgerelateerde informatie en het beperken van de gevolgen van COVID-19-uitbraken 6,7,8,9. De concentratie van SARS-CoV-2, een omhuld RNA-virus, in afvalwatermonsters vormt echter nog steeds een uitdaging10. Een van deze uitdagingen is bijvoorbeeld de verdeling van SARS-CoV-2 in vaste stoffen in afvalwater, wat van invloed kan zijn op het herstel wanneer de vaste stoffen worden geëlimineerd tijdens concentratie11. Als dit het geval is, moet de kwantificering/beoordeling gericht zijn op zowel vaste als waterige fasen van milieuwatermonsters, in plaats van alleen op de waterige fase. Bovendien kan de keuze van de concentratiemethode worden gewijzigd op basis van downstreamtests en -analyses. De concentratie van virusdeeltjes en pathogenen uit omgevingsmonsters is een urgent onderzoeksonderwerp geworden met ontwikkelingen op het gebied van sequencing en microbioom.

Op het gebied van virusconcentratie uit omgevingswater- en afvalwatermonsters zijn verschillende virusconcentratiemethoden toegepast. Enkele veelgebruikte methoden zijn filtratie, magere melkflocculatie (SMF), adsorptie / elutie en polyethyleenglycolprecipitatie12-17. Onder hen is SMF beschouwd als een goedkope en effectieve methode, met succes getest en toegepast voor het herstellen van virussen, waaronder SARS-CoV-2, uit afvalwater en oppervlaktewateren12,15,16,18. De SMF-procedure is een relatief nieuwe benadering die in veel milieustudies steeds meer erkenning heeft gekregen als een geschikte methode om tegelijkertijd een breed scala aan micro-organismen zoals virussen, bacteriën en protozoën terug te winnen uit alle soorten watermonsters, namelijk slib, ruw afvalwater, afvalwater en effluentmonsters19. In vergelijking met andere bekende methoden om virussen te herstellen uit omgevingsmonsters zoals ultrafiltratie en glycine-alkalische elutie, op lyofilisatie gebaseerde benadering of ultracentrifugatie en glycine-alkalische elutie, is SMF gerapporteerd als de meest efficiënte methode met hogere virale herstel- en detectiepercentages18,20. In de huidige studie gebruikten we gepantserd RNA als testvirus om de herstelefficiëntie van virusconcentratiemethoden te beoordelen, inclusief tests voor het beoordelen van SARS-CoV-2-herstel21,22.

Hier hebben we afvalwater- en milieuwatermonsters getest om het nut van SMF aan te tonen en een sequentiële ultrafiltratiemethode om microbiële fracties te concentreren voor kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), sequentiegebaseerde metagenomica en diepe ampliconsequencing. SMF is een relatief goedkopere methode en optimaal voor een groter volume monsters in vergelijking met ultrafiltratiemethoden. Het idee om een sequentiële ultrafiltratiemethode te gebruiken, kwam voort uit de noodzaak om het uiteindelijke volume van de virale concentraten te verminderen tijdens de COVID-19-pandemie, toen het aanbod van de veelgebruikte ultrafiltratie-apparaten beperkt was en er behoefte was aan de ontwikkeling van alternatieve virale concentratiemethoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vergelijking van seriële ultrafiltratie en mageremelkflocculatie om virussen in afvalwatermonsters te concentreren

  1. Monstervoorbereiding
    1. Verzamel 2 L van 24 h flow-proportionele samengestelde ruwe (influent) afvalwatermonsters. In de zomer en herfst van 2020 werden monsters verzameld van de drie grote afvalwaterzuiveringsinstallaties (RWZI's) in Winnipeg, Canada (tabel 1).
    2. Transporteer de monsters naar het laboratorium in lichtdichte flessen in een ijskast en verwerk ze binnen 24 uur. Verzamel gegevens over fysisch-chemische en biologische kenmerken van afvalwater.
  2. Virusconcentratietests
    OPMERKING: Een sequentiële ultrafiltratiemethode en een organische flocculatiemethode, namelijk mageremelkflocculatie (SMF), werden toegepast om de totale herstelefficiëntie van elke methode te beoordelen met behulp van gepantserd RNA als testvirus23. Andere onderzoekers hebben ook gepantserd RNA gebruikt als een controlevirus voor het beoordelen van het herstel van concentratiemethoden voor omhulde virussen, zoals de familie Coronaviridae22,24,25,26.
