Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Berigelse af indfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler af mykobakterier

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol beskriver berigelsen af indfødte mykobakterielle ekstracellulære vesikler (mEV'er) fra axeniske kulturer af Mycobacterium smegmatis (Msm), og hvordan mCherry (en rød fluorescerende reporter) -indeholdende rekombinante MsmEV'er kan designes og beriges. Endelig verificerer den den nye tilgang med berigelse af MsmEV'er, der indeholder EsxA-proteinet fra Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

De fleste bakterier, herunder mykobakterier, genererer ekstracellulære vesikler (EV'er). Da bakterielle EV'er (bEV'er) indeholder en delmængde af cellulære komponenter, herunder metabolitter, lipider, proteiner og nukleinsyrer, har flere grupper evalueret enten de indfødte eller rekombinante versioner af bEV'er for deres beskyttende styrke som underenhedsvaccinekandidater. I modsætning til native EV'er er rekombinante EV'er molekylært konstrueret til at indeholde et eller flere immunogener af interesse. I løbet af det sidste årti har forskellige grupper udforsket forskellige tilgange til generering af rekombinante bEV'er. Men her rapporterer vi design, konstruktion og berigelse af rekombinante mykobakterielle EV'er (mEV'er) i mykobakterier. Til det formål bruger vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en avirulent jordmykobakterie som modelsystem. Vi beskriver først generering og berigelse af indfødte elbiler af Msm. Derefter beskriver vi design og konstruktion af rekombinante mEV'er, der indeholder enten mCherry, et rødt fluorescerende reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), et fremtrædende immunogen af Mycobacterium tuberculosis. Vi opnår dette ved separat at fusionere mCherry og EsxA N-termini med C-terminalen af et lille MSM-protein Cfp-29. Cfp-29 er et af de få rigeligt tilstedeværende proteiner i MsmEV'er. Protokollen til generering og berigelse af rekombinante mEV'er fra Msm forbliver identisk med generering og berigelse af native EV'er af Msm.

Introduction

På trods af udvikling og administration af en bred vifte af vacciner mod infektionssygdomme, selv den dag i dag, forekommer ~ 30% af alle menneskelige dødsfald stadig fra smitsomme sygdomme1. Før fremkomsten af tuberkulosevaccinen (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - var TB den største dræber (~ 10.000 til 15.000 / 100.000 indbyggere)2. Med administrationen af BCG og nem adgang til første og anden linje anti-TB-lægemidler er TB-relaterede dødsfald i 2022 dramatisk faldet til ~ 1 million / år i 2022 (dvs. ~ 15-20 / 100,000 befolkning1). I TB-endemiske befolkninger i verden ligger TB-relaterede dødsfald imidlertid fortsat på ~ 100-550/100.000 befolkning1. Mens eksperter anerkender flere grunde, der fører til disse skæve tal, synes BCG-medieret beskyttelse, der ikke varer i selv det første årti af livet, at være den fremtrædende årsag 3,4,5,6,7. I betragtning af FN's fornyede "mål for bæredygtig udvikling" og WHO's "End TB-strategi" er der derfor en samordnet global indsats for at udvikle et meget overlegent vaccinealternativ til BCG, der måske giver livslang beskyttelse mod TB.

For at nå dette mål evaluerer flere grupper i øjeblikket modificerede/rekombinante BCG-stammer, andre ikke-patogene og svækkede mykobakterielle arter end BCG og underenhedskandidaterne 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typisk er underenhedsvacciner liposomer, der selektivt er fyldt med få rensede (~ 1-6) fuldlængde eller afkortede immunogene proteiner fra patogenet. På grund af deres falske foldning i ikke-indfødte konformationer og / eller tilfældige ikke-funktionelle interaktioner mellem de indlæste proteiner mangler underenheder ofte indfødte og tyske epitoper og undlader derfor at prime immunsystemet tilstrækkeligt14,19,20.

Derfor har ekstracellulære vesikler (EV'er) af bakterier taget fart som et lovende alternativ 21,22,23,24,25,26. Typisk indeholder bakterielle EV'er (bEV'er) en delmængde af deres cellulære komponenter, herunder nogle dele af nukleinsyrer, lipider og hundredvis af metabolitter og proteiner27,28. I modsætning til liposomer, hvor nogle få oprensede proteiner er kunstigt indlæst, indeholder bEV'er hundredvis af naturligt belastede, naturligt foldede proteiner med en bedre tilbøjelighed til at prime immunsystemet, især uden boost / hjælp fra adjuvanser og Toll-like receptor (TLR) agonister27,28,29. Det er i denne forskningslinje, at vi og andre har udforsket nytten af mykobakterielle EV'er som potentielle underenhedsboostere til BCG30. På trods af bekymringer om, at bEV'er mangler ensartede antigenbelastninger, har EV'er fra svækket Neisseria meningitidis med succes beskyttet mennesker mod serogruppe B meningococcus31,32.

I det mindste teoretisk set er de bedste elbiler, der kan øge BCG godt, elbiler beriget med patogene bakterier. Imidlertid er berigende elbiler genereret af patogen mycobacterium dyrt, tidskrævende og risikabelt. Derudover kan patogengenererede elbiler være mere virulente end beskyttende. I betragtning af de potentielle risici rapporterer vi her en veltestet protokol til berigelse af elbiler genereret af axenisk dyrket Msm, en avirulent mycobakterie.

På trods af kodning af flere patogenproteinortologer mangler avirulente mykobakterier imidlertid flere vaccineantigener/patogene proteinepitoper, der er nødvendige for at forberede immunsystemet tilstrækkeligt til beskyttelse33. Derfor undersøgte vi også konstruktion og berigelse af rekombinante EV'er af Msm gennem molekylær teknik, således at en betydelig del af ethvert patogent protein af interesse udtrykt og oversat i Msm, skal nå sine EV'er. Vi antog, at et eller flere af de 10 bedste rigelige proteiner i MSM EV'er, når de smeltes sammen med proteinet af interesse, vil hjælpe med en sådan translokation.

Mens vi begyndte at standardisere berigelsen af mykobakterielle EV'er (mEV'er) i vores laboratorium, rapporterede Prados-Rosales et al. i 2011 først visualisering og berigelse af mEV'er in vitro30. Senere, i 2014, offentliggjorde den samme gruppe en modificeret version af deres 2011-metode34. I 2015 rapporterede Lee et al. også en uafhængigt standardiseret metode til mEV-berigelse igen fra axeniske kulturer af mykobakterier35. Ved at kombinere begge protokoller 34,35 og inkorporere et par af vores ændringer efter grundig standardisering beskriver vi her en protokol, der hjælper rutinemæssigt med at berige mEV'er fra axeniske kulturer af mykobakterier36.

Her beskriver vi især berigelsen af Msm-specifikke elbiler, som er en udvidelse af en offentliggjort protokol36 til berigelse af mykobakterielle elbiler generelt. Vi beskriver også, hvordan man konstruerer rekombinante mEV'er (R-mEV'er), der indeholder mCherry-proteinet (som en rød fluorescerende reporter) og EsxA (Esat-6)37,38,39, et dominerende immunogen og en potentiel underenhed vaccinogen af Mycobacterium tuberculosis. Protokollen til berigelse af R-mEV'erne forbliver identisk med den, vi har beskrevet til berigelse af native EV'er fra Msm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vækstbetingelser for Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli og derivater heraf

