Anvendelse af flere lysspredninger til undersøgelse af stabiliteten af Phyllanthus emblica L. Ekstrakter opnået med forskellige ekstraktionsmetoder

Summary

Her introducerer vi en stabilitetsevalueringsmetode baseret på flere lysspredningsteknologier til evaluering af stabiliteten af traditionelle kinesiske medicinekstrakter.

Abstract

Ekstraktionsmellemproduktet i traditionel kinesisk medicin er nøglemellemproduktet i fremstillingsprocessen, og dets stabilitet har en vigtig indvirkning på slutproduktets effektivitet og kvalitet. Imidlertid er eksisterende stabilitetsevalueringsmetoder ofte tidskrævende og arbejdskrævende, hvilket kræver langsigtet observation og drift af komplekst udstyr (såsom højtydende væskekromatografi), og det er vanskeligt at få mere fysisk information om systemets ustabilitet. Derfor er der et presserende behov for at etablere en hurtig og præcis stabilitetsanalyseteknologi til traditionel kinesisk medicin. Multipel lysspredning er en banebrydende analysemetode, der nøjagtigt og hurtigt kan evaluere stabiliteten af traditionelle kinesiske lægemidler på en miljøvenlig måde uden at ændre prøvens art eller tilstand eller bruge organiske reagenser.

I dette arbejde, ved hjælp af de præcise scanningsdata for flere lysspredninger, erhvervede den nuværende protokol hurtigt variationskurverne for lagtykkelse, partikelmigrationshastighed og gennemsnitlig partikelstørrelse over tid. Dette muliggjorde en præcis identifikation af mekanismen og afgørende egenskaber, der forårsagede systemets ustabilitet i dets tidlige stadier. Det skal bemærkes, at forskningsperioden for ekstraktionsprocessen kan forkortes betydeligt ved den detaljerede kvantificering af systemstabiliteten, hvilket også giver mulighed for en hurtig, præcis og dybdegående analyse af virkningerne af forskellige ekstraktionsprocesser på stabiliteten af Phyllanthus emblica L.

Introduction

Ved fremstilling af traditionel kinesisk medicin (TCM) har stabiliteten af TCM-ekstraktionsmellemprodukter og relaterede flydende præparater altid været fokus for inspektion¹. Den kliniske virkning af lægemidler, især med polyfenoler som det primære aktive stof, lider under betydelige stabilitetsproblemer ^2,3. Sanajon oral væske og Nuodikang oral væske er eksempler på typiske tilfælde af dette problem⁴. Derfor er det afgørende at lære at bruge effektive værktøjer til hurtigt og præcist at evaluere og optimere stabiliteten af flydende mellemprodukter i TCM-produktionsprocessen. Phyllanthus emblica L. (PE), en udbredt lægeplante i Sydøstasien, menes at have gode antioxidantegenskaber⁵, såvel som antiinflammatoriske⁶, antibakterielle⁷ og antitumorhandlinger⁸. Under den termiske ekstraktionsprocedure transformeres tanninerne i PE voldsomt⁹. Under katalyse med høje temperaturer hydrolyserer disse tanniner hurtigt for at producere molekyler som gallinsyre og ellaginsyre, hvilket fører til ustabilitet eller nedbør på grund af deres dårlige opløselighed¹. De nuværende metoder til evaluering af TCM-stabilitet, såsom accelereret test eller centrifugering, er normalt besværlige⁴, hvilket begrænser den videre udvikling af relevante forberedelsesprocesser.

Baseret på princippet om multipel lysspredning (MLS) etablerede vi en hurtig stabilitetsevalueringsmetode for PEF-ekstrakter og analyserede ustabilitetsmekanismen. MLS er en målemetode baseret på scanning af nær-infrarøde lyskilder. Enhver ændring af løsningssystemet resulterer i en ændring i lysintensiteten. Det indfaldende lys spredes, når det absorberes eller gennemtrænges af partiklerne i prøven. Systemet registrerer transmissionslyssignalet, når det passerer gennem prøven; Hvis prøvens lystransmission er dårlig, registrerer systemet tilbagespredningslyssignalet. Sammenlignet med visuel observation kan dette spare meget tid¹ og kan hurtigt og præcist analysere ustabilitetsfænomenet i detaljer og dermed give mere nyttige oplysninger til styring af optimeringen af ekstraktionsprocessen.

Protocol

1. Uddrag forberedelse

1. En passende mængde PE vejes nøjagtigt, og der tilsættes 10x (vægt) deioniseret vand til tilbagesvalingsekstraktion.
2. Der indstilles fem prøver til tilbagesvalingsekstraktion i 0 timer (E1), 0,5 timer (E2), 1 time (E3), 1,5 timer (E4) og 2 timer (E5) efter vejning.
3. Efter ekstraktionen afkøles prøverne til stuetemperatur og vejes for at kompensere for den tabte vægt for at sikre overensstemmelse med præekstraktionsvægtene.
4. Prøverne centrifugeres ved 8,581 × g i 10 minutter for at sikre, at uopløseligt materiale og drogerester fjernes fra prøveopløsningen.
5. Brug en pipette til at tilsætte 20 ml prøveopløsning i prøveflasken for at sikre, at den opløsning, der tilsættes hver gang, er i samme højde.
   BEMÆRK: Undgå kontaminering, såsom fingeraftryk, på scanningsdelen af prøveflasken, sørg for, at prøveflasken er ren, og kontroller, om der er synlige ridser på flaskens overflade. Når du tilsætter prøveopløsningen, skal du passe på ikke at spilde eller sprøjte på prøveflasken, og sørg for, at væskeniveauet er i samme højde i hver flaske.

2. Betjening af instrumentet

1. Tænd MLS-registreringsinstrumentet, og varm det op i 30 minutter.
2. Klik på knappen Opret fil i topmenuen (eller klik på knappen Filer | Ny filfunktion ) for at oprette en ny testfil.
3. Klik på knappen Vis Turbiscan Lab-temperatur i topmenuen for at indstille instrumentets måltemperatur til 25 °C.
   BEMÆRK: Instrumentets indstillede temperatur skal være højere end stuetemperaturen; Ellers påvirkes prøvetemperaturen af stuetemperaturen.
4. Klik på Programscanning i topmenuen for at åbne opsætningsanalyseprogrammet. Føj programmet til listen, og tilføj 5 min som en cyklus på proceslinjen, scan i 48 timer til analysesekvensen, og indstil balancetiden til 20 min. Vælg dette analyseprogram for alle efterfølgende målinger.
5. Flyt den forberedte prøveflaske ind i MLS-detekteringssystemet. Når du har konfigureret programmet, skal du klikke på Start for at starte målingen.
   BEMÆRK: Pas på ikke at ryste glasflasken, når du lægger prøven i. Målingen kan først startes, når prøvetemperaturen og indstillingstemperaturen er afbalanceret.

3. Programindstilling til analyse af flere lysspredninger

1. Efter dataindsamlingen skal du klikke på listen over beregningsparametre for at indstille de optiske parametre til beregning af stabilitetsindeks (SI), partikelstørrelse og partikelmigrationshastighed.
2. Indstil de optiske parametre som følger: den kontinuerlige fase lystransmissionsintensitet (T₀) som 99,99% (vand), det dispergerede fasebrydningsindeks (np) som 1,36 og det kontinuerlige fasebrydningsindeks (nf) som 1,33.

Representative Results

Figur 1 viser princippet om multipel lysmåling og betydningen af de indsamlede resultater. I MLS-spektreresultaterne (figur 2) var abscissen prøvecellens højde, og ordinaten var transmissionen (T%) og tilbagespredningsintensiteten (BS%). Ved at beregne MLS-spektreresultaterne kan systemet opnå ændringer i prøvens vigtigste fysiske parametre i måleperioden, herunder deltatransmissionsmiddelværdien (ΔT) (figur 3A), den fotonfrie vej (figur 3B), SI (figur 3C) og partikelstørrelsen (figur 3D). Med forlængelsen af måletiden svinger MLS-spektrene af stabile ekstrakter lidt eller slet ikke, og deres fysiske parametre, herunder ΔT, fotonfri vej og partikelstørrelse, har tendens til at være stabile.

Typiske resultater af prøvens ustabilitet er vist i figur 2A, C-E. De spektrale resultater af stabile prøver havde tendens til at være konsistente på alle scanningstidspunkter, som vist i figur 2B, hvilket er et typisk kendetegn ved stabile prøver. For yderligere at kvantificere stabilitetsparametrene kan SI bruges til evaluering. Den nuværende protokol giver mulighed for hurtig identifikation af stabilitet under forskellige ekstraktionsmetoder baseret på SI (figur 3C) og analyse af ustabilitetsmekanismen. Det skal bemærkes, at lavere SI-værdier er forbundet med bedre stabilitet. Prøven betragtes som stabil, hvis SI er <10 inden for scanningsperioden. Ved at sammenligne SI-værdierne kunne stabiliteten af de fem prøver skelnes nøjagtigt, og de relevante stabilitetskarakteristiske spektre kunne opnås (figur 4). Partikelmigrationshastigheden (tabel 1) kombineret med ovenstående parameter kan yderligere give indsigt i prøvens ustabilitetsmekanisme.

Figur 1: Analyseprincip for MLS. MLS bruger pulserende nær-infrarødt lys som lyskilde (bølgelængde: 880 nm), og to synkrone optiske detektorer registrerer henholdsvis transmissionslyset (T, 0 ° fra den indfaldende stråling, transmissionssensor) og tilbagespredningslys (BS, 135 ° fra den indfaldende stråling, tilbagespredningsdetektor), der passerer gennem prøven. Lyskilden, transmissionslysdetektoren og tilbagespredningslysdetektoren udgør målesonden. Målingen fra bunden til toppen af prøvecellen omfatter en scanning. Enhver ustabilitet i prøven vil have en lille indvirkning på T- og BS-signalstyrkerne. Denne indvirkning registreres og analyseres for at karakterisere forskellige ustabile fænomener, herunder flokkulering, stratificering og sedimentering⁴. Gennem beregningen af flere scanningsresultater kan mekanismen og hastigheden af opløsningssystemets ustabilitet i den indledende fase af ustabilitet analyseres nøjagtigt, og forholdskurven for lagtykkelsen (sedimentlag, flydende lag og afklaringslag) med tiden samt forholdskurven for partikelmigrationshastigheden og partikelstørrelsen med tiden, kan fås. Forkortelse: MLS = flere lysspredning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: MLS-spektre (transmission og backscattering) af PE-ekstrakt med forskellige ekstraktionsmetoder. (A-E) MLS-spektre af E1-E5. Fra spektraldataene kan det groft udledes, at (B) E2-prøven svingede mindre, hvilket indikerer, at prøven var mere stabil, mens (A) E1 kan have haft turbiditet på grund af det samlede fald i transmissionslys. (C-E) E3-E5-prøverne var ret ustabile, og spektraldataene for prøverne i forskellige højder var forskellige, hvilket indikerer, at stratificering fandt sted i den senere periode. Forkortelser: MLS = multipel lysspredning, PE = Phyllanthus emblica L., EN = ekstrakt opnået ved metode N. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Resultaterne af analysen af MLS-spektre . (A) Med tiden bliver T-værdien højere, og prøven er mere ustabil. For E3 og E4 vendte ΔT-niveauet tilbage til niveauet i det tidligere stadium til sidst, hvilket indikerer, at aggregering og nedbør forekom i disse ekstrakter. ΔT af E5 forblev på et lavt niveau efter turbiditet, hvilket indikerer, at E5 kan have haft en stor mængde sedimentering. (B) Tendensen i den fotonfrie bane kan afspejle ændringerne i prøvens transmitterede lys. (C) Stabiliteten af forskellige ekstrakter svingede kontinuerligt over tid, idet E2 > E1 > E5 > E3 > E4 var stabilitetens rækkefølge i løbet af opbevaringsperioden. (D) Dynamiske ændringer i partikelstørrelse kan afsløre aggregeringen af partikler i prøven. Resultaterne viser, at partikelstørrelserne på alle prøverne ændrede sig betydeligt inden for 8-20 timer, hvor partikelstørrelsen på E3 og E5 endda overskred måleområdet. Således er dette trin afgørende for dannelsen af ustabile aggregater af molekyler eller partikler i prøven. På samme måde blev der i det sidste trin, da partiklerne begyndte at nukleere og fortsætte med at aggregere, til sidst observeret en reduktion i partikelstørrelsen, efter at nok partikler dannede store agglomerater og udfældede. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Ustabilitet af PE-ekstrakter opnået ved forskellige ekstraktionsmetoder. Resultatet tager tid, da abscissen og farven repræsenterer intensiteten af transmitteret lys eller tilbagespredt lys. Resultatet kan direkte afspejle den reelle situation med turbiditet og stratificering af prøverne på forskellige tidspunkter og højder. Kromaticitetsbåndet øverst i hvert resultat repræsenterer lysintensitetsværdierne svarende til forskellige farver, hvor den blå del repræsenterer T%, og den brune del repræsenterer BS%. (A) T% af E1 begyndte at falde efter 16 timer, hvilket tyder på, at prøven var uklar, og hele processen delaminerede eller udfældede ikke. (B) T% af E2 var konsistent i hele måleperioden, hvilket tyder på, at prøven var stabil. (C) E3 var uklar ved 16 timer, og dens BS% steg pludselig ved 20 timer, hvilket indikerer, at partiklerne i prøven samledes, stratificerede og udfældedes i det øjeblik. (D) Resultatet her svarer til resultatet i (C). (E) E5 oplevede alvorlig delaminering efter 20 timer, hvilket varede indtil målingens afslutning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Måling	Beregningszone	Migrationshastighed (mm/h)
E1	0-24 timer	1.56
E2	0-24 timer	0.005
E3	0-24 timer	1.476
E4	0-19 timer	2.732
E5	0-24 timer	1.377

Tabel 1: Resultater af partikelmigrationshastigheden. I resultaterne kan partikelmigrationshastigheden betragtes som partikeludfældningshastigheden, som til en vis grad kan afspejle prøvens stabilitet. Højere migrationsrater indikerer dårligere stabilitet. Det fremgår af resultaterne, at migrationshastigheden blev rangeret som E4 > E1 > E3 > E5 > E2, og denne rækkefølge er noget anderledes end resultaterne for stabilitetsindekset, SI. Dette skyldes, at dette resultat afspejler den gennemsnitlige migrationshastighed for partikler i prøven i måleperioden snarere end partikelmigrationshastigheden under den hurtige udfældning af prøven.

Discussion

Den hurtige og nøjagtige vurdering af TCM-stabilitet har altid været et fokus for TCM-forskning. For at give mere nyttige oplysninger til styring af forbedringen af ekstraktionsprocessen analyserede denne undersøgelse stabilitets- og ustabilitetsmekanismerne i en prøve ved hjælp af en nær-infrarød ikke-destruktiv teknologi.

I denne protokol beregnes de vigtige stabilitetsparametre baseret på nøjagtige MLS-scanningsdata. MLS-scanninger kan indsamle transmission (T%) og backscattering (BS%) af prøven i realtid og beregne stabilitetsindekset (SI), partikelstørrelse, partikelmigrationshastighed og andre vigtige fysiske parametre. Beregningsformlen er givet ved ligning (1)⁴:

TSI = (1)

hvor x i er gennemsnitlig transmission for hvert måleminut, x T er gennemsnittet x _i, x _T = (x ₁ + x₂ + ... x i + x_i +_{1 ... +} x n) / n, og n er antallet af scanninger. SI er en vigtig parameter, der afspejler prøvens stabilitet, og en stigning i SI-værdien indikerer et fald i stabiliteten. SI inkluderer alle måledata til beregning, hvilket betyder, at det kan bruges til at forudsige og evaluere stabiliteten af prøver på kort sigt.

Partikelstørrelsesberegningen er baseret på Beer-Lambert-loven. Beregningsformlen er givet ved ligning (2):

T(l,ri) = T₀ , l(d,φ) = (2)

hvor ri er cellens indre diameter, og T₀ er transmissionslysintensiteten i den kontinuerlige fase. I henhold til den målte transmissionslysintensitet (T), partikelvolumenfraktionen (φ) og de indstillede parametre kan partikelstørrelsen beregnes.

Sedimentationshastigheden beregnes ved hjælp af ligning (3):

(3)

V er partikelmigrationshastigheden (ms-1), ρ _c er den kontinuerlige fasetæthed (kgm-3), ρ_p er partikeldensiteten (kgm-3), g er tyngdekraftskonstanten (9,81 ^ms-2), d er den gennemsnitlige partikeldiameter (μm), v er den kontinuerlige faseviskositet (cP) og er volumenprocenten.

I processen med ekstraktion med varme, et stort antal hydrolyserbare tanniner i PE-hydrolyserer, frigiver den uopløselige aglyconon-ellaginsyre. Da ellaginsyre er et plant ikke-polært molekyle, gennemgår det intermolekylær aggregering og udfældning på grund af hydrofobe interaktioner, og dette er hovedårsagen til udfældning i opløsningen¹. Med forlængelsen af ekstraktionstiden dannes mere ellaginsyre, hvilket resulterer i dårlig stabilitet af prøven, og klaringstiden for den tilsvarende prøve forkortes. Dette afspejles godt i resultaterne i figur 4.

På grundlag af ovenstående beregningsresultater kan det konkluderes, at udfældningen forårsaget af aggregering af komponenter eller partikler, hvilket er tydeligt i E3-E5-prøverne, er hovedkilden til PE-ekstraktionsopløsningens ustabilitetsmekanisme. På grund af polysacchariderne, der blev opløst under ekstraktionsprocessen, var E2 relativt stabil, fordi udfældningsprocessen blev hæmmet af dens høje viskositet¹⁰. Da ekstraktionsperioden imidlertid blev forlænget, blev der produceret store mængder uopløselige komponenter såsom ellaginsyre, hvilket gjorde det vanskeligt at opretholde steady state. Samlet set startede den accelererede ustabilitet ved ~12 timer, og ekstraktionsvarigheden havde en negativ korrelation med stabilitet, hvilket var afgørende for procesoptimering.

MLS-metodens betydning i forhold til eksisterende metoder er som følger. For det første er måleresultaterne mere nøjagtige og autentiske, da metoden er enkel at bruge, ikke kræver nogen prøveforbehandling, og målingerne kan tages uden at røre prøven. Selv prøver med høje koncentrationer behøver ingen fortynding. For det andet har MLS høj følsomhed. De skiftende hastigheder baseret på partikelkoncentration og størrelse kan detekteres i begyndelsen af ændringen i partiklerne dispergeret i det flydende præparat. Sammenlignet med visuel observation er MLS således ~ 200x mere tidseffektiv.

Da temperaturændringer kan påvirke systemets spredte lysintensitet, skal det understreges, at prøvetemperaturen skal holdes konstant efter installationen, hvilket kræver en ligevægtstid. Derudover skal interfererende elementer (såsom rester af medicinsk materiale) fjernes for korrekt at vurdere ekstraktets stabilitet. Endelig er det vigtigt præcist at måle de fysiske egenskaber inden testning for nøjagtigt at bestemme de fysiske parametre, såsom partikelstørrelse og fotonfri vej.

Der er flere begrænsninger for denne tilgang. For eksempel forårsager oxidation fra langtidsopbevaring pludselige farveændringer i ekstraktionsopløsningen, hvilket kan påvirke udfældningsvurderingen og aggregeringsadfærden. Det kan være en udfordring at garantere konsistensen af nogle prøver, når der kræves parallelle prøver, da flere prøver ikke kan måles på én gang. Den investering i udstyr, der kræves til denne teknologi, er relativt dyr, hvilket er den primære barriere for dens anvendelse og fremme.

I fremtiden er vi overbeviste om, at denne metode vil yde fremragende bidrag inden for farmaceutiske præparater, især i evalueringer af dispersion og in vitro-opløsning. Det kan bruges til at studere nye lægemiddelafgivelsessystemer såsom liposomer, nanopartikler og in situ-geler, og på grund af dets fordele ved at være mere effektive, hurtige, enkle og omfattende kan denne metode betydeligt forkorte forskningscyklussen^11,12. Derudover kunne en stabilitetsforudsigelsesmodel baseret på en stor mængde medicinstabilitetsdata realiseres. Denne teknologi kan kobles og forbedres med andre detektionsteknikker i fremtiden, hvilket kan bidrage til farmaceutisk forskning og udvikling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com