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Biology

Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino ex vivo y preadipocitos primarios diferenciados in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

La lipólisis de triglicéridos en los adipocitos es un proceso metabólico importante que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para medir la lipólisis basal y estimulada en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones.

Abstract

Los adipocitos almacenan energía en forma de triglicéridos en gotas de lípidos. Esta energía se puede movilizar a través de la lipólisis, donde las cadenas laterales de ácidos grasos se escinden secuencialmente de la columna vertebral de glicerol, lo que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Debido a la baja expresión de glicerol quinasa en los adipocitos blancos, las tasas de recaptación de glicerol son insignificantes, mientras que la recaptación de ácidos grasos está dictada por la capacidad de unión de ácidos grasos de componentes de medios como la albúmina. Tanto el glicerol como la liberación de ácidos grasos en los medios se pueden cuantificar mediante ensayos colorimétricos para determinar la tasa lipolítica. Al medir estos factores en múltiples puntos de tiempo, se puede determinar la tasa lineal de lipólisis con alta confianza. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la medición de la lipólisis en adipocitos diferenciados in vitro y tejido adiposo ex vivo de ratones. Este protocolo también puede optimizarse para otras líneas celulares de preadipocitos o tejido adiposo de otros organismos; Se discuten las consideraciones y los parámetros de optimización. Este protocolo está diseñado para ser útil en la determinación y comparación de la tasa de lipólisis de adipocitos entre modelos de ratón y tratamientos.

Introduction

El exceso de nutrientes se almacena en el tejido adiposo blanco en forma de triglicéridos en el núcleo lipídico neutro de las gotas de lípidos. Las reservas de triglicéridos se movilizan a través de la lipólisis, un proceso por el cual las cadenas laterales de ácidos grasos son escindidas secuencialmente por la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo (ATGL), la lipasa sensible a las hormonas (HSL) y la lipasa monoglicérida (MGL), lo que resulta en la liberación de ácidos grasos libres (AGL) y la columna vertebral de glicerol 1,2. La lipólisis se activa por la señalización de catecolaminas en el tejido adiposo. Las terminales nerviosas simpáticas liberan localmente catecolaminas, que se unen a los receptores β-adrenérgicos en la membrana plasmática de los adipocitos. Tras la unión del ligando, estos receptores acoplados a proteínas G (GPCR) activan la adenilil ciclasa a través de Gαs. La activación posterior de la proteína quinasa A (PKA) por cAMP da como resultado la regulación positiva tanto de ATGL como de HSL. La fosforilación de la perilipina-1 por PKA provoca la disociación de ABHD5 (también conocido como CGI-58), que se une y coactiva ATGL3. PKA fosforila directamente HSL, promoviendo su translocación del citosol a la gota lipídica, donde la interacción con la perilipina-1 fosforilada promueve aún más su actividad lipasa 4,5,6,7. La tercera lipasa involucrada en la lipólisis, MGL, no parece estar regulada por la señalización de catecolaminas8. Es importante destacar que la síntesis de triglicéridos en los adipocitos está mediada por la vía de síntesis de lípidos de glicerol, que no implica la formación de monoglicéridos como intermediario; en cambio, las glicerol-3-fosfato aciltransferasas catalizan la formación de ácido lisofosfatídico, que se combina con otro acil-CoA graso para formar ácido fosfatídico, y luego se isomeriza a diglicéridos antes de la síntesis final de triglicéridos (Figura 1)9,10,11.

Figure 1
Figura 1: Vías de síntesis de lípidos de lipólisis y lipíleo de lipcerol. Arriba: vía lipolítica; enzimas mostradas en rojo: triglicéridos del tejido adiposo lipasa (ATGL), lipasa sensible a hormonas (HSL) y monoglicéridos lipasa (MGL). Abajo: vía de síntesis de lípidos de glicerol; enzimas mostradas en verde: diglicérido aciltransferasa (DGAT), fosfatasa de ácido fosfatídico (PAP), ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAT, también conocida como LPAAT) y glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT). Lípidos: triglicéridos (TG), diglicéridos (DG), monoglicéridos (MG), ácidos grasos libres (FFA), acil-CoA grasos (FA-CoA), ácido lisofosfatídico (LPA) y ácido fosfatídico (PA). Otros metabolitos: fosfato inorgánico (Pi) y glicerol 3-fosfato (G3P). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La adenosina extracelular es otro regulador importante de la lipólisis, que trabaja a través de GPCR acoplados a Gs y Gi para afectar la actividad de la adenilciclasa. El receptor de adenosina predominante en los adipocitos, ADORA1, inhibe la adenilil ciclasa y, por lo tanto, la lipólisis a través de la activación de Gi12. Expresado en niveles más bajos, y principalmente en adipocitos marrones, ADORA2A activa la lipólisis a través de la señalización Gs 13. ADORA1 afecta tanto a la lipólisis basal como a la respuesta a los agonistas adrenérgicos. El efecto de la adenosina sobre la lipólisis se puede controlar mediante la adición de adenosina desaminasa para neutralizar la adenosina, así como el agonista específico de ADORA1 fenilisopropiladenosina14,15. La activación hormonal de los GPCR acoplados a Gq también puede afectar la lipólisis a través de la activación de la fosfolipasa C y la proteína quinasa C16,17,18,19. Las señales inflamatorias también afectan las tasas lipolíticas. La activación de TLR4 por LPS (y otras endotoxinas) aumenta la tasa lipolítica al activar ERK, que fosforila perilipin-1 y HSL20. El TNF-α también activa la lipólisis a través de la activación de ERK y NF-κB, así como la regulación transcripcional a la baja de la fosfodiesterasa PDE-3B y CIDEC21,22,23. La IL-6 también se ha asociado con un aumento de la lipólisis de los adipocitos, especialmente en el tejido adiposo mesentérico, cuya liberación de AGF afecta la esteatosis hepática y la gluconeogénesis24,25,26.

La lipólisis es suprimida durante el estado alimentado por la insulina. AKT fosforila y activa PDE-3B para suprimir la señalización de cAMP y prevenir la activación de PKA27. La insulina también regula transcripcionalmente a la baja ATGL28. La obesidad promueve la resistencia a las catecolaminas a través de una variedad de mecanismos, incluyendo la regulación a la baja de los receptores β-adrenérgicos en los adipocitos 29,30,31,32,33. Los adipocitos expresan los tres receptores β-adrenérgicos (β-1, β-2 y β-3). Mientras que los receptores adrenérgicos β-1 y β-2 se expresan ubicuamente, el receptor adrenérgico β-3 se expresa predominantemente en los adipocitos en ratones34,35. La expresión de Adrb3 es inducida por C/EBPα durante la adipogénesis36. El receptor adrenérgico β-3 está altamente expresado en adipocitos maduros. La activación de los receptores adrenérgicos β-1 y β-2 es autolimitada debido a la inhibición de la retroalimentación por β-arrestina37. La inhibición por retroalimentación del receptor adrenérgico β-3 está mediada por otras vías de señalización, que reducen la expresión de Adrb3 33,38,39.

Se pueden utilizar numerosos compuestos para activar la lipólisis de los adipocitos. Las catecolaminas son los principales activadores fisiológicos de la lipólisis. La norepinefrina (o noradrenalina) y la epinefrina (o adrenalina) activan los tres receptores β-adrenérgicos40. La norepinefrina y la epinefrina también afectan la lipólisis a través de la activación de la señalización del receptor α-adrenérgico41. Los agonistas de los receptores β-adrenérgicos comúnmente utilizados incluyen isoproterenol, que es un agonista no selectivo del receptor β-adrenérgico, y los agonistas del receptor adrenérgico β-3 CL-316,243 y mirabegron42. Dado que los adipocitos expresan predominantemente el receptor adrenérgico β-3, utilizamos CL-316,243 como ejemplo aquí. Su especificidad para el receptor adrenérgico β-3 también lo convierte en un activador relativamente específico de la señalización de catecolaminas de adipocitos, que también se puede usar de manera segura in vivo. Tenga en cuenta que la concentración comúnmente utilizada de 10 μM CL-316,243 en cultivo celular es órdenes de magnitud mayor que la dosis de ~ 0.1 μM requerida para lograr una respuesta máxima33. La forskoline evita el receptor adrenérgico, activando directamente la adenilil ciclasa y la señalización lipolítica aguas abajo. Hay muchos más activadores, así como supresores de la lipólisis. Al seleccionar un compuesto para estimular la lipólisis, la especificidad del receptor y las vías de señalización aguas abajo deben considerarse cuidadosamente dentro del diseño experimental.

La tasa de lipólisis en el tejido adiposo blanco es un factor metabólico importante que afecta la tolerancia al frío y la disponibilidad de nutrientes durante el ayuno o el ejercicio43,44,45,46. El propósito de este protocolo es medir la tasa de lipólisis en adipocitos y tejido adiposo, lo que facilitará la comprensión del metabolismo de los adipocitos y cómo puede afectar el fenotipo metabólico de varios modelos murinos. Para cuantificar la tasa lipolítica, medimos la aparición de productos lipolíticos en los medios (es decir, AGL y glicerol). El método se basa en la liberación de productos lipolíticos del adipocito en los medios. Dado que los adipocitos blancos expresan niveles bajos de glicerol quinasa, las tasas de recaptación de glicerol son bajas47. Por el contrario, también se debe considerar la producción de AGL y glicerol por vías metabólicas distintas de la lipólisis. Los adipocitos parecen expresar una fosfatasa con actividad contra el fosfato de glicerol-3, lo que permite la producción de glicerol a partir de glicerol-3-fosfato derivado de la glucosa48,49,50. La glucólisis es una fuente de glicerol-3-fosfato utilizada para la reesterificación de FFA en adipocitos blancos. Cuando los niveles de glucosa son limitados, la gliceroneogénesis requiere otras fuentes de 3 carbonos, como lactato y piruvato51. La canalización de AGL liberados por lipólisis dentro de la célula y su destino metabólico es poco conocida; Los AGL liberados por lipólisis deben convertirse en acil-CoA graso, antes de ser reesterificados o sometidos a β-oxidación. Parece que los AGL liberados por lipólisis probablemente salen de la célula antes de ser tomados de nuevo y convertidos en acil-CoA graso 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . Los AGF pueden ser secuestrados fuera de la célula por la albúmina. Es importante destacar que se sabe que los AGF de cadena larga inhiben la lipólisis si no son secuestrados por la albúmina 63,64,65,66,67. Por lo tanto, es fundamental optimizar la capacidad de amortiguación de FFA de los medios durante el ensayo de lipólisis. El procedimiento descrito aquí es similar a los métodos publicados anteriormente para medir la tasa lipolítica en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones y humanos 15,68,69,70,71. Este protocolo difiere por el uso de muestreo en serie; Al realizar un muestreo en serie, podemos validar internamente que la lipólisis se mide en la fase lineal y utilizar múltiples mediciones para calcular la tasa de lipólisis, reduciendo así el error de medición para aumentar la confianza en el valor final calculado. El inconveniente del muestreo en serie es que el ensayo requiere más tiempo y reactivos; Sin embargo, el plazo más largo reduce el impacto del error de medición en el error estándar de las estimaciones de la tasa. Además, este protocolo mide tanto la liberación de FFA como la de glicerol, y considera la relación de liberación de FFA:glicerol con el objetivo de lograr una relación de 3:1, como se esperaría de la lipólisis completa y la liberación de productos lipolíticos en los medios72.

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Protocol

El uso de todos los animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Weill Cornell Medical College de la Universidad de Cornell.

1. Preparación de tampones y placas de recogida

  1. Producir albúmina sérica bovina (BSA) al 5% disolviendo 5 g de BSA en 100 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin rojo fenol. Revuelva suavemente el BSA para que se disuelva (agitar es contraproducente). Una vez que el BSA esté completamente disuelto, esterilice el medio con filtro con un filtro de 0,2 μm. Conserve el soporte BSA a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
  2. Realizar concentraciones de trabajo de medios de control y estimulación. Medios de control: 5% de medios BSA con control del vehículo. Medios de estimulación: 5% de medios BSA con 0,5 μM CL-316,243. Haga nuevos medios de estimulación para cada experimento.
  3. Calentar el soporte a utilizar a 37 °C. Etiquete una placa de 96 pocillos para la recolección de medios.

2. Preparación de la muestra

  1. Realice el cultivo celular como se describe a continuación. Realice todo el trabajo de celda en una campana de humos estéril para minimizar la contaminación externa.
    1. Aislar y diferenciar preadipocitos primarios, como en73,74.
      1. Preadipocitos primarios en placa a una alta densidad, como 1 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos en medios de cultivo de 1 ml/pocillo (15% de suero bovino fetal (FBS) y 1x penicilina-estreptomicina-glutamina en DMEM/F12).
      2. Después de que las células alcancen el 100% de confluencia, diferenciar con 5 μM dexametasona, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 1 μg/ml de insulina y 1 μM tiazolidindiona (TZD) en medios de cultivo durante 3 días. Luego, cambie a medios de cultivo con insulina de 1 μg / ml durante al menos 3 días para cultivar gotas de lípidos. Use 1 ml/pocillo de medio en la placa de 24 pocillos.
      3. Cambiar los medios de cultivo (1 ml/pocillo) con insulina cada 2 o 3 días. Las células se pueden mantener en medios con insulina hasta por 2 semanas. Utilice solo cultivos en los que las tasas de diferenciación sean superiores al 90% y sean similares en todos los grupos para este ensayo, ya que la diferenciación reducida podría malinterpretarse como una reducción en la tasa lipolítica.
      4. Cultivar las células en medios libres de insulina durante 24 h antes de medir la lipólisis.
        NOTA: La insulina en los medios mantiene las gotas de lípidos, pero también inhibe la lipólisis. La incubación sin insulina durante 24 h permite la activación lipolítica completa sin pérdida del volumen de gotas de lípidos. En algunos sistemas, el tiempo de cultivo sin insulina puede necesitar ser acortado o extendido.
    2. Lave las células con DPBS una vez para eliminar el suero residual de los medios de cultivo.
      NOTA: Este protocolo no incluye la inanición sérica, que puede activar la lipólisis. La inanición de suero puede emplearse a discreción del investigador.
  2. Realizar un cultivo ex vivo como se describe a continuación.
    1. Prepare una placa de 6 pocillos, con un pocillo para cada tejido que se recogerá de cada ratón. Coloque 4 ml de DMEM a temperatura ambiente en cada pocillo que se vaya a utilizar.
      NOTA: BSA en los medios de recolección no es necesario.
    2. Prepare una placa de 48 pocillos para el ensayo de lipólisis, con un pocillo para cada réplica. Coloque 400 μL de DMEM a temperatura ambiente en cada pocillo que se vaya a utilizar. Use de dos a cuatro pocillos de control y de dos a cuatro estimulados por tejido por ratón.
    3. Eutanasia al ratón por luxación cervical bajo anestesia, con un método secundario como el neumotórax bilateral. Aquí, utilizamos un ratón hembra C57BL / 6J de 32 g y 7 meses de edad, alimentado con una dieta alta en grasas al 45% durante 4 meses.
      NOTA: Este protocolo también se puede usar para hombres, así como para otras cepas, dietas y edades.
    4. Rocíe con etanol al 70% y use tijeras para hacer una pequeña incisión lateral (~ 1 cm) en el centro de la piel abdominal, separe la piel pellizcando cualquiera de los lados con el pulgar y el índice y doble la piel abdominal inferior para revelar los depósitos subcutáneos posteriores. Localice y extirpe el ganglio linfático inguinal y disección roma el tejido adiposo inguinal inmediatamente posterior al ganglio linfático inguinal con fórceps.
    5. Para recoger el tejido adiposo gonadal, realice una incisión lateral y una vertical en el peritoneo para acceder a la cavidad peritoneal. Sostenga la almohadilla de grasa gonadal con pinzas y corte a lo largo del útero (o epidídimo para los hombres) para eliminar el tejido adiposo gonadal. Coloque los depósitos recolectados en una placa de 6 pocillos.
    6. Retire el tejido del pozo, colóquelo en una estera de silicona y córtelo en trozos de 5 a 7 mg con tijeras.
    7. Pesar de 25 a 30 mg (cinco o seis trozos) para cada pocillo de ensayo y colocarlo en una placa de ensayo de 48 pocillos. Seque el pañuelo en una toalla limpia antes de pesarlo para eliminar cualquier medio. Pese el bote de pesas después de retirar el tejido y registre el peso de cualquier residuo que quede. Limpie el bote de pesas entre muestras y vuelva a tarlo si es necesario. Use un bote de pesas nuevo para cada tejido.
    8. Una vez que se hayan pesado todas las muestras de tejido, coloque la placa de ensayo de 48 pocillos en una incubadora deCO2 al 10% a 37 °C durante 15 min.

3. Ensayo de lipólisis

  1. Realizar la recopilación de medios. Realice la transferencia de los medios y la posterior recolección de muestras en una campana extractora estéril para minimizar la posible contaminación de fuentes externas.
    1. A t = 0, retirar el medio y añadir 400 μL por pocillo de medio de control o estimulación, y colocar el ensayo de la placa en una incubadora deCO2 al 10% a 37 °C. Para el cultivo de tejido ex vivo , retire con cuidado los medios con una pipeta; Nunca se debe usar succión.
      NOTA: Alternativamente, prepare una segunda placa con medios de control y estimulación, y transfiera los tejidos.
    2. A t = 1, 2, 3 y 4 h, recoger 200 μL de medios, sustituir por 200 μL de los medios de control o estimulación apropiados y devolver la placa de ensayo a la incubadora. Conservar la placa de recogida a 4 °C. Para determinar la capacidad de almacenamiento en búfer FFA de los medios BSA, utilice una colección adicional a las 24 h.
      NOTA: Los experimentos se pueden detener aquí, y los medios recopilados se pueden almacenar a -20 ° C.

4. Ensayo colorimétrico FFA

  1. Caliente los reactivos a temperatura ambiente y disuelva una botella de reactivo de color A con una botella de disolvente A y una botella de reactivo de color B con una botella de disolvente B. A partir de la fecha de reconstitución, estos reactivos se utilizan mejor dentro de 1 semana. Desechar 1 mes después de la reconstitución.
  2. Descongelar y mezclar las muestras.
  3. Cree una curva estándar FFA. La solución estándar es de 1 mM. Utilice el siguiente volumen con los reactivos para la curva estándar: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (dilución 1:2), 10 μL (dilución 1:4), 10 μL (dilución 1:8) y 10 μL de agua para el rango máximo. Para niveles bajos de FFA, 10 μL de 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM y 0.05 mM estándar pueden ser más aplicables.
  4. Pipetear patrones y muestras en una placa de ensayo de 96 pocillos. El volumen de muestra recomendado es de 10 μL. Incluya tres pocillos con el mismo volumen de medios BSA que las muestras para la corrección de fondo.
    NOTA: Si las concentraciones de la muestra quedan fuera del rango de la curva estándar, repita el ensayo, ajustando el volumen de la muestra a 2-25 μL.
  5. Añadir 150 μL de reactivo A a cada pocillo y mezclar. Evita generar burbujas. Haga estallar cualquier burbuja con una aguja de calibre fino. Incubar la placa de ensayo a 37 °C durante 5 min.
  6. Lea la absorbancia de la placa a 550 nm y 660 nm de referencia (Lectura A).
  7. Añadir 75 μL de reactivo B a cada pocillo y mezclar. Evita generar burbujas. Haga estallar cualquier burbuja con una aguja de calibre fino. Incubar la placa de ensayo a 37 °C durante 5 min.
  8. Lea de nuevo la absorbancia de la placa a 550 nm y 660 nm de referencia (lectura B).

5. Ensayo colorimétrico de glicerol

  1. Reconstituir el reactivo de glicerol libre con 36 mL de agua ultrapura y aclimatarlo a temperatura ambiente. Estos reactivos se utilizan mejor en unas pocas semanas. Desechar 2 meses después de la reconstitución.
  2. Descongelar y mezclar las muestras.
  3. Cree una curva estándar de glicerol haciendo una dilución en serie de siete puntos y 2 veces de la solución estándar de glicerol y un espacio en blanco.
    NOTA: La curva estándar es relativamente lineal hasta 25 μL de glicerol de 2,8 mM, pero no lineal a concentraciones más altas.
  4. Pipetear 25 μL cada uno de los ejemplares estándar y muestras en la placa de ensayo de 96 pocillos. Incluya tres pozos con los medios BSA para la corrección de fondo.
  5. Agregue 175 μL de reactivo de glicerol libre a cada pocillo y mezcle. Evita generar burbujas. Haga estallar cualquier burbuja con una aguja de calibre fino. Incubar la placa de ensayo a 37 °C durante 5 min.
  6. Lea la absorbancia de la placa a 540 nm.

6. Cálculo de la tasa lipolítica

  1. Comience con los valores de densidad óptica (OD). Para el glicerol, utilice directamente los valores de A540 OD. Calcule el OD del ensayo FFA de acuerdo con la siguiente fórmula:
    OD = (Lectura B: A 550 - A 660) - (Lectura A: A550 - A660)
  2. Utilice la curva estándar para calcular los niveles de FFA y glicerol en las muestras recogidas. Trazar los valores estándar de OD en el eje y, y en el eje x, utilizar concentraciones estándar relativas al volumen de la muestra (es decir, la concentración de los pocillos con 20 μL de 1 mM FFA estándar en una placa con muestras de 10 μL es igual a 2 mM). Ajuste a una línea de tendencia lineal:
    y = mx + b
  3. Inspeccione visualmente la curva estándar y elimine cualquier punto fuera del rango lineal del ensayo. Calcule las concentraciones de muestra usando la ecuación:
    Concentración de la muestra: x = (OD - b) ÷ m
  4. Ajustar y volver a ensayar las muestras que caen fuera del rango de ensayo lineal. Para obtener la concentración final de la muestra, reste la concentración de los pocillos de fondo que contienen solo medios BSA de la concentración de las muestras.
  5. Calcule los moles de FFA y glicerol producidos por cada muestra en cada punto de tiempo, de acuerdo con la fórmula:
    Equation 1
    donde C n = concentración en el tiempo t = n; Vt = volumen total en el pozo; Vs = volumen de recogida de muestras; y M n = moles producidos en el tiempo t = n (cuando las concentraciones están en mM y los volúmenes están en mL, la salida es μMol).
    Por ejemplo, en varios puntos temporales:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    o
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normalizar el peso del tejido dividiendo por el peso del tejido para cada muestra en gramos para obtener unidades de μmol/g. Para las células cultivadas, los valores se presentan como μmol/pocillo. Asegúrese de que el número de células y la eficiencia de diferenciación sean comparables de un pozo a otro.
    NOTA: Las diferencias en la eficiencia de proliferación o diferenciación complicarán la interpretación de los resultados y requerirán otro método de normalización (por ejemplo, normalización a proteína; ver discusión).
  7. Calcule la pendiente del μmol/g producido (eje y) frente al tiempo (eje x) para cada muestra individualmente.
    1. En una hoja de cálculo, esto se puede hacer usando la función =SLOPE(known_ys,known_xs). En una celda nueva, escriba "=SLOPE" (luego use el cursor para resaltar los valores de glicerol o FFA de la muestra en μmol / g, luego para resaltar los valores de tiempo correspondientes).
    2. Verifique la linealidad de los datos. Los valores de R2 son una forma rápida de determinar la linealidad de las muestras. En una hoja de cálculo, esto se puede hacer usando la función =RSQ(known_ys,known_xs), de la misma manera que se describe en el paso 6.7.1, pero la entrada inicial es =RSQ. Asegúrese de que los valores de R2 sean > 0,98; Los valores más bajos indican una desviación de la linealidad. Esto puede ser el resultado de un error de medición/muestreo o pérdida de linealidad.
      1. Otra forma de probar la linealidad es realizar una regresión lineal para cada muestra y trazar los residuos. En un software de análisis estadístico, genere una tabla XY con un solo valor Y para cada punto de tiempo. Seleccione Analizar > Regresión lineal simple y seleccione la casilla Gráfica residual antes de pulsar OK. La gráfica residual aparecerá como un nuevo gráfico.
  8. Utilice la tasa de producción de FFA y glicerol (es decir, pendiente [(μmol / g / h]) para cada muestra como un punto de datos individual para realizar análisis estadísticos y trazar valores si se comparan diferentes condiciones lipolíticas. Si se comparan las tasas lipolíticas entre genotipos, use dos o tres muestras por animal como réplicas técnicas y use el promedio para un punto de datos por animal, de modo que el tamaño de la muestra sea igual al número de animales.

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Representative Results

Medimos la tasa lipolítica basal y estimulada de adipocitos diferenciados in vitro. Los preadipocitos primarios del tejido adiposo blanco inguinal se diferenciaron en adipocitos mediante el tratamiento de células confluentes con 5 μM de dexametasona, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml de insulina y 1 μM de troglitazona durante 4 días, seguido de un tratamiento adicional de 3 días con 1 μg/ml de insulina. Las células se incubaron en medios sin insulina durante 24 h antes del ensayo de lipólisis. En el momento = 0h, las células se lavaron una vez con PBS, luego se agregó DMEM libre de rojo de fenol con BSA al 2%, que contenía 10 μM CL-316,243 o control del vehículo, a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. En el momento = 1 h, 2 h, 3 h y 4 h, el 50% de los medios se recogió y se reemplazó con BSA al 2% en DMEM libre de rojo de fenol. Los niveles de FFA y glicerol se midieron en los medios recolectados y los moles de FFA, y el glicerol secretado en los medios se calculó en cada punto de tiempo (Figura 2A, B). La producción de FFA y glicerol fue lineal para el ensayo de 4 h, con valores de R2 de 0,98 y superiores. Los niveles de FFA de 4 h fueron ligeramente bajos, lo que indica que las tasas lipolíticas pueden haber disminuido; Sin embargo, el análisis con y sin el punto de tiempo de 4 h no tuvo un impacto significativo en la tasa lipolítica calculada. Las tasas lipolíticas estimuladas fueron significativamente más altas que las tasas basales (Figura 2C). La estimulación lipolítica resultó en la producción de AGF y glicerol en una proporción molar cercana a 3:1 en todas las muestras recolectadas, como se esperaría de la lipólisis completa de triglicéridos sin recaptación o retención significativa (Figura 2D). Sin embargo, en las células no estimuladas, la proporción fue más cercana a 1, lo que sugiere una fuente no lipolítica de glicerol48,49,50.

Figure 2
Figura 2: Tasa lipolítica en adipocitos primarios diferenciados in vitro . Los preadipocitos se diferenciaron en una placa de 12 pocillos. La insulina se retiró de los medios 24 h antes del ensayo lipolítico. En el momento = 0 h, las células fueron estimuladas con 10 μM CL-316,243 (CL) o tratadas con medios de control del vehículo (V). El nmol de (A) FFA y (B) glicerol producido en cada pocillo por cada punto de tiempo se trazó a lo largo del tiempo, y se ajustó una línea de regresión lineal para cada pocillo individual. (C) Tasa de producción de FFA. (D) Tasa de producción de glicerol. Los datos se representan como media ± SEM. (E) Relación molar de FFA:glicerol en los medios recolectados en cada punto de tiempo. El análisis estadístico en (C) y (D) se realizó utilizando la prueba t de un estudiante; el efecto del CL fue significativo a α = 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el cultivo celular, la monocapa de células está en contacto directo con el medio, mientras que en los tejidos cultivados ex vivo, las células en el centro no están en contacto con el medio. Por lo tanto, en cultivos ex vivo, es más probable que los AGF se retengan dentro del tejido. Los trozos más grandes de tejido, que tienen una menor relación área de superficie a volumen, exhiben tasas más altas de retención de FFA, lo que resulta en menores relaciones molares de FFA: glicerol (Figura 3A). Con la disminución del tamaño del trozo de tejido, la relación molar de FFA:glicerol liberado se acerca a 3:1 (Figura 3A). Sin embargo, los trozos de tejido también pueden ser demasiado pequeños. Además del desafío de trabajar con pequeños trozos de tejido adiposo, los trozos de 1-2 mg de tejido adiposo exhiben tasas lipolíticas reducidas, lo que sugiere una viabilidad y funcionalidad reducidas del tejido (Figura 3B, C). Si bien es tedioso y requiere mucho tiempo cortar el tejido adiposo en trozos de tamaño y forma consistentes, se requiere obtener resultados comparables y confiables. Recomendamos de 5 a 10 mg trozos de tejido adiposo, pero la consistencia es lo más importante. Las tasas lipolíticas aún se pueden medir de manera reproducible en trozos de tejido más grandes, sin embargo, es importante considerar la inhibición de la lipólisis por retroalimentación por AGL 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figura 3: Efecto del tamaño del trozo de tejido en la liberación de FFA y la tasa lipolítica. Se recolectó tejido adiposo blanco gonadal de una dieta alta en grasas alimentada con ratones hembra C57Bl / 6J y se cortó en trozos de tamaño variable. Todos los pocillos contenían 25-30 mg de tejido adiposo en total; Para los pocillos de 25 mg, esto fue un trozo de tejido; Los pocillos de 10 mg tenían tres trozos de tejido cada uno de ~ 10 mg, los pocillos de 5 mg contenían cinco o seis trozos de tejido y los pocillos de 2 mg contenían 13-16 trozos. En el momento = 0 h, se estimuló la lipólisis con 0,5 μM CL-316.243 (CL), o se trataron los pocillos control con vehículo (V). La tasa lipolítica calculada a partir de muestras recolectadas después de 1 h, 2 h y 3 h se representa gráficamente para (A) AGF y (B) glicerol. (C) Relación molar de la producción de FFA:glicerol en cada pozo. Los datos se representan como media ± SEM. El análisis estadístico en (A) y (B) se realizó utilizando un ANOVA bidireccional con un análisis post-hoc de Holm-Sidak, α = 0,05. El efecto de la CL fue significativo en todas las muestras. Dentro de las muestras tratadas con CL, las tasas de producción de AGF y glicerol fueron significativamente diferentes en todas las comparaciones por pares, excepto las muestras de 10 mg versus 5 mg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El impacto negativo de la retención de FFA se puede observar en los trozos de tejido de 25 mg, que exhiben tasas más bajas de producción de FFA y glicerol tras la estimulación (Figura 3B, C). Esta inhibición de la retroalimentación también es evidente cuando la capacidad de unión FFA de los medios es demasiado baja (es decir, no hay suficiente BSA en los medios). Cuando la BSA en los medios se redujo a 0.5%, la liberación de FFA se redujo más de cuatro veces y la liberación de glicerol se redujo casi dos veces (Figura 4A, B). Como regla general, los niveles micromolares de FFA en los medios no deben acercarse al porcentaje de BSA en los medios (es decir, los niveles de FFA deben permanecer por debajo de 5 mM de FFA en medios BSA al 5% y 0.5 mM en medios BSA al 0.5% [en este nivel hay una relación molar de 20: 3 de FFA: BSA]). Para probar la capacidad máxima de amortiguación de BSA de la preparación de medios BSA, recolecte medios de una muestra estimulada de 24 h y mida la concentración de FFA (la concentración será alta, por lo que se recomienda un volumen de muestra o dilución de muestra más bajo). La acumulación de FFA en los medios BSA al 5% después de la estimulación de 24 h fue de aproximadamente 5 mM, mientras que el contenido de FFA del medio BSA al 0,5% fue de solo 0,6 mM (Figura 4C). Al observar la concentración de FFA en los medios recolectados, se puede ver que la capacidad de unión de FFA de los medios BSA al 0,5% está sobrecargada (Figura 4D). Si bien los niveles de FFA en los medios BSA al 5% son mucho más altos, no exceden la capacidad de almacenamiento en búfer de los medios (Figura 4D). Idealmente, la concentración de FFA en los medios debe permanecer por debajo de una relación molar de 3:1 FFA:BSA (es decir, 2,3 mM de FFA en 5% [0,75 mM] BSA).

Figure 4
Figura 4: Los niveles insuficientes de BSA resultan en tasas lipolíticas aparentes reducidas. Se recolectó tejido adiposo blanco gonadal de una dieta alta en grasas alimentada con ratones hembra C57Bl / 6J y se cortó en trozos de ~ 5 mg. Se colocó un total de 20-30 mg de tejido adiposo en cada pocillo. En el momento = 0 h, la lipólisis se estimuló con 0,5 μM CL-316,243 (CL), o los pocillos de control se trataron con vehículo (V) en medios BSA al 5% o medios que contenían solo 0,5% de BSA. La tasa lipolítica calculada a partir de las muestras recogidas después de 4 h se representa gráficamente para (A) AGF y (B) glicerol. El efecto de la CL fue significativo en todas las muestras. Dentro de las muestras tratadas con CL, las tasas de producción de FFA y glicerol fueron significativamente diferentes entre las condiciones de medios BSA del 5% y 0.5%. (C) Niveles de FFA en los medios de los pocillos estimulados después de 24 h. (D) Niveles de FFA en las muestras recogidas a las 4 h. (E) Curvas estándar de FFA con y sin diversas preparaciones de BSA al 5% en DMEM. Densidad óptica calculada como (Lectura B: A 550 - A 660) - (Lectura A: A550 - A660). (F) Curva estándar de glicerol con y sin BSA. La densidad óptica es absorbente a 540 nm (A540). Los valores de DO a 5,6 mM no fueron lineales y, por lo tanto, no se incluyeron en la curva estándar. (G) Tasa de liberación de FFA del tejido adiposo gonadal femenino utilizando diferentes tipos de BSA en los medios de ensayo. Los datos se representan como media ± SEM. El análisis estadístico en (A) y (B) se realizó utilizando un ANOVA bidireccional con un análisis post hoc de Holm-Sidak, * valor de p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es importante señalar que algunas preparaciones de BSA contienen FFAs. Cada lote de BSA debe probarse para garantizar que el contenido de FFA sea insignificante (tenga en cuenta que algunas preparaciones de BSA se comercializan como libres de FFA). Aunque no se comercializa específicamente como libre de FFA, el BSA utilizado aquí no contiene FFA detectables. Probamos los medios de ensayo que contienen BSA libre de AFA (Equitech Bio Inc, BAH66), el BSA utilizado en experimentos aquí (Sigma, A9418) y una fracción V BSA más cruda (menos costosa) (Sigma, 810531). El BSA libre de FFA y el BSA A9418 no produjeron ninguna señal de fondo ni cambiaron la pendiente o intercepción de la curva estándar; las curvas estándar eran superponibles (Figura 4E). Tampoco se observó ningún impacto del DMEM BSA en la curva estándar de glicerol (Figura 4F). La fracción V BSA, por otro lado, produjo una señal de fondo en el ensayo FFA, que equivalía a una concentración de FFA de 0,3 mM (Figura 4E). Este fondo desplazó la curva estándar hacia arriba, pero no impactó significativamente la pendiente, lo que indica que la resta de fondo es suficiente. También realizamos un experimento de lipólisis estimulada utilizando estos tres tipos diferentes de BSA, y encontramos que después de la sustracción de fondo, la tasa calculada de lipólisis no difería entre las formulaciones de BSA (Figura 4F). Sin embargo, este no es a menudo el caso, especialmente con preparaciones de BSA menos puras que pueden contener fácilmente insulina u otros componentes que afectan la tasa de lipólisis. Cada lote de BSA debe ser probado y validado, y utilizado consistentemente (es decir, las muestras ensayadas con diferentes lotes de BSA no son comparables). Se debe realizar una curva estándar completa con la adición de BSA y DMEM al validar cada lote de BSA para garantizar que no contenga nada que interfiera con las enzimas en los ensayos colorimétricos.

Tomar muestras en serie y reemplazar el volumen con medios nuevos ayuda a reducir la carga de FFA en los medios durante todo el experimento. Medimos las tasas lipolíticas en el tejido adiposo gonadal de un ratón hembra alimentado con una dieta alta en grasas durante 4 meses. En este experimento, se incubaron trozos de tejido de 5-8 mg (peso total de 25-30 mg) en 200 μL de medios BSA al 5%, y se recolectaron 100 μL y se reemplazaron a 1 h, 2 h, 3 h y 4 h. Se midieron los niveles de FFA y glicerol en los medios recolectados. A las 3 h, los niveles de FFA en los medios habían alcanzado la zona de peligro de 2,3 mM (Figura 5A). La inhibición por retroalimentación de la lipólisis fue sugerida por la falta de aumento en los niveles de FFA media y glicerol a las 4 h (Figura 5A, B). Después de calcular el μmol de FFA y glicerol liberado en cada punto de tiempo y ajustar una curva lineal, es evidente que la tasa lipolítica comienza a disminuir a las 4 h en las muestras estimuladas, con valores de R2 tan bajos como 0.976 para FFA y 0.983 para glicerol (Figura 5C, D). Mirando la gráfica de residuos, está claro que los valores de 4 h están por debajo de la tendencia lineal (es decir, los residuos son negativos) (Figura 5E, F). La exclusión del punto de tiempo de 4 h aumentó los valores deR2 a 0,997 y 0,998 y más para FFA y glicerol, respectivamente. La inclusión del punto de tiempo de 4 h causa una disminución pequeña pero significativa en las tasas de liberación de FFA y glicerol calculadas (Figura 5G, H).

Figure 5
Figura 5: Cálculo de la tasa lipolítica lineal en tejido adiposo ex vivo . Se recolectó tejido adiposo blanco gonadal de una dieta alta en grasas alimentada con ratones hembra C57Bl / 6J y se cortó en trozos de ~ 5 mg. Se colocó un total de 20-30 mg de tejido adiposo en cada pocillo. En el momento = 0 h, la lipólisis fue estimulada con 0,5 μM CL-316.243 (CL), o los pocillos control fueron tratados con vehículo (V). Las colecciones de medios se realizaron a las 1 h, 2 h, 3 h y 4 h. (A) FFA y (B) niveles de glicerol en los medios. (C) FFA y (D) producción de glicerol trazada a lo largo del tiempo. Placas residuales para (E) FFA y (F) producción de glicerol a lo largo del tiempo. Velocidad de liberación de (G) FFA y (H) glicerol, calculada con y sin el punto de tiempo de 4 h. (I) Liberación de FFA en tejido adiposo gonadal femenino. Casi el 50% de los medios cambiaron a la 1 h, 2 h y 3 h. Entre horas, los puntos de tiempo de 15 minutos recogieron el 2,75% de los medios sin reemplazo. Los datos se representan como media ± SEM. El análisis estadístico en (G) y (H) se realizó utilizando un ANOVA bidireccional con un análisis post-hoc de Holm-Sitak, * valor de p < 0,05. El efecto del CL fue significativo en todas las muestras (valor de p < 0,05). Dentro de las muestras tratadas con CL, las tasas de producción de FFA y glicerol fueron significativamente diferentes entre los cálculos con y sin el punto de tiempo de 4 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A diferencia de los protocolos anteriores, este protocolo utiliza múltiples puntos de tiempo para determinar la tasa lipolítica, reduciendo así el error de medición y proporcionando una validación interna de que se está midiendo la tasa lineal de lipólisis. Para mantener la lipólisis en la fase lineal en cada punto de recolección, se recoge y reemplaza el 50% de los medios. Dado que la linealidad es crítica, queríamos asegurarnos de que la adición de medios frescos no causara un estallido de lipólisis en cada adición. Para validar la linealidad entre los puntos de tiempo, tomamos una muestra muy pequeña (2,75%) cada 15 min entre los puntos de tiempo horarios de 1 h a 3 h, sin reemplazo. A las 1 h, 2 h y 3 h, se realizó y reemplazó la recolección normal de la muestra al 50%. La tasa de liberación de FFA fue lineal entre los puntos de tiempo habituales, lo que indica que no hubo un estallido de lipólisis con cada adición de medios frescos (Figura 5I).

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Discussion

Aquí, proporcionamos un protocolo básico para medir la tasa de lipólisis en adipocitos y tejido adiposo ex vivo . Para cuantificar la lipólisis, es importante medir la tasa lipolítica en la fase lineal. Utilizamos una técnica de muestreo en serie, donde se recolecta una gran fracción de los medios y se reemplaza con medios frescos a intervalos regulares. Este método semiconservador permite la adición de BSA fresco con capacidad de amortiguación FFA y retrasa la inhibición de la retroalimentación, extendiendo la duración de la lipólisis lineal. Este diseño experimental intenta recapitular la vascularización del tejido adiposo in vivo, que proporciona albúmina fresca para unirse a los AGF liberados75. Este protocolo fue optimizado para medir la lipólisis en tejido adiposo blanco murino ex vivo y preadipocitos primarios del tejido adiposo inguinal diferenciados in vitro. Es probable que el protocolo se pueda optimizar para que funcione bien en depósitos adiposos marrones y beige, así como en tejido adiposo de otros organismos y líneas celulares inmortalizadas con alto potencial adipogénico. El protocolo permite flexibilidad en la edad, el sexo y la dieta de los ratones antes de la recolección de tejido adiposo para ensayos ex vivo . Algunas manipulaciones, como el ayuno, pueden afectar la tasa lipolítica basal, mientras que otras intervenciones, como la obesidad inducida por la dieta, también afectan la tasa de lipólisis estimulada.

El protocolo debe optimizarse para cada sistema experimental, dependiendo de si las tasas lipolíticas son mayores o más bajas. Para validar la linealidad, recomendamos calcular los valores de R2 y mirar la gráfica de residuos. Los valores de R2 deben estar muy cerca de 1. Al evaluar la gráfica residual, uno debe estar atento a los valores residuales negativos en puntos de tiempo posteriores, ya que estos indican que las tasas lipolíticas están disminuyendo y se está perdiendo linealidad. En la Figura 5E,F se muestran ejemplos de tales gráficos residuales. La eliminación de los puntos de tiempo de 4 h en este caso proporciona un cálculo más preciso de la tasa lipolítica lineal y mejora los valores deR2. Sin embargo, dado que la tasa se calcula a partir de múltiples puntos de tiempo, es relativamente robusta, y la inclusión de dicho punto de tiempo tiene solo un pequeño impacto en los valores de R2 y la tasa calculada de lipólisis. Si se utiliza un solo punto de tiempo para calcular la tasa lipolítica, los datos pueden ser sesgados más fácilmente.

La forma en que se normalizan los datos también puede afectar los resultados relativos entre muestras. Aquí, recomendamos normalizar el tejido ex vivo al peso del tejido y los preadipocitos primarios diferenciados in vitro por pocillo. Sin embargo, estas técnicas de normalización pueden no ser apropiadas para todos los sistemas experimentales. Es importante destacar que si la tasa de proliferación o la eficiencia de diferenciación difieren entre los grupos, la normalización por pozo no es apropiada. Las técnicas alternativas de normalización incluyen proteínas, lípidos y ADN. Cada método de normalización tiene sus ventajas y desventajas. El peso del tejido y la normalización del pozo son simples y directos. Las diferencias en el tamaño de los adipocitos pueden significar que el tejido adiposo magro contiene muchos más adipocitos por gramo que el tejido adiposo obeso, mientras que las diferencias en la eficiencia de la diferenciación pueden dar lugar a diferencias en el número de adipocitos por pocillo. Los lípidos se pueden extraer con disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo 2:1:metanol [v/v]) y contenido de triglicéridos medido con un reactivo colorimétrico. Si bien la normalización del contenido de lípidos no es un método utilizado tradicionalmente, las gotas de lípidos son, después de todo, el orgánulo sometido a lipólisis, y este método de normalización es específico para los adipocitos, que pueden ser útiles cuando las tasas de diferenciación difieren entre las células. Después de la extracción de lípidos, se puede usar 0.1-0.3 N NaOH para extraer proteínas, que luego pueden ser analizadas por Bradford o BCA proteinassay 68. Alternativamente, las muestras pueden homogeneizarse en tampón de lisis y la fracción lipídica puede eliminarse por centrifugación70. Tenga en cuenta que la contaminación lipídica interferirá con los ensayos de proteínas. Si se va a utilizar proteína para la normalización, las células deben lavarse extensamente (al menos tres veces) para eliminar la BSA de los medios de ensayo. A veces, los adipocitos diferenciados no se adhieren bien a la placa y no toleran los tres lavados necesarios para eliminar el exceso de BSA. La normalización al ADN permite la normalización al número de células, y se puede realizar con un kit comercial de extracción de ADN, seguido de la cuantificación del ADN total por absorbancia o análisis de PCR en tiempo real del número de copias de genes. Alternativamente, en las células plateadas, se puede usar la tinción DAPI seguida de imágenes para contar núcleos y normalizar el número de células. Al normalizar el uso del número de células o proteínas, es importante considerar las células no adipocitos en la muestra. El tejido adiposo también contiene células inmunes y endoteliales; En el tejido adiposo obeso, la inflamación y la hipertrofia pueden resultar en tan solo 1 de cada 10 núcleos provenientes de adipocitos maduros. Sin embargo, los adipocitos todavía contribuyen a la mayoría de la masa y el contenido de lípidos del tejido. Para los preadipocitos diferenciados in vitro , la eficiencia de diferenciación afecta el porcentaje relativo de adipocitos maduros; Cuando este es el caso, la normalización es complicada. Idealmente, la eficiencia de diferenciación debe optimizarse antes de utilizar las células para un ensayo de lipólisis. Si no es posible, se recomienda la normalización del contenido de lípidos si el volumen de gotas de lípidos es similar entre los adipocitos diferenciados. La comparación de las tasas lipolíticas entre cultivos de adipocitos con diferenciación desigual puede llevar a conclusiones erróneas sobre la lipólisis cuando el factor impulsor es en realidad la adipogénesis; Esta es una limitación del protocolo.

Los AGF de cadena larga inhiben la lipólisis 63,64,65,66,67. Los AGF se acumulan cuando no están suficientemente secuestrados en los medios de comunicación. Gran parte de la solución de problemas asociada con la optimización de la medición de la lipólisis está relacionada con la minimización de la retención de FFA. El cálculo de la relación molar de la liberación de FFA:glicerol en los medios ayuda a identificar problemas relacionados con la retención de FFA. Si la relación molar es de 3: 1 para FFA: glicerol, entonces todos los productos de la lipólisis están siendo liberados y capturados en los medios, mientras que una proporción por debajo de 2: 1 es motivo de preocupación. Una consideración importante para los ensayos ex vivo es el tamaño del trozo de tejido adiposo. Los trozos más grandes de tejido tienen una menor relación área de superficie a volumen y, por lo tanto, es más probable que retengan AGL y exhiban tasas lipolíticas reducidas como consecuencia (Figura 4A, B). Teniendo esto en cuenta, es fundamental cortar el tejido adiposo para cada muestra en trozos de un tamaño y forma consistentes. Para facilitar el secuestro de FFA en los medios, también es importante asegurarse de que los medios contengan suficiente BSA para vincular el FFA liberado. La capacidad de amortiguación FFA de los medios se puede aumentar aumentando la concentración de BSA o aumentando el volumen de medios. Es igualmente efectivo para aumentar el volumen o la frecuencia de la recolección. Si se observan altas tasas lipolíticas, pero las proporciones FFA:glicerol son inferiores a 2:1, recomendamos aumentar la frecuencia de recolección a cada 30 min y detener el ensayo a las 2,5 h.

El protocolo proporcionado aquí está optimizado para tejido adiposo blanco ex vivo de ratón y preadipocitos primarios diferenciados in vitro, los cuales son altamente lipolíticos. El ensayo debe optimizarse para medir la lipólisis en otros sistemas, o si las diferencias en la tasa basal relativamente baja de lipólisis son de particular interés. Por ejemplo, los adipocitos 3T3-L1 tienen menor actividad lipolítica32. Cuando la tasa lipolítica es baja, el volumen de incubación debe reducirse (es decir, en lugar de 400 μL por pocillo en una placa de 24 pocillos, se deben usar 200 μL en una placa de 24 pocillos, o 300 μL en una placa de 12 pocillos, y 100-150 μL recolectados por punto de tiempo). El volumen de recolección no debe caer por debajo de 100 μL, ya que se requieren volúmenes de muestra más grandes para medir con precisión los niveles bajos de FFA y glicerol. Para evaluar el glicerol utilizando 50 μL de medio por muestra, el reactivo de glicerol libre debe disolverse en 31 ml de agua, y 150 μL de reactivo utilizado con 50 μL de muestra en cada pocillo. Los niveles de FFA se pueden medir con 25 μL de muestra por pocillo, tal vez más, siempre que se mantenga la linealidad. Los puntos de tiempo también se pueden extender para aumentar la señal. Al analizar las tasas lipolíticas de células distintas de los adipocitos blancos, se deben considerar las diferencias en el metabolismo celular. Por ejemplo, los adipocitos marrones y beige expresan niveles mucho más altos de glicerol quinasa y, por lo tanto, pueden retener la liberación de glicerol por lipólisis76,77. Estas células metabólicamente activas también pueden canalizar los ácidos grasos liberados en vías catabólicas o sintéticas sin liberación en los medios. El destino metabólico del FFA y el glicerol en el tipo de célula específica que se está ensayando debe considerarse al interpretar los resultados de un ensayo de lipólisis, especialmente en un tipo de célula que no sea adipocitos blancos. Los ensayos de lipólisis en otros tipos de células deben optimizarse y validarse.

Este protocolo está diseñado para evaluar las diferencias en la tasa lipolítica en modelos de ratón. Los preadipocitos primarios diferenciados in vitro son una herramienta útil para investigar los efectos autónomos celulares de las manipulaciones genéticas o los tratamientos farmacológicos en los adipocitos. El tejido adiposo, por otro lado, contiene otros tipos de células, incluidas las células inmunes. Es importante considerar el impacto de las células inmunes del tejido adiposo en la regulación de la lipólisis al evaluar la lipólisis de tejido completo. Los modelos de lipólisis de adipocitos cultivados pueden eludir la posible influencia complicada de las células inmunes y permitir la investigación exhaustiva de los tipos específicos de células, mientras que los explantes de tejido adiposo permiten una comparación más robusta con el entorno in vivo . Además, el ensayo ex vivo se puede utilizar para investigar las tasas lipolíticas en varios depósitos adiposos. En estos sistemas, la lipólisis es estimulada por compuestos como los agonistas del receptor β-adrenérgico, por lo tanto, no se observará ningún cambio en el tono simpático que pueda afectar el modelo de ratón in vivo . La medición in vivo de la lipólisis se complica por la dinámica de la liberación y absorción de FFA y glicerol en varios tejidos en todo el cuerpo. Los niveles séricos de FFA y glicerol en un momento dado son el equilibrio de secreción y absorción, y no debe presumirse que los cambios en los niveles séricos de FFA y glicerol son atribuibles únicamente a la lipólisis del tejido adiposo. La lipólisis inducida por el ayuno se ve afectada por el tono simpático, pero no produce cambios rápidos y robustos en los niveles séricos de AGF o glicerol, lo que dificulta la interpretación de los cambios en los niveles séricos en ayunas de AGF y glicerol. La lipólisis in vivo se puede estimular utilizando un agonista del receptor adrenérgico β-3, como CL-316,243, y el aumento de FFA sérico y glicerol son detectables dentro de los 20 minutos de estimulación. Los ensayos lipolíticos in vivo deben incluir mediciones basales de AGF sérica y glicerol, así como un control del vehículo; de esta manera, se puede determinar el cambio específico de la estimulación en los niveles séricos de FFA y glicerol.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención R01DK126944 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos a S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

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References

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Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino <em>ex vivo</em> y preadipocitos primarios diferenciados <em>in vitro</em>
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Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

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