  1. Medie
    1. Middlebrook 7H9 flydende bouillon
      1. Forbered 20% Tween-80 stamopløsning ved at forvarme det krævede volumen dobbeltdestilleret vand (ddw) i et glasbægerglas til ~ 45-50 oC i en mikrobølgeovn, tilsæt det krævede volumen Tween-80 ved hjælp af en passende målecylinder, og rør kontinuerligt på en lille magnetisk omrører for at bringe 20% Tween-80 i ensartet opløsning. 20% Tween-80 filtreres gennem et 0,22 um bortskaffelsesfilter, og den lysegule stamopløsning opbevares ved 4o C.
        BEMÆRK: Alle spor af Tween-80 i måleglasset skal overføres til bægerglasset for at opnå nøjagtig slutkoncentration. Autoklave ikke den forberedte Tween-80-bestand. Filtrer (brug 0,22 μM), steriliser og opbevar ved 4 oC.
      2. Følg producentens anvisninger til fremstilling af 7H9 bouillon. Suspender 4,7 g 7H9 pulver i 900 ml ddw. Tilsæt 2 ml glycerol, bland indholdet og autoklave ved 121 oC, 15 psi i 20 minutter.
        BEMÆRK: Tilføj ikke Middlebrook ADC-berigelse (ADC) og Tween-80 før autoklavering.
      3. Når det autoklaverede medie er afkølet til stuetemperatur (RT, dvs. ~ 25 oC), tilsættes aseptisk i et standard A2-type biosikkerhedskabinet 10x lager på 100 ml ADC (endelig 1x) og 2,5 ml (endelig 0,05%) 20% Tween-80. Blandingen filtreres gennem en 0,22 μm engangsfilterenhed, og den meget lysegulgrønne, gennemsigtige stamopløsning opbevares ved 4 oC.
        BEMÆRK: Mediets pH-værdi skal være ~6,6 til 6,8 (hvis <6,4 eller >7,0, kasseres og friskgøres). Opbevares ved 4 oC (stabil i 3-4 uger). Det anbefales stærkt at filtrere 7H9-mediet (efter tilsætning af ADC og Tween-80) to gange gennem to uafhængige 0,22 μm engangsfilterenheder.
    2. Sautons (minimale medier) flydende bouillon
      1. Opløs L-asparagin (0,4% w/v) og citronsyre (0,2% w/v) i 950 ml ddw. Tilsæt 1 ml hver af frisklavede 1.000x lagre (i ddw) dibasisk kaliumphosphat (farveløs; lager 10 g/20 ml; endelig 1x 0,5 g/l); magnesiumsulfatheptahydrat (farveløs; lager 10 g/20 ml; endelig 1x 0,5 g/l); og jernammoniumcitrat (meget lysebrun; lager 1,6 g/40 ml; endelig 1x 0,04 g / l) og rør godt på en magnetomrører.
        BEMÆRK: I bedste fald kan 1,000x lagrene være 2 uger gamle; hvis ældre end det, skal du forberede friske lagre; opbevar dem på RT i mørke (f.eks. inde i et skab / hylde). Hvis jernammoniumcitratet er mørkebrunt, kasseres det og gøres frisk. Det er bedst at tilsætte de tre salte i den rækkefølge, der er nævnt i trin 1.1.2.1. Hæld opløsningen hver gang, før du tilsætter hver saltopløsning.
      2. Mål og noter pH-værdien ved hjælp af en pH-meter; Sørg for, at det er omkring 3,1 til 3,2. Hvis pH-værdien er over 3,7, kasseres lagrene og tilberedes frisk. For at justere pH til 7,4 skal du bruge så mange dråber 10 N natriumhydroxid som nødvendigt. Overvåg den endelige pH-værdi, mens opløsningen/mediet kontinuerligt omrøres på en magnetisk omrører.
      3. Der tilsættes 4,76 ml glycerol, 0,25 ml 20% Tween-80 (endelig 0,005 %, se også bemærkning til trin 2.2.1.3), og først derefter fyldes volumen op til 1 liter. Derefter filtreres og steriliseres to gange 1 liter medium med to separate 0,22 μm bortskaffelsesfiltre. Opbevar det klare, farveløse medium ved 4 oC (stabilt i 2 uger).
        BEMÆRK: Først efter at pH er justeret til 7,4, tilsættes glycerol. Ellers bliver medierne overskyet hvide. Hvis det er overskyet, skal du kassere det (prøv ikke at opvarme det) og forberede det frisk. Til alle mEVs præparater skal du bruge frisklavede Sauton's.
    3. Middlebrook 7H11 agar base
      1. Følg producentens anvisninger for klargøring. 19 g 7H11 pulver suspenderes i 900 ml ddw. Tilsæt 5 ml glycerol, hvirvl på en magnetisk omrører for at opnå en ensartet suspension (lysegrøn; pH 6,6 til 6,8; hvis >7,2, kassér og tilbered frisk) og autoklave ved 121 oC, 15 psi og i 20 min.
        BEMÆRK: Tilføj ikke ADC og 0,05% Tween-80 før autoklavering.
      2. Når mediet afkøles til ~ 50 oC, aseptisk i et biosikkerhedsskab af A2-typen, tilsættes 100 ml ADC (bragt til RT) og 2,5 ml 20% (endelig 0,05%) Tween-80 (bragt til RT). Dispenser straks aseptisk i petriskåle.
        BEMÆRK: Pladerne er stabile ved 4 oC i mindst 4-6 uger. Sørg for, at pladerne er på RT natten over, før pladerne pakkes ind til 4 oC opbevaring. Ellers vil fugt blive fanget i pladerne under inkubationen ved 37 oC.
    4. Miller Luria Bertani (LB) bouillon og agarbase
      1. Følg producentens anvisninger for klargøring. For at forberede LB Broth suspenderes 25 g pulver i 1.000 ml ddw og omrøres forsigtigt i 5 minutter i et glasbægerglas på en magnetomrører. Efter ensartet suspension alikvote de nødvendige volumener i medieflasker (f.eks. 300 ml i en 500 ml medieflaske) og autoklave. For at fremstille LB Agar suspenderes 40 g pulver i 1.000 ml ddw og autoklave (12 g pulver i 300 ml ddw i en 500 ml glasmedieflaske).
  2. Vækstbetingelser
    BEMÆRK: Alle trin i bakteriekulturarbejde skal udføres i et biosikkerhedsskab (A2-type). Alle kulturer skal behandles med sterile rør, kolber og pipettespidser.
    1. Dag 1
      1. Tilsæt 1 ml hver glycerolbestand af Msm (fra -80 o C fryser) til 2 x 10 ml (i 50 ml sterile koniske centrifugerede rør) frisk autoklaveret, afkølet og forvarmet (~ 37 o C) 7H9 bouillon, hvirvl tre gange, luk lågene og inkuber rørene natten over ved 37 o C og 200-220 o/ min (inkubatorryster).
        BEMÆRK: For at dyrke Mycobacterium tuberculosis (Mtb) skal du følge lignende trin, men inkubere 50 ml rørene i 4-6 dage ved 37 o C og 120-150 o/ min (inkubatorryster) i BSL3-indstillinger. Følg ALLE internationale retningslinjer og biosikkerhedspraksis for BSL3- og risikogruppe 3-patogener, mens du håndterer og kasserer Mtb og dets kulturer. Brug biosikkerhedsskab af B2-typen til håndtering af Mtb og dets kulturer.
    2. Dag 2
      1. Når OD 600 (A600nm; celledensitetsmeter) når ~ 1,0, centrifugeres MSM-kulturerne i 10 minutter ved 3.200 × g og RT (benchtop centrifuge). Supernatanterne kasseres med sterile 1 ml pipettespidser.
        BEMÆRK: Ovenstående trin forbliver det samme for Mtb-kulturer, bortset fra at antallet af dage er 4-7. Sørg for ikke at røre bakteriepillen med pipettespidsen.
      2. Vask: Til hver MSM-pille tilsættes 1 ml forvarmet Sautons (ved RT) medie (trin 1.1.2) og opslæmmes forsigtigt med 1 ml pipettespidser for at opnå en ensartet suspension. Brug sterile pipettespidser til at fylde mængderne op til 10 ml (i hver) med det samme medie. Suspensionerne centrifugeres i 10 minutter ved 3.200 × g og RT, og supernatanterne kasseres. Gentag dette trin igen.
        BEMÆRK: Ovenstående trin forbliver det samme for Mtb-kulturer.
      3. Resuspender de to gange vaskede MSM-celler i 20 ml (hver) forvarmede Sautons (forvarmet i en plade- eller rysteinkubator) og mål cellernes optiske tæthed ved 600 nm. Det krævede volumen MSM-kulturer podes i sterile 1 L Erlenmeyerkolber, der indeholder ~330 ml sterile Sauton'er, således at den endelige OD600 er ~0,05.
        BEMÆRK: Resuspensioner skal altid begynde i et lille volumen. Hvis det endelige volumen tilsættes direkte til pelleten som et enkelt trin, forbliver cellerne som diffuse pellets (en indikator for dårlig resuspension). Den eneste måde at løse problemet på er at dreje kulturerne ned og gentage resuspensionen som anbefalet. Ovenstående trin forbliver det samme for Mtb-kulturer.
    3. Dag 2/3
      1. Inkuber 330 ml kulturen i inkubatorrysteren ved 200 o / min og 37 oC, indtil kulturen OD600 når ~ 0,3. Derefter vaskes cellerne en gang (svarende til trin 1.2.2.2, men med samme volumen), og derefter resuspenderes pelleten i samme volumen. 50 ml af de resuspenderede kulturer fordeles hver i seks sterile 1 L sterile Erlenmeyerkolber, der hver indeholder 280 ml sterile forvarmede Sauton'er med 1/10af normalt anvendte (0,05%) Tween-80, dvs. 0,005% (se også note til trin 2.2.1.3. for at forstå hvorfor 1/10th). Den endelige OD600 skal være ca. 0,05.
        BEMÆRK: For Mtb-kulturer skal du i stedet for Erlenmeyer-kolber bruge rulleflasker (med en kapacitet på 1/2/4 L). Volumenet pr. flaske justeres, således at kulturen ikke når flaskens munding, når den opbevares på rulleapparatet. Det faktiske volumen i rulleflasken afhænger af rulleflaskens kapacitet.
      2. Hver af de 330 ml kulturer inkuberes i inkubatorrysteren ved 200 o / min og 37 oC, indtil OD600 når 2,0 til 2,5 (~ 15-18 timer).
        BEMÆRK: For Mtb-kulturer skal du sikre dig, at den endelige OD600 er ~ 1,0-1,2 (tager ~ 5-8 dage).

2. Berigelse af MSM mEV'er ved anvendelse af densitetsgradientcentrifugering

  1. Dag 4
    1. ~2 L af Msm-kulturer i mellemeksponentielt stadium centrifugeres i 6 x 400 ml sterile centrifugeflasker ved 4 oC i 20 minutter ved ~8.000 × g (gulvmodelcentrifuge). Den brugte medie-/kultursupernatant opsamles i to forkølede, autoklaverede 1 L Erlenmeyerkolber, og der opbevares en delprøve af pellet til analyseprocedurer (f.eks. SDS-PAGE og western blotting, der ikke er beskrevet her).
      BEMÆRK: Alle efterfølgende trin skal udføres i kulde (~ 4 °C) for bedre at opretholde mEV'ernes integritet. MEV'erne er ret stabile ved RT, men køling er et must for langsigtet stabilitet (gentagen frysning og optøning anbefales ikke). Under aksenisk kulturvækst adskilles mEV'er fra overfladen af Msm/Mtb og akkumuleres i kultursupernatanten/brugte medier.
    2. Msm-kultursupernatanten filtreres først gennem 0,45 μm bortskaffelsesfilterenheden/-enhederne og derefter gennem 0,22 μm bortskaffelsesfilterenheden/-enhederne for at fjerne alle spor af bakterier.
      BEMÆRK: Direkte filtrering gennem 0,22 μm filtrene kvæler ofte filterenhederne (da bakteriepillen kan blive forstyrret under udførelse af trin 2.1.1.). For at generere Mtb-kultursupernatanter skal du udføre tre filtreringer af Mtb-kulturer (dvs. første filtreringstrin med en 0,45 μm engangsfilterenhed; to på hinanden følgende filtreringstrin med 0,22 μm engangsfilterenheder), før kulturfiltraterne flyttes til BSL-2-indstillinger.
  2. Dag 4/5
    1. Brug 30 kDa membrankoncentratorerne til at koncentrere MSM-kulturfiltratet (~2 L) ned til ~ 38 ml ved centrifugering af kulturfiltratet ved 4 oC, 20 min og ved 3.200 × g.
      1. Forvask koncentratorerne først med steril, kold ddw (~15 ml) (vask ved 4 oC, 5 min og ved 3.200 × g).
      2. Vask med ~15 ml forfiltreret, kold Sauton's (samme betingelser som for vand (2.2.1.1.)) for at fjerne alle spor af kemikalier (brugt under fremstillingen).
      3. Da ~ 130 centricons (hvis kun en brug) er teknisk påkrævet for at koncentrere ~ 2 L kulturfiltrat, skal du genbruge centricons mindst 3-4 gange, hvis det er nødvendigt. Følg disse trin: koncentrer 15 ml til 0,5 til 1,0 ml (følg trin 2.2.1), overfør koncentratet til et rent, autoklaveret og koldt 38 ml ultracentrifugerør, og overfør derefter det resterende ikke-koncentrerede kulturfiltrat til de anvendte centricons for gentagen koncentration.
        BEMÆRK: Brug af 24, 30 kDa koncentratorer til at koncentrere 2 L kulturfiltrat vil tage op til 6 timer. Ved koncentrering af kulturfiltratet bliver Tween-80 også koncentreret og kan blokere koncentratoren. Brug af Tween-80 til 0,005% endelig (snarere end 0,05%) i Sautons medier hjælper med at forhindre denne blokering. Den reducerede koncentration af Tween-80 påvirker ikke den ensartede suspension af Msm under vækst og forårsager ikke sammenklumpning af MSM-celler. Men da Mtb-celler klumper sig sammen ved 0,005% Tween-80, skal du bruge 0,05% Tween-80 til Mtb-specifikke elbiler.
    2. Det koncentrerede MSM-kulturfiltrat (~38 ml) overføres til et rent, vasket (med ddw) og forkølet 40-50 ml polypropylencentrifugerør, og underkast det en totrinscentrifugering, først ved 4.000 × g og derefter ved 15.000 × g, begge trin ved 4 oC i 20 minutter (for at fjerne alt snavs). Brug en gulvcentrifuge til det samme.
  3. Dag 5/6
    1. Dyrkningssupernatanten overføres til et forkølet 38,5 ml polypropylen ultracentrifugeglas og centrifugeres i en ultracentrifuge ved 100.000 × g i 4 timer ved 4o C.
      BEMÆRK: En svingspand fungerer bedst ved denne hastighed. Sørg for at fylde ultracentrifugerøret til randen og have et balance ultracentrifugerør med tilsvarende vægt. Hvis et af rørene sidder fast i svingspanden efter centrifugering (hvilket sker på grund af kondens), skal du forsigtigt fjerne det fra rotoren ved hjælp af tang. Aftørring af den kondenserede fugt, der findes på ultracentrifugens ydre overflade, før ultracentrifugering forhindrer klæbning.
    2. Supernatanten opbevares i et 50 ml forkølet rør (se note). Vend ultracentrifugeglasset på et friskt, fnugfrit, absorberende papir for at fjerne spor af supernatanten. Pellet resuspenderes i 600 μL HEPES-bufferopløsning (50 mM HEPES og 150 mM NaCl, pH 7,4; filtersteriliseres før brug).
      BEMÆRK: Gem kun supernatanten som backup. Den oprindelige mEV-pellet fremstår som en gelélignende 5-7 mm diameter, kedelig grågul til gennemskinnelig plet. Hvis der ikke er nogen pellet synlig, gentages trin 2.3.1 ved at genbruge den gemte supernatant. Hvis der ikke vises nogen pellet efter gentagelse af trin 2.3.1, kasseres og genstartes fra trin 1.2. Pelleten tager tid at resuspendere. Det anbefales at tilføje HEPES-bufferen og lade den stå natten over ved 4 oC for nem resuspension. Resuspender forsigtigt, men med gentagen pipettering (brug P200-spidser for bedre resuspension) indtil ensartet resuspension.
  4. Dag 6
    1. Udsæt det resuspenderede pellet for »iodixanol«-baseret densitetsgradientcentrifugering.
      1. Lag den resuspenderede pellet i bunden af det 13 ml rene, vaskede (med ddw) og forkølede ultraklare polypropylen ultracentrifugerør og bland forsigtigt (brug 1 ml pipette) med ~ 4 ml inert densitetsgradient 'iodixanol' opløsning (kommercielt tilgængelig som en ~ 60% w / v opløsning). Efter lagdeling af den resuspenderede pellet i bunden af røret (til maksimalt 5 ml) overlejres derefter med 1 ml (w/v) hver på 40%, 30%, 20% og 10% underlagre af 'iodixanol' i den respektive rækkefølge (forbered underlagre (med HEPES-buffer) fra 60% lager). Tilsæt derefter 4 ml 6% underlager (fremstillet af 60% lager med HEPES-buffer) øverst for at fylde røret.
        BEMÆRK: Forbered gradienten lige før brug; Opbevar og brug aldrig.
      2. Vej forsigtigt (uden at ryste), vej røret i et glasbægerglas, og overfør det forsigtigt til den svingende skovlrotor.
        BEMÆRK: Vejning er nødvendig for at afbalancere med et attraprør (også vejet).
      3. Udsæt den for ultracentrifugering ved 141.000 × g i 16 timer ved 4 oC.
  5. Dag 7
    1. Glasset fjernes forsigtigt (se bemærkningen i trin 2.3.1) og opsamles 1 ml fraktioner i friskautoklaverede mikrocentrifugeglas; Vær opmærksom på de 4. til 6. fraktioner, som typisk indeholder MSM mEV'erne.
      BEMÆRK: mEV'erne fra disse fraktioner fraktioneres normalt i tre eller fire mEV-bånd (det ene er hovedbåndet), der er kedelige hvide i farven. R-mEV'erne, der indeholder mCherry, fraktioneres ud i 5. til 7. fraktion og ser mørk lilla ud til magenta. Mtb EV'erne fraktionerer typisk ud i 5. til 7. fraktion. Adskillelsen af mEV'erne i gradienten afhænger af den anvendte gradientkoncentration, og hvor godt gradienten er lagdelt. Hvis mEV'er brister delvist, kan de fraktioneres ud i tidligere fraktioner. Alternativt, hvis pellet opnået efter trin 2.3.2 ikke resuspenderes godt, danner vesiklerne tætte mikropellets, der fraktioneres ud som senere fraktioner. Vi anbefaler kun præcis indsamling af fraktionerne, når brugeren ønsker at vurdere, hvilke af 1 ml-fraktionerne der indeholder mEV'erne. Brugere kan lide at alikvote i mindre eller større fraktioner baseret på deres bekvemmelighed. Når vi bruger dem til visse applikationer, for eksempel ved at teste dem som en potentiel underenhedsvaccinebooster til BCG, begrænser vi vores indsamling af mEV'erne til mindre end 250 μL af fraktionerne (hvor mEV'er fraktioneres), så vi specifikt kun kan indsamle mEV-båndene og behandle som angivet i 2.7.5. Dette hjælper med mere effektivt at fjerne alle spor af iodixanol, der kan forstyrre vejen for vores downstream-eksperimenter.
  6. Dag 8
    1. De mEV-holdige fraktioner samles, fortyndes med HEPES-buffer til 38 ml, og ultracentrifugeringen gentages ved 4o C i16 timer ved 100.000 × g. Resuspender pellet (som i trin 2.3.2 med de samme advarsler) enten i HEPES-buffer eller i enhver buffer, som nedstrømseksperimenter (ikke beskrevet her), såsom proteinestimering, nanosporingsanalyser, negativ farvning, transmissionselektronmikroskopi, western blotting og immun-guldmærkning kræver.
      BEMÆRK: For bedre resuspension, sonikere mEV-holdige rør i 10 min ved hjælp af en ultralyd vandbad sonikator. Sonikering i længere tid kan indlede brud og tab af intakte mEV'er. Hvis suspenderet godt, er sonikering unødvendig. Alle trin fra 2,1 til 2,6 er identiske, mens de beriger Mtb-genererede elbiler.

3. Konstruktion og berigelse af rekombinante mEV'er.

BEMÆRK: Et af de 10 mest rigelige proteiner (identificeret ved massespektrometri) af MSM EV'er er Cfp-2930. På grund af dets lille størrelse (29 kDa), enkle sekundære struktur 40, lokalisering til membranen 41 og tilbøjelighed til at blive udskilt i brugte medier i axeniske kulturer (f.eks. som et kulturfiltratprotein; udskilt af både Msm og Mtb42,43, er det her blevet udnyttet til at levere en rød fluorescerende reporter og et protein af interesse (EsxAMtb) til mEV'er. For at opnå dette,

  1. Anvend passende fremadgående og omvendte primere (tabel 1; kompatibel til at blive klonet direkte til en shuttle-vektor såsom pMV261) til forstærkning af cfp-29 fra Msm. Ved hjælp af ~50 ng højmolekylært (~>20 kb) Msm-genomisk DNA som skabelon PCR-amplificeres cfp-29-genfragmentet med en high-fidelity-korrekturlæsnings-DNA-polymerase (såsom Phusion eller Q5). Følg producentens anbefalinger til PCR.
    BEMÆRK: Design nødvendige begrænsningssteder i primere for nem kloning i enhver alternativ shuttle-vektor af interesse. PCR-betingelser og volumen varierer med typen og mærket af korrekturlæsnings-DNA-polymerase, der anvendes. Volumenet af reaktionsblandingen vil variere afhængigt af mængden af DNA-skabelon og mængden af korrekturlæsning af DNA-polymerase. Følg producentens anbefalinger for PCR-betingelser, succes med forstærkning og eliminering af ikke-specifik glødning af primere.
  2. PCR renser den eluerede amplicon med ethvert kommercielt tilgængeligt PCR-rensningssæt og verificerer ampliconlængden ved standard agarosegelelektroforese. Fordøje den rensede amplicon.
    1. Anslå mængden af renset amplicon på et spektrofotometer. Brug mindst 2 μg cfp-29 amplicon til fordøjelsen.
    2. Fordøjes først med BstB1 ved 65 o C i 1 time (type og mængde buffer og enzym i henhold til producentens anbefalinger), bring reaktionstemperaturen ned til RT, og fordøjes derefter med HindIII i 1 time ved 37 oC (type og mængde buffer og enzym i henhold til producentens anbefalinger).
    3. PCR renser og eluerer den fordøjede amplikon i 50 μL autoklaveret nukleasefri ddw.
    4. Anslå koncentrationen og udbyttet af den fordøjede amplicon ved hjælp af et spektrofotometer. Opbevares ved -20 oC indtil ligeringsopsætning. BEMÆRK: Efter PCR kontrolleres amplikonlængden (~ 798 + 50 bp) og udbyttet ved elektroforese 10 μL af PCR-reaktionsblandingen på en 1% agarosegel. Selvom dobbelt fordøjelse ikke er mulig med denne kombination af enzymer, vil en kompatibel buffer forhindre gentagen PCR-oprensning og efterfølgende tab af fordøjet amplicon. Koncentrationen af fordøjet amplicon varierer med det kit, der anvendes til PCR-oprensning. Det varierer også med længden (i bp) af eventuelle alternative vektorer efter eget valg.
  3. Anvend de fremadgående og omvendte primere (tabel 1), en korrekturlæsning af DNA-polymerase og ~ 50 ng af Mtb genomisk DNA, PCR amplificere esxA- eller esxA-3X FLAG-tag specifik amplicon. Brug ~ 5 ng passende plasmid-DNA til PCR-forstærkning af mCherry. Plasmid og sekvensdetaljer findes i supplerende fil 1.
    BEMÆRK: Brug en glycin, glycin, glycin, glycin, serin 44,45 (G4S) linker mellem cfp-29 og mCherry / esxA / esxA-3X FLAG; før starten af mCherry hjælper G4S-linkeren mCherry med ikke at gennemgå falske ikke-funktionelle folder (inklusive dem, der drives af Cfp-29). Se cfp-29, hsp60 promoter, mCherry og esxA sekvenser i supplerende fil 1. Plasmider, der fungerer som skabeloner til mCherry, er tilgængelige på forskellige plasmiddepoter / banker. Forskellige versioner (let ændrede sekvenser) af mCherry er tilgængelige, der kræver ændrede fremadgående og omvendte primersekvenser. Primere (tabel 1) hjælper med at forstærke den mCherry, der er nævnt i supplerende fil 1. Fusion af N-terminalen af mCherry/esxA/esxA::3XFLAG til den C-terminale ende af Cfp-29 fungerer godt.
  4. Fordøje 1 μg DNA fra mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons og rense fordøjet DNA.
    1. Hver amplicon dobbeltfordøjes med hindIII og HpaI i 1 time ved 37 oC (eller i henhold til producentens anbefalinger).
    2. Brug et kommercielt tilgængeligt PCR-rensningssæt og producentens anbefalinger til rensning af den fordøjede amplicon. Eluer den fordøjede amplikon i 50 μL autoklaveret nukleasefri ddw.
    3. Anslå koncentrationen og udbyttet af den fordøjede amplicon ved hjælp af et spektrofotometer. Opbevares ved -20 oC indtil ligeringsopsætning.
  5. Der aflægges 2 μg pMV261-KanR (supplerende fil 1) eller en egnet kloningsvektor med det eller de enzymer, du vælger.
    1. Fordøjes først med BstB1 ved 65 o C i 1 time (type og mængde buffer og enzym i henhold til producentens anbefalinger), bring reaktionstemperaturen ned til RT, og fordøjes derefter med HindIII i 1 time ved 37 oC (type og mængde buffer og enzym i henhold til producentens anbefalinger).
    2. Gel renser og eluerer i 50 μL autoklaveret nukleasefri ddw.
    3. Anslå koncentrationen og udbyttet af den fordøjede vektor ved hjælp af et spektrofotometer. Opbevares ved -20 oC indtil ligeringsopsætning.
      BEMÆRK: Et-trins to-fragment kloning er mulig med ovenstående primere til pMV261. Enhver alternativ shuttle-vektor, der overlever som et episom, fungerer. Integrative plasmider vil også fungere, men rekombinant proteinudbytte vil være relativt mindre pr. Cellebasis.
  6. Ligate og omdanne til en kompatibel stamme af E. coli.
    1. Til ligering skal du bruge 125 ng af vektoren. Brug passende fordøjede mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons i forholdet 1:3 molær. Der udføres ligering natten over ved hjælp af T4 DNA-ligase (mængde i henhold til producentens anbefalinger) ved 16 °C i et kølet cirkulerende vandbad.
      BEMÆRK: Brug kun passende kontroller såsom vektor med og uden T4 DNA-ligase til evaluering af effektiviteten af fordøjelsen og forudsigelse af effektiviteten af kloningssucces.
    2. Transformation
      1. Optø NEB5α kemisk kompetente celler alikvoter (~100 μL pr. transformation) på is i 15 min. Bland forsigtigt to gange med en steril pipettespids. Tilsæt ligeringsblanding (op til 20 μL) til de kolde kompetente celler.
      2. Bland forsigtigt pipetteceller + ligeret DNA. Inkuber blandingen på is i yderligere 30 minutter.
      3. Der gives varmechok ved 42 °C (i cirkulerende vandbad) i 60 sek. og overføres straks tilbage til is i yderligere 15 minutter.
      4. Genvind de transformerede celler ved at tilsætte 1 ml SOC-bouillon (2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 og 20 mM glucose) og inkuber ved 37 ° C i 1 time ved 200 o / min.
      5. De genvundne bakterier centrifugeres i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas (3000 × g, RT og 10 min), supernatanten kasseres, pelletpen resuspenderes i 200 μL sterile, forvarmede, frisklavede LB-medier, og suspensionen spredes på friskhældte LB Miller-agarplader indeholdende nødvendige antibiotika i passende koncentrationer.
      6. Inkuber petriskålene i en pladeinkubator forudindstillet til 37 oC.
  7. Skærm (ikke detaljeret her) for potentielle kloner, kontroller (ved koloni PCR-/restriktionsenzymbaseret)46 og sekvens (Sanger-sekventering) dem for at bekræfte fusion.
  8. Ekstraktid plasmid DNA (~ 200 ng / 1-2 μL; ethvert kommercielt tilgængeligt kit) af den bekræftede klon (E. coli baggrund) og omdanne det til frisklavede elektro-kompetente celler af Msm.
  9. Fremstilling af MSM elektrokompetente celler
    1. Friskdyrket MSM (som i trin 1.2.1 og 1.2.2). Den friskdyrkede MSM vaskes som i trin 1.3.3 og 1.3.4 (brug kun 7H9 + ADC + Tween-80 (rig) i stedet for Sautons).
    2. Der tilsættes en prøve af de vaskede MSM-celler til en endelig OD 600 på ~0,05 i en steril500 ml Erlenmeyerkolbe indeholdende 150 ml rich media.
    3. Inkuber i inkubatorrysteren ved 200 o / min og 37 oC, indtil kulturen OD600 når ~ 0, 8 til 1, 0 (~ 12-14 timer).
    4. Overfør kulturen til en forkølet 400 ml centrifugeflaske og inkuber på is i 60-90 min. Pellet derefter cellerne ned ved 4 oC i 15 minutter ved 4.000 × g.
    5. Vask cellerne to gange (hver vask med 150 ml, ved 4.000 × g, 4 oC og 15 min) med iskold, steril (autoklaveret) 10% glycerol.
      BEMÆRK: Ved hver vask bliver pillen løs. Vær forsigtig, når du kasserer hele supernatanten (efter hver vask). Ellers vil størstedelen af cellerne gå tabt i den kasserede supernatant.
    6. Vask cellerne igen med 75 ml iskold, steril 10% glycerol indeholdende 0,005% Tween-80.
    7. Resuspender cellepillen i 7,5 ml 10% glycerol med 0,005% Tween-80 og alikvote til 400 μL alikvoter.
      BEMÆRK: Selvom MSM elektrokompetente celler er kompetente i mindst 4 måneder, giver frisklavede elektrokompetente celler de bedste resultater. Ved anvendelse af gamle kompetente celler vises nogle få ikke-lyserøde kolonier (hvide) som falske transformanter. Jo ældre de kompetente celler er, jo flere hvide kolonier.
  10. Transformation af MSM
    1. Optø de MSM-kompetente celler, der er alikvote på is.
      BEMÆRK: Optøning ved RT og transformering af sådanne celler giver mindre effektivitet.
    2. Der tilsættes 1-2 μL plasmid-DNA (~200 ng i alt) til de kolde kompetente celler, blandes forsigtigt med en 1 ml steril pipettespids og overføres til en forkølet steril 2 mm elektroporationskuvette.
    3. Overfør den lukkede kuvette med MSM-kompetente celler + plasmid-DNA-blanding i elctroporatorens mus, luk låget forsigtigt og påfør en puls (eksponentiel henfaldstype) ved 2,5 kV (spænding), 25 μF (kapacitans) og 1000 Ω (modstand).
    4. Tilsæt straks 1 ml forvarmet sterilt rigt (7H9 + ADC + Tween-80) medium til kuvetten, bland forsigtigt med en 1 ml steril pipettespids, og overfør hele indholdet til et 10 ml sterilt rør.
    5. Inkuber indholdet i 3 timer i en inkubatorryster indstillet til 37 o C og 200 o/ min. Centrifuger indholdet i et mikrocentrifugerør (4.000 × g, RT og 10 min), kassér supernatanten, genopslæm pellet i 200 μL sterilt forvarmet rigsmedium, og fordel suspensionen på friskhældte 7H11 agarplader indeholdende ADC, Tween-80 og de nødvendige antibiotika i passende koncentrationer.
      BEMÆRK: For MSM skal du om nødvendigt bruge hygromycin, kanamycin og apramycin i de endelige koncentrationer på henholdsvis 50 μg / ml, 25 μg / ml og 50 μg / ml. MSM i sig selv er IKKE resistent over for disse antibiotika. Brug kun disse antibiotika, når du bruger plasmider med passende resistente gener til udvælgelse/vækst af transformanter/rekombinante MSM-kolonier.
    6. Inkuber petriskålene i en pladeinkubator forudindstillet til 37 oC. Typisk forekommer transformanter mellem 3-5 dage.
      BEMÆRK: Hvis et protein af interesse er giftigt for Msm, kan transformanterne dukke op senere eller ikke dukke op. I sådanne tilfælde klon afkortede versioner af fuld længde.
    7. Lav glycerollagre af de fremvoksende MSM-kolonier efter verifikation for positive kloner (samme som trin 3.7)
  11. For at berige R-mEV'er, der indeholder enten mCherry- eller EsxA-proteiner, skal du først dyrke R-MSM, der udtrykker enten mCherry eller exsA eller esxA::3X FLAG ved at følge trin 1.2.1 til 1.2.3 og derefter følge trin 2.1 til 2.6. for at berige R-mEV'er. R-mEV'erne eluerer ind i 4.-7. fraktioner efter densitetsgradientspin (trin2.5). R-mEVs pellet efter det første ultracentrifugeringstrin (2.3.1). Efter at have udført identisk med trin 2.3.1, skal du kontrollere, at R-mEV'erne er synlige som en mørk lilla til magenta pellet med en diameter på 5-7 mm nederst i midten af ultracentrifugen.
  12. Udfør vestlige analyser47 (ikke detaljeret her) for at detektere protein(er) af interesse inden for de berigede R-mEV'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi bruger M. smegmatis (Msm) som model mycobacterium til at demonstrere berigelsen af både native og rekombinante mEV'er (R-mEV'er). Denne skematisk opsummerede mEVs berigelsesprotokol (figur 1) fungerer også til berigelse af R-mEV'er af Msm og native EV'er af Mtb (med mindre ændringer som i protokolnoter af 1.2). Visualisering af de berigede mEV'er kræver negativ farvning under et transmissionselektronmikroskop36 (figur 2A). Typisk adskilles Msm-specifikke elbiler i 4.-6. 1 ml fraktionerne af 13 ml6-60% densitetsgradienten (figur 2B). Ca. 80-100 μg proteinækvivalent af EV'er opnås rutinemæssigt fra 2 liter mid-logaritmiske axeniske kulturer af Msm. Deres diametre ligger typisk mellem 20 nm og 250 nm (figur 2C).

Et langsigtet mål for vores laboratorium er at vurdere, om mEV'er af forskellige mykobakterier potentielt kan fungere som en underenhedsbooster til den eksisterende vaccine, BCG. Da berigende mEV'er genereret af patogene bakterier er tidskrævende, risikabelt og dyrt, kan udnyttelse af indfødte og rekombinante EV'er fra avirulente mykobakterier fungere som et passende alternativ. Derfor sigter vi mod ikke kun at standardisere protokollen for at berige mEV'erne for MSM, men også at konstruere og berige dens R-mEV'er.

For at konstruere R-mEV'er udvalgte vi først de 10 mest rigelige proteiner i MSM-elbiler (tabel 1; vi identificerede dem ud fra detaljerede massespektrometrianalyser af MSM-elbiler)30. Vi antog, at hvis et fremmed protein af interesse er translationelt smeltet til nogen af dem, skal det være i stand til at lokalisere til mEV'er. Derefter shortlistede vi Cfp-29 blandt de 10, fordi det er den mindste blandt dem (~ 29 kDa), er membranlokaliseret og er et kulturfiltratprotein med en relativt simpel sekundær struktur40,41,42,43. Vi fusionerede translationelt mCherrys (fluorescerende protein) N-terminale ende til den C-terminale ende af Cfp-29 og evaluerede dens indlæsning/levering til mEV'er. En del af de berigede mEV'er af Msm blev lyserøde (figur 3), hvilket indikerer Cfp-29's evne til at bære et fremmed protein af interesse i MSM EV'er.

I betragtning af denne evne af Cfp-29 (figur 3) evaluerede vi derefter EsxA (Esat-6), et vigtigt immunogent protein37,38,39 levering til MSM EV'er. Igen genererede vi to uafhængige translationelle fusioner til C-terminalen for Cfp-29-only EsxA og EsxA + 3X FLAG-tag (3X FLAG smeltet sammen med C-terminalen på EsxA. Som forventet observerede vi Mtb's EsxA i MSM EV'er (bane 5, 6 og 10, figur 4A, B), omend i lave mængder. Interessant nok var Cfp-29::EsxA::3XFLAG meget mere stabil (bane 3 og 4 plus 8 og 9; Figur 4A) og akkumuleret på højere niveauer i mEV'er (bane 3 og 4 plus 8 og 9; Figur 4B). Sammenfattende demonstrerer vi design, konstruktion og berigelse af R-mEV'er, der indeholder et fremmed protein af interesse (figur 3 og figur 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af mykobakteriel ekstracellulær vesikelberigelse. 'Dage' (med rød skrift øverst på figuren) henviser til de dage, der er nødvendige for at berige mEV'erne fra MSM (specifikt til protokoltrin 1 og 2). "Trin" (med sort skrifttype nederst på figuren) henviser til protokoltrinnene som beskrevet i protokolafsnittet. For at berige mEV'er fra Mtb, selvom alle trin er ens, tager det mindst 10 dage for de forskellige dyrkningstrin (trin 1) til det første trin i centrifugering (trin 2). Efterfølgende trin kræver identisk varighed (som angivet med rød skrifttype). Før densitetsgradienten ser mEV'erne pellet + ekstracellulære komplekser farveløse ud, når de beriger både native mEV'er og R-mEV'er. Det ser dog lyserødt til blåt ud (se figur 3), når man beriger mEV'er, der indeholder mCherry. Efter densitetsgradienten vises mEV'erne hvide (native og R-mEV'er) eller lyserøde (hvis de indeholder mCherry) i densitetsgradientrøret. Farverne på mEV'er i figuren er kun til at indikere klarhed og repræsenterer ikke de nøjagtige farver. Se figur 3 for yderligere klarhed. Forkortelser: msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberkulose; 0,45 og 0,22 μm = porestørrelse af bortskaffelsesfilterenheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mykobakterielle elbiler er cirkulære, koncentrerer sig med densitetsgradienter og varierer i dimensioner . (A) Et repræsentativt billede af MSM EV'er ved deres visualisering med negativ farvning og visning under et transmissionselektronmikroskop. Skala bar = 200 nm. (B) Et repræsentativt billede af, hvordan mEV'er vises i ultracentrifugerøret ved udførelse af en tæthedsgradient på 6-60%. Hvis gradienten på 6-60 % ikke er nøjagtigt lagdelt, kan placeringen af de overordnede (øverste åbne pil) og mindre (nederste åbne pil) bånd af mEV'er ændre sig betydeligt og dermed ændre brøktallet på 1 ml. (C) Et repræsentativt billede efter nanotracking-analyse af berigede mEV'er af Msm. Nanotracking-analyser afslører proportionerne og koncentrationerne af mEV'er i forskellige størrelser og det samlede antal mEV'er i præparatet. I gennemsnit, med protokollen beskrevet her, ~ 1-3 × 1010 elbiler er beriget fra 2 L msm og Mtb. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Forskellige trin, der indikerer berigelse af mEV'er, der udtrykker mCherry. (A) Repræsentativt billede, der viser Msm axenic culture, der udtrykker Cfp-29::mCherry. (B) Repræsentativt billede af bakteriel pellet efter centrifugering af Msm axenisk kultur, der udtrykker Cfp-29::mCherry. (C) Repræsentativt billede af kulturfiltratkoncentrat opnået efter koncentrering af de brugte medier af Msm axenisk kultur, der udtrykker Cfp-29::mCherry gennem centricon koncentratorer. (D) Repræsentativt billede af mEVs + ekstracellulære komplekser pellet post ultracentrifugation af kulturfiltrat koncentrat opnået fra Msm axenisk kultur, der udtrykker Cfp-29::mCherry. Pelleten ville dog forblive farveløs, hvis mEV'erne enten skulle være native eller rekombinante (ved fusion til Cfp-29) for ethvert fremmed protein (er) undtagen mCherry. (E) Repræsentative billeder af mCherry, der indeholder mEV'er. Bemærk, at ikke alle mEV'er er lyserøde, hvilket indikerer, at ikke alle mEV'er indeholder Cfp-29. Godt: Et repræsentativt billede, der angiver forskellige bånd af mEV'er, der typisk opnås efter berigelse for Cfp-29::mCherry EV'er. Da mCherry-holdige elbiler er tættere, adskilles de i senere fraktioner. Dårlig: Et repræsentativt billede, der indikerer dårlig adskillelse (de hvide mEV'er adskilles i den første/anden fraktion, og de mCherry-holdige mEV'er adskilles i den 10. fraktion (muligvis på grund af dårlig resuspension af mEVs pellet, dvs. protokoltrin2.3.2). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Rekombinante mEV'er indeholdende EsxA (ESAT-6), et Mtb-kodet immunogen i Msm total cellelysat og Msm genererede EV'er. (A) Coomassie gel og (B) vestlige analyse (påvist med ESAT6-specifikt polyklonalt antistof) billeder, der viser akkumulering af smeltet ExsA i både Msm total cellelysat og mEV'er, der udtrykker enten cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, bane 3 og 4 (total lysat) og bane 8 og 9 (mEV'er)) eller cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, bane 5 og 6 (total lysat) og bane 10 (mEV'er)). Åbne og udfyldte pile angiver henholdsvis akkumuleret Cfp-29::ExsA::3XFLAG og Cfp-29::ExsA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Primere:
Sl # Gen Primer Sekvens (5' til 3') Kilde At klone ind i
1 FFP-29 Fremad CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC MSM genomisk DNA pMV261
Omvendt GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG MSM genomisk DNA pMV261
2 mCherry Fremad GAAAAGCTT(HindIII) ggcggcggtggctcg (G4S linker)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Indsamling af laboratorier pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Indsamling af laboratorier pMV261
3 esxA Fremad GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomisk DNA pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 Mtb genomisk DNA pMV261
4 exsA-3X FLAG Fremad GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (G4S linker) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG Mtb genomisk DNA pMV261
Omvendt TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 Mtb genomisk DNA pMV261

Tabel 1: Primersekvenser. Fremadgående og baglæns primere til forstærkning af cfp-29, mCherry, esxA og esxA : :3X FLAG og kloning til shuttle-vektor pMV261 er angivet.

Supplerende fil 1: A: pMV261, dets cirkulære kort, hovedfunktioner og komplet nukleotidsekvens. Gul highlight-hsp60 promotor nukleotidsekvens; Grønne og cyan highlight-restriktionssteder, hvor mCherry, esxA og esxA::3X FLAG amplicons blev klonet. B, C og D: Nukleotidsekvenser af henholdsvis cfp-29, mCherry og esxA . Grønt highlight-stop codon af cfp-29, mCherry og esxA. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da udvikling af en ny TB-vaccine, der er bedre end og kan erstatte BCG, fortsat er en formidabel udfordring, forfølger flere grupper som et alternativ opdagelsen af forskellige underenhed TB-vacciner, der kan øge BCGs styrke og forlænge dens beskyttende varighed48,49. I betragtning af den stigende opmærksomhed på bakterielle EV'er (bEV'er) som potentielle underenheder og som naturlige hjælpestoffer50,51 er konsekvent berigelse af tilstrækkelige mængder mEV'er til deres downstream-test/analyse blevet et vigtigt skridt. Det er i betragtning af disse forskningsspørgsmål, at denne protokol sigter mod at berige mEV'er fra axeniske kulturer og deres rekombinante versioner.

Under detaljerede massespektrometriske proteomanalyser af MSM EV'er identificerede Prados-Rosales et al. de 10 mest rigelige proteiner30. Vi antog endvidere, at efter tilstrækkelig molekylær teknik skulle en blandt dem være tilstrækkelig til at bære et fremmed protein af interesse i mEV'er. Interessant nok stod Cfp-29 ud som den bedst mulige mulighed på grund af dens forskellige funktioner 39,40,41,42. Vores data viser faktisk, at det er tilstrækkeligt nok til at bære mCherry og EsxA (omend EsxA krævede et lille mærke ved sin C-terminal for at være mere stabil) og akkumulere dem i mEV'erne. For nylig, i 2021, viste Tang et al., at Cfp-29 er et indkapsling med evnen til at bære farvestofaffarvningsperoxidase (DyP)-type peroxidaser40. Måske kan Cfp-29 også bære andre fremmede proteiner.

Vi udforskede EsxA, fordi det er et fremtrædende Mtb-immunogen 37,38,39, kan være beskyttende som en underenhedsvaccine i dyremodel37,38,39, er lille i størrelse; og dens ortolog (MSMEG_0066) er interessant fraværende i MSM EV'er. Selvom vi ikke diskuterer dette her, har vi med succes genereret R-mEV'er til et par andre Mtb-proteiner (unikt til stede i Mtb og ikke kodet af Msm), herunder antigen 85B (Rv 1886c). Samtidig lykkedes det interessant nok heller ikke at generere R-mEV'er til et par andre, herunder Rv2660c i fuld længde og Rv0288, muligvis fordi proteinerne er giftige for Msm. Vi konkluderer det, fordi der på trods af kloning af de korrekte nukleotidsekvenser og udførelse af gentagne transformationer ikke opstod nogen transformanter af MSM. Da EsxA krævede et 3XFLAG-tag i sin C-terminalende for bedre akkumulering i mEV'er, tilføjede vi et 3XFLAG-tag til alle andre Mtb-kodede proteiner, som vi evaluerede. På trods af mærket overlevede MSM ikke, hvilket indikerer, at nogle Mtb-proteiner forbliver giftige på trods af tagfusionen. Vi spekulerer på, at kloning af kun de forudsagte epitopregioner eller sammensyning af flere epitoper kan betale sig (i øjeblikket under evaluering i vores laboratorium). Vi brugte en lille fem aminosyre (fire glycin og en serin) linker mellem Cfp-29 og mCherry/EsxA for at minimere den negative indflydelse på foldningen af proteinet af interesse44,45. Vi forudsiger, at uden denne linker ville proteinet af interessefoldning være stærkt påvirket af Cfp-29-foldning.

Denne berigelsesprotokol kan let udvides til berigelse af Mtb-genererede elbiler. Vi spekulerer også i, at berigende mEV'er fra miljømæssige mykobakterier også bør være mulige med denne protokol. På trods af at protokollen er enkel og ligetil, tager det stadig 7-8 dage at berige Msm-genererede elbiler og R-mEV'er. I modsætning hertil kræver det 15-20 dage til berigelse af Mtb-genererede elbiler. Det er tidskrævende og dyrt at koncentrere elbiler til en mindre mængde, og vi undersøger i øjeblikket filtrering af tangentielt flow og andre tilgange til at løse problemet med "tid".

Endelig bruger vi Sautons og ikke 7H9 til at berige mEV'er, fordi 'ADC'-tilskuddet indeholder store mængder bovint serumalbumin, der kan forstyrre enhver downstream-brug af mEV'er. Denne protokol kan let udvides til ethvert andet specifikt medie (f.eks. medier med lavt jernindhold), der skal bruges til at evaluere mEVs sammensætning. Alternativt kan man til visse anvendelser på det sidste trin (dvs. protokoltrin 2.7.5) i stedet for HEPES-buffer anvende sterilt saltvand, når det samme injiceres i mus eller marsvin til forskellige in vivo-baserede analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere erklærer, at dette forskningsarbejde blev udført i mangel af kommercielle eller finansielle forbindelser / interesser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker oprigtigt professor Sarah M. Fortune for venligt at dele M. smegmatis mc2155 lager. De anerkender også Servier Medical Art (smart.servier.com) for at give nogle grundlæggende elementer til figur 1. De anerkender oprigtigt støtten fra resten af laboratoriemedlemmerne til deres patientjusteringer under den lange brug af inkubatorrystere, centrifuger og ultracentrifuger til mEV-berigelse. De anerkender også Mr. Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, for altid at sikre, at de nødvendige glasvarer og forbrugsvarer altid var tilgængelige og praktiske. Endelig anerkender de THSTI's administrative, indkøbs- og økonomiteams for deres konstante støtte og hjælp til problemfri udførelse af projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Global Tuberculosis Report 2022. , https://www.who.int/publications/m/item/global-tb-report (2022).
  2. Luca, S., Mihaescu, T. History of BCG vaccine. Mædica. 8 (1), 53-58 (2013).
  3. Palmer, C. E., Long, M. W. Effects of infection with atypical mycobacteria on BCG vaccination and tuberculosis. The American Review of Respiratory Disease. 94 (4), 553-568 (1966).
  4. Brandt, L., et al. Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine: some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis. Infection and Immunity. 70 (2), 672-678 (2002).
  5. Andersen, P., Doherty, T. M. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nature Reviews. Microbiology. 3 (8), 656-662 (2005).
  6. Kumar, P. A perspective on the success and failure of BCG. Frontiers in Immunology. 12, 778028 (2021).
  7. Fine, P. E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet. 346 (8986), 1339-1345 (1995).
  8. Triccas, J. A. Recombinant BCG as a vaccine vehicle to protect against tuberculosis. Bioengineered Bugs. 1 (2), 110-115 (2010).
  9. Dietrich, G., Viret, J. -F., Hess, J. Mycobacterium bovis BCG-based vaccines against tuberculosis: novel developments. Vaccine. 21 (7-8), 667-670 (2003).
  10. Singh, V. K., Srivastava, R., Srivastava, B. S. Manipulation of BCG vaccine: a double-edged sword. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (4), 535-543 (2016).
  11. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  12. Kaufmann, S. H. E., Gengenbacher, M. Recombinant live vaccine candidates against tuberculosis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (6), 900-907 (2012).
  13. Yuan, X., et al. A live attenuated BCG vaccine overexpressing multistage antigens Ag85B and HspX provides superior protection against Mycobacterium tuberculosis infection. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (24), 10587-10595 (2015).
  14. Vartak, A., Sucheck, S. J. Recent advances in subunit vaccine carriers. Vaccines. 4 (2), 12 (2016).
  15. Lindenstrøm, T., et al. Tuberculosis subunit vaccination provides long-term protective immunity characterized by multifunctional CD4 memory T cells1. The Journal of Immunology. 182 (12), 8047-8055 (2009).
  16. Liu, Y., et al. A subunit vaccine based on rH-NS induces protection against Mycobacterium tuberculosis infection by inducing the Th1 immune response and activating macrophages. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (10), 909-922 (2016).
  17. Ning, H., et al. Subunit vaccine ESAT-6:c-di-AMP delivered by intranasal route elicits immune responses and protects against Mycobacterium tuberculosis infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 647220 (2021).
  18. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  19. Moyle, P. M., Toth, I. Modern subunit vaccines: development, components, and research opportunities. ChemMedChem. 8 (3), 360-376 (2013).
  20. Baxter, D. Active and passive immunity, vaccine types, excipients and licensing. Occupational Medicine. 57 (8), 552-556 (2007).
  21. Lee, W. -H., et al. Vaccination with Klebsiella pneumoniae-derived extracellular vesicles protects against bacteria-induced lethality via both humoral and cellular immunity. Experimental & Molecular Medicine. 47 (9), e183-e183 (2015).
  22. Micoli, F., et al. Comparative immunogenicity and efficacy of equivalent outer membrane vesicle and glycoconjugate vaccines against nontyphoidal Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (41), 10428-10433 (2018).
  23. Obiero, C. W., et al. A phase 2a randomized study to evaluate the safety and immunogenicity of the 1790GAHB generalized modules for membrane antigen vaccine against Shigella sonnei administered intramuscularly to adults from a shigellosis-endemic country. Frontiers in Immunology. 8, 1884 (2017).
  24. Sedaghat, M., et al. Evaluation of antibody responses to outer membrane vesicles (OMVs) and killed whole cell of Vibrio cholerae O1 El Tor in immunized mice. Iranian Journal of Microbiology. 11 (3), 212-219 (2019).
  25. Adriani, R., Mousavi Gargari, S. L., Nazarian, S., Sarvary, S., Noroozi, N. Immunogenicity of Vibrio cholerae outer membrane vesicles secreted at various environmental conditions. Vaccine. 36 (2), 322-330 (2018).
  26. Roier, S., et al. Intranasal immunization with nontypeable Haemophilus influenzae outer membrane vesicles induces cross-protective immunity in mice. PLOS ONE. 7 (8), e42664 (2012).
  27. Furuyama, N., Sircili, M. P. Outer membrane vesicles (OMVs) produced by gram-negative bacteria: structure, functions, biogenesis, and vaccine application. BioMed Research International. 2021, e1490732 (2021).
  28. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nature Reviews Immunology. 23 (4), 236-250 (2022).
  29. Cai, W., et al. Bacterial outer membrane vesicles, a potential vaccine candidate in interactions with host cells based. Diagnostic Pathology. 13 (1), 95 (2018).
  30. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  31. Bai, X., Findlow, J., Borrow, R. Recombinant protein meningococcal serogroup B vaccine combined with outer membrane vesicles. Expert Opinion on Biological Therapy. 11 (7), 969-985 (2011).
  32. Nagaputra, J. C., et al. Neisseria meningitidis native outer membrane vesicles containing different lipopolysaccharide glycoforms as adjuvants for meningococcal and nonmeningococcal antigens. Clinical and Vaccine Immunology: CVI. 21 (2), 234-242 (2014).
  33. Echeverria-Valencia, G., Flores-Villalva, S., Espitia, C. I. Virulence factors and pathogenicity of Mycobacterium. Mycobacterium - Research and Development. IntechOpen. , (2017).
  34. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  35. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  36. Das, S., et al. Development of DNA aptamers to visualize release of mycobacterial membrane-derived extracellular vesicles in infected macrophages. Pharmaceuticals. 15 (1), 45 (2022).
  37. Brandt, L., Elhay, M., Rosenkrands, I., Lindblad, E. B., Andersen, P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity. 68 (2), 791-795 (2000).
  38. Kim, W. S., Kim, H., Kwon, K. W., Cho, S. -N., Shin, S. J. Immunogenicity and vaccine potential of InsB, an ESAT-6-like antigen identified in the highly virulent Mycobacterium tuberculosis Beijing K strain. Frontiers in Microbiology. 10, 220 (2019).
  39. Valizadeh, A., et al. Evaluating the performance of PPE44, HSPX, ESAT-6 and CFP-10 factors in tuberculosis subunit vaccines. Current Microbiology. 79 (9), 260 (2022).
  40. Tang, Y., et al. Cryo-EM structure of Mycobacterium smegmatis DyP-loaded encapsulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (16), (2021).
  41. Rosenkrands, I., et al. Identification and characterization of a 29-kilodalton protein from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by mouse memory effector cells. Infection and Immunity. 66 (6), 2728-2735 (1998).
  42. Gu, S., et al. Comprehensive proteomic profiling of the membrane constituents of a Mycobacterium tuberculosis strain. Molecular & cellular proteomics: MCP. 2 (12), 1284-1296 (2003).
  43. Xiong, Y., Chalmers, M. J., Gao, F. P., Cross, T. A., Marshall, A. G. Identification of Mycobacterium tuberculosis H37Rv integral membrane proteins by one-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 4 (3), 855-861 (2005).
  44. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. -C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  45. Klein, J. S., Jiang, S., Galimidi, R. P., Keeffe, J. R., Bjorkman, P. J. Design and characterization of structured protein linkers with differing flexibilities. Protein Engineering, Design and Selection. 27 (10), 325-330 (2014).
  46. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual, 4th Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  47. Atmakuri, K., Ding, Z., Christie, P. J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens. MolecularMicrobiology. 49 (6), 1699-1713 (2003).
  48. Woodworth, J. S., et al. A Mycobacterium tuberculosis-specific subunit vaccine that provides synergistic immunity upon co-administration with Bacillus Calmette-Guérin. Nature Communications. 12 (1), 6658 (2021).
  49. Khademi, F., Derakhshan, M., Yousefi-Avarvand, A., Tafaghodi, M., Soleimanpour, S. Multi-stage subunit vaccines against Mycobacterium tuberculosis: an alternative to the BCG vaccine or a BCG-prime boost. Expert Review of Vaccines. 17 (1), 31-44 (2018).
  50. Prior, J. T., et al. Bacterial-derived outer membrane vesicles are potent adjuvants that drive humoral and cellular immune responses. Pharmaceutics. 13 (2), 131 (2021).
  51. Tan, K., Li, R., Huang, X., Liu, Q. Outer membrane vesicles: current status and future direction of these novel vaccine adjuvants. Frontiers in Microbiology. 9, 783 (2018).

Tags

Immunologi og infektion udgave 202 Ekstracellulære vesikler rekombinante vesikler Esat-6 mykobakterier ExsA mCherry Cfp-29 bakterier

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Berigelse af indfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler af mykobakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter