Summary
脂肪细胞中的甘油三酯脂肪分解是导致游离脂肪酸和甘油释放的重要代谢过程。在这里，我们提供了一个详细的方案来测量小鼠脂肪细胞和 离体 脂肪组织中的基础和刺激脂肪分解。
Abstract
脂肪细胞以甘油三酯的形式在脂滴中储存能量。这种能量可以通过脂解 动员 ，其中脂肪酸侧链从甘油骨架上依次裂解，导致游离脂肪酸和甘油的释放。由于甘油激酶在白色脂肪细胞中的低表达，甘油再摄取率可以忽略不计，而脂肪酸再摄取由白蛋白等培养基成分的脂肪酸结合能力决定。甘油和脂肪酸释放到培养基中都可以通过比色测定法进行定量，以确定脂解速率。通过在多个时间点测量这些因素，可以高置信度地确定脂肪分解的线性速率。在这里，我们提供了一个详细的方案，用于测量来自小鼠的体 外 分化脂肪细胞和 离体 脂肪组织中的脂肪分解。该协议也可以针对其他前脂肪细胞系或来自其他生物体的脂肪组织进行优化;讨论了考虑因素和优化参数。该协议旨在用于确定和比较小鼠模型和治疗之间的脂肪细胞脂肪分解率。
Introduction
多余的营养物质以甘油三酯的形式储存在脂滴的中性脂质核心中的白色脂肪组织中。甘油三酯储存通过脂解动员，脂肪分解是脂肪酸侧链被脂肪组织甘油三酯脂肪酶（ATGL），激素敏感脂肪酶（HSL）和甘油单酯脂肪酶（MGL）顺序切割的过程，导致游离脂肪酸（FFA）和甘油骨架的释放1，2。脂肪分解由脂肪组织中的儿茶酚胺信号激活。交感神经末梢局部释放儿茶酚胺，儿茶酚胺与脂肪细胞质膜上的β-肾上腺素能受体结合。配体结合后，这些G蛋白偶联受体（GPCR）通过Gαs激活腺苷酸环化酶。随后通过cAMP激活蛋白激酶A（PKA）导致ATGL和HSL的上调。PKA对perilipin-1的磷酸化导致ABHD5（也称为CGI-58）的解离，其结合并共激活ATGL3。PKA直接磷酸化HSL，促进其从细胞质质到脂滴的易位，其中与磷酸化的perilipin-1相互作用进一步促进其脂肪酶活性4，5，6，7。参与脂解的第三种脂肪酶MGL似乎不受儿茶酚胺信号传导的调节8。重要的是，脂肪细胞中的甘油三酯合成是由甘油脂质合成途径介导的，其不涉及甘油单酯作为中间体的形成;相反，甘油-3-磷酸酰基转移酶催化溶血磷脂酸的形成，溶血磷脂酸与另一种脂肪酰基辅酶A结合形成磷脂酸，然后在最终合成甘油三酯之前异构化为甘油二酯（图1）9，10，11。
图1：脂解和甘油脂质合成途径。 上图：脂解通路;红色显示的酶：脂肪组织甘油三酯脂肪酶（ATGL），激素敏感脂肪酶（HSL）和甘油单酯脂肪酶（MGL）。下图：甘油脂质合成途径;绿色显示的酶：甘油二酰基转移酶 （DGAT）、磷脂酸磷酸酶 （PAP）、溶血磷脂酸酰基转移酶 （LPAT，也称为 LPAAT） 和甘油-3-磷酸酰基转移酶 （GPAT）。脂质：甘油三酯 （TG）、甘油二酯 （DG）、甘油单酯 （MG）、游离脂肪酸 （FFA）、脂肪酰辅酶 A （FA-CoA）、溶血磷脂酸 （LPA） 和磷脂酸 （PA）。其他代谢物：无机磷酸盐（Pi）和甘油3-磷酸（G3P）。 请点击此处查看此图的大图。
细胞外腺苷是脂肪分解的另一种重要调节因子，通过Gs和Gi偶联GPCR影响腺苷酸环化酶活性。脂肪细胞中的主要腺苷受体ADORA1抑制腺苷酸环化酶，从而通过激活Gi12来抑制脂肪分解。ADORA2A以较低水平表达，主要在棕色脂肪细胞中表达，通过Gs信号传导激活脂肪分解13。ADORA1影响基础脂肪分解和对肾上腺素能激动剂的反应。腺苷对脂肪分解的作用可以通过添加腺苷脱氨酶来中和腺苷，以及ADORA1特异性激动剂苯基异丙基腺苷14，15来控制。Gq偶联GPCR的激素激活也可以通过磷脂酶C和蛋白激酶C16，17，18，19的活化来影响脂肪分解。炎症信号也会影响脂解率。LPS（和其他内毒素）的TLR4激活通过激活ERK来增加脂解率，ERK磷酸化perilipin-1和HSL20。TNF-α还通过ERK和NF-κB活化激活脂肪分解，以及磷酸二酯酶PDE-3B和CIDEC21，22，23的转录下调。IL-6 也与脂肪细胞脂肪分解增加有关，特别是在肠系膜脂肪组织中，其 FFA 释放影响肝脂肪变性和糖异生24，25，26。
脂肪分解在进食状态下被胰岛素抑制。AKT 磷酸化并激活 PDE-3B 以抑制 cAMP 信号传导并阻止 PKA 活化27。胰岛素也转录下调ATGL28。肥胖通过多种机制促进儿茶酚胺耐药性，包括下调脂肪细胞29，30，31，32，33中的β-肾上腺素能受体。脂肪细胞表达所有三种β-肾上腺素能受体（β-1、β-2 和 β-3）。虽然β-1和β-2肾上腺素能受体普遍表达，但β-3肾上腺素能受体主要在小鼠34，35的脂肪细胞中表达。Adrb3 表达由 C/EBPα 在脂肪生成36 期间诱导。β-3肾上腺素能受体在成熟脂肪细胞中高表达。由于β-arrestin37的反馈抑制，β-1和β-2肾上腺素能受体的激活是自限性的。β-3肾上腺素能受体的反馈抑制由其他信号通路介导，其降低Adrb3表达33，38，39。
许多化合物可用于激活脂肪细胞脂质分解。儿茶酚胺是脂解的主要生理激活剂。去甲肾上腺素（或去甲肾上腺素）和肾上腺素（或肾上腺素）激活所有三种β肾上腺素能受体40。去甲肾上腺素和肾上腺素也通过激活α-肾上腺素能受体信号传导 来 影响脂肪分解41。常用的β-肾上腺素能受体激动剂包括异丙肾上腺素能激动剂，它是一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，以及β-3肾上腺素能受体激动剂CL-316，243和米拉贝隆42。鉴于脂肪细胞主要表达β-3肾上腺素能受体，我们在这里使用CL-316，243作为一个例子。它对β-3肾上腺素能受体的特异性也使其成为脂肪细胞儿茶酚胺信号传导的相对特异性激活剂，也可以安全地用于 体内。请注意，细胞培养物中常用的10μM CL-316，243浓度比达到最大反应所需的~0.1μM剂量高几个数量级33。佛司可林绕过肾上腺素能受体， 直接激活腺苷酸环化酶和下游脂解信号.还有更多的激活剂，以及脂肪分解的抑制剂。在选择刺激脂解的化合物时，应在实验设计中仔细考虑受体特异性和下游信号通路。
白色脂肪组织中脂肪分解的速度是影响禁食或运动期间耐寒性和营养可用性的重要代谢因素43，44，45，46。该协议的目的是测量脂肪细胞和脂肪组织中脂肪分解的速率，这将有助于了解脂肪细胞代谢以及它如何影响各种小鼠模型的代谢表型。为了量化脂解率，我们测量了脂解产物在培养基中的外观（即FFA和甘油）。该方法依赖于脂解产物从脂肪细胞释放到培养基中。由于白色脂肪细胞表达低水平的甘油激酶，因此甘油再摄取率较低47。相反，还应考虑通过脂肪分解以外的代谢途径产生FFA和甘油。脂肪细胞似乎表达一种具有抗甘油-3磷酸活性的磷酸酶，使得能够从葡萄糖48，49，50衍生的甘油-3-磷酸产生甘油。糖酵解是用于白色脂肪细胞中FFA再酯化的甘油-3-磷酸的来源。当葡萄糖水平有限时，甘油新生需要其他3碳来源，如乳酸和丙酮酸51。细胞内脂肪分解释放的FFA的通道及其代谢命运知之甚少;脂肪分解释放的FFA必须在再酯化或经历β氧化之前转化为脂肪酰基辅酶A。看来脂肪分解释放的FFAs可能会在被带回并转化为脂肪酰辅酶A 52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62之前离开细胞.FFA可以通过白蛋白隔离在细胞外。重要的是，已知长链FFAs如果不被白蛋白63，64，65，66，67隔离，则反馈抑制脂肪分解。因此，在脂解测定过程中优化培养基的FFA缓冲能力至关重要。这里描述的程序类似于先前发表的测量小鼠和人类脂肪细胞和离体脂肪组织中脂解率的方法15，68，69，70，71。该协议通过使用串行采样而有所不同;通过执行连续采样，我们可以在内部验证线性阶段测量脂肪分解，并利用多次测量来计算脂肪分解速率，从而减少测量误差，以提高最终计算值的置信度。连续取样的缺点是检测需要更多的时间和试剂;然而，较长的时间范围减少了测量误差对速率估计标准误差的影响。此外，该协议测量FFA和甘油释放，并考虑FFA：甘油释放的比例，目标是实现3：1的比例，正如完全脂解和脂解产物释放到培养基中的预期一样72。
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Protocol
所有动物的使用都得到了康奈尔大学威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 缓冲液和收集板的制备
- 通过将 5 g BSA 溶解在 100 mL 不含酚红的 Dulbecco 改性鹰培养基 （DMEM） 中，制成 5% 牛血清白蛋白 （BSA）。轻轻搅拌BSA溶解（摇晃适得其反）。BSA完全溶解后，用0.2μm过滤器对培养基进行过滤灭菌。将BSA培养基在4°C下储存长达1个月。
- 使控制和刺激介质的工作浓度。控制介质：5% BSA 介质，带车辆控制。刺激培养基：含有0.5μM CL-316，243的5%BSA培养基。为每个实验制作新鲜的刺激培养基。
- 将要使用的培养基加热至37°C。 标记用于培养基收集的 96 孔板。
2. 样品制备
- 如下所述进行细胞培养。在无菌通风橱中进行所有细胞工作，以尽量减少外部污染。
- 分离和分化原代前脂肪细胞，如73，74。
- 高密度接种原代前脂肪细胞，例如 1 x 105 个细胞 /孔在 1 mL/孔培养基中的 24 孔板中（DMEM/F12 中的 15% 胎牛血清 （FBS） 和 1x 青霉素-链霉素-谷氨酰胺）。
- 细胞达到 100% 汇合后，在培养基中用 5 μM 地塞米松、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μg/mL 胰岛素和 1 μM 噻唑烷二酮 （TZD） 分化 3 天。然后，换成含有 1 μg/mL 胰岛素的培养基至少 3 天以生长脂滴。在 24 孔板中使用 1 mL/孔培养基。
- 每2或3天用胰岛素更换培养基（1ml /孔）。细胞可以在含有胰岛素的培养基中维持长达2周。在此测定中，仅使用分化率超过90%且各组相似的培养物，因为分化的减少可能会被误解为脂解率的降低。
- 在测量脂解之前，将细胞在无胰岛素培养基中培养24小时。
注意：培养基中的胰岛素维持脂滴，但也抑制脂解。在没有胰岛素的情况下孵育24小时允许完全脂解活化而不会损失脂滴体积。在某些系统中，可能需要缩短或延长不使用胰岛素的培养时间。
- 用DPBS洗涤细胞一次，以去除培养基中的残留血清。
注意：此协议不包括血清饥饿，这可以激活脂肪分解。血清饥饿可由研究人员自行决定。
- 分离和分化原代前脂肪细胞，如73，74。
- 如下所述进行 离体 培养。
- 准备一个6孔板，每个组织都有一个孔，用于从每只小鼠收集。将 4 mL 室温 DMEM 放入要使用的每个孔中。
注：收集介质中的 BSA 不是必需的。 - 准备一个用于脂肪分解测定的48孔板，每个重复一个孔。将 400 μL 室温 DMEM 放入要使用的每个孔中。每只小鼠每个组织使用两到四个对照和两到四个刺激孔。
- 在麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，使用双侧气胸等辅助方法。在这里，我们使用一只 32 克、7 个月大的雌性 C57BL/6J 小鼠，用 45% 的高脂肪饮食喂养 4 个月。
注意：此协议也可用于男性，以及其他菌株，饮食和年龄。 - 喷洒70%乙醇，用剪刀在腹部皮肤中心做一个小（~1厘米）侧切口，用拇指和食指捏住两侧将皮肤拉开，将下腹部皮肤折叠起来，露出后皮下库。定位并切除腹股沟淋巴结，并使用镊子钝化解剖紧邻腹股沟淋巴结的腹股沟脂肪组织。
- 为了收集性腺脂肪组织，在腹膜上做一个横向和垂直切口以进入腹膜腔。用镊子握住性腺脂肪垫，沿着子宫（或男性附睾）切开，以去除性腺脂肪组织。将收集的仓库放入6孔板中。
- 从孔中取出纸巾，放在硅胶垫上，用剪刀切成 5 至 7 毫克的大块。
- 为每个测定孔称出 25 至 30 mg（五块或六块），并放入 48 孔测定板中。称量前，用干净的毛巾吸干纸巾以除去任何介质。取出组织后称量重量舟，并记录留下的任何残留物的重量。在样品之间擦拭配重舟，必要时重新去皮。为每张纸巾使用新的配重船。
- 称量所有组织样品后，将48孔测定板置于37°C，10%CO2 培养箱中15分钟。
- 准备一个6孔板，每个组织都有一个孔，用于从每只小鼠收集。将 4 mL 室温 DMEM 放入要使用的每个孔中。
3. 脂肪分解试验
- 执行媒体收集。在无菌通风橱中进行培养基转移和随后的样品收集，以最大程度地减少来自外部来源的潜在污染。
- 在t = 0时，除去培养基，每孔加入400μL对照或刺激培养基，并将测定板放入37°C，10%CO2 培养箱中。对于 离体 组织培养，使用移液管小心地去除培养基;切勿使用抽吸。
注意：或者，用对照和刺激培养基准备第二块板，并转移组织。 - 在t = 1，2，3和4小时时，收集200μL培养基，用200μL适当的对照或刺激培养基替换，然后将测定板返回到培养箱中。将收集板储存在4°C。 要确定BSA培养基的FFA缓冲容量，请在24小时使用额外的集合。
注意：实验可以在这里停止，收集的培养基可以储存在-20°C。
- 在t = 0时，除去培养基，每孔加入400μL对照或刺激培养基，并将测定板放入37°C，10%CO2 培养箱中。对于 离体 组织培养，使用移液管小心地去除培养基;切勿使用抽吸。
4. FFA比色法
- 将试剂加热至室温，将一瓶颜色试剂A与一瓶溶剂A溶解，将一瓶颜色试剂B与一瓶溶剂B溶解。从复溶之日起，这些试剂最好在1周内使用。复溶后1个月丢弃。
- 解冻并混合样品。
- 创建 FFA 标准曲线。标准溶液为1 mM。将以下体积与标准曲线试剂一起使用：25 μL、20 μL、15 μL、10 μL、10 μL（1：2 稀释）、10 μL（1：4 稀释）、10 μL（1：8 稀释）和 10 μL 水以获得最大范围。对于低FFA水平，10 μL 的 1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM 和 0.05 mM 标准品可能更适用。
- 将标准品和样品移液到96孔测定板中。推荐的样品体积为 10 μL，包括三个具有与样品相同体积的 BSA 培养基的孔进行背景校正。
注意：如果样品浓度超出标准曲线的范围，请重复测定，将样品体积调整为 2-25 μL。 - 向每个孔中加入 150 μL 试剂 A 并混合。避免产生气泡。用细针戳破任何气泡。将测定板在37°C孵育5分钟。
- 读取板在550nm和660nm参考处的吸光度（读数A）。
- 向每个孔中加入 75 μL 试剂 B 并混合。避免产生气泡。用细针戳破任何气泡。将测定板在37°C孵育5分钟。
- 在550nm和660nm参考处再次读取板的吸光度（读数B）。
5. 甘油比色法
- 用 36 mL 超纯水复溶游离甘油试剂并适应室温。这些试剂最好在几周内使用。复溶后2个月丢弃。
- 解冻并混合样品。
- 通过对甘油标准溶液和水空白进行7点，2倍连续稀释来创建甘油标准曲线。
注意：标准曲线在高达 25 μL 的 2.8 mM 甘油时相对线性，但在较高浓度下不线性。 - 将标准品和样品各 25 μL 移液到 96 孔测定板中。包括三个带有BSA培养基的孔，用于背景校正。
- 向每个孔中加入 175 μL 游离甘油试剂并混合。避免产生气泡。用细针戳破任何气泡。将测定板在37°C孵育5分钟。
- 读取板在540nm处的吸光度。
6. 脂解率的计算
- 从光密度 （OD） 值开始。对于甘油，直接使用A 540 OD 值。根据以下公式计算FFA测定的OD：
OD = （读数 B： A 550 - A 660） - （读数 A： A550 - A660） - 使用标准曲线计算收集样品中的FFA和甘油水平。在y轴上绘制标准OD值，在x轴上，使用相对于样品体积的标准浓度（即，在含有10 μL样品的平板上含有20 μL1 mM FFA标准的孔的浓度等于2 mM）。拟合线性趋势线：
y = mx + b - 目视检查标准曲线并去除测定线性范围之外的任何点。使用以下公式计算样品浓度：
样品浓度：x = （OD - b） ÷ m - 调整并重新测定超出线性测定范围的样品。要获得最终样品浓度，请从样品浓度中减去仅含有BSA培养基的背景孔浓度。
- 根据公式计算每个样品在每个时间点产生的FFA和甘油的摩尔数：
其中 C n = 时间 t = n 时的浓度;Vt = 井中的总体积;Vs = 样品收集体积;M n = 在时间 t = n 时产生的摩尔数（当浓度以 mM 为单位且体积以 mL 为单位时，输出为 μMol）。
例如，在不同的时间点：
M 1 = C1 × Vt
M 4 = C4 × Vt + （C1 + C 2+ C3）Vs
或
M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s - 通过将每个样品的组织重量除以克为单位，获得μmol/g单位，归一化为组织重量。对于培养的细胞，值以μmol/孔表示。确保细胞数量和分化效率在孔与孔之间具有可比性。
注意：增殖或分化效率的差异将使结果的解释复杂化，需要另一种标准化方法（例如，标准化为蛋白质;参见讨论）。 - 单独计算每个样品产生的μmol/g（y轴）与时间（x轴）的斜率。
- 在电子表格中，这可以使用 =SLOPE（known_ys，known_xs） 函数来完成。在新单元格中，键入“=SLOPE”（然后使用光标突出显示样品甘油或 FFA 值（以μmol/g为单位），然后突出显示相应的时间值）。
- 验证数据的线性度。R2 值是确定样品线性的快速方法。在电子表格中，可以使用 =RSQ（known_ys，known_xs） 函数完成此操作，方法与步骤 6.7.1 中所述相同，但初始输入为 =RSQ。确保R 2 值> 0.98;较低的值表示与线性度的偏差。这可能是由测量/采样误差或线性度损失引起的。
- 测试线性的另一种方法是对每个样本执行线性回归并绘制残差图。在统计分析软件中，生成一个XY表，每个时间点都有一个Y值。选择分析>简单线性回归，然后在点击确定之前选中残差图框。残差图将显示为新图形。
- 使用每个样品的FFA和甘油产生速率（即斜率[（μmol/g/h]）作为单独的数据点进行统计分析，并在比较不同的脂解条件时绘制值。如果要比较不同基因型的脂解率，则每只动物使用两个或三个样本作为技术重复，并使用每只动物一个数据点的平均值，以便样本量等于动物的数量。
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Representative Results
我们测量了体外分化脂肪细胞的基础和刺激脂解率。通过用5μM地塞米松、0.5mM IBMX、1μg/mL胰岛素和1μM曲格列酮处理融合细胞4天，将来自腹股沟白色脂肪组织的原代前脂肪细胞分化为脂肪细胞，然后用1μg/mL胰岛素再处理3天。在脂肪分解测定之前，将细胞在没有胰岛素的培养基中孵育24小时。在时间= 0h时，用PBS洗涤细胞一次，然后将含有10μM CL-316，243或载体对照的2%BSA的无酚红DMEM加入到12孔板的每个孔中。在时间= 1小时，2小时，3小时和4小时时，收集50%的培养基并用2%BSA在无酚红DMEM中替换。测量收集的培养基中的FFA和甘油水平以及FFA的摩尔，并计算每个时间点分泌到培养基中的甘油（图2A，B）。FFA和甘油产量在4小时测定中呈线性，R2值为0.98及以上。4 h FFA水平略低，表明脂解率可能一直在放缓;然而，有和没有4小时时间点的分析对计算的脂解率没有显着影响。刺激的脂解率明显高于基础率（图2C）。脂解刺激导致在所有收集的样品中以接近3：1的摩尔比产生FFA和甘油，正如完全甘油三酯脂肪分解所预期的那样，没有显着的再摄取或保留（图2D）。然而，在未刺激的细胞中，该比率接近1，表明甘油48，49，50的非脂解来源。
图2： 体外 分化的原代脂肪细胞中的脂解率。 前脂肪细胞在12孔板中分化。在脂解测定前24小时从培养基中取出胰岛素。在时间= 0小时时，用10μM CL-316，243（CL）刺激细胞或用载体（V）对照培养基处理细胞。绘制每个时间点每孔中产生的（A）FFA和（B）甘油的nmol随时间的变化，并为每个孔拟合线性回归线。（c） FFA的生产率。（D）甘油产率。数据表示为平均±SEM。 （E）每个时间点收集的培养基中FFA：甘油的摩尔比。（C）和（D）中的统计分析是使用学生的t检验进行的;CL的效果在α = 0.05时显著。 请点击此处查看此图的大图。
在细胞培养中，单层细胞与培养基直接接触，而在离体培养的组织中，中心的细胞不与培养基接触。因此，在离体培养中，FFA更有可能保留在组织中。具有较低表面积与体积比的较大组织块表现出较高的FFA保留率，导致较低的FFA：甘油摩尔比（图3A）。随着组织块尺寸的减小，FFA：甘油释放的摩尔比接近3：1（图3A）。然而，组织块也可能太小。除了处理微小脂肪组织的挑战外，1-2 mg脂肪组织块表现出降低的脂解率，表明组织的活力和功能降低（图3B，C）。虽然将脂肪组织切割成大小和形状一致的块既繁琐又耗时，但需要获得可比且可靠的结果。我们建议使用5至10毫克的脂肪组织块，但一致性是最重要的。脂解率仍然可以在较大的组织块中重复测量，但是，重要的是要考虑FFAs对脂肪分解的反馈抑制63，64，65，66，67。
图3：组织块大小对FFA释放和脂解率的影响。 收集来自喂食雌性C57Bl / 6J小鼠的高脂肪饮食的性腺白色脂肪组织并切成不同大小的块。所有孔总共含有25-30毫克脂肪组织;对于 25 毫克孔，这是一块组织;10 mg孔有三块组织，每个~10 mg，5 mg孔包含5或6块组织，2 mg孔包含13-16块组织。在时间= 0小时时，用0.5μM CL-316，243（CL）刺激脂肪分解，或用载体（V）处理对照孔。绘制（A）FFA和（B）甘油的1小时，2小时和3小时后收集的样品中计算的脂解率。（C）每口孔FFA：甘油产量的摩尔比。数据表示为SEM±平均值。 （A）和（B）中的统计分析使用双向方差分析进行，并进行Holm-Sidak事后分析，α = 0.05。CL在所有样品中均有显著影响。在CL处理的样品中，FFA和甘油的产生率在所有成对比较中均有显着差异，除了10mg和5mg样品。 请点击此处查看此图的大图。
FFA保留的负面影响可以在25mg组织块中观察到，其在刺激时FFA和甘油的产生率较低（图3B，C）。当培养基的FFA结合能力太低（即培养基中没有足够的BSA）时，这种反馈抑制也很明显。当培养基中的BSA降低到0.5%时，FFA释放减少了四倍以上，甘油释放减少了近两倍（图4A，B）。作为一个简单的经验法则，培养基中FFA的微摩尔水平不应接近培养基中BSA的百分比（即，FFA水平在5%BSA培养基中应保持在5 mM FFA以下，在0.5%BSA培养基中应保持在0.5 mM以下[在此水平上，FFA：BSA的摩尔比为20：3]）。为了测试BSA培养基制备的最大BSA缓冲能力，请从24小时刺激样品中收集培养基，并测量FFA的浓度（浓度会很高，因此建议使用较低的样品体积或样品稀释度）。刺激24小时后5%BSA培养基中的FFA积累约为5mM，而0.5%BSA培养基的FFA含量仅为0.6mM（图4C）。观察收集的培养基中的FFA浓度，可以看出0.5%的BSA培养基FFA结合能力过高（图4D）。虽然 5% BSA 培养基中的 FFA 水平要高得多，但它们不超过培养基的缓冲能力（图 4D）。理想情况下，培养基中的FFA浓度应保持在3：1 FFA：BSA摩尔比以下（即，5%[0.75 mM] BSA中的2.3 mM FFA）。
图 4：BSA 水平不足导致表观脂解率降低。收集来自喂食雌性C57Bl / 6J小鼠的高脂肪饮食的性腺白色脂肪组织并切成~5mg块。在每个孔中总共放置20-30mg脂肪组织。在时间= 0小时时，用0.5μM CL-316，243（CL）刺激脂肪分解，或者用载体（V）在5%BSA培养基或仅含有0.5%BSA的培养基中处理对照孔。绘制4小时后收集的样品中计算的脂解率（A）FFA和（B）甘油。CL在所有样品中均有显著影响。在CL处理的样品中，FFA和甘油的产生速率在5%和0.5%BSA培养基条件下显着不同。（C）24小时后受刺激孔培养基中的FFA水平。 （D）4小时收集的样品中的FFA水平。 （E）在DMEM中具有和没有各种5%BSA制剂的FFA标准曲线。光密度计算公式为（读数B：A 550 - A 660）-（读数A：A550 -A 660）。（F）带和不带BSA的甘油标准曲线。光密度为540nm处的吸收剂（A540）。5.6 mM处的OD值不是线性的，因此不包括在标准曲线中。（G）在测定培养基中使用不同类型的BSA从女性性腺脂肪组织中释放FFA的速率。数据表示为SEM±平均值。 （A）和（B）中的统计分析使用双向方差分析进行，并进行Holm-Sidak事后分析，* p值<0.05。请点击此处查看此图的大图。
重要的是要指出，BSA的一些制剂含有FFA。每批BSA都应进行测试，以确保FFA含量可以忽略不计（请注意，某些BSA制剂以不含FFA的形式销售）。虽然没有专门作为无FFA销售，但此处使用的BSA不包含可检测的FFA。我们测试了含有不含FFA的BSA（Equitech Bio Inc，BAH66），此处实验中使用的BSA（Sigma，A9418）和较粗（较便宜）的BSA部分V BSA（Sigma，810531）的测定培养基。无FFA的BSA和A9418 BSA都没有产生任何背景信号，也没有改变标准曲线斜率或截距;标准曲线是可叠加的（图4E）。也没有观察到BSA DMEM对甘油标准曲线的影响（图4F）。另一方面，馏分V BSA确实在FFA测定中产生了背景信号，相当于FFA浓度为0.3mM（图4E）。该背景将标准曲线向上移动，但对斜率没有显着影响，表明背景减法就足够了。我们还使用这三种不同类型的BSA进行了刺激脂肪分解实验，发现在背景减去后，计算出的脂肪分解率在BSA配方之间没有差异（图4F）。然而，情况往往并非如此，特别是对于纯度较低的BSA制剂，它们很容易含有胰岛素或其他影响脂解速率的成分。每批BSA都应进行测试和验证，并一致使用（即，用不同批次的BSA测定的样品没有可比性）。在验证每批BSA时，应执行添加BSA和DMEM的完整标准曲线，以确保其不包含任何干扰比色测定中酶的东西。
采集系列样品并用新鲜培养基替换体积有助于降低整个实验过程中培养基中的FFA负荷。我们测量了一只喂食高脂肪饮食4个月的雌性小鼠的性腺脂肪组织中的脂解率。在该实验中，将5-8mg组织块（总重量为25-30mg）在200μL的5%BSA培养基中孵育，收集100μL并在1小时，2小时，3小时和4小时更换。在3小时，培养基中的FFA水平达到2.3mM的危险区域（图5A）。4小时培养基FFA和甘油水平缺乏增加，提示了脂肪分解的反馈抑制（图5A，B）。在计算每个时间点释放的FFA和甘油的μmol并拟合线性曲线后，很明显，受刺激样品中的脂解速率在4小时开始下降，FFA的R 2值低至0.976，甘油的R2 值低至0.983（图5C，D）。查看残差图，很明显 4 小时值低于线性趋势（即残差为负）（图 5E，F）。排除4小时时间点使FFA和甘油的R2 值分别增加到0.997和0.998及以上。包含4小时时间点会导致计算的FFA和甘油释放速率小而显着下降（图5G，H）。
图5： 离体 脂肪组织中线性脂解率的计算。 收集来自喂食雌性C57Bl / 6J小鼠的高脂肪饮食的性腺白色脂肪组织并切成~5mg块。在每个孔中总共放置20-30mg脂肪组织。在时间= 0小时时，用0.5μM CL-316，243（CL）刺激脂肪分解，或用载体（V）处理对照孔。培养基收集在1小时，2小时，3小时和4小时进行，培养基中的（A）FFA和（B）甘油水平。（C）FFA和（D）甘油产量随时间推移绘制。（E）FFA和（F）甘油生产随时间推移的残留板。（G）FFA和（H）甘油的释放速率，计算有和没有4小时时间点。（I）FFA在女性性腺脂肪组织中的释放。近50%的培养基在1小时，2小时和3小时发生变化。在几小时之间，15分钟的时间点收集了2.75%的介质，无需更换。数据表示为平均± SEM。 （G）和（H）中的统计分析使用双向方差分析进行，并进行Holm-Sidak事后分析，* p 值<0.05。CL在所有样品中的影响均显著（p 值<0.05）。在CL处理的样品中，FFA和甘油的产生速率在有和没有4小时时间点的计算之间显着不同。 请点击此处查看此图的大图。
与以前的协议不同，该协议利用多个时间点来确定脂解速率，从而减少测量误差并提供内部验证，以测量脂肪分解的线性速率。为了在每个收集点保持线性相的脂解，收集并更换50%的培养基。由于线性至关重要，我们希望确保每次添加新鲜培养基时都不会引起脂肪分解。为了验证时间点之间的线性，我们在1小时到3小时的小时时间点之间每15分钟取一个非常小的样本（2.75%），没有替换。在1 h，2 h和3 h，进行正常的50%样品收集并更换。FFA释放速率在通常的时间点之间是线性的，表明每次添加新鲜培养基时都没有脂肪分解的爆发（图5I）。
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Discussion
在这里，我们提供了一种用于测量脂肪细胞和离体脂肪组织中脂肪分解速率的基本方案。为了量化脂解，重要的是测量线性相中的脂解速率。我们使用连续采样技术，其中收集大部分培养基并定期更换为新鲜培养基。这种半保守的方法允许添加具有FFA缓冲能力的新鲜BSA，并延迟反馈抑制，延长线性脂解的持续时间。该实验设计试图概括体内脂肪组织的血管化，其提供新鲜白蛋白以结合释放的FFA75。该方案经过优化以测量小鼠离体白色脂肪组织和腹股沟脂肪组织体外分化的原代前脂肪细胞中的脂肪分解。该方案可能会经过优化，以在棕色和米色脂肪库以及来自其他生物体的脂肪组织和具有高脂肪生成潜力的永生化细胞系中很好地工作。该方案允许在收集脂肪组织进行离体测定之前灵活地选择小鼠的年龄，性别和饮食。一些操作，如禁食，可能会影响基础脂解率，而其他干预措施，如饮食诱导的肥胖，也会影响刺激脂肪分解的速率。
必须针对每个实验系统优化协议，具体取决于脂解率是更高还是更低。为了验证线性，我们建议计算 R2 值并查看残差图。R2 值应非常接近 1。在评估残差图时，应注意稍后时间点的负残差值，因为这些值表明脂解率正在下降，线性正在丧失。这种残差图的示例如图 5E，F所示。在这种情况下，消除4小时时间点可以更准确地计算线性脂解率并改善R2 值。然而，由于速率是从多个时间点计算的，因此相对稳健，并且包含这样的时间点对R2 值和计算的脂解速率的影响很小。如果使用单个时间点来计算脂解率，则数据可能更容易偏斜。
数据归一化的方式也会影响样本之间的相对结果。在这里，我们建议将离体组织标准化为组织重量和每孔体外分化的初级前脂肪细胞。然而，这些归一化技术可能并不适合所有实验系统。重要的是，如果组之间的增殖速率或分化效率不同，则不宜按孔进行归一化。替代归一化技术包括蛋白质、脂质和 DNA。每种规范化方法都有其优点和缺点。组织重量和井位标准化简单明了。脂肪细胞大小的差异可能意味着瘦脂肪组织每克含有比肥胖脂肪组织更多的脂肪细胞，而分化效率的差异可能导致每孔脂肪细胞数量的差异。脂质可以用有机溶剂（例如，2：1氯仿：甲醇[v/v]）和用比色试剂测量的甘油三酯含量进行提取。虽然脂质含量的归一化不是传统上使用的方法，但脂质液滴毕竟是经历脂肪分解的细胞器，并且这种归一化方法是脂肪细胞特有的，当细胞之间的分化速率不同时，这可能是有用的。脂质提取后，0.1-0.3N NaOH可用于提取蛋白质，然后可以通过Bradford或BCA蛋白质测定68进行测定。或者，可以将样品在裂解缓冲液中匀浆，并通过离心除去脂质级分70。请注意，脂质污染会干扰蛋白质测定。如果要将蛋白质用于标准化，则必须广泛洗涤细胞（至少三次）以从测定培养基中去除BSA。有时，分化的脂肪细胞不能很好地粘附在板上，并且不能耐受去除过量BSA所需的三次洗涤。归一化为DNA允许归一化为细胞数，并且可以使用商业DNA提取试剂盒进行，然后通过吸光度或基因拷贝数的实时PCR分析对总DNA进行定量。或者，在电镀细胞中，DAPI染色后成像可用于计数细胞核并归一化为细胞数。使用细胞数或蛋白质进行归一化时，重要的是要考虑样品中的非脂肪细胞。脂肪组织还含有免疫细胞和内皮细胞;在肥胖脂肪组织中，炎症和肥大可导致每 10 个细胞核中只有 1/1 来自成熟脂肪细胞。然而，脂肪细胞仍然贡献组织的大部分质量和脂质含量。对于体外分化的前脂肪细胞，分化效率影响成熟脂肪细胞的相对百分比;在这种情况下，规范化很复杂。理想情况下，在使用细胞进行脂肪分解测定之前，应优化分化效率。如果不可能，如果分化脂肪细胞之间的脂滴体积相似，建议将脂质含量标准化。当驱动因素实际上是脂肪生成时，比较不同分化的脂肪细胞培养物的脂解率可能导致关于脂肪分解的错误结论;这是协议的限制。
长链FFA反馈抑制脂肪分解63，64，65，66，67。当FFA没有在媒体中充分隔离时，它们就会积累。与优化脂肪分解测量相关的大部分故障排除都与最小化FFA保留有关。计算FFA：甘油释放到培养基中的摩尔比有助于识别与FFA保留相关的问题。如果FFA：甘油的摩尔比为3：1，那么所有脂肪分解产物都在培养基中释放和捕获，而低于2：1的比例是值得关注的。离体测定的一个重要考虑因素是脂肪组织块的大小。较大的组织块具有较低的表面积与体积比，因此更有可能保留FFA并因此表现出降低的脂解率（图4A，B）。考虑到这一点，将每个样品的脂肪组织切成大小和形状一致的块至关重要。为了促进培养基中的FFA封存，确保培养基包含足够的BSA来结合释放的FFA也很重要。通过增加BSA的浓度或增加培养基的体积，可以增加培养基的FFA缓冲能力。增加收集量或频率同样有效。如果观察到高脂解率，但FFA：甘油比例低于2：1，我们建议将收集频率增加到每30分钟一次，并在2.5小时停止测定。
此处提供的方案针对小鼠离体白色脂肪组织和体外分化的原代前脂肪细胞进行了优化，两者都是高度脂解的。该测定需要优化以测量其他系统中的脂肪分解，或者如果相对较低的基础脂肪分解率的差异特别感兴趣。例如，3T3-L1脂肪细胞具有较低的脂解活性32。当脂解率低时，应减少孵育体积（即，不应在 24 孔板中每孔 400 μL，而是在 24 孔板中使用 200 μL，或在 12 孔板中使用 300 μL，每个时间点收集 100-150 μL。收集体积不应低于 100 μL，因为需要更大的样品体积才能准确测量低 FFA 和甘油水平。要为每个样品使用 50 μL 培养基测定甘油，应将游离甘油试剂溶解在 31 mL 水中，并将 150 μL 试剂与每个孔中的 50 μL 样品一起使用。只要保持线性，每孔 25 μL 样品即可测量 FFA 水平，也许更多。时间点也可以延长以增加信号。当测定来自白色脂肪细胞以外的细胞的脂解率时，应考虑细胞代谢的差异。例如，棕色和米色脂肪细胞表达更高水平的甘油激酶，因此能够通过脂肪分解76，77保留甘油释放。这些代谢活跃的细胞也可能能够将释放的脂肪酸引导到分解代谢或合成途径中，而不会释放到培养基中。在解释脂肪分解测定的结果时，必须考虑FFA和甘油在被测定的特定细胞类型中的代谢命运，特别是在白色脂肪细胞以外的细胞类型中。其他细胞类型的脂肪分解测定需要优化和验证。
该协议旨在评估小鼠模型中脂解率的差异。 体外 分化的原代前脂肪细胞是研究脂肪细胞遗传操作或药物治疗的细胞自主效应的有用工具。另一方面，脂肪组织包含其他细胞类型，包括免疫细胞。在评估全组织脂肪分解时，脂肪组织免疫细胞在调节脂肪分解方面的影响很重要。培养的脂肪细胞溶脂模型可以规避免疫细胞的潜在复杂影响，并能够彻底研究特定细胞类型，而脂肪组织外植体可以与 体内 环境进行更可靠的比较。此外， 离体 测定可用于研究各种脂肪库的脂解率。在这些系统中，脂肪分解受到诸如β-肾上腺素能受体激动剂等化合物的刺激，因此，不会观察到可能影响 体内 小鼠模型的任何交感神经张力变化。脂肪分解的 体内 测量因FFA和甘油在全身各种组织中的释放和摄取的动力学而变得复杂。任何给定时间点的血清FFA和甘油水平是分泌和摄取的平衡，不应假定血清FFA和甘油水平的变化仅归因于脂肪组织脂肪溶解。禁食诱导的脂肪分解受交感神经张力的影响，但不会产生血清FFA或甘油水平的快速而剧烈的变化，因此难以解释空腹血清FFA和甘油水平的变化。可以使用β-3肾上腺素能受体激动剂（例如CL-316，243）刺激 体内 脂肪分解，并且在刺激后20分钟内可检测到血清FFA和甘油升高。 体内 脂解测定应包括血清FFA和甘油的基线测量，以及载体对照;通过这种方式，可以确定血清FFA和甘油水平的刺激特异性变化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院向S.M.R.拨款R01DK126944的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well tissue culture treated plate | Corning Inc | 3527 | Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation |
| 48-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353078 | Can be tissue culture treated |
| 6-Well flat bottom plate with lid | Corning Inc | 353046 | Can be tissue culture treated |
| 96-Well PCR Plate | USA sceintific | 1402-9100 | Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers |
| CO2 incubator | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermofischer | 11054020 | Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate |
| FFA-free Bovine serum albumin | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma Aldrich | G7793 | This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration |
| HR Series NEFA Standard Solution | Fujifilm | 276-76491 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A | Fujifilm | 999-34691 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B | Fujifilm | 991-34891 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Solvent A | Fujifilm | 995-34791 | |
| HR Series NEFA-HR (2) Solvent B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Microbiological Incubator | Fischer Scientific | S28668 | Any incubator at 37C can be used |
| Nunc MicroWell 96-Well Plates | Thermo Scientific | 269620 | Any optically clear, flat bottom 96-well plate works |
| Silicone Laboratory Benchtop Mat | VWR | 76045-300 | Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended |
| Spectrophotometer/Microplate Reader | Molecular devices | SpectraMax i3x | Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work |
| V Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Wipers | Kimberly-Clark | 41200 | Any high quality paper towel will work |
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