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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

富集分枝杆菌的天然和重组细胞外囊泡

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

该方案详细介绍了从耻垢分枝杆菌（Msm）的无轴培养物中富集天然分枝杆菌细胞外囊泡（mEV），以及如何设计和富集含有mCherry（红色荧光报告基因）的重组MsmEV。最后，通过富集含有结核分枝杆菌EsxA蛋白的MsmEVs验证了新方法。

Abstract

大多数细菌，包括分枝杆菌，都会产生细胞外囊泡 （EV）。由于细菌 EV （bEV） 包含细胞成分的子集，包括代谢物、脂质、蛋白质和核酸，因此一些小组已经评估了 bEV 的天然或重组版本作为亚单位候选疫苗的保护效力。与天然 EV 不同，重组 EV 经过分子工程改造，含有一种或多种感兴趣的免疫原。在过去十年中，不同的团队探索了生成重组bEV的不同方法。然而，在这里，我们报告了分枝杆菌中重组分枝杆菌 EV （mEV） 的设计、构建和富集。为此，我们使用 耻垢分枝 杆菌（Msm），一种无毒的土壤分枝杆菌作为模型系统。我们首先描述了 Msm 原生 EV 的产生和丰富。然后，我们描述了重组 mEV 的设计和构建，这些重组 mEV 含有 mCherry（一种红色荧光报告蛋白）或 EsxA （Esat-6）（一种突出的 结核分枝杆菌免疫原）。我们通过将 mCherry 和 EsxA N 端分别与小 Msm 蛋白 Cfp-29 的 C 端融合来实现这一点。 Cfp-29 是为数不多的大量存在的 MsmEV 蛋白之一。从 Msm 生成和富集重组 mEV 的协议与生成和富集 Msm 的天然 EV 的协议相同。

Introduction

尽管开发和管理了针对传染病的各种疫苗，但直到今天，~30% 的人类死亡仍然发生在传染病1.在结核病 （TB） 疫苗 - 卡介苗 （BCG） 出现之前，结核病是头号杀手（~10,000 至 15,000/100,000 人口）2。随着卡介苗的实施以及一线和二线抗结核药物的易得性，到 2022 年，结核病相关死亡人数已大幅下降到 ~100 万/年（即 ~15-20/100,000 人口1）。然而，在世界结核病流行人群中，结核病相关死亡人数仍为~100-550/100,000人口1。虽然专家们认识到导致这些数字出现偏差的几个原因，但卡介苗介导的保护甚至不会持续到生命的头十年，这似乎是突出的原因3,4,5,6,7。因此，鉴于联合国更新的“可持续发展目标”和世卫组织的“终结结核病战略”，全球正在共同努力开发一种比卡介苗更优越的疫苗替代品，这种疫苗可能提供终生预防结核病的保护。

为了实现这一目标，几个小组目前正在评估改良/重组卡介苗菌株、除卡介苗以外的非致病性和减毒分枝杆菌物种以及候选亚基8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18.通常，亚单位疫苗是脂质体，选择性地装载了少量纯化 （~1-6） 病原体的全长或截短的免疫原性蛋白。然而，由于它们虚假地折叠成非天然构象和/或负载蛋白质之间的随机非功能性相互作用，亚基通常缺乏天然和密切相关的表位，因此无法充分启动免疫系统14,19,20。

因此，细菌的细胞外囊泡 （EV） 作为有前途的替代品 21,22,23,24,25,26 已经加快了步伐。通常，细菌 EV （bEV） 包含其细胞成分的一个子集，包括核酸、脂质和数百种代谢物和蛋白质的某些部分27,28。与人工加载一些纯化蛋白质的脂质体不同，bEV 包含数百种自然加载的天然折叠蛋白质，具有更好的启动免疫系统的倾向，尤其是在没有佐剂和 Toll 样受体 （TLR） 激动剂的增强/帮助的情况下27,28,29。正是在这项研究中，我们和其他人探索了分枝杆菌 EV 作为 BCG30 潜在亚基增强剂的效用。尽管人们担心 bEV 缺乏均匀的抗原载量，但来自减毒脑膜炎奈瑟菌的 EV 已成功保护人类免受血清群 B 脑膜炎球菌的侵害31,32。

至少从理论上讲，能够很好地促进卡介苗的最佳电动汽车是从病原菌中富集的电动汽车。然而，富集致病分枝杆菌产生的 EV 是昂贵、耗时且有风险的。此外，病原体产生的 EV 可能毒性大于保护性。鉴于潜在风险，在这里，我们报告了一种经过充分测试的方案，用于富集由轴向生长的 Msm（一种无毒分枝杆菌）产生的 EV。

然而，尽管编码了几种病原体蛋白直系同源物，但无毒分枝杆菌缺乏几种疫苗抗原/致病蛋白表位，这些抗原/致病蛋白表位是充分启动免疫系统以提供保护所必需的33。因此，我们还探索了通过分子工程构建和富集 Msm 的重组 EV，使得在 Msm 中表达和翻译的任何目标致病蛋白的很大一部分必须到达其 EV。我们假设，当与感兴趣的蛋白质融合时，Msm EVs 的前 10 种丰度蛋白质中的一种或多种将有助于这种易位。

当我们开始在实验室中标准化分枝杆菌 EV （mEV） 的富集时，2011 年，Prados-Rosales 等人首次报道了 mEV 在体外30 的可视化和富集。后来，在 2014 年，同一小组发布了他们 2011 年方法34 的修改版本。2015 年，Lee 等人还报道了一种独立的标准化方法，用于再次从分枝杆菌 35 的 axenic 培养物中富集mEV。结合两种方案 34,35 并在彻底标准化后合并我们的一些修改，我们在这里描述了一种方案，该方案有助于从分枝杆菌36 的 axenic 培养物中常规富集 mEV。

在这里，我们特别详细介绍了 Msm 特异性 EV 的富集，这是已发表的方案36 的扩展，用于富集分枝杆菌 EV。我们还详细介绍了如何构建含有 mCherry 蛋白（作为红色荧光报告基因）和 EsxA （Esat-6）37,38,39 的重组 mEV （R-mEV），这是一种主要免疫原和结核分枝杆菌的潜在亚基疫苗原。富集 R-mEV 的协议与我们描述的从 Msm 富集天然 EV 的协议相同。

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Protocol

1. 耻垢分枝杆菌、 大肠杆菌及其衍生物的生长条件

  1. 媒体
    1. Middlebrook 7H9 液体肉汤
      1. 通过在微波炉中将玻璃烧杯中所需体积的双蒸水 （ddw） 预热至 ~45-50 oC 来制备 20% 吐温-80 储备溶液，使用适当的量筒加入所需体积的吐温-80，并在小型磁力搅拌器上连续搅拌，使 20% 吐温-80 进入均匀溶液。通过0.22um处置过滤器过滤20%吐温-80，并将淡黄色储备溶液储存在4°C。
        注意：测量筒中所有痕量的吐温-80必须转移到烧杯中，以获得准确的最终浓度。不要高压灭菌准备好的吐温-80原液。过滤（使用0.22μM）灭菌并储存在4 °C。
      2. 按照制造商的说明准备 7H9 肉汤。将 4.7 g 7H9 粉末悬浮在 900 mL ddw 中。加入 2 mL 甘油，混合内容物，并在 121 oC、15 psi 下高压灭菌 20 分钟。
        注意：高压灭菌前不要添加 Middlebrook ADC 富集 （ADC） 和 Tween-80。
      3. 高压灭菌培养基冷却至室温（RT，即~25°C）后，在标准A2型生物安全柜中，无菌加入10倍100mL ADC（最终1x）和2.5mL（最终0.05%）20%吐温-80的储备液。通过0.22μm一次性过滤装置过滤混合物，并将非常浅的黄绿色透明储备溶液储存在4°C。
        注意： 培养基的 pH 值必须为 ~6.6 至 6.8（如果< 6.4 或 >7.0，请丢弃并新鲜制作）。在4 °C下储存（稳定3-4周）。强烈建议通过两个独立的 0.22 μm 一次性过滤单元对 7H9 介质（添加 ADC 和 Tween-80 后）进行两次过滤。
    2. Sauton's（最小介质）液体肉汤
      1. 将 L-天冬酰胺 （0.4% w/v） 和柠檬酸 （0.2% w/v） 溶解在 950 mL ddw 中。加入新鲜制备的 1,000x 磷酸氢二钾原液（无色;原液 10 g/20 mL;最终 1x 0.5 g/L）各 1 mL;七水硫酸镁（无色;原液 10 g/20 mL;最终 1x 0.5 g/L）;和柠檬酸铁铵（非常浅的棕色;原液 1.6 g/40 mL;最终 1x 0.04 g/L），并在磁力搅拌器上充分搅拌。
        注意：充其量，1,000 倍的股票可以有 2 周的历史;如果比这更老，请准备新鲜的库存;将它们存放在室温下，在黑暗中（例如，在橱柜/架子内）。如果柠檬酸铁铵呈深棕色，请将其丢弃并使其新鲜。最好按照步骤1.1.2.1中提到的顺序添加三种盐。每次在加入每种盐溶液之前旋转溶液。
      2. 使用pH计测量并记录pH值;确保它在 3.1 到 3.2 左右。如果 pH 值超过 3.7，则丢弃原料并准备新鲜的。要将 pH 值调节至 7.4，请根据需要使用尽可能多的 10 N 氢氧化钠滴。监测最终pH值，同时在磁力搅拌器上连续搅拌溶液/培养基。
      3. 加入 4.76 mL 甘油、0.25 mL 20% 吐温-80（最终 0.005%，另见步骤 2.2.1.3 的注释），然后才将体积补足至 1 L。然后，用两个单独的 0.22 μm 处置过滤器对 1 L 培养基进行两次过滤灭菌。将透明、无色的培养基储存在 4 °C（稳定 2 周）。
        注意：只有在pH值调节到7.4后，才加入甘油。否则，介质将变成浑浊的白色。如果浑浊，请丢弃它（不要尝试加热它）并新鲜准备。对于所有 mEV 的制备，请使用新鲜制备的 Sauton。
    3. Middlebrook 7H11琼脂基质
      1. 按照制造商的说明进行准备。将 19 g 7H11 粉末悬浮在 900 mL ddw 中。加入 5 mL 甘油，在磁力搅拌器上旋转以获得均匀的悬浮液（淡绿色;pH 值 6.6 至 6.8;如果 >7.2，则丢弃并新鲜制备），并在 121 °C、15 psi 和 20 分钟下高压灭菌。
        注意：高压灭菌前不要添加 ADC 和 0.05% 吐温-80。
      2. 当培养基冷却至~50 °C时，在A2型生物安全柜中无菌加入100mL ADC（进入室温）和2.5mL 20%（最终0.05%）吐温-80（带入室温）。立即无菌分配到培养皿中。
        注意：板在 4 oC 下稳定至少 4-6 周。确保板在室温下过夜，然后再将板包裹起来储存 4 oC。否则，在37 °C的孵育过程中，水分会被困在板中。
    4. Miller Luria Bertani （LB） 肉汤和琼脂基底
      1. 按照制造商的说明进行准备。为了制备LB肉汤，将25g粉末悬浮在1,000mLddw中，并在磁力搅拌器上的玻璃烧杯中轻轻搅拌5分钟。悬浮均匀后，将所需体积分装到培养基瓶中（例如，500 mL 培养基瓶中的 300 mL）并高压灭菌。为了制备LB琼脂，将40g粉末悬浮在1,000mL的ddw中，然后高压灭菌器（在500mL玻璃培养基瓶中的300mL ddw中加入12g粉末）。
  2. 生长条件
    注意：细菌培养工作的所有步骤都必须在生物安全柜（A2 型）中进行。所有培养物必须用无菌管、烧瓶和移液器吸头处理。
    1. 第1天
      1. 将 1 mL Msm（来自 -80 o C 冰箱）的甘油原液加入 2 x 10 mL（在 50 mL 无菌锥形离心管中）新鲜高压灭菌、冷却和预热 （~37 oC） 7H9 肉汤中，旋转三次，盖上盖子，并在 37 oC 和 200-220 rpm（培养箱振荡器）下孵育管过夜。
        注意：要培养 结核分枝杆 菌 （Mtb），请遵循类似的步骤，但在 BSL3 设置中将 50 mL 管在 37 oC 和 120-150 rpm（培养箱振荡器）下孵育 4-6 天。在处理和丢弃 Mtb 及其培养物时，遵循 BSL3 和风险组 3 病原体的所有国际准则和生物安全实践。使用 B2 型生物安全柜处理 Mtb 及其培养物。
    2. 第2天
      1. 当OD600 （A 600nm;细胞密度计）达到~1.0时，将Msm培养物以3,200× g 离心10分钟，并室温（台式离心机）。使用无菌 1 mL 移液器吸头弃去上清液。
        注意：上述步骤对于 Mtb 培养物保持不变，只是天数为 4-7 天。确保不要用移液器吸头接触细菌沉淀。
      2. 洗涤：向每个 Msm 沉淀中加入 1 mL 预热的 Sauton（室温）培养基（步骤 1.1.2），并用 1 mL 移液器吸头轻轻重悬以获得均匀的悬浮液。使用无菌移液器吸头，用相同的培养基将体积补足至10 mL（每个）。将悬浮液以3,200× g 离心10分钟，室温并弃去上清液。再次重复此步骤。
        注意：对于 Mtb 培养物，上述步骤保持不变。
      3. 将两次洗涤的 Msm 细胞重悬于 20 mL（每个）预热的 Sauton（在板或振荡器培养箱中预热）中，并在 600 nm 处测量细胞的光密度。将所需体积的 Msm 培养物接种到含有 ~330 mL 无菌 Sauton 的无菌 1 L 锥形瓶中，使最终 OD600 为 ~0.05。
        注意：再悬浮必须始终从小体积开始。如果将最终体积作为单个步骤直接添加到沉淀中，则细胞将保持为扩散沉淀（重悬不良的指标）。解决该问题的唯一方法是降低培养物的旋转速度，并按照建议重做重悬。对于Mtb培养物，上述步骤保持不变。
    3. 第2/3天
      1. 将 330 mL 培养物在培养箱振荡器中以 200 rpm 和 37 oC 孵育，直到培养物 OD600 达到 ~0.3。然后，洗涤细胞一次（类似于步骤1.2.2.2，但体积相等），然后，将沉淀重悬于相同体积。将 50 mL 重悬的培养物分别分配到六个无菌 1 L 无菌锥形瓶中，每个瓶中含有 280 mL 无菌预热的 Sauton，其中含有正常使用的 1/10（ 0.05%） 吐温-80，即 0.005%（另请参阅步骤 2.2.1.3 的注释，以了解为什么为 1/10）。最终的 OD600 必须约为 0.05。
        注意：对于 Mtb 培养物，使用滚瓶（容量为 1/2/4 L）代替锥形瓶。调整每个瓶子的培养体积，使得当保持在滚筒装置上时，培养物 不会 到达瓶口。滚筒瓶中的实际体积将取决于滚筒瓶的容量。
      2. 在培养箱振荡器中以 200 rpm 和 37 oC 孵育 330 mL 培养物，直到 OD600 达到 2.0 至 2.5（~15-18 小时）。
        注意：对于 Mtb 培养物，确保最终的 OD600 为 ~1.0-1.2（需要 ~5-8 天）。

2. 采用密度梯度离心法富集Msm mEVs

  1. 第4天
    1. 将~2L中指数阶段的Msm培养物在6×400mL无菌离心瓶中，在4 °C下以~8,000 ×g 离心20分钟（落地型离心机）。将用过的培养基/培养物上清液收集在两个预冷、高压灭菌的 1 L 锥形瓶中，并储存沉淀的等分试样用于任何分析程序（例如 SDS-PAGE 和蛋白质印迹 - 此处未详细说明）。
      注意：所有后续步骤必须在低温（~4°C）下进行，以更好地保持mEV的完整性。mEV 在室温下非常稳定，但冷藏是长期稳定的必要条件（不建议反复冻融）。在无轴培养生长过程中，mEV 与 Msm/Mtb 表面解离并积聚在培养上清液/废培养基中。
    2. 首先通过0.45μm处置过滤装置过滤Msm培养上清液，然后通过0.22μm处置过滤装置以除去所有细菌痕迹。
      注意：通过 0.22 μm 过滤器直接过滤通常会阻塞过滤器单元（因为细菌沉淀在执行步骤 2.1.1 时可能会受到干扰）。为了产生Mtb培养物上清液，在将培养物移至BSL-2设置之前，对Mtb培养物进行三次过滤（即，使用0.45μm一次性过滤装置的第一个过滤步骤;使用0.22μm一次性过滤装置进行两个连续过滤步骤）。
  2. 第4/5天
    1. 使用30 kDa膜浓缩器将培养滤液（~2L）浓缩至~38 mL，方法是将培养滤液在4 °C，20mm和3,200× g下离心。
      1. 首先用无菌冷ddw（~15mL）预洗浓缩器（在4 °C，5分钟和3,200× g下洗涤）。
      2. 用 ~15 mL 预过滤的冷 Sauton（与水 （2.2.1.1.） 相同的条件）洗涤以去除所有微量的化学品（在制造过程中使用）。
      3. 由于从技术上讲，浓缩~2L培养滤液需要~130个中心子（如果仅使用一次），因此如有必要，至少重复使用3-4次中心子。按照以下步骤操作：将 15 mL 浓缩至 0.5 至 1.0 mL（按照步骤 2.2.1），将浓缩液转移到干净、高压灭菌和冷的 38 mL 超速离心管中，然后将剩余的未浓缩培养滤液重新转移到使用过的中心子中进行重复浓缩。
        注意：使用 24、30 kDa 浓缩器浓缩 2 L 培养滤液最多需要 6 小时。浓缩培养滤液后，吐温-80 也会浓缩并可能阻塞浓缩器。在 Sauton 培养基中使用 Tween-80 至 0.005% 最终值（而不是 0.05%）有助于防止这种堵塞。Tween-80浓度的降低不会影响生长过程中Msm的均匀悬浮液，并且不会引起Msm细胞的聚集。然而，由于 Mtb 电池确实在 0.005% 吐温-80 时结块，因此将 0.05% 吐温-80 用于 Mtb 特异性 EV。
    2. 将浓缩的Msm培养滤液（~38mL）转移到干净，洗涤（用ddw）和预冷的40-50mL聚丙烯离心管中，并对其进行两步离心，首先在4,000× g ，然后在15,000 ×g，两个步骤在4 °C下20分钟（以除去所有碎片）。使用落地式离心机进行相同的操作。
  3. 第5/6天
    1. 将培养上清液转移到预冷的38.5mL聚丙烯超速离心管中，并在4°C下以100,000×g超速离心机旋转4小时。
      注意： 摆动铲斗在此速度下效果最佳。确保将超速离心管装满边缘，并有一个同等重量的平衡超速离心管。如果离心后任一根管子粘在摆动桶上（这是由于冷凝而发生的），请使用镊子轻轻地将其从转子上取下。在超速离心之前擦去超速离心机外表面的冷凝水分可防止粘连。
    2. 将上清液保存在 50 mL 预冷管中（见注释）。将超速离心管倒置在新鲜的无绒吸水纸上，以去除微量的上清液。将沉淀重悬于 600 μL HEPES 缓冲溶液（50 mM HEPES 和 150 mM NaCl，pH 7.4;使用前过滤灭菌）中。
      注意：仅将上清液保存为备份。天然 mEV 颗粒呈果冻状，直径 5-7 毫米，暗灰黄色至半透明斑点。如果没有可见的沉淀，则重复步骤2.3.1，重复使用保存的上清液。如果重复步骤 2.3.1 后没有出现颗粒，请丢弃并从步骤 1.2 重新开始。颗粒需要时间才能恢复。建议加入HEPES缓冲液，并在4 °C下放置过夜，以便于重悬。轻轻重悬，但要反复移液（使用 P200 吸头以获得更好的重悬效果），直到均匀重悬。
  4. 第6天
    1. 将重悬的沉淀置于基于“碘克沙醇”的密度梯度离心中。
      1. 将重悬的沉淀分层在 13 mL 清洁、洗涤（用 ddw）和预冷的超透明聚丙烯超速离心管底部，并与 ~4 mL 惰性密度梯度“碘克沙醇”溶液（市售为 ~60% w/v 溶液）轻轻混合（使用 1 mL 移液管）。将重悬的沉淀分层到管底部（最多 5 mL）后，然后按相应顺序用 1 mL （w/v） 的 40%、30%、20% 和 10% 的“碘克沙醇”子储备液覆盖（从 60% 储备液中制备子储备液（含 HEPES 缓冲液）。然后，在顶部加入 4 mL 6% 亚储备液（由 60% 储备液和 HEPES 缓冲液制备）以填充试管。
        注意： 使用前准备渐变;切勿储存和使用。
      2. 小心（不要摇晃），在玻璃烧杯中称量管子，然后轻轻地将其转移到摆动的铲斗转子中。
        注意： 称量对于使用假管（也称重）进行平衡是必要的。
      3. 使其在141,000× g 下在4 °C下超速离心16小时。
  5. 第7天
    1. 小心地取出试管（参见步骤2.3.1的注释）并将1mL馏分收集到新鲜高压灭菌的微量离心管中;注意第 4到 6个 分数，它们通常包含 Msm mEV。
      注意：这些馏分的 mEV 通常分成三个或四个 mEV 条带（一个是主条带），这些条带呈暗白色。含有 mCherry 的 R-mEV 在第 5 至 7次分馏中分馏，呈深紫色至洋红色。Mtb EV 通常在第5 到 7 个分数中分馏。梯度中mEV的分离取决于所使用的梯度浓度和梯度的分层程度。如果 mEV 部分破裂，它们可能会在早期的部分部分分离。或者，如果在步骤2.3.2之后获得的沉淀没有很好地重悬，则囊泡形成致密的微颗粒，这些微颗粒作为后来的馏分分馏出。我们建议仅当用户想要评估 1 mL 馏分中的哪一个含有 mEV 时才精确收集馏分。用户可能希望根据自己的方便等分成更小或更大的部分。当我们将它们用于某些应用时，例如，将它们作为 BCG 的潜在亚单位疫苗加强剂进行测试，我们将 mEV 的收集限制在 250 μL 以下（其中 mEV 分馏），以便我们可以专门收集 mEVs 条带并按照 2.7.5 中所示进行处理。这有助于更有效地去除所有可能干扰我们下游实验的碘克沙醇痕迹。
  6. 第8天
    1. 将含有mEVs的馏分汇集在一起，用HEPES缓冲液稀释至38mL，并在4 °C下以100,000× g重复超速离心16小时。将沉淀重悬于HEPES缓冲液或下游实验（此处未详述）所需的任何缓冲液中，例如蛋白质估计，纳米示踪分析，阴性染色，透射电子显微镜，蛋白质印迹和免疫金标记。
      注意：为了获得更好的重悬，使用超声波水浴超声仪对含有 mEV 的管进行超声处理 10 分钟。超声处理时间越长，完整 mEV 就会破裂和丢失。如果悬浮良好，则无需超声处理。从 2.1 到 2.6 的所有步骤都是相同的，同时丰富了 Mtb 生成的 EV。

3. 重组mEV的构建和富集。

注意：Msm EV 的 10 种最丰富的蛋白质（通过质谱法鉴定）之一是 Cfp-2930。鉴于其小尺寸 （29 kDa）、简单的二级结构40、定位到膜41 以及倾向于在 axenic 培养物中分泌到废培养基中（例如，作为培养滤液蛋白;由 Msm 和 Mtb分泌 42,43，在这里，它已被用于将红色荧光报告基因和目标蛋白 （EsxAMtb） 递送至 mEV 中。为了实现这一点，

  1. 使用适当的正向和反向引物（表1;兼容直接克隆到穿梭载体中，如pMV261）从Msm扩增 cfp-29 。 使用~50ng高分子量（~>20kb）Msm基因组DNA作为模板，用高保真校对DNA聚合酶（如Phusion或Q5） PCR扩增cfp-29 基因片段。遵循制造商的PCR建议。
    注：在引物中设计必要的限制性位点，以便于克隆到任何感兴趣的替代穿梭载体中。PCR条件和体积将因所使用的校对DNA聚合酶的类型和品牌而异。反应混合物的体积将根据 DNA 模板的量和校对 DNA 聚合酶的数量而变化。遵循制造商关于PCR条件、扩增成功率和消除引物非特异性退火的建议。
  2. 使用任何市售的PCR纯化试剂盒对洗脱的扩增子进行PCR纯化，并通过标准琼脂糖凝胶电泳验证扩增子长度。消化纯化的扩增子。
    1. 在分光光度计上估计纯化的扩增子的量。使用至少 2 μg cfp-29 扩增子进行消化。
    2. 首先用BstB1在65 °C下消化1小时（缓冲液和酶的类型和数量 - 根据制造商的建议），将反应温度降至室温，然后在37 °C下用HindIII消化1小时（缓冲液和酶的类型和数量 - 根据制造商的建议）。
    3. PCR纯化并在50μL高压灭菌的无核酸酶ddw中洗脱消化的扩增子。
    4. 使用分光光度计估计消化扩增子的浓度和产量。储存在-20 °C直至连接设置。注：PCR 后，通过在 1% 琼脂糖凝胶上电泳 10 μL PCR 反应混合物来验证扩增子长度 （~798 + 50 bp） 和产量。尽管使用这种酶组合无法进行双重酶切，但兼容的缓冲液将防止重复PCR纯化和随后消化扩增子的丢失。消化扩增子的浓度随用于PCR纯化的试剂盒而异。它还随任何选择的替代载体的长度（以 bp 为单位）而变化。
  3. 使用正向和反向引物（表 1）、校对 DNA 聚合酶和 ~50 ng Mtb 基因组 DNA，PCR 扩增 esxA- 或 esxA-3X FLAG标签特异性扩增子。使用 ~5 ng 适当的质粒 DNA 对 mCherry 进行 PCR 扩增。质粒和序列详细信息在补充文件1中。
    注意：在 cfp-29 和 mCherry/esxA/esxA-3X FLAG 之间使用甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸44,45（G4S） 接头;在 mCherry 开始之前，G4S 接头帮助 mCherry 不经历虚假的非功能折叠（包括由 Cfp-29 驱动的折叠）。请参阅补充文件 1 中的 cfp-29、hsp60 启动子、mCherry 和 esxA 序列。作为 mCherry 模板的质粒可在不同的质粒库/库获得。mCherry 有不同的版本（略有改变的序列），需要改变正向和反向引物序列。引物（表1）有助于扩增补充文件1中提到的mCherry。将 mCherry/esxA/esxA：：3XFLAG 的 N 端融合到 Cfp-29 的 C 端效果很好。
  4. 消化 1 μg mCherry/esxA/esxA：：3XFLAG 扩增子的 DNA 并纯化消化的 DNA。
    1. 在37 °C下用HindIII和HpaI双消化每个扩增子1小时（或根据制造商的建议）。
    2. 使用市售的PCR纯化试剂盒和制造商关于纯化消化扩增子的建议。在 50 μL 高压灭菌的无核酸酶 ddw 中洗脱消化的扩增子。
    3. 使用分光光度计估计消化扩增子的浓度和产量。储存在-20 °C直至连接设置。
  5. 用所选酶消化 2 μg pMV261-KanR （补充文件 1）或合适的克隆载体。
    1. 首先用BstB1在65 °C下消化1小时（缓冲液和酶的类型和数量 - 根据制造商的建议），将反应温度降至室温，然后在37 °C下用HindIII消化1小时（缓冲液和酶的类型和数量 - 根据制造商的建议）。
    2. 凝胶纯化并在 50 μL 高压灭菌的无核酸酶 ddw 中洗脱。
    3. 使用分光光度计估计消化载体的浓度和产量。储存在-20 °C直至连接设置。
      注：使用上述pMV261引物可以进行一步法双片段克隆。任何作为附偶体存活下来的替代穿梭载体都将起作用。整合质粒也可以工作，但重组蛋白的产量将相对较低。
  6. 连接并转化为相容的大 肠杆菌菌株。
    1. 对于连接，使用125ng载体。使用 1：3 摩尔比适当消化的 mCherry/esxA/esxA：：3XFLAG 扩增子。在16°C下在冷冻循环水浴中使用T4 DNA连接酶（根据制造商的建议数量）进行连接过夜。
      注：使用适当的对照，例如仅使用和不使用 T4 DNA 连接酶的载体来评估消化效率并预测克隆成功的效率。
    2. 转型
      1. 在冰上解冻 NEB5α 化学感受态细胞等分试样（每次转化 ~100 μL）15 分钟。用无菌移液器吸头轻轻混合两次。将连接混合物（最多 20 μL）加入冷感受态细胞中。
      2. 轻轻混合移液器细胞+连接的DNA。将混合物在冰上再孵育 30 分钟。
      3. 在42°C（在循环水浴中）提供热休克60秒，并立即转移回冰中再15分钟。
      4. 通过加入1mLSOC肉汤（2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl 2,10mM MgSO4和20mM葡萄糖）回收转化的细胞，并在37°C下以200rpm孵育1小时。
      5. 在 1.5 mL 微量离心管（3000 × g，室温和 10 分钟）中旋转回收的细菌，弃去上清液，将沉淀重悬于 200 μL 无菌、预热、新鲜制备的 LB 培养基中，并将悬浮液铺在含有适当浓度所需抗生素的新鲜倒入的 LB Miller 琼脂平板上。
      6. 将培养皿在预设为37 °C的平板培养箱中孵育。
  7. 筛选（此处不详述）潜在克隆，验证（通过基于菌落PCR/限制性内切酶）46 并对其进行测序（Sanger测序）以确认融合。
  8. 提取已确认克隆（大肠杆菌 背景）的质粒DNA（~200 ng/1-2μL;任何市售试剂盒），并将其转化为新鲜制造的Msm电感受态细胞。
  9. Msm电感受态电池的制备
    1. 新生长的 Msm（如步骤 1.2.1 和 1.2.2 所示）。按照步骤 1.3.3 和 1.3.4 清洗新鲜生长的 Msm（除了使用 7H9 + ADC + Tween-80（丰富）而不是 Sauton's）。
    2. 在含有 150 mL 富培养基的无菌 500 mL 锥形瓶中，将洗涤的 Msm 细胞的等分试样加入 ~0.05 的最终 OD600 中。
    3. 在培养箱振荡器中以 200 rpm 和 37 oC 孵育，直到培养物 OD600 达到 ~0.8 至 1.0（~12-14 小时）。
    4. 将培养物转移到预冷的 400 mL 离心瓶中，并在冰上孵育 60-90 分钟。然后，将细胞在4 °C下沉淀15分钟，浓度为4,000× g。
    5. 用冰冷、无菌（高压灭菌）的 10% 甘油洗涤细胞两次（每次用 150 mL、4,000 × g、4 oC 和 15 分钟洗涤）。
      注意：每次洗涤时，颗粒都会变得松散。丢弃整个上清液（每次洗涤后）时要小心。否则，大部分细胞将在丢弃的上清液中丢失。
    6. 用 75 mL 冰冷、无菌的 10% 甘油（含 0.005% 吐温-80）再次洗涤细胞。
    7. 将细胞沉淀重悬于含有 0.005% 吐温-80 的 7.5 mL 10% 甘油中，并分装成 400 μL 等分试样。
      注意：尽管 Msm 电感受态细胞至少具有 4 个月的能力，但新制备的电感受态细胞可提供最佳结果。当使用旧的感受态细胞时，一些非粉红色的菌落（白色）表现为假转化体。感受态细胞越老，白色菌落越多。
  10. Msm 的转型
    1. 解冻 Msm 感受态细胞等分试样在冰上。
      注意：在室温下解冻并转化此类细胞会产生较低的效率。
    2. 向冷感受态细胞中加入 1-2 μL 质粒 DNA（总共 ~200 ng），用 1 mL 无菌移液器吸头轻轻混合，然后转移到预冷的无菌 2 mm 电穿孔比色皿中。
    3. 将含有Msm感受态细胞+质粒DNA混合物的封闭比色皿转移到elctroporator的小鼠中，轻轻盖上盖子，并在2.5kV（电压），25μF（电容）和1000 Ω（电阻）下施加脉冲（指数衰减型）。
    4. 立即向比色皿中加入 1 mL 预热的富含无菌 （7H9 + ADC + Tween-80） 培养基，用 1 mL 无菌移液器吸头轻轻混合，然后将全部内容物转移到 10 mL 无菌管中。
    5. 将内容物在设置为37 °C和200rpm的培养箱振荡器中孵育3小时。在微量离心管（4,000× g，室温和10分钟）中旋转内容物，弃去上清液，将沉淀重悬于200μL无菌预热的富培养基中，并将悬浮液铺在新鲜倒入的含有ADC，吐温-80和所需抗生素的7H11琼脂平板上适当浓度。
      注意：对于 Msm，需要时，使用潮霉素、卡那霉素和阿普拉霉素，终浓度分别为 50 μg/mL、25 μg/mL 和 50 μg/mL。Msm 本身 对这些抗生素没有耐药性。仅当使用具有适当抗性基因的质粒来选择/生长转化体/重组 Msm 菌落时，才使用这些抗生素。
    6. 将培养皿在预设为37 °C的平板培养箱中孵育，通常，转化体在3-5天之间出现。
      注意：如果感兴趣的蛋白质对 Msm 有毒，则转化体可能会稍后出现或无法出现。在这种情况下，克隆全长的截断版本。
    7. 在验证阳性克隆后，制备紧急Msm菌落的甘油储备（与步骤3.7相同）
  11. 要富集含有 mCherry 或 EsxA 蛋白的 R-mEV，首先按照步骤 1.2.1 至 1.2.3 培养表达 mCherry 或 exsA 或 esxA：：3X FLAG 的 R-Msm，然后按照步骤 2.1 至 2.6 进行操作。以丰富 R-mEV。R-mEVs在密度梯度自旋后洗脱到第4-7个馏分中（步骤2.5）。R-mEVs在第一个超速离心步骤（2.3.1）后沉淀。执行与步骤2.3.1相同的操作后，确认R-mEV在超速离心机的底部中心可见为直径为5-7 mm的深紫色至洋红色沉淀。
  12. 进行蛋白质分析47 （此处未详细说明）以检测富集的 R-mEV 中感兴趣的蛋白质。

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Representative Results

我们使用 耻垢分枝杆 菌 （Msm） 作为模型分枝杆菌来证明天然和重组 mEV （R-mEV） 的富集。这种示意性总结的 mEVs 富集方案（图 1）也适用于 Msm 的 R-mEV 和 Mtb 的天然 EV 的富集（稍作修改，如 1.2 的方案说明）。富集的mEV的可视化需要在透射电子显微镜下对它们进行负染色36 （图2A）。通常，Msm 特异性 EV 在 13 mL 6-60% 密度梯度的4-6 次 1 mL 馏分中分离出来（图 2B）。通常从 2 L Msm 的中对数 axenic 培养物中获得大约 80-100 μg 蛋白当量的 EV。它们的直径通常在 20 nm 和 250 nm 之间（图 2C）。

我们实验室的一个长期目标是评估不同分枝杆菌的 mEV 是否可能作为现有疫苗 BCG 的亚基加强剂。由于富集病原菌产生的 mEV 既费时又有风险且昂贵，因此利用无毒分枝杆菌的天然和重组 EV 可能是一种合适的替代方案。因此，我们不仅要标准化协议以丰富 Msm 的 mEV，还要构建和富集其 R-mEV。

为了构建 R-mEV，我们首先选择了 Msm EV 中丰度最高的 10 种蛋白质（表 1;我们从 Msm EV 的详细质谱分析中鉴定了它们）30。我们假设，如果感兴趣的外源蛋白质通过翻译与其中任何一种融合，它应该能够定位到 mEV 中。然后，我们将 Cfp-29 列入 10 个候选名单，因为它是其中最小的 （~29 kDa），是膜定位的，并且是一种具有相对简单的二级结构40,41,42,43 的培养滤液蛋白。我们将 mCherry（荧光蛋白）的 N 端翻译融合到 Cfp-29 的 C 端，并评估其加载/递送到 mEV 中。Msm 的一部分富集 mEV 变成粉红色（图 3），表明 Cfp-29 能够将感兴趣的外源蛋白携带到 Msm EV 中。

鉴于 Cfp-29 的这种能力（图 3），我们随后评估了 EsxA （Esat-6），这是一种主要的免疫原性蛋白37,38,39 递送至 Msm EV。同样，我们生成了两个独立的翻译融合到仅 Cfp-29 的 EsxA 的 C 末端和 EsxA + 3X FLAG 标签（3X FLAG 融合到 EsxA 的 C 末端。正如预期的那样，我们在 Msm EV（车道 5、6 和 10，图 4A，B）中观察到 Mtb 的 EsxA，尽管数量很少。有趣的是，Cfp-29：：EsxA：：3XFLAG要稳定得多（泳道3和4加上8和9;图4A）在 mEV 中累积的水平更高（车道 3 和 4 加上 8 和 9;图4B）。总之，我们展示了含有目标外源蛋白的R-mEV的设计、构建和富集（图3和图4）。

Figure 1
图1：分枝杆菌细胞外囊泡富集的示意图。 “天数”（红色字体，图顶部）是指从 Msm 富集 mEV 所需的天数（特别是对于协议步骤 1 和 2）。“步骤”（黑色字体，图底部）是指协议部分中描述的协议步骤。为了富集 Mtb 的 mEV，尽管所有步骤都相似，但从培养的不同步骤（步骤 1）到离心的第一步（步骤 2）至少需要 10 天。后续步骤需要相同的持续时间（如红色字体所示）。在密度梯度之前，mEVs 颗粒 + 细胞外复合物在富集天然 mEV 和 R-mEV 时看起来是无色的。然而，当富集含有mCherry的mEV时，它会呈现粉红色到蓝色（见 图3）。密度梯度后，mEV在密度梯度管中将显示为白色（天然和R-mEV）或粉红色（如果含有mCherry）。图中mEV的颜色仅用于表示清晰度，并不代表确切的颜色。有关详细信息，请参阅 图 3 。缩写：Msm = M. smegmatis;Mtb = 结核分枝杆菌;0.45 和 0.22 μm = 处置过滤器单元的孔径。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：分枝杆菌 EV 是圆形的，具有密度梯度，尺寸各不相同 。 （A） Msm EV 在透射电子显微镜下通过负染色和观察进行可视化时的代表性图像。比例尺 = 200 nm。（B） 执行 6-60% 密度梯度后 mEV 在超速离心管中出现的代表性图像。如果 6-60% 梯度没有准确分层，则 mEV 的主要（顶部打开箭头）和次要（底部打开箭头）条带的位置会显着改变，从而改变 1 mL 分数数。（C） 对 Msm 的富集 mEV 进行纳米跟踪分析的代表性图像。 纳米跟踪分析揭示了不同大小的 mEV 的比例和浓度以及制剂中 mEV 的总数。平均而言，使用此处详述的协议，~1-3 ×10 10 EV 从 2 L 的 Msm 和 Mtb 中富集。 请 点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3：指示表达 mCherry 的 mEV 富集的不同步骤 。 （A） 代表图像显示表达 Cfp-29：：mCherry 的 Msm axenic 培养物。（B） 表达 Cfp-29：：mCherry 的 Msm axenic 培养物离心后细菌沉淀的代表性图像。（C）通过中心子浓缩器浓缩表达Cfp-29：：mCherry的Msm axenic培养物的废培养基后获得的培养物滤液浓缩物的代表性图像。（D） 从表达 Cfp-29：：mCherry 的 Msm axenic 培养物中获得的培养滤液浓缩物超速离心后 mEVs + 细胞外复合物沉淀的代表性图像。然而，如果 mEV 对于除 mCherry 以外的任何外来蛋白质都是天然的或重组的（与 Cfp-29 融合后），则沉淀将保持无色。（E） 含有 mEV 的 mCherry 的代表性图像。请注意，并非所有 mEV 都是粉红色的，表明并非所有 mEV 都含有 Cfp-29。 良好：代表性图像，表示 Cfp-29：：mCherry EV 富集后通常获得的不同 mEV 条带。由于含有 mCherry 的 EV 密度更大，因此它们会分离成后来的馏分。差：表明分离不良的代表性图像（白色 mEV 在第 1/2 部分分离出来，含有 mCherry 的 mEV 在第 10部分 分离出来（可能是因为 mEVs 颗粒的重悬不良，即方案步骤 2.3.2）。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4：含有 EsxA （ESAT-6） 的重组 mEV，EsxA 是 Msm 总细胞裂解物和 Msm 生成的 EV 中 Mtb 编码的免疫原。 （A） 考马斯凝胶和 （B） 蛋白质分析（用 ESAT6 特异性多克隆抗体检测）图像显示融合的 ExsA 在 Msm 总细胞裂解物和表达 cfp-29：：esxA：：3XFLAG（+ 3XFLAG，泳道 3 和 4（总裂解物）和泳道 8 和 9 （mEV））或 cfp-29 ： ：esxA （- 3XFLAG，泳道 5 和 6（总裂解物）和泳道 10（mEV））。打开和填充箭头分别表示累积的 Cfp-29：：ExsA：：3XFLAG 和 Cfp-29：：ExsA。 请点击这里查看此图的较大版本.

引：
Sl（英语：Sl）# 基因 底漆 序列（5' 至 3'） 源 克隆到
1 CFP-29型 向前 CAGTTCGAA（BstBI）ATGAACAACCTCTATCGC Msm 基因组 DNA pMV261型
反向 GAAAAGCTT（HindIII）GGGGGTCAGCGCGACAG Msm 基因组 DNA pMV261型
2 mCherry的 向前 GAAAAGCTT（HindIII） ggcggcggtggctcg （G4S linker）ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG 实验室集合 pMV261型
反向 TGTGTTAAC（HpaI）CTACTTGTACAGCTCGTCC 实验室集合 pMV261型
3 esxA 向前 GAAAAGCTT（HindIII）ggcggcggtggctcg （G4S linker） ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb基因组DNA pMV261型
反向 TGTGTTAAC（HpaI）TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Mtb基因组DNA pMV261型
4 exsA-3X 旗帜 向前 GAAAAGCTT（HindIII）ggcggcggtggctcg （G4S linker） ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb基因组DNA pMV261型
反向 TGTGTTAAC（HpaI）TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc （3XFLAG） TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Mtb基因组DNA pMV261型

表1：引物序列。 列出了用于扩增 cfp-29、 mCherry、esxA 和 esxA ： ：3X FLAG 和克隆到穿梭载体 pMV261 的正向和反向引物。

补充文件1：A：pMV261，其环图，主要特征和完整的核苷酸序列。黄色highlight-hsp60启动子核苷酸序列;绿色和青色高光限制位点，其中克隆了 mCherry、esxA 和 esxA：：3X FLAG 扩增子。B、C 和 D：分别为 cfp-29、mCherry 和 esxA 的核苷酸序列。cfp-29、mCherry 和 esxA 的绿色高亮终止密码子。请点击这里下载此文件。

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Discussion

由于开发一种优于并可以替代卡介苗的新型结核病疫苗仍然是一个艰巨的挑战，作为一种替代方案，一些小组正在寻求发现不同的亚单位结核病疫苗，这些疫苗可以提高卡介苗的效力并延长其保护期48,49。鉴于细菌 EV （bEV） 作为潜在亚基和天然佐剂50,51 越来越受到关注，持续富集足够数量的 mEV 用于其下游测试/分析已成为重要的一步。正是考虑到这些研究问题，该协议旨在从 axenic 培养物及其重组版本中富集 mEV。

在对 Msm EV 进行详细的质谱蛋白质组分析期间，Prados-Rosales 等人鉴定了 10 种最丰富的蛋白质30。我们进一步假设，经过充分的分子工程，其中一种应该足以将感兴趣的外源蛋白质携带到 mEV 中。有趣的是，Cfp-29 因其各种功能而脱颖而出 39,40,41,42.我们的数据确实表明，它足以携带 mCherry 和 EsxA（尽管 EsxA 需要在其 C 末端有一个小标签才能更稳定）并将它们积累在 mEV 中。最近，在 2021 年，Tang 等人证明了 Cfp-29 是一种荚膜蛋白，具有携带染料脱色过氧化物酶 （DyP） 型过氧化物酶40 的能力。也许，Cfp-29也可以携带其他外来蛋白质。

我们探索了 EsxA，因为它是一种突出的 Mtb 免疫原 37,38,39，可以作为动物模型37,38,39 的亚单位疫苗具有保护作用，体积小;有趣的是，它的直系同源物 （MSMEG_0066） 在 Msm EV 中不存在。虽然我们在这里不讨论这个问题，但我们已经成功地为其他一些 Mtb 蛋白（唯一存在于 Mtb 中且不由 Msm 编码）产生了 R-mEV，包括抗原 85B （Rv 1886c）。与此同时，有趣的是，我们也未能为其他一些蛋白质产生R-mEV，包括全长Rv2660c和Rv0288，可能是因为这些蛋白质对Msm有毒。我们之所以如此得出结论，是因为尽管克隆了正确的核苷酸序列并进行了重复转化，但没有出现Msm的转导物。由于 EsxA 需要在其 C 末端使用 3XFLAG 标签才能更好地在 mEV 中积累，因此我们在我们评估的所有其他 Mtb 编码蛋白中添加了 3XFLAG 标签。尽管有标签，但 Msm 没有存活下来，这表明尽管标签融合，一些 Mtb 蛋白仍然有毒。我们推测，在这些情况下，仅克隆预测的表位区域或将多个表位拼接在一起可能会得到回报（目前正在我们的实验室进行评估）。我们在 Cfp-29 和 mCherry/EsxA 之间使用了一个小的五氨基酸（四个甘氨酸和一个丝氨酸）接头，以尽量减少对目标蛋白折叠的负面影响44,45。我们预测，如果没有这种连接子，目标蛋白折叠将受到 Cfp-29 折叠的强烈影响。

这种富集协议可以很容易地扩展到 Mtb 生成的 EV 的富集。我们还推测，通过该协议从环境分枝杆菌中富集 mEV 也应该是可行的。尽管该协议简单明了，但仍然需要 7-8 天来富集 Msm 生成的 EV 和 R-mEV。相比之下，Mtb 生成的电动汽车的浓缩需要 15-20 天。将电动汽车浓缩到更小的体积既费时又昂贵，我们目前正在探索切向流过滤和其他方法来解决“时间”问题。

最后，我们使用 Sauton 而不是 7H9 来富集 mEV，因为“ADC”补充剂含有大量的牛血清白蛋白，可能会干扰 mEV 的任何下游使用。该协议可以很容易地扩展到必须用于评估mEV组成的任何其他特定介质（例如，低铁介质）。或者，对于某些应用，在最后一步（即方案步骤2.7.5），在将无菌盐水注射到小鼠或豚鼠中进行各种 基于体内的分析时，可以使用无菌盐水代替HEPES缓冲液。

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Disclosures

所有作者声明，本研究工作是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系/利益的情况下进行的。

Acknowledgments

作者衷心感谢 Sarah M. Fortune 教授慷慨分享 耻垢分 枝杆菌mc 2155 股票。他们还感谢施维雅医学艺术 （smart.servier.com） 为 图 1 提供了一些基本元素。他们衷心感谢实验室其他成员在长期使用培养箱振荡器、离心机和超速离心机进行 mEV 富集期间对患者调整的支持。他们还感谢实验室助理 Surjeet Yadav 先生始终确保必要的玻璃器皿和耗材始终可用且方便。最后，他们感谢 THSTI 的行政、采购和财务团队在项目无缝执行方面的持续支持和帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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免疫学与感染，第 202 期，细胞外囊泡、重组囊泡、Esat-6、分枝杆菌、ExsA、mCherry、Cfp-29、细菌

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

富集分枝杆菌的天然和重组细胞外囊泡
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Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

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