使用多重光散射检查不同提取方法获得的余 甘子 L.提取物的稳定性

Summary

本文介绍了一种基于多重光散射技术的稳定性评价方法，用于评价中药提取物的稳定性。

Abstract

中药提取中间体是制备过程中的关键中间体，其稳定性对最终产品的有效性和质量有重要影响。然而，现有的稳定性评价方法往往费时费力，需要长期观察和复杂设备（如高效液相色谱）的操作，并且难以获得更多关于系统不稳定性的物理信息。因此，迫切需要为中药建立快速准确的稳定性分析技术。多重光散射是一种前沿的分析方法，可以在不改变样品性质或状态或使用有机试剂的情况下，以环保的方式准确快速地评估中药的稳定性。

在这项工作中，使用多次光散射的精确扫描数据，本协议快速获得了层厚度、颗粒迁移速度和平均粒径随时间的变化曲线。这使得能够精确识别导致系统早期不稳定的机制和关键特征。值得注意的是，通过系统稳定性的详细定量，可以大大缩短提取过程的研究周期，这也允许快速、准确和深入地分析各种提取过程对 余甘子 L稳定性的影响。

Introduction

在中药（TCM）的制造中，中药提取中间体和相关液体制剂的稳定性一直是检查的重点¹.医药产品的临床疗效，特别是以多酚为主要活性成分的药物，由于显着的稳定性问题而受到影响^2,3。Sanajon口服液和诺迪康口服液是本期典型案例⁴。因此，学习如何使用高效的工具快速准确地评估和优化中药生产过程中液体中间体的稳定性至关重要。余甘子（PE）是一种在东南亚广泛分布的药用植物，被认为具有良好的抗氧化特性⁵，以及抗炎⁶，抗菌⁷和抗肿瘤作用⁸。在热提取过程中，PE中的单^{宁剧烈变化}9。在高温催化下，这些单宁迅速水解生成没食子酸和鞣花酸等分子，由于其溶解度差导致不稳定或^沉淀1。目前用于评估TCM稳定性的方法，例如加速测试或离心，通常很麻烦⁴，这限制了相关制备过程的进一步发展。

基于多重光散射（MLS）原理，建立了PEF提取物的快速稳定性评价方法，并分析了其失稳机理。MLS是一种基于近红外光源扫描的测量方法。任何解决方案系统的变化都会导致光强度的变化。入射光在被样品颗粒吸收或穿透时被散射。系统记录通过样品时的透射光信号;如果样品的透光率差，系统会记录反向散射光信号。与目视观察相比，这样可以节省大量时间¹ ，可以快速准确地详细分析失稳现象，从而为指导提取过程的优化提供更多有用的信息。

Protocol

1. 提取物制备

1. 准确称取适量的PE，并加入10倍（重量）的去离子水进行回流提取。
2. 称重后，将五个样品用于回流提取0小时（E1），0.5小时（E2），1小时（E3），1.5小时（E4）和2小时（E5）。
3. 提取后，将样品冷却至室温，并称重以弥补损失的重量，以确保与提取前的重量一致。
4. 将样品以8,581× g 离心10分钟，以确保从样品溶液中去除不溶性物质和草药残留物。
5. 使用移液管将 20 mL 样品溶液添加到样品瓶中，以确保每次添加的溶液处于相同的高度。
   注意：避免样品瓶扫描部分的污染，如指纹，确保样品瓶干净，并检查瓶表面是否有可见的划痕。添加样品溶液时，注意不要溢出或溅到样品瓶上，并确保每个瓶子中的液位处于相同的高度。

2. 仪器操作

1. 打开MLS检测仪器，并加热30分钟。
2. 单击顶部菜单中的“ 创建 文件”按钮（或单击 “文件”|”新建 文件函数）创建新的测试文件。
3. 单击顶部菜单中的显示 Turbiscan实验室 温度按钮，将仪器目标温度设置为25°C。
   注意：仪器的设定温度必须高于室温;否则，样品温度将受到室温的影响。
4. 单击顶部菜单中 的程序扫描 以进入 设置分析 程序。将 程序添加到列表中，并在 任务栏中添加 5分钟作为周期， 扫描分析序列48小时 ，并将 平衡时间 设置为 20分钟。为所有后续测量选择此分析程序。
5. 将准备好的样品瓶移入MLS检测系统。设置程序后，单击 “开始”开始 测量。
   注意：装入样品时注意不要摇晃玻璃瓶。只有在样品温度和设定温度平衡后才能开始测量。

3.多重光散射分析程序设置

1. 数据采集完成后，点击计算参数列表，设置光学参数，计算稳定指数（SI）、粒径、粒子迁移速度。
2. 光学参数设置如下：连续相光透射强度（T₀）为99.99%（水），分散相折射率（np）为1.36，连续相折射率（nf）为1.33。

Representative Results

图1显示了多光测量的原理和收集结果的含义。在MLS光谱结果（图2）中，横坐标是样品池的高度，纵坐标是透射（T%）和反向散射（BS%）强度。通过计算MLS光谱结果，系统可以获得测量期间样品关键物理参数的变化，包括δ透射平均值（ΔT）（图3A）、光子自由程（图3B）、SI（图3C）和粒径（图3D）).随着测量时间的延长，稳定提取物的MLS光谱波动很小或根本没有波动，其物理参数（包括ΔT、光子自由程和粒径）趋于稳定。

典型的样品不稳定结果如图2A，C-E所示。稳定样品的光谱结果在所有扫描时间都趋于一致，如图2B所示，这是稳定样品的典型特征。为了进一步量化稳定性参数，可以使用SI进行评估。当前协议允许基于SI（图3C）的不同提取方法快速识别稳定性并分析不稳定的机制。应该注意的是，较低的SI值与更好的稳定性相关。如果在扫描周期内SI为<10，则认为样品稳定。通过比较SI值，可以准确区分5个样品的稳定性，并获得相关的稳定性特征谱（图4）。颗粒迁移速率（表1）结合上述参数可以进一步深入了解样品的不稳定机制。

图1：MLS的分析原理。 MLS使用脉冲近红外光作为光源（波长：880nm），两个同步光学检测器分别检测穿过样品的透射光（T，距离入射辐射0°，透射传感器）和反向散射光（BS，距离入射辐射135°，反向散射检测器）。光源、透射光检测仪和背散射光检测仪构成测量探头。从样品池底部到顶部的测量包括一次扫描。样品中的任何不稳定性都会对 T 和 BS 信号强度产生轻微影响。记录和分析这种影响，以表征各种不稳定现象，包括絮凝、分层和沉降⁴.通过多次扫描结果的计算，可以准确分析失稳初期溶液体系失稳的机理和速度，以及层厚（沉积层、浮层、澄清层）与时间的关系曲线，以及颗粒迁移速度和粒径随时间的关系曲线， 可以获得。缩写：MLS = 多个光散射。 请点击此处查看此图的大图。

图2：使用不同提取方法的PE提取物的MLS光谱（透射和反向散射）。 （A-E）E1-E5的MLS光谱。从光谱数据可以大致推断，（B）E2样品波动较小，表明样品更稳定，而（A）E1可能由于透射光整体下降而出现浑浊。（中欧）E3-E5样品相当不稳定，不同高度样品的光谱数据不同，表明后期发生分层。缩写：MLS = 多重光散射，PE = 余甘子 L.，EN = 通过方法 N 获得的提取物。

图3：MLS光谱分析结果 。 （A）随着时间的流逝， T 值变高，样品更不稳定。对于E3和E4，ΔT 水平最终恢复到前期水平，表明这些提取物中发生了聚集和沉淀。E5的ΔT 在浊化后仍处于较低水平，表明E5可能已经有大量沉降。（B）光子自由程的趋势可以反映样品透射光的变化。（C）各种提取物的稳定性随时间连续波动，E2>E1>E5>E3>E4是贮藏过程中的稳定性顺序。（D）粒径的动态变化可以揭示样品中颗粒的聚集。结果表明，所有样品的粒径在8-20 h内变化较大，E3和E5的粒径甚至超过了测量范围。因此，该阶段是样品中分子或颗粒不稳定聚集体形成的关键阶段。类似地，在最后阶段，随着颗粒开始成核并继续聚集，最终观察到在足够的颗粒形成大团聚物并沉淀后粒径减小。 请点击此处查看此图的大图。

图4：通过不同提取方法获得的PE提取物的不稳定性。 结果需要时间，因为横坐标和颜色表示透射光或背散射光的强度。结果可以直接反映样品在不同时间点和高度下浑浊和分层的真实情况。每个结果顶部的色度带表示对应于不同颜色的光强度值，其中蓝色部分表示 T%，棕色部分表示 BS%。（A）E1的 T%在16 h后开始下降，表明样品浑浊，整个过程没有分层或沉淀。（B）E2的 T%在整个测量期间保持一致，表明样品是稳定的。（C）E3在16 h时浑浊，20 h时其 BS%突然增加，表明样品中的颗粒在当时聚集、分层和沉淀。（D）这里的结果与（C）中的结果相似。（E）E5在20 h后经历了严重的分层，一直持续到测量结束。 请点击此处查看此图的大图。

测量	计算区	迁移速率（毫米/小时）
E1	0-24小时	1.56
E2	0-24小时	0.005
E3	0-24小时	1.476
E4	0-19小时	2.732
E5	0-24小时	1.377

表1：颗粒迁移速率结果。 在结果中，颗粒迁移速率可以看作是颗粒降水速率，可以在一定程度上反映样品的稳定性。迁移率越高表示稳定性越差。从结果可以看出，迁移速率排名为E4>E1>E3>E5>E2，此顺序与稳定性指数 SI的结果略有不同。这是因为该结果反映了测量期间样品中颗粒的平均迁移速率，而不是样品快速沉淀期间的颗粒迁移速率。

Discussion

快速、准确地评估中药稳定性一直是中药研究的重点。本研究采用近红外无损技术分析了样品的稳定性和不稳定性机理，为指导提取工艺的改进提供更多有用的信息。

在该协议中，重要的稳定性参数是基于准确的MLS扫描数据计算的。MLS扫描可以实时采集样品的透射率（T%）和反向散射（BS%），并计算稳定性指数（SI）、粒径、粒子迁移速度和其他重要的物理参数。计算公式由公式（1）⁴给出：

TSI = （1）

其中 x i 是每分钟测量的平均传输率，x _T 是平均 x _{i，x T} = （x ₁ + x ₂ + ...x_i + x_i+1 ... + x n）/n，n 是扫描次数。SI是反映样品稳定性的重要参数，SI值的上升表示稳定性的降低。SI包括所有用于计算的测量数据，这意味着它可用于预测和评估样品在短期内的稳定性。

粒度计算基于比尔-朗伯定律。计算公式由公式（2）给出：

T（l，ri） = T₀ ， l（d，φ） = （2）

其中 ri 是电池的内径， T₀ 是连续相的透射光强度。根据实测透射光强度（T），颗粒体积分数（φ），以及设定的参数，可以计算出颗粒尺寸。

沉降速率使用公式（3）计算：

（三）

V是颗粒迁移速率（ms⁻¹），ρ_c是连续相密度（kgm−3），ρp是颗粒密度（kgm−³），g是重力常数（9.81ms⁻²），d是平均粒径（μm），v是连续相粘度（cP_{），是体积}百分比。

在用热萃取过程中，PE中大量可水解的单宁水解，释放出不溶性糖苷元鞣花酸。由于鞣花酸是一种平面非极性分子，由于疏水相互作用而发生分子间聚集和沉淀，^{这是溶液中}沉淀的主要原因1。随着提取时间的延长，形成更多的鞣花酸，导致样品稳定性差，相应样品的澄清时间缩短。 这在图4的结果中得到了很好的反映。

基于上述计算结果，可以得出结论，组分或颗粒聚集引起的沉淀在E3-E5样品中很明显，是PE萃取液不稳定机理的主要来源。由于多糖在提取过程中溶解，E2相对稳定，因为其高粘度¹⁰阻碍了沉淀过程。然而，随着提取期的延长，产生了大量的不溶性成分，如鞣花酸，难以保持稳态。总体而言，加速的不稳定性始于~12 h，提取持续时间与稳定性呈负相关，这对于工艺优化至关重要。

MLS方法相对于现有方法的意义如下。首先，测量结果更加准确和真实，因为该方法使用简单，不需要样品预处理，并且无需接触样品即可进行测量。即使是高浓度的样品也不需要任何稀释。其次，MLS具有很高的灵敏度。基于颗粒浓度和大小的变化速度可以在分散在液体制剂中的颗粒变化开始时检测到。因此，与目视观察相比，MLS 的时间效率提高了 ~200 倍。

由于温度的变化会影响系统的散射光强度，因此应强调的是，安装后样品温度应保持恒定，这需要平衡时间。此外，必须去除干扰元素（如药材残留物），以适当评估提取物的稳定性。最后，必须在测试之前精确测量物理特性，以准确确定物理参数，例如粒径和光子自由程。

此方法有几个限制。例如，长期储存产生的氧化会导致萃取液突然变色，这可能会影响沉淀评估和聚集行为。当需要平行样品时，保证某些样品的一致性可能具有挑战性，因为无法一次测量多个样品。该技术所需的设备投资相对昂贵，这是其应用和推广的主要障碍。

未来，我们相信该方法将在药物制剂领域做出突出贡献，特别是在分散和体外溶出的评估方面。它可用于研究脂质体、纳米颗粒和原位凝胶等新型药物递送系统，并且由于其更有效、更快速、更简单和更全面的优点，该方法可以大大缩短研究周期^11,12。此外，可以实现基于大量药物不稳定数据的稳定性预测模型。这项技术将来可以与其他检测技术相结合和增强，这可能有助于药物研究和开发。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com