    1. Voor de toevoeging van gepantserd RNA stelt u de afvalwatertestvolumes voor de ultrafiltratie- en SMF-methoden in op respectievelijk 140 ml en 500 ml. Met behulp van een pipettor, spike 5 x 104 kopieën van gepantserd RNA in zes verse afvalwatermonsters verzameld op een datum en zes verse afvalwatermonsters op een andere datum, voor elke ultrafiltratiemethode; verder worden spike zes opgeslagen (bij 4 °C) afvalwatermonsters verzameld op een derde, latere datum en dagen later verwerkt voor SMF.
      OPMERKING: Elk van de zes monstersets die op verschillende data werden verzameld, bestond uit twee monsters van elk van de drie RWZI's. In onze studie werden de eerste reeks zoete afvalwatermonsters verzameld op 8 juli 2020, de tweede op 30 september 2020 en de afvalwatermonsters worden opgeslagen voor SMF op 14 oktober 2020.
    2. Roer gedurende 30 minuten bij 4 °C om het gepantserde RNA in de monsters te enten en te homogeniseren met behulp van een magnetische roerder.
    3. Verwijder alle deeltjes of cellen groter dan 0,2 μm en voer ultrafiltratie uit.
      1. Filter de puntige afvalwatermonsters (120 ml van elk 140 ml spiked monster) door kaasdoek en eiwitarme binding, respectievelijk 0,45 μm en 0,2 μm, 47 mm membraanschijffilters, om grote deeltjes, sedimenten, eukaryoten en bacteriën te verwijderen27. Verwerk de gefilterde monsters met behulp van de hieronder beschreven ultrafiltratiemethoden.
        OPMERKING: De afvalwatermonsters verzameld op 8 juli en 30september werden gebruikt voor ultrafiltratiemethoden met respectievelijk 3.000 x g en 7.500 x g.
      2. Concentreer voor sequentiële ultrafiltratie bij 3.000 x g (UF-3k x g) in totaal 120 ml van het testmonster dat op de eerste datum is verzameld op 3.000 x g gedurende 30 minuten door 60 ml van het monster tweemaal tot ongeveer 5 ml te laden met behulp van een centrifugaalapparaat van het merk A, 30 kDa. Concentreer vervolgens het volume van 5 ml gedurende 30 minuten op 3.000 x g met behulp van een merk B-centrifugaalapparaat, 30 kDa, tot 500-1.200 μl.
      3. Voor sequentiële ultrafiltratie bij 7.500 x g (UF-7,5k x g), wijzigt u de centrifugatiesnelheid voor het centrifugaalapparaat van merk B van 3.000 x g naar 7.500 x g om kleinere eindvolumes te verkrijgen, volgens de aanbevelingen van de fabrikant, en houdt u de centrifugatiesnelheid van het merk A-centrifugaalapparaat hetzelfde.
        OPMERKING: De tests werden uitgevoerd met de monsters verzameld op 30september.
    4. Voer voor SMF de onderstaande stappen uit.
    5. Spike de afvalwatermonsters (elk 500 ml) om zich direct te concentreren met behulp van het SMF-protocol16,18, zonder voorfiltratie met kaasdoek en eiwitarme membraanschijffilters, zoals hieronder beschreven.
    6. Los 0,5 g mageremelkpoeder op in 50 ml synthetisch zeewater om een 1% (m/v) mageremelkoplossing te verkrijgen en stel de pH van de oplossing voorzichtig in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.
      OPMERKING: Verzuring zorgt ervoor dat virussen aggregeren en neerslaan uit water als gevolg van de verandering in hun iso-elektrische punt16 en verbetert de oplosbaarheid van melkpoeder28.
    7. Voeg 5 ml mageremelkoplossing toe aan 500 ml ruwe afvalwatermonsters om een uiteindelijke concentratie magere melk van 0,01% (m/v) te verkrijgen.
    8. Roer de monsters gedurende 8 uur op gemiddelde snelheid en laat de gevormde vlokken nog eens 8 uur bezinken bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder de supernatanten voorzichtig met serologische pipetten zonder de bezonken vlokken te verstoren. Breng een eindvolume van 50 ml met de vlokken over in centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 8.000 x g bij 8 °C.
    10. Schraap de pellets voorzichtig met een gesteriliseerde spatel en resuspensie de resterende pellets in de buizen in 250 μL van 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,5) nadat het supernatant is verwijderd. Breng de geschraapte en geresuspendeerde pellets over naar dezelfde 1,5 ml minicentrifugebuizen.
  3. Voer virale RNA-extractie uit virale concentraten van afvalwatermonsters en herstelefficiëntietests uit met behulp van een RNA-extractiekit met een 25: 24: 1-verhouding van fenol: chloroform: isoamylalcohol en β-mercaptoethanol, volgens de instructies van de fabrikant, om de extractie-efficiëntie te verbeteren. Elueer ten slotte het RNA in 50 μL elutiebuffer.
  4. Real-time-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) analyse
    1. Kwantificeer gepantserd RNA met behulp van tienvoudige verdunningen (7,8 x 10,4 tot 7,8 genkopieën) van een synthetisch enkelstrengs DNA of gBlock-construct. Zie tabel 2 voor de primers en probe sets die het gepantserde RNA detecteren en kwantificeren.
    2. Ontwerp primer- en probe-sets met behulp van de primer-ontwerptool29 en richt je op een 95 bp-gebied (gBlock-construct) binnen het gepantserde RNA-genoom.
    3. Verkrijg kalibratiecurven voor elke RT-qPCR-run. Neem negatieve besturingselementen op in elke qPCR-run. Voer standaarden, voorbeelden en niet-sjabloonbesturingselementen in drievoud uit.
    4. Bereid elk 10 μL RT-qPCR-mengsel in de volgende volgorde: 2,5 μL 4x mastermix, 400 nM van elke primer, 200 nM-sonde en 2,5 μL sjabloon, evenals ultrapuur DNAse / RNAse-vrij gedestilleerd water.
    5. Voer thermische cyclusreacties uit bij 50 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 45 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s op een real-time PCR-systeem. Als de CT <40 was, overweeg dan het monster gepantserd RNA-positief.
    6. Voer qPCR- en RT-qPCR-tests uit met runderserumalbumine met ruwe rioolwatermonsters om de mogelijkheid van remmers of verontreinigingen zoals humuszuren te beoordelen24. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen monsters met en zonder het enzym.
  5. Bereken de concentraties uit de standaardcurve. Bereken het efficiëntiepercentage van de terugwinning door de teruggewonnen concentratie te delen door de piekconcentratie.
  6. Transformeer genkopienummers met behulp van de log10-functie voor analyse. Voer een algemeen lineair model uit met behulp van een statistische analysetool op de qPCR-gegevens. Pas de test van Tukey toe om verschillen tussen de methoden en behandelingen te detecteren. Neem een p-waarde van 0,05 als minimaal significantieniveau voor de test.

2. Filtratie en concentratie van DNA- en RNA-virussen voor epidemiologie op waterbasis

  1. Voor het verzamelen van oppervlaktewater in het milieu, verzamelt u 10 L oppervlaktewatermonsters en gebruikt u 10 L gedeïoniseerde watermonsters voor achtergrondcontrole. Bewaar alle monsters in een ruimte van 4 °C totdat ze binnen 24 uur na de monsterneming zijn verwerkt.
  2. Voer de concentratie van virussen uit omgevingsmonsters uit met SMF met behulp van de onderstaande stappen.
    1. Voer capsule- en vacuümfiltratie uit met behulp van grondwaterbemonsteringscapsules met hoge capaciteit en membraanschijffilters van 0,45 μm, 0,2 μm en 0,1 μm om ruis tijdens metagenomische sequencing te minimaliseren, van grotere fracties zoals micro-eukaryoten en bacteriën tot kleinere zoals virussen.
    2. Bereid een voorgevlokte mageremelkoplossing van 1% gewicht per volume in 1,32 l synthetisch zeewater met 13,2 g mageremelkpoeder. Stel de pH van deze suspensie in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.
  3. Stel de pH van de omgevingsoppervlaktewatermonsters in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.
  4. Breng 100 ml van de voorgevlokte aangezuurde mageremelkoplossing over in 10 L aangezuurde (pH 3,5) milieuwatermonsters (uiteindelijke mageremelkconcentratie van 0,01% [g/v]).
  5. Roer met behulp van een magneetroerder en een magneetroerstaaf de monsters gedurende 8 uur bij kamertemperatuur en laat de vlokken door de zwaartekracht nog eens 8 uur bezinken. Zonder de vlokken te storen, verwijdert u het supernatant voorzichtig met behulp van een vacuümpomp.
  6. Aliquoteer en balanceer de resterende vlokken volgens het gewicht in centrifugebuizen van 50 ml en draai ze gedurende 30 minuten bij 4 °C naar beneden bij 8.000 x g .
  7. Gooi het supernatant weg en los de resulterende pellet (die theoretisch interessante virussen bevat) op in 200 μL natriumfosfaatbuffer.
  8. Behandel de opgeloste pellet met DNase I en RNase A, volgens de instructies van de fabrikant, om vrij DNA en RNA te verwijderen dat samen kan worden neergeslagen als gevolg van de kit die wordt gebruikt voor nucleïnezuurextractie. Deactiveer de DNase I en RNase A volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Extraheer totale nucleïnezuren uit de opgeloste pellet met behulp van een DNA / RNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant.
  10. Kwantificeer de totale hoeveelheid geëxtraheerd DNA en RNA uit effluentmonsters met behulp van een fluorometer. Monsters met concentraties >1 ng/μL worden als optimaal beschouwd voor DNA-kwantificering en -sequencing.
  11. Voer qPCR-analyse uit om enterische virussen van belang te targeten en high-throughput sequencing om de virale gemeenschapsstructuur te identificeren.

3. Directe precipitatie en concentratie van microbiële fracties voor epidemiologie op waterbasis

  1. Verzamel 2 L watermonsters van beschermde en getroffen waterwegen. Als het monster een aanzienlijke hoeveelheid vuil bevat, gebruik dan een kaasdoek om ze te verwijderen.
    OPMERKING: Het verzamelen van een biologisch duplicaat per monster wordt ten zeerste aanbevolen.
  2. Bereid een 1% (m/v) magere melkoplossing door 4,4 g mageremelkpoeder op te lossen in 440 ml synthetisch zeewater. Stel de pH van deze suspensie in op 3,5 met 1 N HCl.
  3. Stel de pH van de zoetwatermonsters in op 3,5 met behulp van 1 N HCl.
  4. Voeg 20 ml mageremelkoplossing toe aan de eerder voor de pH gecorrigeerde zoetwatermonsters van 2 l (uiteindelijke mageremelkconcentratie van 0,01% [g/v]). Roer de monsters gedurende 8 uur bij kamertemperatuur.
  5. Laat de vlokken nog 8 uur door de zwaartekracht bezinken. Verwijder de supernatanten voorzichtig met een peristaltische pomp. Breng de gesedimenteerde vlokken over in een centrifugebuis van 50 ml en draai ze gedurende 30 minuten op 8.000 x g naar beneden.
  6. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellets met 200 μL natriumfosfaatbuffer van 0,2 M. Bewaar de monsters bij -20 °C of selecteer ~ 0,5 g van de vlok voor microbiële DNA-extractie met behulp van de nucleïnezuurisolatiekit naar keuze, volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Bepaal de DNA-nucleïnezuurconcentratie en -zuiverheid met een hooggevoelige fluorometer. Monsters met concentraties >1 ng/μL moeten optimaal zijn voor DNA-kwantificering en -sequencing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluatie van virale RNA-concentratiemethoden
Alle zes monsters verwerkt met UF-3k x g waren positief en resulteerden in een herstel van 13,38% ± 8,14% (figuur 1). Slechts één monster was positief wanneer de monsters werden verwerkt met UF-7,5k x g. Alle met SMF verwerkte monsters waren positief en resulteerden in een herstel van 15,27% ± 2,65% (figuur 1). De gemiddelde herstelpercentages van UF-3K x g en SMF waren significant en consistent (p < 0,0001) hoger dan UF-7,5K x g. Aan de andere kant was er geen significant verschil (p = 0,6240) tussen de herstelpercentages van UF-3K x g en SMF. Het verhogen van de centrifugatiesnelheid van het merk B centrifugaalapparaat tot 7.500 x g van 3.000 x g resulteerde in een lager herstel, waarschijnlijk als gevolg van de passage van gepantserd RNA door filters met een verhoogde snelheid en binding van gepantserde RNA-deeltjes aan de filters met een verhoogde centrifugale snelheid. Het elimineren van vaste deeltjes met ultrafiltratiemethoden zou de lagere terugwinningssnelheden van de ultrafiltratiemethoden tegen SMF kunnen verklaren, gezien de potentiële verdeling van gepantserd RNA naar de vaste stoffen in het afvalwater30. Daarnaast zijn fysisch-chemische en biologische afvalwaterparameters (metadata) samengevat in tabel 1. Het testen van SMF met oppervlaktewateren (stap 2) resulteerde in een hoger herstelpercentage, 42,7% ± 15,1%, wat aangeeft dat het verdelen van de virussen in vaste deeltjes het herstel aanzienlijk kan hebben beïnvloed, gezien de lage vaste concentraties in oppervlaktewateren.

Seriële filtratie en concentratie van virussen
Tabel 3 geeft een overzicht van de waterkwaliteitsparameters en nucleïnezuren die zijn geëxtraheerd uit milieuwatermonsters die gedurende drie seizoenen in Winnipeg zijn verzameld. DNA was kwantificeerbaar op alle bemonsteringslocaties en in alle seizoenen. Aanvullende figuur 1 geeft een kaart weer met de omgevingslocaties van het oppervlaktewater. Aan de andere kant lagen de RNA-waarden meestal onder de detectiegrens met behulp van een fluorometer (<0,025 ng / μL). Deze RNA-extracten werden willekeurig versterkt om kwantificeerbaar cDNA te genereren voor high-throughput sequencing (tabel 3).

Concentratie van microbiële fracties uit milieuwatermonsters
Figuur 2 en figuur 3 tonen de workflow voor de methodologie en concentratie van microbiële fracties uit oppervlaktewatermonsters in het milieu. Tabel 4 bevat de gemiddelde DNA-concentratie, standaarddeviatie en de omgevingscondities, zoals pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, atmosferische druk, neerslag en daglichttijden van de bemonsteringslocaties van de beschermde (beboste) en beïnvloede (stedelijke en agrarische) waterwegen die in dit onderzoek zijn geanalyseerd. Monsters werden maandelijks verzameld van april 2022 tot oktober 2022 in stedelijke en landelijke gebieden rond de stad Portage la Prairie langs de Assiniboine-rivier in Manitoba, Canada. De hoogste DNA-concentratie werd waargenomen in de beboste site 1 en leverde 109,35-229,18 ng/μL op. Aan de andere kant werd de laagste microbiële DNA-concentratie teruggevonden op de landbouwlocatie 3 en had een gemiddelde concentratie van 19,83-22,05 ng / μL. De gemiddelde DNA-concentratie, standaarddeviatie en metadata van alle monsters die van april tot oktober 2022 zijn verzameld, zijn samengevat in tabel 4. De verkregen DNA-concentraties waren optimaal voor andere downstream-toepassingen, waaronder PCR, qPCR en sequencing (gegevens niet getoond).

Figure 1
Figuur 1: Percentage terugwinning en statistische analyse voor elke methode voor afvalwatermonsters. Afkortingen: SMF = magere melk flocculatie; UF-3K x g = ultrafiltratie bij 3.000 x g; UF-7.5K x g = ultrafiltratie bij 7.500 x g. Gemiddelden met een sterretje (*) geven significante verschillen aan op het niveau van 0,05 tussen de behandelingen; n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Schematische weergave van de methodologie die wordt gebruikt om virussen uit stedelijke waterlichamen van Manitoba die afvalwater ontvangen, te concentreren en te kwantificeren. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Grafische samenvatting van de concentratie van virussen, bacteriën en microeukaryoten voor DNA-kwantificering en -sequencing. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Locaties van 11 milieuwatermonsters. Monsters werden verzameld langs de rode en assiniboine rivieren in Winnipeg, Manitoba, zoals aangegeven door de rode stippen. De drie grote rioolwaterzuiveringsinstallaties van Winnipeg zijn in het blauw aangegeven als een van de bezochte locaties, ook al hebben zich geen bemonsteringsgebeurtenissen voorgedaan. De bronnen van de data zijn Google maps en Tableau software. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel 1: Waterkwaliteitsparameters in influentmonsters van NESTP, SESTP en WESTP. Afkortingen: NESTP = North End Rioolwaterzuiveringsinstallatie; SESTP = South End rioolwaterzuiveringsinstallatie; WESTP = West End rioolwaterzuiveringsinstallatie; MLD = miljoen liter per dag; TS = totaal aan vaste stoffen; TSS = totaal gesuspendeerde vaste stoffen; BZV5 = 5 dagen biochemisch zuurstofverbruik; NH4-N = ammoniumstikstof; TP = totaal fosfor; TOC = totaal organische koolstof; TN = totaal stikstof. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Primer/probe sets van RT-qPCR assays. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Rode en Assiniboine rivieren waterkwaliteitsparameters tijdens monsterverzameling in de lente op 16 mei, zomer op 27 augustus en herfst op 21 november 2021) en fluorometer kwantificering van totale nucleïnezuren (DNA en RNA). * De detectielimiet van de RNA-kit is 0,025 ng / μL; ^ getallen vertegenwoordigen bereikwaarden. Afkortingen: DO = opgeloste zuurstof; BZV5= 5 dagen biochemisch zuurstofverbruik; TP = totaal fosfor. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: Assiniboine rivierwaterkwaliteitsparameters tijdens het verzamelen van monsters (april tot oktober 2022). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een van de kritische stappen in deze studie is de eliminatie van vaste deeltjes door het toepassen van een voorfiltratiestap met membraanfilters van 0,2 μm en 0,45 μm. Gezien de verdeling van virussen in vaste deeltjes, met name omhulde virussen, kan voorfiltratie een aanzienlijk verlies in viraal herstel veroorzaken30. Hoewel een voorfiltratiestap voor ultrafiltratiemethoden bijna altijd nodig is voor milieu- en afvalwatermonsters om te voorkomen dat ultrafiltratie-apparaten verstopt raken, kan voorfiltratie voor SMF nodig zijn, afhankelijk van het type downstream-analyse. Voor gerichte PCR-onderzoeken is voorfiltratie mogelijk niet vereist. Aan de andere kant kan voorfiltratie de virale metagenomica aanzienlijk verbeteren, omdat het het achtergrondgeluid in viromen van grotere fracties zoals microeukaryoten en bacteriën vermindert. Deze stap is van cruciaal belang voor sequencing, zodat grotere genomen het virale signaal niet zwermen.

Het monstervolume dat kan worden verwerkt met sequentiële ultrafiltratie is beperkt tot 140 ml. Dit is een belangrijke beperking voor monsters met een laag aantal virussen. Aan de andere kant kan SMF veel grotere monstervolumes verwerken, waardoor de kans op het herstellen van virussen toeneemt.

De terugwinningspercentages van de SMF zijn in overeenstemming met andere studies die zich richten op de concentratie van virale deeltjes uit afvalwater. Eerder gepubliceerde artikelen rapporteerden vergelijkbare herstelpercentages met een verscheidenheid aan testvirussen. De gerapporteerde gemiddelde herstelpercentages in deze studies varieerden tussen 3,4% en 14% 13,31,32. De huidige methodologie maakte deel uit van een ander onderzoek naar SARS-CoV-2 in afvalwater in relatie tot het aantal gevallen in Winnipeg33. De hier beschreven SMF-methode is ook gebruikt om te screenen op SARS-CoV-2 RNA in oxidatielagunes van landelijke gemeenschappen van Manitoba in ons laboratorium. Het nut van de SMF-methode is ook gebruikt in combinatie met seriële filtratie (0,45 μm gevolgd door 0,2 μm en 0,1 μm) om virale gemeenschappen in zoetwatermonsters uit stedelijke omgevingen te karakteriseren met behulp van high-throughput sequencing in ons laboratorium (beschreven in het tweede deel van de methodologie). Ten slotte kan de SMF-methode ook worden toegepast om de precipitatie van microbiële gemeenschappen, zoals microeukaryoten, bacteriën en virussen uit milieuwatermonsters, te sturen en verdere karakterisering met behulp van deep-amplicon sequencing van de 18S rRNA- en 16S-rRNA-genen, evenals het belangrijkste capsid-eiwitgen (g23) van virale groepen zoals T4-achtige virussen (Zambrano en Uyaguari-Díaz, niet-gepubliceerde gegevens). De SMF-methode maakt het mogelijk om de microbiële fracties in watermonsters te concentreren van grote invoervolumes (d.w.z. 10-40 l) tot relatief kleinere volumes (d.w.z. 1-5 ml). Als onderdeel van deze methodologie wordt ultrapuur water ook opgenomen als een negatieve / achtergrondcontrole. Zodra de microbiële fracties zijn geconcentreerd, kan nucleïnezuurextractie worden uitgevoerd met behulp van commerciële extractiekits of interne protocollen. SMF vertegenwoordigt een veelzijdige, relatief goedkope en eenvoudige / hands-off methode om microbiële fracties of virale deeltjes te concentreren, zonder significante verschillen in vergelijking met ultrafiltratie of tangentiële stroomfiltratiebenaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NSERC Alliance Covid-19 Grant (Award No. 431401363, 2020-2021, Drs. Yuan en Uyaguari-Díaz). MUD wil graag het University Research Grants Program (Award No. 325201) bedanken. Zowel JF als JZA worden ondersteund door het Visual and Automated Disease Analytics (VADA) graduate trainingsprogramma. KY en JF ontvingen beide beurzen van het Mitacs Accelerate-programma. MUD en zijn laboratoriumleden (KY, JF, JZA) worden ondersteund door NSERC-DG (RGPIN-2022-04508) en de Research Manitoba New Investigator Operating grant (nr. 5385). Speciale dank aan de stad Winnipeg, Manitoba. Dit onderzoek werd uitgevoerd aan de Universiteit van Manitoba. We willen graag erkennen dat de campussen van de Universiteit van Manitoba zich bevinden op de oorspronkelijke landen van Anishinaabeg, Cree, Oji-Cree, Dakota en Dene-volkeren en op het thuisland van de Métis Nation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 M sodium phosphate buffer with a pH 7.5 Alfa Aesar J62041AP Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
0.2 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 66234 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
0.45 μm 47-mm Supor-200 membrane disc filters VWR 60043 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
4X TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444432 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Armored RNA Quant IPC-1 Processing Control Asuragen 49650 Asuragen, Austin, TX, USA
Brand A, Jumbosep Centrifugal Device, 30-kDa Pall  OD030C65 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Brand B, Microsep Advance Centrifugal Device, 30-kDa Pall MCP010C46 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Centrifuge tubes (50 ml)  Nalgene 3119-0050PK Thermo Fisher Scientific
DNAse I Invitrogen 18047019 Thermo Fisher Scientific
Dyna Mag-2 Invitrogen 12027 Thermo Fisher Scientific
GWV High Capacity Groundwater Sampling Capsules - 0.45 µm Pall 12179 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
Hydrochloric acid, 1N standard solution Thermo Fisher Scientific AC124210025 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit Applied biosystems A42358 Thermo Fisher Scientific
Nuclease free water Promega P1197 Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA
Peristaltic pump Masterflex, Cole-Parmer instrument 7553-20 Thermo Fisher Scientific
pH meter  Denver instrument RK-59503-25 Cole-Parmer. This product has been discontinued
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 Invitrogen 15593031 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Primers and probe sets IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
Qiagen All-prep DNA/RNA power microbiome kit Qiagen Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A34322 Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q33231 Thermo Fisher Scientific
Qubit 4 Fluorometer, with WiFi Invitrogen Q33238 Thermo Fisher Scientific
Qubit RNA High Sensitivity (HS) assay kit Invitrogen Q32855 Thermo Fisher Scientific
RNAse A Invitrogen EN0531 Thermo Fisher Scientific
RNeasy PowerMicrobiome Kit Qiagen 26000-50 Qiagen Sciences, Inc., Germantown, MD, USA
Skim milk powder Difco (BD Life Sciences) DF0032173 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA
Sodium phosphate buffer Alfa Aesar Alfa Aesar, Ottawa, ON, Canada
Synthetic seawater VWR  RC8363-1 RICCA chemical company
Synthetic single-stranded DNA gBlock IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, USA
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.1 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4621 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
VacuCap 90 Vacuum Filtration Devices - 0.2 µm, 90 mm, gamma-irradiated Pall 4622 Pall Corporation, Ann Arbor, MI
β-mercaptoethanol Gibco 21985023 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumblathan, T., Liu, Y., Uppal, G. K., Hrudey, S. E., Lix, X. F. Wastewater-based epidemiology for community monitoring of SARS-CoV-2: progress and challenges. ACS Environmental Au. 1, 18-31 (2021).
  2. Lu, D., Huang, Z., Luo, J., Zhang, X., Sha, S. Primary concentration-The critical step in implementing the wastewater based epidemiology for the COVID-19 pandemic: A mini-review. The Science of The Total Environment. 747, 141245 (2020).
  3. Bi, Q. Insights into household transmission of SARS-CoV-2 from a population-based serological survey. Nature Communications. 12, 3643 (2021).
  4. Day, M. Covid-19: identifying and isolating asymptomatic people helped eliminate virus in Italian village. British Medical Journal. 368, 1165 (2020).
  5. Ing, A. J., Cocks, C., Green, J. P. COVID-19: in the footsteps of Ernest Shackleton. Thorax. 75 (8), 693-694 (2020).
  6. Bivins, A., et al. Wastewater-based epidemiology: global collaborative to maximize contributions in the fight against COVID-19. Environmental Science & Technology. 54 (13), 7754-7757 (2020).
  7. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  8. Thompson, J. R., et al. Making waves: Wastewater surveillance of SARS-CoV-2 for population-based health management. Water Research. 184, 116181 (2020).
  9. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 RNA concentrations in wastewater foreshadow dynamics and clinical presentation of new COVID-19 cases. The Science of the Total Environment. 805, 150121 (2022).
  10. Kantor, R. S., Nelson, K. L., Greenwald, H. D., Kennedy, L. C. Challenges in measuring the recovery of SARS-CoV-2 from wastewater. Environmental Science & Technology. 55 (6), 3514-3519 (2021).
  11. Chik, A. H. S., et al. Comparison of approaches to quantify SARS-CoV-2 in wastewater using RT-qPCR: Results and implications from a collaborative inter-laboratory study in Canada. Journal of Environmental Sciences. 107, 218-229 (2021).
  12. Hjelmsø, M. H., et al. Evaluation of methods for the concentration and extraction of viruses from sewage in the context of metagenomic sequencing. PLoS One. 12 (1), e0170199 (2017).
  13. Philo, S. E., et al. A comparison of SARS-CoV-2 wastewater concentration methods for environmental surveillance. The Science of the Total Environment. 760, 144215 (2021).
  14. Ahmed, W., Harwood, V. J., Gyawali, P., Sidhu, J. P. S., Toze, S. Comparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental waters. Applied and Environmental Microbiology. 81 (6), 2042-2049 (2015).
  15. Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47 (8), 2797-2810 (2013).
  16. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  17. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115 (1), 1-11 (2013).
  18. Calgua, B., et al. New methods for the concentration of viruses from urban sewage using quantitative PCR. Journal of Virological Methods. 187 (2), 215-221 (2013).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  20. Assis, A. S. F., et al. Optimization of the skimmed-milk flocculation method for recovery of adenovirus from sludge. The Science of the Total Environment. 583, 163-168 (2017).
  21. Goncharova, E. A., et al. One-step quantitative RT-PCR assay with armored RNA controls for detection of SARS-CoV-2. Journal of Medical Virology. 93 (3), 1694-1701 (2021).
  22. Yu, X. F., et al. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. Journal of Clinical Microbiology. 46 (3), 837-841 (2008).
  23. Alygizakis, N., et al. Analytical methodologies for the detection of SARS-CoV-2 in wastewater: Protocols and future perspectives. Trends in Analytical Chemistry. 134, 116125 (2021).
  24. Garcia, A., et al. Quantification of human enteric viruses as alternative indicators of fecal pollution to evaluate wastewater treatment processes. PeerJ. 10, e12957 (2022).
  25. Gonzalez, R., et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 186, 116296 (2020).
  26. Hietala, S. K., Crossley, B. M. Armored RNA as virus surrogate in a real-time reverse transcriptase PCR assay proficiency panel. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 67-70 (2006).
  27. Uyaguari-Diaz, M. I., et al. A comprehensive method for amplicon-based and metagenomic characterization of viruses, bacteria, and eukaryotes in freshwater samples. Microbiome. 4 (1), 20 (2016).
  28. Meena, G. S., Singh, A. K., Gupta, V. K., Borad, S., Parmar, P. T. Effect of change in pH of skim milk and ultrafiltered/diafiltered retentates on milk protein concentrate (MPC70) powder properties. Journal of Food Science and Technology. 55 (9), Geneious. https://www.geneious.com. 3526-3537 (2018).
  29. Geneious. , Available from: https://www.geneious.com (2021).
  30. Ye, Y., Ellenberg, R. M., Graham, K. E., Wigginton, K. R. Survivability, partitioning, and recovery of enveloped viruses in untreated municipal wastewater. Environmental Science & Technology. 50 (10), 5077-5085 (2016).
  31. Philo, S. E., et al. Development and validation of the skimmed milk pellet extraction protocol for SARS-CoV-2 wastewater surveillance. Food and Environmental Virology. 14 (4), 355-363 (2022).
  32. Monteiro, S., et al. Recovery of SARS-CoV-2 from large volumes of raw wastewater is enhanced with the inuvai R180 system. Journalof Environmental Management. 304, 114296 (2022).
  33. Yanaç, K., Adegoke, A., Wang, L., Uyaguari, M., Yuan, Q. Detection of SARS-CoV-2 RNA throughout wastewater treatment plants and a modeling approach to understand COVID-19 infection dynamics in Winnipeg, Canada. The Science of The Total Environment. 825, 153906 (2022).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 193
Concentratie van virusdeeltjes uit milieuwater- en afvalwatermonsters met behulp van magere melkflocculatie en ultrafiltratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanaç, K., Francis, J.,… More

Yanaç, K., Francis, J., Zambrano-Alvarado, J., Yuan, Q., Uyaguari-Díaz, M. Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration. J. Vis. Exp. (193), e65058, doi:10.3791/65058 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter