Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning av lipolyshastigheten i ex vivo murin fettvävnad och primära preadipocyter differentierade in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Triglyceridlipolys i adipocyter är en viktig metabolisk process som resulterar i frigörelse av fria fettsyror och glycerol. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att mäta basal och stimulerad lipolys i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss.

Abstract

Adipocyter lagrar energi i form av triglycerider i lipiddroppar. Denna energi kan mobiliseras via lipolys, där fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt från glycerolryggraden, vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror och glycerol. På grund av det låga uttrycket av glycerolkinas i vita adipocyter är glycerolåterupptagshastigheterna försumbara, medan återupptaget av fettsyror dikteras av fettsyrabindningskapaciteten hos mediekomponenter såsom albumin. Både glycerol och fettsyrafrisättning i media kan kvantifieras med kolorimetriska analyser för att bestämma lipolytisk hastighet. Genom att mäta dessa faktorer vid flera tidpunkter kan man bestämma den linjära lipolyshastigheten med hög säkerhet. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för mätning av lipolys i in vitro-differentierade adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss. Detta protokoll kan också optimeras för andra preadipocytcellinjer eller fettvävnad från andra organismer; Överväganden och optimeringsparametrar diskuteras. Detta protokoll är utformat för att vara användbart för att bestämma och jämföra graden av adipocytlipolys mellan musmodeller och behandlingar.

Introduction

Överskott av näringsämnen lagras i vit fettvävnad i form av triglycerider i den neutrala lipidkärnan i lipiddroppar. Triglyceridförråd mobiliseras via lipolys, en process genom vilken fettsyrasidokedjorna klyvs sekventiellt av fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL), vilket resulterar i frisättning av fria fettsyror (FFA) och glycerolryggraden 1,2. Lipolys aktiveras genom katekolaminsignalering i fettvävnaden. Sympatiska nervterminaler frisätter lokalt katekolaminer, som binder till β-adrenerga receptorer på adipocytplasmamembranet. Vid ligandbindning aktiverar dessa G-proteinkopplade receptorer (GPCR) adenylylcyklas via Gαs. Efterföljande aktivering av proteinkinas A (PKA) av cAMP resulterar i uppreglering av både ATGL och HSL. Fosforyleringen av perilipin-1 av PKA orsakar dissociation av ABHD5 (även känd som CGI-58), som binder och samaktiverar ATGL3. PKA fosforylerar HSL direkt, vilket främjar dess translokation från cytosolen till lipiddroppen, där interaktion med fosforylerad perilipin-1 ytterligare främjar dess lipasaktivitet 4,5,6,7. Det tredje lipaset som är involverat i lipolys, MGL, verkar inte regleras av katekolaminsignalering8. Viktigt är att triglyceridsyntes i adipocyter medieras av glycerollipidsyntesvägen, som inte involverar bildandet av monoglycerider som mellanprodukt; istället katalyserar glycerol-3-fosfatacyltransferaser bildningen av lysofosfatidinsyra, som kombineras med en annan fettacyl-CoA för att bilda fosfatidinsyra och sedan isomeriseras till diglycerider före den slutliga syntesen av triglycerider (figur 1) 9,10,11.

Figure 1
Figur 1: Lipolys och glycerol lipidsyntesvägar. Överst: Lipolytisk väg; enzymer som visas i rött: fettvävnad triglyceridlipas (ATGL), hormonkänsligt lipas (HSL) och monoglyceridlipas (MGL). Botten: glycerol lipid syntes väg; enzymer som visas i grönt: diglyceridacyltransferas (DGAT), fosfatidsyrafosfatas (PAP), lysofosfatidsyraacyltransferas (LPAT, även känt som LPAAT) och glycerol-3-fosfatacyltransferas (GPAT). Lipider: triglycerid (TG), diglycerid (DG), monoglycerid (MG), fri fettsyra (FFA), fettacyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinsyra (LPA) och fosfatidinsyra (PA). Andra metaboliter: oorganiskt fosfat (Pi) och glycerol-3-fosfat (G3P). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Extracellulär adenosin är en annan viktig regulator för lipolys, som arbetar genom Gs- och Gi-kopplade GPCR för att påverka adenylcyklasaktivitet. Den dominerande adenosinreceptorn i adipocyter, ADORA1, hämmar adenylylcyklas och därmed lipolys genom aktivering av Gi12. ADORA2A uttrycks vid lägre nivåer, och främst i bruna adipocyter, och aktiverar lipolys via G s-signalering13. ADORA1 påverkar både basal lipolys och svaret på adrenerga agonister. Effekten av adenosin på lipolys kan kontrolleras genom tillsats av adenosindeaminas för att neutralisera adenosin, liksom ADORA1-specifik agonist fenylisopropyladenosin14,15. Hormonell aktivering av Gq-kopplade GPCR kan också påverka lipolys via aktivering av fosfolipas C och proteinkinas C16,17,18,19. Inflammatoriska signaler påverkar också lipolytiska hastigheter. TLR4-aktivering av LPS (och andra endotoxiner) ökar den lipolytiska hastigheten genom att aktivera ERK, som fosforylerar perilipin-1 och HSL20. TNF-α aktiverar också lipolys via ERK- och NF-κB-aktivering, samt transkriptionell nedreglering av fosfodiesteras PDE-3B och CIDEC21,22,23. IL-6 har också associerats med ökad adipocytlipolys, särskilt i mesenterisk fettvävnad, vars FFA-frisättning påverkar leversteatos och glukoneogenes24,25,26.

Lipolys undertrycks under matningstillståndet av insulin. AKT fosforylerar och aktiverar PDE-3B för att undertrycka cAMP-signalering och förhindra PKA-aktivering27. Insulin nedreglerar också ATGL28 via transkription. Fetma främjar katekolaminresistens genom en mängd olika mekanismer, inklusive nedreglering av β-adrenerga receptorer i adipocyter 29,30,31,32,33. Adipocyter uttrycker alla tre β-adrenerga receptorer (β-1, β-2 och β-3). Medan β-1 och β-2 adrenerga receptorer uttrycks allestädes närvarande, uttrycks β-3-adrenerga receptorn huvudsakligen i adipocyter hos möss34,35. Adrb3-uttryck induceras av C / EBPα under adipogenesis36. Den β-3 adrenerga receptorn uttrycks starkt i mogna adipocyter. Aktiveringen av β-1 och β-2 adrenerga receptorer är självbegränsande på grund av återkopplingshämning av β-arrestin37. Återkopplingshämning av β-3-adrenerga receptorn medieras av andra signalvägar, vilket minskar Adrb3-uttrycket 33,38,39.

Många föreningar kan användas för att aktivera adipocytlipolys. Katekolaminer är viktiga fysiologiska aktivatorer av lipolys. Noradrenalin (eller noradrenalin) och adrenalin (eller adrenalin) aktiverar alla tre β-adrenerga receptorer40. Noradrenalin och adrenalin påverkar också lipolys via aktivering av α-adrenerg receptorsignalering41. Vanliga β-adrenerga receptoragonister inkluderar isoproterenol, som är en icke-selektiv β-adrenerg receptoragonist, och β-3-adrenerga receptoragonister CL-316,243 och mirabegron42. Med tanke på att adipocyter huvudsakligen uttrycker den β-3-adrenerga receptorn använder vi CL-316,243 som ett exempel här. Dess specificitet för β-3-adrenerga receptorn gör den också till en relativt specifik aktivator av adipocytkatekolaminsignalering, som också säkert kan användas in vivo. Observera att den vanliga koncentrationen av 10 μM CL-316,243 i cellodling är storleksordningar högre än den ~ 0,1 μM dos som krävs för att uppnå ett maximalt svar33. Forskolin kringgår adrenerga receptorn, direkt aktivera adenylylcyklas och nedströms lipolytisk signalering. Det finns många fler aktivatorer, liksom suppressorer av lipolys. Vid val av en förening för att stimulera lipolys bör receptorspecificiteten och nedströms signalvägar noggrant övervägas inom den experimentella designen.

Graden av lipolys i vit fettvävnad är en viktig metabolisk faktor som påverkar kalltolerans och näringstillgänglighet under fasta eller träning43,44,45,46. Syftet med detta protokoll är att mäta graden av lipolys i adipocyter och fettvävnad, vilket kommer att underlätta förståelsen av adipocytmetabolism och hur det kan påverka den metaboliska fenotypen av olika murina modeller. För att kvantifiera den lipolytiska hastigheten mäter vi utseendet på lipolytiska produkter i media (dvs FFA och glycerol). Metoden bygger på frisättning av lipolytiska produkter från adipocyten i media. Eftersom vita adipocyter uttrycker låga nivåer av glycerolkinas är glycerolåterupptagshastigheterna låga47. Omvänt bör produktion av FFA och glycerol genom andra metaboliska vägar än lipolys också övervägas. Adipocyter verkar uttrycka ett fosfatas med aktivitet mot glycerol-3-fosfat, vilket möjliggör produktion av glycerol från glycerol-3-fosfat härrörande från glukos48,49,50. Glykolys är en källa till glycerol-3-fosfat som används för FFA-reesterifiering i vita adipocyter. När glukosnivåerna är begränsade kräver glyceroneogenes andra 3-kolkällor, såsom laktat och pyruvat51. Kanaliseringen av FFA som frigörs genom lipolys i cellen och deras metaboliska öde är dåligt förstådd; FFA som frigörs genom lipolys måste omvandlas till fettacyl-CoA innan de förestras eller genomgår β-oxidation. Det verkar som om FFA som frigörs genom lipolys sannolikt lämnar cellen innan de tas upp igen och omvandlas till fettacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA kan sekvestreras utanför cellen med albumin. Viktigt är att långkedjiga FFA är kända för att återkopplingshämma lipolys om de inte sekvestreras av albumin 63,64,65,66,67. Således är optimering av medias FFA-buffertkapacitet under lipolysanalysen kritisk. Proceduren som beskrivs här liknar tidigare publicerade metoder för att mäta den lipolytiska hastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad från möss och människor 15,68,69,70,71. Detta protokoll skiljer sig genom användning av seriell provtagning; Genom att utföra seriell provtagning kan vi internt validera att lipolys mäts i den linjära fasen och använda flera mätningar för att beräkna lipolyshastigheten, vilket minskar mätfelet för att öka förtroendet för det slutliga beräknade värdet. Nackdelen med seriell provtagning är att analysen kräver mer tid och reagens; Den längre tidsramen minskar dock mätfelets inverkan på standardfelet i uppskattningarna av frekvensen. Dessutom mäter detta protokoll både FFA- och glycerolfrisättning och beaktar förhållandet mellan FFA: glycerolfrisättning med målet att uppnå ett 3: 1-förhållande, vilket kan förväntas från fullständig lipolys och frisättning av lipolytiska produkter i media72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av alla djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Weill Cornell Medical College of Cornell University.

1. Förberedelse av buffertar och uppsamlingsplattor

  1. Gör 5% bovint serumalbumin (BSA) genom att lösa upp 5 g BSA i 100 ml Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) utan fenolrött. Rör försiktigt BSA för att lösa upp (skakning är kontraproduktivt). När BSA är helt upplöst, filtersterilisera mediet med ett 0,2 μm filter. Förvara BSA-materialet vid 4 °C i upp till 1 månad.
  2. Gör fungerande koncentrationer av kontroll- och stimuleringsmedia. Kontrollmedia: 5% BSA-media med fordonskontroll. Stimuleringsmedia: 5% BSA-media med 0,5 μM CL-316,243. Gör nya stimuleringsmedier för varje experiment.
  3. Värm mediet som ska användas till 37 °C. Märk en platta med 96 brunnar för medieinsamling.

2. Beredning av prov

  1. Utför cellodling enligt beskrivningen nedan. Utför allt cellarbete i en steril dragskåp för att minimera yttre kontaminering.
    1. Isolera och differentiera primära preadipocyter, som i73,74.
      1. Platta primära preadipocyter med hög densitet, såsom 1 x 105 celler / brunn i en 24-brunnsplatta i 1 ml / brunnsodlingsmedia (15% fetalt bovint serum (FBS) och 1x penicillin-streptomycin-glutamin i DMEM / F12).
      2. När cellerna når 100% sammanflöde, differentiera med 5 μM dexametason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 1 μg / ml insulin och 1 μM tiazolidindion (TZD) i odlingsmedier i 3 dagar. Byt sedan till odlingsmedia med 1 μg / ml insulin i minst 3 dagar för att odla lipiddroppar. Använd 1 ml / brunn media i 24-brunnsplattan.
      3. Byt odlingsmedium (1 ml/brunn) med insulin var 2:e eller 3:e dag. Cellerna kan hållas i media med insulin i upp till 2 veckor. Använd endast kulturer där differentieringsgraden är över 90% och är likartad mellan grupper för denna analys, eftersom minskad differentiering kan misstolkas som en minskning av lipolytisk hastighet.
      4. Odla cellerna i insulinfria medier i 24 timmar före mätning av lipolys.
        OBS: Insulin i media upprätthåller lipiddroppar, men hämmar också lipolys. Inkubation utan insulin i 24 timmar möjliggör fullständig lipolytisk aktivering utan förlust av lipiddroppvolym. I vissa system kan odlingstiden utan insulin behöva förkortas eller förlängas.
    2. Tvätta cellerna med DPBS en gång för att avlägsna kvarvarande serum från odlingsmediet.
      OBS: Detta protokoll inkluderar inte serumsvält, vilket kan aktivera lipolys. Serumsvält kan användas efter forskarens gottfinnande.
  2. Utför ex vivo-odling enligt beskrivningen nedan.
    1. Förbered en 6-brunnsplatta, med en brunn för varje vävnad som ska samlas in från varje mus. Placera 4 ml rumstemperatur DMEM i varje brunn som ska användas.
      OBS: BSA i samlingsmediet är inte nödvändigt.
    2. Bered en platta med 48 brunnar för lipolysanalysen, med en brunn för varje replikat. Placera 400 μl DMEM i rumstemperatur i varje brunn som ska användas. Använd två till fyra kontroll- och två till fyra stimulerade brunnar per vävnad per mus.
    3. Eutanisera musen genom cervikal dislokation under anestesi, med en sekundär metod såsom bilateral pneumotorax. Här använde vi en 32 g, 7 månader gammal kvinnlig C57BL / 6J-mus, matad med en 45% fettrik diet i 4 månader.
      OBS: Detta protokoll kan också användas för män, liksom andra stammar, dieter och åldrar.
    4. Spraya med 70% etanol och använd sax för att göra ett litet (~ 1 cm) lateralt snitt i mitten av bukhuden, dra isär huden genom att klämma på vardera sidan med tummen och pekfingret och vik den nedre bukhuden över för att avslöja de bakre subkutana depåerna. Leta reda på och ta bort den inguinala lymfkörteln och trubbigt dissekera den inguinala fettvävnaden omedelbart bakom inguinal lymfkörteln med pincett.
    5. För att samla den gonadala fettvävnaden, gör ett lateralt och ett vertikalt snitt i bukhinnan för att komma åt bukhålan. Håll gonadfettkudden med pincett och skär längs livmodern (eller epididymis för män) för att ta bort gonadfettvävnaden. Placera de uppsamlade depåerna i en 6-brunnsplatta.
    6. Ta bort vävnaden från brunnen, lägg på en silikonmatta och skär i 5 till 7 mg bitar med sax.
    7. Väg upp 25 till 30 mg (fem eller sex bitar) för varje analysbrunn och placera i en 48-brunns analysplatta. Torka vävnaden på en ren handduk innan du väger för att ta bort eventuella medier. Väg viktbåten efter avlägsnande av vävnaden och registrera vikten av eventuella rester kvar. Torka av viktbåten mellan proverna och tara igen vid behov. Använd en ny viktbåt för varje vävnad.
    8. När alla vävnadsprover har vägts, placera analysplattan med 48 brunnar i en 37 °C, 10% CO2-inkubator i 15 minuter.

3. Lipolysanalys

  1. Utför medieinsamling. Genomföra överföring av media och efterföljande provinsamling i en steril dragskåp för att minimera potentiell kontaminering från externa källor.
    1. Vid t = 0 avlägsnas mediet och 400 μl kontroll- eller stimuleringsmedium tillsätts per brunn och plattan placeras i en 37 °C, 10 % CO2-inkubator . För vävnadsodling ex vivo , ta försiktigt bort media med en pipett; Suge ska aldrig användas.
      OBS: Alternativt kan du förbereda en andra platta med kontroll- och stimuleringsmedia och överföra vävnaderna.
    2. Vid t = 1, 2, 3 och 4 timmar samlas 200 μl substrat, ersätts med 200 μl av lämpligt kontroll- eller stimuleringsmedium och analysplattan återförs till inkubatorn. Förvara uppsamlingsplattan vid 4 °C. För att bestämma FFA-buffertkapaciteten för BSA-mediet, använd en extra samling vid 24 timmar.
      OBS: Experimenten kan stoppas här, och de insamlade medierna kan lagras vid -20 °C.

4. FFA-kolorimetrisk analys

  1. Värm reagenserna till rumstemperatur och lös upp en flaska färgreagens A med en flaska lösningsmedel A och en flaska färgreagens B med en flaska lösningsmedel B. Från dagen för beredning används dessa reagenser bäst inom 1 vecka. Kasseras 1 månad efter beredning.
  2. Tina och blanda proverna.
  3. Skapa en FFA-standardkurva. Standardlösningen är 1 mM. Använd följande volym med reagenserna för standardkurvan: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 utspädning), 10 μL (1:4 utspädning), 10 μL (1:8 utspädning) och 10 μL vatten för maximalt intervall. För låga FFA-nivåer kan 10 μL av 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM och 0,05 mM standard vara mer tillämplig.
  4. Pipettstandarder och prover i en 96-brunns analysplatta. Rekommenderad provvolym är 10 μl. Inkludera tre brunnar med samma volym BSA-media som proverna för bakgrundskorrigering.
    Anmärkning: Om provkoncentrationerna faller utanför standardkurvan, upprepa testet och justera provvolymen till 2-25 μl.
  5. Tillsätt 150 μl reagens A till varje brunn och blanda. Undvik att generera bubblor. Poppa eventuella bubblor med en fin mätnål. Inkubera analysplattan vid 37 °C i 5 minuter.
  6. Avläs plattans absorbans vid 550 nm och 660 nm referens (avläsning A).
  7. Tillsätt 75 μl reagens B till varje brunn och blanda. Undvik att generera bubblor. Poppa eventuella bubblor med en fin mätnål. Inkubera analysplattan vid 37 °C i 5 minuter.
  8. Avläs plattans absorbans igen vid 550 nm och 660 nm referens (avläsning B).

5. Kolorimetrisk analys av glycerol

  1. Bered det fria glycerolreagenset med 36 ml ultrarent vatten och acklimatisera till rumstemperatur. Dessa reagens används bäst inom några veckor. Kasseras 2 månader efter beredning.
  2. Tina och blanda proverna.
  3. Skapa en glycerolstandardkurva genom att göra en sjupunkts, 2-faldig serieutspädning av glycerolstandardlösningen och ett vattenämne.
    Standardkurvan är relativt linjär upp till 25 μL 2,8 mM glycerol, men inte linjär vid högre koncentrationer.
  4. Pipettera 25 μL vardera av standard och prover i 96-brunnsanalysplattan. Inkludera tre brunnar med BSA-media för bakgrundskorrigering.
  5. Tillsätt 175 μl fritt glycerolreagens till varje brunn och blanda. Undvik att generera bubblor. Poppa eventuella bubblor med en fin mätnål. Inkubera analysplattan vid 37 °C i 5 minuter.
  6. Avläs plattans absorbans vid 540 nm.

6. Beräkning av lipolytisk hastighet

  1. Börja med värden för optisk densitet (OD). För glycerol, använd A540 OD-värden direkt. Beräkna OD för FFA-analysen enligt följande formel:
    OD = (Läsning B: A 550 - A 660) - (Läsning A: A550 - A660)
  2. Använd standardkurvan för att beräkna FFA- och glycerolnivåerna i de insamlade proverna. Plotta standard-OD-värdena på y-axeln och på x-axeln, använd standardkoncentrationer i förhållande till provvolymen (dvs. koncentrationen av brunnarna med 20 μL 1 mM FFA-standard på en platta med 10 μL prover är lika med 2 mM). Anpassa en linjär trendlinje:
    y = mx + b
  3. Inspektera standardkurvan visuellt och ta bort alla punkter utanför analysens linjära intervall. Beräkna provkoncentrationer med hjälp av ekvationen:
    Provkoncentration: x = (OD - b) ÷ m
  4. Justera och ompröva prover som faller utanför det linjära analysområdet. För att få den slutliga provkoncentrationen, subtrahera koncentrationen av bakgrundsbrunnarna som endast innehåller BSA-media från provernas koncentration.
  5. Beräkna mol FFA och glycerol som produceras av varje prov vid varje tidpunkt enligt formeln:
    Equation 1
    där C n = koncentration vid tiden t = n; Vt = total volym i brunnen; Vs = provinsamlingsvolym; och M n = mol producerade vid tiden t = n (när koncentrationerna är i mM och volymerna är i ml är utgången μMol).
    Till exempel vid olika tidpunkter:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2 + C3) Vs
    eller
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normalisera till vävnadsvikt genom att dividera med vävnadsvikten för varje prov i gram för att erhålla enheter av μmol / g. För odlade celler presenteras värden som μmol/brunn. Se till att cellantalet och differentieringseffektiviteten är jämförbara från brunn till brunn.
    OBS: Skillnader i proliferation eller differentieringseffektivitet kommer att komplicera tolkningen av resultat och kräver en annan normaliseringsmetod (t.ex. normalisering till protein; se diskussion).
  7. Beräkna lutningen på μmol/g som produceras (y-axeln) kontra tiden (x-axeln) för varje prov individuellt.
    1. I ett kalkylblad kan detta göras med funktionen =SLOPE(known_ys,known_xs). I en ny cell skriver du "= SLOPE" (använd sedan markören för att markera provglycerol- eller FFA-värdena i μmol / g och markera sedan motsvarande tidsvärden).
    2. Kontrollera dataens linjäritet. R2-värden är ett snabbt sätt att bestämma linjäriteten hos proverna. I ett kalkylblad kan detta göras med funktionen =RSQ(known_ys,known_xs), på samma sätt som beskrivs i steg 6.7.1, men den första inmatningen är =RSQ. Se till att R2-värdena är > 0,98; Lägre värden indikerar avvikelse från linjäritet. Detta kan bero på ett mät-/samplingsfel eller förlust av linjäritet.
      1. Ett annat sätt att testa linjäritet är att utföra en linjär regression för varje prov och plotta resterna. I ett statistiskt analysprogram genererar du en XY-tabell med ett enda Y-värde för varje tidpunkt. Välj Analysera > enkel linjär regression och markera rutan för Återstående diagram innan du trycker på OK. Det återstående diagrammet visas som ett nytt diagram.
  8. Använd FFA- och glycerolproduktionshastigheten (dvs. lutning [(μmol / g / h]) för varje prov som en individuell datapunkt för att utföra statistisk analys och plotta värden om olika lipolytiska förhållanden jämförs. Om lipolytiska hastigheter jämförs mellan genotyper, använd två eller tre prover per djur som tekniska replikat och använd genomsnittet för en datapunkt per djur, så att provstorleken är lika med antalet djur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi mätte den basala och stimulerade lipolytiska hastigheten för in vitro differentierade adipocyter. Primära preadipocyter från vit fettvävnad differentierades till adipocyter genom behandling av konfluenta celler med 5 μM dexametason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin och 1 μM troglitazon i 4 dagar, följt av ytterligare 3 dagars behandling med 1 μg/ml insulin. Cellerna inkuberades i media utan insulin i 24 timmar före lipolysanalysen. Vid tiden = 0h tvättades cellerna en gång med PBS, sedan tillsattes fenolrödfri DMEM med 2% BSA, innehållande antingen 10 μM CL-316,243 eller fordonskontroll, till varje brunn på 12-brunnsplattan. Vid tiden = 1 h, 2 h, 3 h och 4 h samlades 50% av media och ersattes med 2% BSA i fenolrött DMEM. FFA- och glycerolnivåerna mättes i det insamlade mediet och molen FFA, och glycerol som utsöndrades i media beräknades vid varje tidpunkt (figur 2A, B). FFA- och glycerolproduktionen var linjär för 4-timmarsanalysen, medR2-värden på 0,98 och högre. FFA-nivåerna på 4 timmar var något låga, vilket indikerar att lipolytiska hastigheter kan ha avtagit; Analys med och utan 4-timmarstidpunkten hade dock ingen signifikant inverkan på den beräknade lipolytiska hastigheten. Stimulerade lipolytiska frekvenser var signifikant högre än basala priser (figur 2C). Lipolytisk stimulering resulterade i produktion av FFA och glycerol vid ett nära 3: 1 molförhållande i alla insamlade prover, vilket kan förväntas från fullständig triglyceridlipolys utan signifikant återupptag eller retention (figur 2D). I de ostimulerade cellerna var förhållandet emellertid närmare 1, vilket tyder på en icke-lipolytisk källa till glycerol48,49,50.

Figure 2
Figur 2: Lipolytisk hastighet i differentierade primära adipocyter in vitro . Preadipocyter differentierades i en 12-brunnsplatta. Insulin avlägsnades från media 24 timmar före den lipolytiska analysen. Vid tid = 0 timmar stimulerades cellerna med 10 μM CL-316,243 (CL) eller behandlades med vehikel (V) kontrollmedia. Nmol av (A) FFA och (B) glycerol som produceras i varje brunn vid varje tidpunkt plottades över tiden och en linjär regressionslinje anpassades för varje enskild brunn. (C) Produktionstakt för FFA. (D) Graden av glycerolproduktion. Data representeras som medelvärde ± SEM. (E) Molförhållande av FFA:glycerol i det insamlade mediet vid varje tidpunkt. Statistisk analys i (C) och (D) utfördes med hjälp av en elevs t-test; effekten av CL var signifikant vid α = 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

I cellodling är monoskiktet av celler i direkt kontakt med mediet, medan i vävnader odlade ex vivo är celler i mitten inte i kontakt med mediet. Således, i ex vivo-kulturer, är FFA mer benägna att behållas i vävnaden. Större bitar av vävnad, som har ett lägre förhållande mellan yta och volym, uppvisar högre FFA-retention, vilket resulterar i lägre FFA: glycerolmolförhållanden (figur 3A). Med minskande vävnadsbitstorlek närmar sig molförhållandet för FFA: glycerol frigjort 3: 1 (figur 3A). Men vävnadsbitar kan också vara för små. Förutom utmaningen att arbeta med små bitar av fettvävnad uppvisar 1-2 mg bitar fettvävnad reducerade lipolytiska hastigheter, vilket tyder på en minskad livskraft och funktionalitet hos vävnaden (figur 3B, C). Även om det är tråkigt och tidskrävande att skära fettvävnad i bitar av konsekvent storlek och form, krävs det för att uppnå jämförbara och tillförlitliga resultat. Vi rekommenderar 5 till 10 mg bitar av fettvävnad, men konsistens är viktigast. Lipolytiska hastigheter kan fortfarande mätas reproducerbart i större vävnadsbitar, men det är viktigt att överväga återkopplingshämningen av lipolys av FFA 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figur 3: Effekt av vävnadsbitstorlek på FFA-frisättning och lipolytisk hastighet. Gonadal vit fettvävnad från en fettrik diet matad kvinnlig C57Bl / 6J mus samlades in och skars i bitar av varierande storlek. Alla brunnar innehöll totalt 25-30 mg fettvävnad; För 25 mg brunnarna var detta en bit vävnad; 10 mg brunnar hade tre bitar vävnad vardera av ~ 10 mg, 5 mg brunnarna innehöll fem eller sex bitar vävnad och 2 mg brunnar innehöll 13-16 bitar. Vid tid = 0 h stimulerades lipolys med 0,5 μM CL-316,243 (CL), eller kontrollbrunnarna behandlades med vehikel (V). Den beräknade lipolytiska hastigheten från prover som samlats in efter 1 h, 2 h och 3 h plottas för (A) FFA och (B) glycerol. (C) Molförhållande av FFA: glycerolproduktion i varje brunn. Data representeras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys i (A) och (B) utfördes med hjälp av en tvåvägs ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc-analys, α = 0,05. Effekten av CL var signifikant i alla prover. Inom de CL-behandlade proverna var frekvensen av FFA- och glycerolproduktion signifikant olika i alla parvisa jämförelser, förutom 10 mg kontra 5 mg-proverna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Den negativa effekten av FFA-retention kan observeras i 25 mg vävnadsbitar, som uppvisar lägre hastigheter av både FFA- och glycerolproduktion vid stimulering (figur 3B, C). Denna återkopplingshämning är också uppenbar när mediets FFA-bindningskapacitet är för låg (dvs. det finns inte tillräckligt med BSA i media). När BSA i media reducerades till 0,5%, minskade FFA-frisättningen mer än fyrfaldigt och glycerolfrisättningen minskade nästan dubbelt (figur 4A, B). Som en enkel tumregel bör mikromolära nivåer av FFA i media inte närma sig procentandelen BSA i media (dvs. FFA-nivåerna bör förbli under 5 mM FFA i 5% BSA-media och 0,5 mM i 0,5% BSA-media [på denna nivå finns 20: 3 molförhållande FFA: BSA]). För att testa den maximala BSA-buffertkapaciteten vid beredningen av BSA-medier, samla in media från ett 24-timmars stimulerat prov och mät koncentrationen av FFA (koncentrationen blir hög, så en lägre provvolym eller provutspädning rekommenderas). FFA-ackumuleringen i 5% BSA-mediet efter 24 timmars stimulering var cirka 5 mM, medan FFA-halten i 0,5% BSA-mediet endast var 0,6 mM (figur 4C). Om man tittar på FFA-koncentrationen i de insamlade medierna kan man se att 0,5% BSA-media FFA-bindningskapaciteten är överbelastad (figur 4D). Medan FFA-nivåerna i 5% BSA-media är mycket högre, överskrider de inte mediets buffertkapacitet (figur 4D). Helst bör FFA-koncentrationen i mediet förbli under ett 3: 1 FFA: BSA-molförhållande (dvs. 2,3 mM FFA i 5% [0,75 mM] BSA).

Figure 4
Figur 4: Otillräckliga BSA-nivåer resulterar i minskad skenbar lipolytisk frekvens. Gonadal vit fettvävnad från en fettrik diet matad kvinnlig C57Bl/6J mus samlades in och skars i ~ 5 mg bitar. Totalt 20-30 mg fettvävnad placerades i varje brunn. Vid tidpunkten = 0 timmar stimulerades lipolys med 0,5 μM CL-316,243 (CL), eller kontrollbrunnarna behandlades med vehikel (V) i antingen 5% BSA-media eller media innehållande endast 0,5% BSA. Den beräknade lipolytiska hastigheten från de prover som samlats in efter 4 timmar plottas för (A) FFA och (B) glycerol. Effekten av CL var signifikant i alla prover. Inom de CL-behandlade proverna var hastigheterna för både FFA- och glycerolproduktion signifikant olika mellan 5% och 0,5% BSA-medieförhållandena. (C) FFA-nivåer i media från de stimulerade brunnarna efter 24 h. (D) FFA-nivåer i proverna som samlats in vid 4 h. (E) FFA-standardkurvor med och utan olika preparat av 5% BSA i DMEM. Optisk densitet beräknad som (avläsning B: A 550 - A 660) - (läsning A: A550 - A660). F) Standardkurva för glycerol med och utan BSA. Optisk densitet är absorberande vid 540 nm (A540). OD-värden vid 5,6 mM var inte linjära och ingick därför inte i standardkurvan. (G) Hastighet för FFA-frisättning från kvinnlig gonadal fettvävnad med användning av olika typer av BSA i analysmediet. Data representeras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys i (A) och (B) utfördes med hjälp av en tvåvägs ANOVA med en Holm-Sidak post hoc-analys, * p-värde < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Det är viktigt att påpeka att vissa preparat av BSA innehåller FFA. Varje parti BSA bör testas för att säkerställa att FFA-innehållet är försumbart (observera att vissa BSA-preparat marknadsförs som FFA-fria). Även om det inte specifikt marknadsförs som FFA-fritt, innehåller BSA som används här inte detekterbara FFA. Vi testade analysmediet som innehåller FFA-fri BSA (Equitech Bio Inc, BAH66), BSA som används i experiment här (Sigma, A9418) och en råare (billigare) fraktion V BSA (Sigma, 810531). Den FFA-fria BSA och A9418 BSA producerade båda ingen bakgrundssignal eller ändrade standardkurvans lutning eller skärningspunkt; Standardkurvorna var överlagrade (figur 4E). Ingen påverkan av BSA DMEM observerades heller på glycerolstandardkurvan (figur 4F). Fraktionen V BSA, å andra sidan, producerade en bakgrundssignal i FFA-analysen, vilket motsvarade en FFA-koncentration på 0,3 mM (figur 4E). Denna bakgrund flyttade standardkurvan uppåt, men påverkade inte lutningen nämnvärt, vilket indikerar att bakgrundssubtraktion är tillräcklig. Vi utförde också ett stimulerat lipolysexperiment med användning av dessa tre olika typer av BSA och fann att efter bakgrundssubtraktion skilde sig den beräknade lipolyshastigheten inte mellan BSA-formuleringar (figur 4F). Detta är dock ofta inte fallet, särskilt med mindre rena BSA-preparat som lätt kan innehålla insulin eller andra komponenter som påverkar lipolyshastigheten. Varje parti BSA bör testas och valideras och användas konsekvent (dvs. prover analyserade med olika partier av BSA är inte jämförbara). En fullständig standardkurva med tillägg av BSA och DMEM bör utföras vid validering av varje parti BSA för att säkerställa att det inte innehåller något som stör enzymerna i de kolorimetriska analyserna.

Att ta seriella prover och ersätta volymen med nya medier hjälper till att sänka FFA-belastningen i media under hela experimentet. Vi mätte lipolytiska hastigheter i gonadfettvävnaden från en kvinnlig mus som matades med en fettrik diet i 4 månader. I detta experiment inkuberades 5-8 mg vävnadsbitar (totalvikt 25-30 mg) i 200 μL 5% BSA-media och 100 μL samlades in och ersattes vid 1 h, 2 h, 3 h och 4 h. FFA- och glycerolnivåer i de insamlade medierna mättes. Vid 3 timmar hade FFA-nivåerna i media nått riskzonen på 2,3 mM (figur 5A). Återkopplingshämning av lipolys föreslogs av avsaknaden av ökning av medias FFA- och glycerolnivåer vid 4 timmar (figur 5A,B). Efter beräkning av μmol FFA och glycerol som frigörs vid varje tidpunkt och anpassning av en linjär kurva är det uppenbart att den lipolytiska hastigheten börjar sjunka vid 4 timmar i de stimulerade proverna, medR2-värden så låga som 0,976 för FFA och 0,983 för glycerol (figur 5C,D). Om man tittar på restdiagrammet är det tydligt att 4 h-värdena ligger under den linjära trenden (dvs. resterna är negativa) (figur 5E, F). Exkludering av 4-timmarstidpunkten ökade R2-värdena till 0,997 och 0,998 och högre för FFA respektive glycerol. Inkludering av 4 timmars tidpunkt orsakar en liten men signifikant minskning av de beräknade FFA- och glycerolfrisättningshastigheterna (figur 5G, H).

Figure 5
Figur 5: Beräkning av linjär lipolytisk hastighet i fettvävnad ex vivo . Gonadal vit fettvävnad från en fettrik diet matad kvinnlig C57Bl/6J mus samlades in och skars i ~ 5 mg bitar. Totalt 20-30 mg fettvävnad placerades i varje brunn. Vid tid = 0 h stimulerades lipolys med 0,5 μM CL-316,243 (CL), eller kontrollbrunnarna behandlades med vehikel (V). Mediesamlingar utfördes vid 1 h, 2 h, 3 h och 4 h. (A) FFA och (B) glycerolnivåer i media. (C) FFA och (D) glycerolproduktion plottad över tiden. Restplattor för (E) FFA- och (F) glycerolproduktion över tid. Frisättningshastighet för (G) FFA och (H) glycerol, beräknad med och utan 4 timmars tidpunkt. (I) FFA-frisättning i kvinnlig gonadal fettvävnad. Nästan 50% av media förändrades vid 1 h, 2 h och 3 h. Mellan timmar samlade 15 minuters tidpunkter 2,75% av media utan ersättning. Data representeras som medelvärde ± SEM. Statistisk analys i (G) och (H) utfördes med hjälp av en tvåvägs ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc-analys, * p-värde < 0,05. Effekten av CL var signifikant i alla prover (p-värde < 0,05). Inom de CL-behandlade proverna var hastigheterna för både FFA- och glycerolproduktion signifikant olika mellan beräkningar med och utan 4-timmarstidpunkten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Till skillnad från tidigare protokoll använder detta protokoll flera tidpunkter för att bestämma den lipolytiska hastigheten, vilket minskar mätfelet och ger intern validering att den linjära lipolyshastigheten mäts. För att upprätthålla lipolys i den linjära fasen vid varje uppsamlingspunkt samlas 50% av mediet upp och ersätts. Eftersom linjäritet är kritisk, ville vi se till att tillsatsen av färska medier inte orsakade en explosion av lipolys vid varje tillsats. För att validera linjäriteten mellan tidpunkter tog vi ett mycket litet prov (2,75%) var 15: e minut mellan timpunkterna från 1 h till 3 h, utan ersättning. Vid 1 h, 2 h och 3 h gjordes den normala 50% provinsamlingen och ersattes. Hastigheten för FFA-frisättning var linjär mellan de vanliga tidpunkterna, vilket indikerar att det inte fanns en explosion av lipolys med varje tillsats av färska medier (figur 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här tillhandahåller vi ett grundläggande protokoll för att mäta lipolyshastigheten i adipocyter och ex vivo fettvävnad. För att kvantifiera lipolys är det viktigt att mäta lipolytisk hastighet i den linjära fasen. Vi använder en seriell provtagningsteknik, där en stor del av media samlas in och ersätts med färska medier med jämna mellanrum. Denna semikonservativa metod möjliggör tillsats av färsk BSA med FFA-buffertkapacitet och fördröjer återkopplingshämning, vilket förlänger varaktigheten av linjär lipolys. Denna experimentella design försöker rekapitulera vaskulariseringen av fettvävnad in vivo, vilket ger färskt albumin för att binda frisatta FFAs75. Detta protokoll optimerades för att mäta lipolys i murin ex vivo vit fettvävnad och primära preadipocyter för inguinal fettvävnad differentierade in vitro. Protokollet kan sannolikt optimeras för att fungera bra i bruna och beige fettdepåer, liksom fettvävnad från andra organismer och odödliggjorda cellinjer med hög adipogenic potential. Protokollet möjliggör flexibilitet i ålder, kön och kost hos mössen före insamling av fettvävnad för ex vivo-analyser . Vissa manipuleringar, såsom fasta, kan påverka den basala lipolytiska hastigheten, medan andra ingrepp som dietinducerad fetma också påverkar graden av stimulerad lipolys.

Protokollet måste optimeras för varje experimentellt system, beroende på om lipolytiska hastigheter är högre eller lägre. För att validera linjäriteten rekommenderar vi att du beräknar R2-värdena och tittar på residualdiagrammet. R2-värdena bör ligga mycket nära 1. Vid utvärdering av restdiagrammet bör man vara på utkik efter negativa restvärden vid senare tidpunkter, eftersom dessa indikerar att lipolytiska räntor minskar och linjäriteten går förlorad. Exempel på sådana restytor visas i figur 5E,F. Eliminering av 4 h-tidpunkterna ger i detta fall en mer exakt beräkning av den linjära lipolytiska hastigheten och förbättrarR2-värdena. Eftersom hastigheten beräknas från flera tidpunkter är den dock relativt robust, och inkludering av en sådan tidpunkt har endast en liten inverkan påR2-värdena och den beräknade lipolyshastigheten. Om en enda tidpunkt används för att beräkna den lipolytiska hastigheten kan data lättare skevas.

Det sätt på vilket data normaliseras kan också påverka de relativa resultaten mellan proverna. Här rekommenderar vi att normalisera ex vivo-vävnaden till vävnadsvikten och de primära preadipocyterna differentierade in vitro per brunn. Dessa normaliseringstekniker kanske dock inte är lämpliga för alla experimentella system. Viktigt, om spridningshastigheten eller differentieringseffektiviteten skiljer sig mellan grupper, är normalisering per brunn inte lämplig. Alternativa normaliseringstekniker inkluderar protein, lipid och DNA. Varje normaliseringsmetod har sina fördelar och nackdelar. Vävnadsvikt och väl normalisering är enkel och okomplicerad. Skillnader i adipocytstorlek kan innebära att mager fettvävnad innehåller många fler adipocyter per gram än fet fettvävnad, medan skillnader i differentieringseffektivitet kan resultera i skillnader i antalet adipocyter per brunn. Lipider kan extraheras med organiska lösningsmedel (t.ex. 2:1 kloroform:metanol [v/v]) och triglyceridinnehåll mätt med hjälp av ett kolorimetriskt reagens. Medan normalisering till lipidinnehåll inte är en traditionellt använd metod, är lipiddropparna trots allt organellen som genomgår lipolys, och denna normaliseringsmetod är specifik för adipocyter, vilket kan vara användbart när differentieringshastigheterna skiljer sig mellan celler. Efter lipidextraktion kan 0,1-0,3 N NaOH användas för att extrahera protein, som sedan kan analyseras med Bradford eller BCA-proteinanalys68. Alternativt kan proverna homogeniseras i lysbuffert och lipidfraktionen avlägsnas genom centrifugering70. Observera att lipidkontaminering kommer att störa proteinanalyserna. Om protein ska användas för normalisering måste cellerna tvättas noggrant (minst tre gånger) för att avlägsna BSA från analysmediet. Ibland fäster differentierade adipocyter inte bra på plattan och tolererar inte de tre tvättar som krävs för att avlägsna överskott av BSA. Normalisering till DNA möjliggör normalisering till cellnummer och kan utföras med ett kommersiellt DNA-extraktionskit, följt av kvantifiering av totalt DNA genom absorbans eller PCR-analys i realtid av genkopienummer. Alternativt, i pläterade celler, kan DAPI-färgning följt av avbildning användas för att räkna kärnor och normalisera till cellantal. Vid normalisering med cellnummer eller protein är det viktigt att överväga icke-adipocytceller i provet. Fettvävnad innehåller också immun- och endotelceller; I fet fettvävnad kan inflammation och hypertrofi resultera i så få som 1 av 10 kärnor som kommer från mogna adipocyter. Adipocyter bidrar emellertid fortfarande till majoriteten av vävnadens massa och lipidinnehåll. För in vitro-differentierade preadipocyter påverkar differentieringseffektiviteten den relativa andelen mogna adipocyter; När så är fallet är normalisering komplicerad. Helst bör differentieringseffektiviteten optimeras innan cellerna används för en lipolysanalys. Om det inte är möjligt rekommenderas normalisering av lipidinnehållet om lipiddroppvolymen är likartad mellan differentierade adipocyter. Jämförelse av lipolytiska hastigheter över adipocytkulturer med ojämn differentiering kan leda till felaktiga slutsatser om lipolys när den drivande faktorn faktiskt är adipogenesis; Detta är en begränsning av protokollet.

Långkedjiga FFAs återkopplingshämmande lipolys 63,64,65,66,67. FFA ackumuleras när de inte är tillräckligt avskilda i media. Mycket av felsökningen i samband med optimering av mätningen av lipolys är relaterad till att minimera FFA-retention. Beräkning av molförhållandet mellan FFA: glycerolfrisättning i media hjälper till att identifiera problem relaterade till FFA-retention. Om molförhållandet är 3: 1 för FFA: glycerol, frigörs alla produkter av lipolys och fångas i media, medan ett förhållande under 2: 1 är anledning till oro. En viktig faktor för ex vivo-analyser är storleken på fettvävnadsbiten. Större bitar av vävnad har ett lägre förhållande mellan yta och volym och är därför mer benägna att behålla FFA och uppvisa reducerade lipolytiska hastigheter som en följd (figur 4A, B). Med detta i åtanke är det viktigt att skära fettvävnaden för varje prov i bitar av jämn storlek och form. För att underlätta FFA-sekvestrering i media är det också viktigt att se till att media innehåller tillräckligt med BSA för att binda den frisläppta FFA. Medias FFA-buffertkapacitet kan ökas genom att öka koncentrationen av BSA eller öka medievolymen. Det är lika effektivt att öka insamlingsvolymen eller frekvensen. Om man observerar höga lipolytiska hastigheter, men FFA: glycerolförhållanden under 2: 1, rekommenderar vi att öka insamlingsfrekvensen till var 30: e minut och stoppa analysen vid 2,5 timmar.

Protokollet som tillhandahålls här är optimerat för mus ex vivo vit fettvävnad och primära preadipocyter differentierade in vitro, som båda är mycket lipolytiska. Analysen måste optimeras för att mäta lipolys i andra system, eller om skillnader i den relativt låga basala lipolyshastigheten är av särskilt intresse. Till exempel har 3T3-L1-adipocyter lägre lipolytisk aktivitet32. När den lipolytiska hastigheten är låg bör inkubationsvolymen minskas (dvs. istället för 400 μL per brunn i en 24-brunnsplatta bör 200 μL i en 24-brunnsplatta användas, eller 300 μL i en 12-brunnsplatta och 100-150 μL uppsamlad per tidpunkt. Insamlingsvolymen bör inte sjunka under 100 μl, eftersom större provvolymer krävs för att noggrant mäta låga FFA- och glycerolnivåer. För att analysera glycerol med 50 μl media per prov bör det fria glycerolreagenset lösas i 31 ml vatten och 150 μl reagens användas med 50 μl prov i varje brunn. FFA-nivåer kan mätas med 25 μL prov per brunn, kanske mer, så länge linjäriteten bibehålls. Tidpunkter kan också förlängas för att öka signalen. Vid analys av lipolytiska hastigheter från andra celler än vita adipocyter bör skillnader i cellulär metabolism beaktas. Till exempel uttrycker bruna och beige adipocyter mycket högre nivåer av glycerolkinas och kan därmed behålla glycerolfrisättning genom lipolys76,77. Dessa metaboliskt aktiva celler kan också kunna kanalisera frisatta fettsyror till kataboliska eller syntetiska vägar utan frisättning i media. FFA:s och glycerolens metaboliska öde i den specifika celltyp som analyseras måste beaktas vid tolkning av resultaten av en lipolysanalys, särskilt i en annan celltyp än vita adipocyter. Lipolysanalyser i andra celltyper måste optimeras och valideras.

Detta protokoll är utformat för att utvärdera skillnader i lipolytisk hastighet i musmodeller. Primära preadipocyter differentierade in vitro är ett användbart verktyg för att undersöka cellautonoma effekter av genetiska manipulationer eller farmakologiska behandlingar i adipocyter. Fettvävnad innehåller å andra sidan andra celltyper, inklusive immunceller. Effekten av fettvävnadens immunceller vid reglering av lipolys är viktigt att tänka på vid bedömning av lipolys i hela vävnaden. Odlade adipocytlipolysmodeller kan kringgå immuncellernas potentiella komplicerande påverkan och möjliggöra en grundlig undersökning av de specifika celltyperna, medan fettvävnadsexplantat möjliggör en mer robust jämförelse med in vivo-miljön . Dessutom kan ex vivo-analysen användas för att undersöka lipolytiska hastigheter i olika fettdepåer. I dessa system stimuleras lipolys av föreningar såsom β-adrenerga receptoragonister, så eventuella förändringar i sympatisk ton som kan påverka in vivo-musmodellen kommer inte att observeras. In vivo-mätning av lipolys kompliceras av dynamiken i FFA och glycerolfrisättning och upptag i olika vävnader i hela kroppen. Serumnivåerna av FFA och glycerol vid en given tidpunkt utgör balansen mellan utsöndring och upptag, och det bör inte antas att förändringar i serumnivåerna av FFA och glycerol enbart beror på fettvävnadslipolys. Fasteinducerad lipolys påverkas av sympatisk ton, men ger inte snabba och robusta förändringar i serum FFA eller glycerolnivåer, vilket gör det svårt att tolka förändringar i fastande serumnivåer av FFA och glycerol. Lipolys in vivo kan stimuleras med hjälp av en β-3-adrenerg receptoragonist, såsom CL-316,243, och ökat serum FFA och glycerol kan detekteras inom 20 minuter efter stimulering. Lipolytiska tester in vivo bör omfatta både baslinjemätningar av serum FFA och glycerol samt en vehikelkontroll. På detta sätt kan den stimuleringsspecifika förändringen i serum FFA och glycerolnivåer bestämmas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health-bidraget R01DK126944 till S.M.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193
Mätning av lipolyshastigheten i <em>ex vivo</em> murin fettvävnad och primära preadipocyter differentierade <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter