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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65138
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1,4, 1, 1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster, 2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 3ICAR-Research Complex for Eastern Region, 4Public Health Research Institute, Rutgers University

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La mayoría de las bacterias, incluidas las micobacterias, generan vesículas extracelulares (VE). Dado que las VE bacterianas (bEV) contienen un subconjunto de componentes celulares, incluidos metabolitos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, varios grupos han evaluado las versiones nativas o recombinantes de las bEV por su potencia protectora como candidatas a vacunas de subunidades. A diferencia de los VE nativos, los VE recombinantes están diseñados molecularmente para contener uno o más inmunógenos de interés. A lo largo de la última década, diferentes grupos han explorado diversos enfoques para generar bEVs recombinantes. Sin embargo, aquí informamos sobre el diseño, la construcción y el enriquecimiento de las VE micobacterianas recombinantes (mEV) en micobacterias. Para ello, utilizamos Mycobacterium smegmatis (Msm), una micobacteria avirulenta del suelo como sistema modelo. En primer lugar, describimos la generación y el enriquecimiento de los vehículos eléctricos nativos de MSM. A continuación, describimos el diseño y la construcción de mEVs recombinantes que contienen mCherry, una proteína reportera fluorescente roja, o EsxA (Esat-6), un inmunógeno prominente de Mycobacterium tuberculosis. Logramos esto fusionando por separado mCherry y EsxA N-terminal con el extremo C-terminal de una pequeña proteína Msm Cfp-29. Cfp-29 es una de las pocas proteínas abundantemente presentes de MsmEVs. El protocolo para generar y enriquecer mEVs recombinantes a partir de Msm sigue siendo idéntico a la generación y enriquecimiento de EVs nativos de Msm.

Introduction

A pesar del desarrollo y la administración de una amplia gama de vacunas contra enfermedades infecciosas, incluso hasta el día de hoy, ~ 30% de todas las muertes humanas todavía ocurren por enfermedades transmisibles1. Antes de la llegada de la vacuna contra la tuberculosis (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tuberculosis era la principal causa de muerte (~10.000 a 15.000/100.000 habitantes)2. Con la administración de BCG y el fácil acceso a medicamentos antituberculosos de primera y segunda línea, para 2022, las muertes relacionadas con la tuberculosis se han reducido drásticamente a ~ 1 millón/año para 2022 (es decir, ~ 15-20/100,000 habitantes1). Sin embargo, en las poblaciones endémicas de tuberculosis del mundo, las muertes relacionadas con la tuberculosis siguen siendo de ~100-550/100.000 habitantes1. Si bien los expertos reconocen varias razones que conducen a estos números sesgados, la protección mediada por BCG que no dura ni siquiera la primera década de vida parece ser la razón principal 3,4,5,6,7. En consecuencia, dados los renovados "Objetivos de Desarrollo Sostenible" de las Naciones Unidas y la "Estrategia para poner fin a la tuberculosis" de la OMS, existe un esfuerzo mundial concertado para desarrollar una vacuna alternativa muy superior a la BCG que tal vez proporcione protección de por vida contra la tuberculosis.

Con ese objetivo, varios grupos están evaluando actualmente cepas de BCG modificadas/recombinantes, especies micobacterianas no patógenas y atenuadas distintas de BCG, y candidatos a subunidades 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por lo general, las vacunas de subunidades son liposomas cargados selectivamente con pocas proteínas inmunogénicas purificadas (~ 1-6) de longitud completa o truncadas del patógeno. Sin embargo, debido a su plegamiento espurio en conformaciones no nativas y/o interacciones aleatorias no funcionales entre las proteínas cargadas, las subunidades a menudo carecen de epítopos nativos y pertinentes y, por lo tanto, no preparan suficientemente el sistema inmune14,19,20.

En consecuencia, las vesículas extracelulares (VE) de las bacterias se han acelerado como una alternativa prometedora 21,22,23,24,25,26. Por lo general, los VE bacterianos (bEV) contienen un subconjunto de sus componentes celulares, incluidas algunas porciones de ácidos nucleicos, lípidos y cientos de metabolitos y proteínas27,28. A diferencia de los liposomas en los que unas pocas proteínas purificadas se cargan artificialmente, los bEV contienen cientos de proteínas cargadas de forma natural y plegadas de forma nativa con una mejor propensión a preparar el sistema inmunitario, especialmente sin el refuerzo/ayuda de adyuvantes y agonistas del receptor tipo Toll (TLR)27,28,29. Es en esta línea de investigación que nosotros y otros hemos explorado la utilidad de los VE micobacterianos como posibles potenciadores de subunidades para BCG30. A pesar de la preocupación de que los BVE carezcan de cargas antigénicas uniformes, los VE de Neisseria meningitidis atenuada han protegido con éxito a los seres humanos contra el meningococo del serogrupo B31,32.

Al menos teóricamente, los mejores VE que podrían impulsar bien la BCG son los VE enriquecidos a partir de bacterias patógenas. Sin embargo, el enriquecimiento de los VE generados por micobacterias patógenas es costoso, requiere mucho tiempo y es arriesgado. Además, los vehículos eléctricos generados por patógenos pueden ser más virulentos que protectores. Dados los riesgos potenciales, aquí informamos de un protocolo bien probado para el enriquecimiento de los VE generados por Msm, una micobacteria avirulenta cultivada axénicamente.

Sin embargo, a pesar de codificar varios ortólogos de proteínas patógenas, las micobacterias avirulentas carecen de varios antígenos vacunales/epítopos de proteínas patógenas necesarios para preparar suficientemente al sistema inmunitario hacia la protección33. Por lo tanto, también exploramos la construcción y el enriquecimiento de EV recombinantes de Msm a través de la ingeniería molecular, de modo que una parte significativa de cualquier proteína patógena de interés expresada y traducida en Msm, debe llegar a sus EV. Planteamos la hipótesis de que una o más de las 10 proteínas más abundantes de los EV de MSM, cuando se fusionan con la proteína de interés, ayudarán en dicha translocación.

Cuando estábamos empezando a estandarizar el enriquecimiento de las VE micobacterianas (mEVs) en nuestro laboratorio, en 2011, Prados-Rosales et al. reportaron por primera vez la visualización y enriquecimiento de las mEVs in vitro30. Más tarde, en 2014, el mismo grupo publicó una versión modificada de su método34 de 2011. En 2015, Lee et al. también informaron de un método estandarizado de forma independiente para el enriquecimiento de mEV a partir de cultivos axénicos de micobacterias35. Combinando ambos protocolos34,35 e incorporando algunas de nuestras modificaciones después de una estandarización exhaustiva, describimos aquí un protocolo que ayuda a enriquecer rutinariamente los mEV de cultivos axénicos de micobacterias 36.

Aquí, detallamos particularmente el enriquecimiento de los VE específicos de Msm, que es una extensión de un protocolo publicado36 para el enriquecimiento de los VE micobacterianos en general. También detallamos cómo construir mEVs recombinantes (R-mEVs) que contienen la proteína mCherry (como un reportero fluorescente rojo) y EsxA (Esat-6)37,38,39, un inmunógeno predominante y una potencial subunidad vaccinógena de Mycobacterium tuberculosis. El protocolo para enriquecer los R-mEVs sigue siendo idéntico al que hemos descrito para enriquecer los EVs nativos a partir de Msm.

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Protocol

1. Condiciones de crecimiento de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli y sus derivados

  1. Medio
    1. Caldo líquido Middlebrook 7H9
      1. Prepare una solución madre de Tween-80 al 20 % precalentando previamente el volumen requerido de agua bidestilada (ddw) en un vaso de precipitados de vidrio a ~ 45-50 oC en un microondas, agregue el volumen requerido de Tween-80 con un cilindro de medición apropiado y revuelva continuamente en un pequeño agitador magnético para llevar el Tween-80 al 20% a una solución uniforme. Filtre el Tween-80 al 20% a través de un filtro de eliminación de 0,22 mmm y almacene la solución madre de color amarillo pálido a 4 oC.
        NOTA: Todas las trazas de Tween-80 en el cilindro de medición deben transferirse al vaso de precipitados para obtener una concentración final precisa. No autoclave el material Tween-80 preparado. Filtrar (usar 0,22 μM), esterilizar y almacenar a 4 oC.
      2. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del caldo 7H9. Suspender 4,7 g de polvo de 7H9 en 900 mL de ddw. Agregue 2 ml de glicerol, mezcle el contenido y autoclave a 121 oC, 15 psi durante 20 min.
        NOTA: No agregue el enriquecimiento de ADC de Middlebrook (ADC) y Tween-80 antes de esterilizarlo en autoclave.
      3. Después de que el medio esterilizado en autoclave se enfríe a temperatura ambiente (RT, es decir, ~ 25 oC), en un gabinete de bioseguridad estándar tipo A2, agregue asépticamente 10 veces el caldo de 100 ml de ADC (1 final 1x) y 2,5 ml (0,05 % final) de 20 % de Tween-80. Filtrar la mezcla a través de una unidad de filtro desechable de 0,22 μm y almacenar la solución madre transparente de color verde amarillento muy claro a 4 °C.
        NOTA: El pH del medio debe ser de ~6.6 a 6.8 (si <6.4 o >7.0, deséchelo y hágalo fresco). Conservar a 4 ºC(estable durante 3-4 semanas). Se recomienda encarecidamente filtrar el medio 7H9 (después de la adición de ADC y Tween-80) dos veces a través de dos unidades de filtro desechables independientes de 0,22 μm.
    2. Caldo líquido de Sauton (medios mínimos)
      1. Disolver la L-asparagina (0,4% p/v) y el ácido cítrico (0,2% p/v) en 950 ml de ddw. Añadir 1 mL de cada uno de los 1.000x caldos (en ddw) recién preparados de fosfato potásico dibásico (incoloro; stock 10 g/20 mL; final 1x 0,5 g/L); sulfato de magnesio heptahidratado (incoloro; stock 10 g/20 mL; final 1x 0,5 g/L); y citrato de amonio férrico (marrón muy claro; stock 1,6 g/40 mL; final 1x 0,04 g/L) y agitar bien en un agitador magnético.
        NOTA: En el mejor de los casos, las acciones de 1,000x pueden tener 2 semanas de antigüedad; si es más viejo que eso, prepare caldos frescos; guárdelos en RT en la oscuridad (por ejemplo, dentro de un gabinete / estante). Si el citrato de amonio férrico es de color marrón oscuro, deséchelo y hágalo fresco. Lo mejor es añadir las tres sales en el orden mencionado en el paso 1.1.2.1. Agite la solución cada vez antes de agregar cada solución salina.
      2. Mida y anote el pH con un medidor de pH; Asegúrese de que esté alrededor de 3.1 a 3.2. Si el pH es superior a 3,7, deseche los caldos y prepárelos frescos. Para ajustar el pH a 7,4, utilice tantas gotas de hidróxido de sodio 10 N como sea necesario. Controle el pH final mientras agita continuamente la solución/medio en un agitador magnético.
      3. Agregue 4,76 ml de glicerol, 0,25 ml de Tween-80 al 20% (0,005% final, consulte también la nota para el paso 2.2.1.3) y, solo entonces, aumente el volumen a 1 L. A continuación, filtre y esterilice el doble de 1 L de medio con dos filtros de eliminación separados de 0,22 μm. Guarde el medio transparente e incoloro a 4 °C (estable durante 2 semanas).
        NOTA: Solo después de que el pH se ajuste a 7.4, agregue glicerol. De lo contrario, los medios se volverán blancos y turbios. Si está turbio, deséchelo (no intente calentarlo) y prepárelo fresco. Para todas las preparaciones de mEV, use Sauton recién preparado.
    3. Base de agar Middlebrook 7H11
      1. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación. Suspender 19 g de polvo 7H11 en 900 mL de ddw. Añadir 5 mL de glicerol, agitar en un agitador magnético para obtener una suspensión uniforme (verde pálido; pH 6,6 a 6,8; si es >7,2, desechar y preparar fresco), y esterilizar en autoclave a 121 ºC, 15 psi y durante 20 min.
        NOTA: No agregue ADC y 0.05% Tween-80 antes de esterilizar en autoclave.
      2. Cuando el medio se enfríe a ~50 oC, asépticamente en una cabina de bioseguridad tipo A2, agregue 100 mL de ADC (llevado a RT) y 2.5 mL de 20% (final 0.05%) Tween-80 (llevado a RT). Dispensar inmediatamente de forma aséptica en placas de Petri.
        NOTA: Las placas son estables a 4 °C durante al menos 4-6 semanas. Asegúrese de que las placas estén a temperatura vertical durante la noche antes de envolverlas para almacenarlas a 4 °C. De lo contrario, la humedad quedará atrapada en las placas durante la incubación a 37 °C.
    4. Caldo Miller Luria Bertani (LB) y base de Agar
      1. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación. Para preparar el caldo LB, suspenda 25 g de polvo en 1.000 ml de ddw y remueva suavemente durante 5 min en un vaso de vidrio sobre un agitador magnético. Tras una suspensión uniforme, alícuota los volúmenes requeridos en frascos de medios (por ejemplo, 300 ml en un frasco de medios de 500 ml) y autoclave. Para preparar LB Agar, suspenda 40 g de polvo en 1.000 ml de ddw y autoclave (12 g de polvo en 300 mL ddw en un frasco de vidrio de 500 mL).
  2. Condiciones de crecimiento
    NOTA: Todos los pasos del trabajo de cultivo bacteriano deben realizarse en una cabina de bioseguridad (tipo A2). Todos los cultivos deben procesarse con tubos, matraces y puntas de pipeta estériles.
    1. Día 1
      1. Agregue 1 ml de caldo de glicerol de Msm (del congelador a -80 ° C) a 2 x 10 ml (en tubos centrífugos cónicos estériles de 50 ml) de caldo 7H9 recién esterilizado, enfriado y precalentado (~ 37 ° C), agite tres veces, cierre las tapas e incube los tubos durante la noche a 37 °C y 200-220 rpm (agitador de incubadora).
        NOTA: Para cultivar Mycobacterium tuberculosis (Mtb), siga pasos similares pero incube los tubos de 50 ml durante 4-6 días a 37 oC y 120-150 rpm (agitador de incubadora) en configuraciones BSL3. Siga TODAS las pautas internacionales y las prácticas de bioseguridad de los patógenos BSL3 y del Grupo de Riesgo 3 mientras manipula y desecha Mtb y sus cultivos. Utilice cabina de bioseguridad tipo B2 para el manejo de Mtb y sus cultivos.
    2. Día 2
      1. Cuando OD 600 (A600 nm; densitómetro celular) alcance ~1.0, centrifugue los cultivos de MSM durante 10 minutos a 3,200 × g y RT (centrífuga de sobremesa). Deseche los sobrenadantes con puntas de pipeta estériles de 1 ml.
        NOTA: El paso anterior sigue siendo el mismo para las referencias culturales de Mtb, excepto que el número de días es de 4 a 7. Asegúrese de no tocar el gránulo bacteriano con la punta de la pipeta.
      2. Lavado: A cada gránulo de Msm, añadir 1 ml de medio Sauton precalentado (a RT) (paso 1.1.2) y volver a suspender suavemente con puntas de pipeta de 1 ml para obtener una suspensión uniforme. Con puntas de pipeta estériles, aumente los volúmenes a 10 ml (en cada una) con el mismo medio. Centrifugar las suspensiones durante 10 min a 3.200 × g y RT y desechar los sobrenadantes. Repita este paso una vez más.
        NOTA: El paso anterior sigue siendo el mismo para las referencias culturales de MTB.
      3. Resuspenda las células de MSM lavadas dos veces en 20 ml (cada una) de Sauton precalentadas (precalentadas en una incubadora de placas o agitadora) y mida la densidad óptica de las células a 600 nm. Inocular el volumen requerido de cultivos de Msm en matraces estériles de 1 L de Erlenmeyer que contengan ~330 mL de Sauton estériles, de modo que el ODfinal 600 sea ~0,05.
        NOTA: Las resuspensiones siempre deben comenzar en un volumen pequeño. Si el volumen final se agrega directamente al gránulo como un solo paso, las células permanecerán como gránulos difusos (un indicador de mala resuspensión). La única manera de resolver el problema es reducir los cultivos y volver a hacer la resuspensión como se recomienda. El paso anterior sigue siendo el mismo para las culturas de MTB.
    3. Día 2/3
      1. Incubar el cultivo de 330 ml en el agitador de la incubadora a 200 rpm y 37 °C hasta que el diámetro exteriordel cultivo sea de 600 ~0,3 . Luego, lave las celdas una vez (similar al paso 1.2.2.2 pero con el mismo volumen) y luego, vuelva a suspender el gránulo en el mismo volumen. Distribuir 50 ml de los cultivos resuspendidos en seis matraces estériles de 1 litro de Erlenmeyer, cada uno de los cuales contiene 280 ml de Sauton estéril precalentado con 1/10de Tween-80 normalmente utilizado (0,05%), es decir, 0,005% (véase también la nota del paso 2.2.1.3. para entender por qué 1/10). El diámetro exterior final de600 debe ser de aprox. 0,05.
        NOTA: Para cultivos de MTB, en lugar de matraces Erlenmeyer, utilice botellas con ruedas (de 1/2/4 L de capacidad). Ajuste el volumen de cultivo por frasco de manera que cuando se mantenga en el aparato de rodillos, el cultivo no llegue a la boca del frasco. El volumen real en la botella de rodillo dependerá de la capacidad de la botella de rodillo.
      2. Incubar cada uno de los cultivos de 330 ml en el agitador de la incubadora a 200 rpm y 37 oC hasta que el diámetro exteriorde 600 alcance de 2,0 a 2,5 (~15-18 h).
        NOTA: Para cultivos de MTB, asegúrese de que el ODfinal 600 sea ~ 1.0-1.2 (tarda ~ 5-8 días).

2. Enriquecimiento de mEV de Msm mediante el empleo de centrifugación en gradiente de densidad

  1. Día 4
    1. Centrifugar los ~2 L de cultivos de Msm de etapa exponencial media en 6 frascos de centrífuga estériles de 400 ml a 4 oC durante 20 min a ~ 8.000 × g (centrífuga modelo de suelo). Recoja el sobrenadante de medio/cultivo gastado en dos matraces Erlenmeyer de 1 L preenfriados y esterilizados en autoclave y guarde una alícuota del gránulo para cualquier procedimiento analítico (como SDS-PAGE y Western blot, no detallado aquí).
      NOTA: Todos los pasos posteriores deben realizarse en frío (~ 4 °C) para mantener mejor la integridad de los mEV. Los mEV son bastante estables en RT, pero la refrigeración es imprescindible para la estabilidad a largo plazo (no se recomienda la congelación y descongelación repetidas). Durante el crecimiento del cultivo axénico, los mEV se disocian de la superficie de Msm/Mtb y se acumulan en el medio sobrenadante/gastado del cultivo.
    2. Filtre el sobrenadante de cultivo de Msm primero a través de la(s) unidad(es) de filtro de eliminación de 0,45 μm y, a continuación, a través de la(s) unidad(es) de filtro de eliminación de 0,22 μm para eliminar todos los rastros de bacterias.
      NOTA: La filtración directa a través de los filtros de 0,22 μm a menudo obstruye las unidades de filtro (ya que el gránulo bacteriano puede alterarse al realizar el paso 2.1.1.). Para generar sobrenadantes de cultivo de Mtb, realice tres filtraciones de cultivos de Mtb (es decir, el primer paso de filtración con una unidad de filtro desechable de 0,45 μm; dos pasos de filtración consecutivos con unidades de filtro desechables de 0,22 μm) antes de mover los filtrados de cultivo a la configuración BSL-2.
  2. Día 4/5
    1. Utilice los concentradores de membrana de 30 kDa para concentrar el filtrado de cultivo de Msm (~2 L) hasta ~ 38 mL centrifugando el filtrado de cultivo a 4 °C, 20 min y a 3.200 × g.
      1. Prelavar primero los concentradores con agua fría estéril (~15 mL) (lavar a 4 °C, 5 min y a 3.200 × g).
      2. Lavar con ~15 ml de Sauton prefiltrado y frío (las mismas condiciones que para el agua (2.2.1.1.)) para eliminar todos los restos de productos químicos (utilizados durante la fabricación).
      3. Dado que técnicamente se requieren ~ 130 centricones (si solo se usa) para concentrar ~ 2 L de filtrado de cultivo, reutilice los centricones al menos 3-4 veces si es necesario. Siga estos pasos: concentre de 15 ml a 0,5 a 1,0 ml (siga el paso 2.2.1), transfiera el concentrado a un tubo de ultracentrífuga de 38 ml limpio, esterilizado en autoclave y frío, y luego vuelva a transferir el filtrado de cultivo no concentrado restante a los centricones utilizados para repetir la concentración.
        NOTA: El uso de concentradores de 24,30 kDa para concentrar 2 L de filtrado de cultivo tomará hasta 6 h. Al concentrar el filtrado de cultivo, el Tween-80 también se concentra y puede bloquear el concentrador. El uso de Tween-80 al 0,005% final (en lugar del 0,05%) en los medios de Sauton ayuda a prevenir este bloqueo. La concentración reducida de Tween-80 no afecta a la suspensión uniforme de Msm durante el crecimiento y no provoca la aglomeración de células de Msm. Sin embargo, como las celdas de Mtb se agrupan al 0,005 % de Tween-80, use 0.05 % de Tween-80 para vehículos eléctricos específicos de Mtb.
    2. Transfiera el filtrado concentrado de cultivo de MSM (~38 mL) a un tubo de centrífuga de polipropileno de 40-50 mL limpio, lavado (con ddw) y preenfriado y sométalo a una centrifugación en dos pasos, primero a 4.000 × g y luego a 15.000 × g, ambos pasos a 4 oC durante 20 min (para eliminar todos los residuos). Use una centrífuga de piso para lo mismo.
  3. Día 5/6
    1. Transferir el sobrenadante de cultivo a un tubo de ultracentrífuga de polipropileno preenfriado de 38,5 mL y centrifugarlo en una ultracentrífuga a 100.000 × g durante 4 h a 4 oC.
      NOTA: Un cucharón giratorio funciona mejor a esta velocidad. Asegúrese de llenar el tubo de ultracentrífuga hasta el borde y tener un tubo de ultracentrífuga de equilibrio de peso equivalente. Si alguno de los tubos se pega a la cubeta oscilante después de la centrifugación (lo que ocurre debido a la condensación), con unas pinzas, retírelo suavemente del rotor. Limpiar la humedad condensada presente en la superficie exterior de la ultracentrífuga antes de la ultracentrifugación evita que se pegue.
    2. Guarde el sobrenadante en un tubo preenfriado de 50 ml (ver nota). Invierta el tubo de ultracentrífuga sobre un papel absorbente nuevo y sin pelusa para eliminar los restos del sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 600 μL de solución tampón HEPES (50 mM HEPES y 150 mM de NaCl, pH 7,4; filtrar-esterilizar antes de su uso).
      NOTA: Guarde el sobrenadante solo como copia de seguridad. El gránulo nativo de mEV aparece como una mancha gelatinosa, de 5-7 mm de diámetro, de color amarillo grisáceo opaco a translúcido. Si no hay ningún gránulo visible, repita el paso 2.3.1 reutilizando el sobrenadante guardado. Si no aparece ningún gránulo después de repetir el paso 2.3.1, deséchelo y reinicie desde el paso 1.2. El gránulo tarda en volver a suspenderse. Se recomienda añadir el tampón HEPES y dejarlo toda la noche a 4 ºCpara facilitar la resuspensión. Vuelva a suspender suavemente pero con pipeteo repetido (use puntas P200 para una mejor resuspensión) hasta una resuspensión uniforme.
  4. Día 6
    1. Someta el gránulo resuspendido a una centrifugación de gradiente de densidad basada en 'yodixanol'.
      1. Coloque el gránulo resuspendido en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga de polipropileno ultratransparente de 13 ml limpio, lavado (con ddw) y preenfriado y mezcle suavemente (use una pipeta de 1 ml) con ~ 4 ml de solución inerte de 'yodixanol' en gradiente de densidad (disponible comercialmente como una solución de ~ 60% p/v). Después de colocar el gránulo resuspendido en capas en la parte inferior del tubo (hasta un máximo de 5 ml), superponga con 1 ml (p/v) cada uno de los submateriales del 40%, 30%, 20% y 10% de 'yodixanol' en el orden respectivo (prepare submateriales (con tampón HEPES) a partir del 60% de existencias). A continuación, añade 4 ml de substock al 6% (preparado a partir del 60% de stock con tampón HEPES) en la parte superior para llenar el tubo.
        NOTA: Prepare el degradado justo antes de usarlo; Nunca lo almacene ni lo use.
      2. Con cuidado (sin agitar), pese el tubo en un vaso de precipitados de vidrio y transfiéralo suavemente al rotor del cubo oscilante.
        NOTA: El pesaje es necesario para equilibrar con un tubo ficticio (también pesado).
      3. Sométalo a ultracentrifugación a 141.000 × g durante 16 h a 4 oC.
  5. Día 7
    1. Retire con cuidado el tubo (véase la nota del paso 2.3.1) y recoja las fracciones de 1 ml en tubos de microcentrífuga recién esterilizados en autoclave; preste atención a las fracciones4ª a6ª , que normalmente contienen los mEV de Msm.
      NOTA: Los mEV de estas fracciones normalmente se fraccionan en tres o cuatro bandas de mEV (una es la banda principal) que son de color blanco opaco. Los R-mEV que contienen mCherry se fraccionan en las fracciones 5ª a7ª y aparecen de color púrpura oscuro a magenta. Los vehículos eléctricos de Mtb suelen fraccionarse entre la 5ª y la7ª fracciones. La separación de los mEV en el gradiente depende de la concentración de gradiente utilizada y de qué tan bien se estratifica el gradiente. Si los mEV se rompen parcialmente, pueden fraccionarse en fracciones anteriores. Alternativamente, si el gránulo obtenido después del paso 2.3.2 no se resuspende bien, las vesículas forman microgránulos densos que se fraccionan como fracciones posteriores. Recomendamos la recolección precisa de las fracciones solo cuando el usuario desee evaluar cuál de las fracciones de 1 mL contiene los mEV. Es posible que los usuarios deseen dividir la alícuota en fracciones más pequeñas o más grandes según su conveniencia. Cuando los utilizamos para determinadas aplicaciones, por ejemplo, para probarlos como posible refuerzo de la vacuna de subunidad para la BCG, limitamos nuestra recogida de los mEV a menos de 250 μl de las fracciones (donde se fraccionan los mEV) para poder recoger específicamente solo las bandas de mEV y procesarlas como se indica en el punto 2.7.5. Esto ayuda a eliminar de manera más efectiva todos los rastros de yodixanol que puedan interferir en el camino de nuestros experimentos posteriores.
  6. Día 8
    1. Agrupar las fracciones que contienen mEVs, diluir con tampón HEPES a 38 mL y repetir la ultracentrifugación a 4 °C durante 16 h a 100.000 × g. Vuelva a suspender el gránulo (como en el paso 2.3.2 con las mismas precauciones) en el tampón HEPES o en cualquier tampón que requieran los experimentos posteriores (no detallados aquí), como la estimación de proteínas, los análisis de nanoseguimiento, la tinción negativa, la microscopía electrónica de transmisión, la transferencia occidental y el marcado de oro inmunitario.
      NOTA: Para una mejor resuspensión, sonique el tubo que contiene mEV durante 10 minutos utilizando un sonicador ultrasónico en baño de agua. La sonicación durante un tiempo más prolongado puede iniciar la ruptura y la pérdida de mEV intactos. Si se suspende bien, la sonicación es innecesaria. Todos los pasos de 2.1 a 2.6 son idénticos mientras se enriquecen los vehículos eléctricos generados por Mtb.

3. Construcción y enriquecimiento de mEVs recombinantes.

NOTA: Una de las 10 proteínas más abundantes (identificadas por espectrometría de masas) de las EV de Msm es Cfp-2930. Dado su pequeño tamaño (29 kDa), su estructura secundaria simple40, su localización en la membrana 41 y su propensión a ser secretada en medios gastados en cultivos axénicos (por ejemplo, como una proteína filtrada de cultivo; secretada tanto por Msm como por Mtb42,43), aquí, se ha explotado para administrar un reportero fluorescente rojo y una proteína de interés (EsxAMtb) en mEVs. Para lograr esto,

  1. Emplear cebadores adecuados hacia adelante y hacia atrás (Tabla 1; compatibles para ser clonados directamente en un vector lanzadera como pMV261) para amplificar cfp-29 a partir de Msm. Utilizando ~50 ng de ADN genómico Msm de alto peso molecular (~>20 kb) como plantilla, amplifique por PCR el fragmento del gen cfp-29 con una ADN polimerasa de alta fidelidad (como Phusion o Q5). Siga las recomendaciones del fabricante para la PCR.
    NOTA: Diseñe los sitios de restricción necesarios en cebadores para una fácil clonación en cualquier vector alternativo de intervención. Las condiciones y el volumen de la PCR variarán según el tipo y la marca de ADN polimerasa de prueba que se utilice. El volumen de la mezcla de reacción variará en función de la cantidad de molde de ADN y de la cantidad de ADN polimerasa de corrección. Siga las recomendaciones del fabricante para las condiciones de PCR, el éxito de la amplificación y la eliminación del recocido no específico de los cebadores.
  2. La PCR purifica el amplicón eluido con cualquier kit de purificación de PCR disponible en el mercado y verifica la longitud del amplicón mediante electroforesis estándar en gel de agarosa. Digiere el amplicón purificado.
    1. Calcule la cantidad de amplicón purificado en un espectrofotómetro. Use al menos 2 μg de amplicón cfp-29 para la digestión.
    2. Digirir primero con BstB1 a 65 °C durante 1 h (tipo y cantidad de tampón y enzima, según las recomendaciones del fabricante), bajar la temperatura de reacción a RT y, a continuación, digerir con HindIII durante 1 h a 37 °C (tipo y cantidad de tampón y enzima, según las recomendaciones del fabricante).
    3. La PCR purifica y eluye el amplicón digerido en 50 μL de ddw libre de nucleasas esterilizado en autoclave.
    4. Estimar la concentración y el rendimiento del amplicón digerido utilizando un espectrofotómetro. Almacenar a -20 oC hasta la configuración de la ligadura. NOTA: Después de la PCR, verifique la longitud del amplicón (~798 + 50 pb) y el rendimiento electroforando 10 μL de la mezcla de reacción de PCR en un gel de agarosa al 1%. Aunque la doble digestión no es posible con esta combinación de enzimas, un tampón compatible evitará la purificación repetida por PCR y la posterior pérdida del amplicón digerido. La concentración de amplicón digerido varía según el kit utilizado para la purificación por PCR. También varía con la longitud (en pb) de cualquier vector alternativo de elección.
  3. Emplee los cebadores directos e inversos (Tabla 1), una ADN polimerasa de corrección y ~ 50 ng de ADN genómico de Mtb, la PCR amplifica el amplicón específico de la etiqueta FLAG- esxA o esxA-3X. Utilice ~5 ng de ADN plasmídico apropiado para amplificar mCherry por PCR. Los detalles del plásmido y la secuencia se encuentran en el Archivo Suplementario 1.
    NOTA: Utilice un enlazador de glicina, glicina, glicina, glicina, serina 44,45 (G4S) entre cfp-29 y mCherry / esxA / esxA-3X FLAG; Antes del inicio de mCherry, el enlazador G4S ayuda a mCherry a no sufrir pliegues no funcionales espurios (incluidos los impulsados por Cfp-29). Refiérase a las secuencias cfp-29, promotor hsp60, mCherry y esxA en el Archivo Suplementario 1. Los plásmidos que sirven como plantillas para mCherry están disponibles en diferentes repositorios/bancos de plásmidos. Están disponibles diferentes versiones (secuencias ligeramente alteradas) de mCherry que requerirán secuencias de cebadores hacia adelante y hacia atrás alteradas. Los cebadores (Tabla 1) ayudan a amplificar el mCherry mencionado en el Archivo Suplementario 1. La fusión del extremo N-terminal de mCherry/esxA/esxA::3XFLAG con el extremo C-terminal de Cfp-29 funciona bien.
  4. Digiera 1 μg de ADN de los amplicones mCherry/esxA/esxA::3XFLAG y purifique el ADN digerido.
    1. Digiera dos veces cada amplicón con HindIII y HpaI durante 1 h a 37 °C (o según las recomendaciones del fabricante).
    2. Utilice un kit de purificación por PCR disponible en el mercado y las recomendaciones del fabricante para purificar el amplicón digerido. Eluir el amplicón digerido en 50 μL de ddw libre de nucleasa esterilizada en autoclave.
    3. Estimar la concentración y el rendimiento del amplicón digerido utilizando un espectrofotómetro. Almacenar a -20 oC hasta la configuración de la ligadura.
  5. Digiera 2 μg de pMV261-KanR (Archivo Suplementario 1) o un vector de clonación adecuado con la(s) enzima(s) de su elección.
    1. Digirir primero con BstB1 a 65 °C durante 1 h (tipo y cantidad de tampón y enzima, según las recomendaciones del fabricante), bajar la temperatura de reacción a RT y, a continuación, digerir con HindIII durante 1 h a 37 °C (tipo y cantidad de tampón y enzima, según las recomendaciones del fabricante).
    2. Purificar en gel y eluir en 50 μL de ddw libre de nucleasas esterilizado en autoclave.
    3. Estimar la concentración y el rendimiento del vector digerido utilizando un espectrofotómetro. Almacenar a -20 oC hasta la configuración de la ligadura.
      NOTA: La clonación de dos fragmentos en un solo paso es posible con los cebadores anteriores para pMV261. Cualquier vector lanzadera alternativo que sobreviva como episoma funcionará. Los plásmidos integrativos también funcionarán, pero el rendimiento de proteínas recombinantes será relativamente menor por célula.
  6. Ligue y transfórmese en una cepa compatible de E. coli.
    1. Para la ligadura, use 125 ng del vector. Utilice amplicones mCherry/esxA/esxA::3XFLAG digeridos adecuadamente en una proporción molar de 1:3. Realizar la ligadura durante la noche con ADN ligasa T4 (cantidad según las recomendaciones del fabricante) a 16 °C en un baño de agua circulante refrigerado.
      NOTA: Utilice controles apropiados, como vector solo con y sin ADN ligasa T4 para evaluar la eficiencia de la digestión y predecir la eficiencia del éxito de la clonación.
    2. Transformación
      1. Descongele las alícuotas de las células químicamente competentes NEB5α (~100 μL por transformación) en hielo durante 15 min. Mezcle suavemente dos veces con una punta de pipeta estéril. Añadir mezcla de ligadura (hasta 20 μL) a las células frías competentes.
      2. Mezcle suavemente las células de pipeta + ADN ligado. Incuba la mezcla en hielo durante 30 minutos más.
      3. Proporcionar un choque térmico a 42 °C (en un baño de agua circulante) durante 60 s y volver a colocarlo inmediatamente en hielo durante 15 minutos más.
      4. Recuperar las células transformadas añadiendo 1 mL del caldo SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM deMgSO4 y 20 mM de glucosa) e incubar a 37 °C durante 1 h a 200 rpm.
      5. Centrifugar las bacterias recuperadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (3000 × g, RT y 10 min), desechar el sobrenadante, volver a suspender el gránulo en 200 μl de medios LB estériles, precalentados y recién preparados, y esparcir la suspensión en placas de agar LB Miller recién vertidas que contengan los antibióticos necesarios en las concentraciones adecuadas.
      6. Incubar las placas de Petri en una incubadora de placas preajustada a 37 °C.
  7. Examinar (no se detalla aquí) en busca de clones potenciales, verificar (mediante PCR de colonias/enzimas de restricción)46 y secuenciarlos (secuenciación de Sanger) para confirmar la fusión.
  8. Extraiga el ADN plasmídico (~200 ng/1-2 μL; cualquier kit disponible comercialmente) del clon confirmado (fondo de E. coli ) y transfórmelo en células electrocompetentes recién hechas de MSM.
  9. Preparación de células electrocompetentes de MSM
    1. Cultive Msm de nuevo (como en los pasos 1.2.1 y 1.2.2). Lave el Msm recién crecido como en los pasos 1.3.3 y 1.3.4 (excepto que use 7H9 + ADC + Tween-80 (rico) en lugar de Sauton).
    2. Añadir una alícuota de las células MSM lavadas a un OD final 600 de ~0,05 en un matraz estéril de Erlenmeyer de500 ml que contenga 150 ml de medios enriquecidos.
    3. Incubar en el agitador de la incubadora a 200 rpm y 37 °C hasta que el diámetro exterior decultivo 600 alcance ~0,8 a 1,0 (~12-14 h).
    4. Transfiera el cultivo a una botella centrífuga preenfriada de 400 ml e incube en hielo durante 60-90 minutos. A continuación, pegue las células a 4 ºCdurante 15 minutos a 4.000 × g.
    5. Lavar las células dos veces (cada lavado con 150 ml, a 4.000 × g, 4 ºCy 15 min) con glicerol al 10 % estéril (esterilizado en autoclave) helado.
      NOTA: Con cada lavado, el gránulo se afloja. Tenga cuidado al desechar todo el sobrenadante (después de cada lavado). De lo contrario, la mayoría de las células se perderán en el sobrenadante desechado.
    6. Lavar las células una vez más con 75 ml de glicerol estéril al 10 % helado que contiene 0,005 % de Tween-80.
    7. Resuspender el gránulo celular en 7,5 ml de glicerol al 10% con Tween-80 al 0,005% y alícuota en alícuotas de 400 μL.
      NOTA: Aunque las células electrocompetentes de Msm son competentes durante al menos 4 meses, las células electrocompetentes recién preparadas dan los mejores resultados. Cuando se utilizan células viejas competentes, algunas colonias no rosadas (blancas) aparecen como falsos transformantes. Cuanto más viejas son las células competentes, más blancas son las colonias.
  10. Transformación de MSM
    1. Descongelar las células competentes de MSM alícuotas en hielo.
      NOTA: La descongelación en RT y la transformación de dichas células produce menos eficiencia.
    2. Agregue 1-2 μL de ADN plasmídico (~200 ng en total) a las células frías competentes, mezcle suavemente con una punta de pipeta estéril de 1 ml y transfiérala a una cubeta de electroporación estéril de 2 mm previamente enfriada.
    3. Transfiera la cubeta cerrada con células competentes de Msm + mezcla de ADN plasmídico al ratón del elctroporador, cierre la tapa suavemente y aplique un pulso (tipo de decaimiento exponencial) a 2,5 kV (voltaje), 25 μF (capacitancia) y 1000 Ω (resistencia).
    4. Añada inmediatamente 1 ml de medio rico estéril precalentado (7H9 + ADC + Tween-80) a la cubeta, mezcle suavemente con una punta de pipeta estéril de 1 ml y transfiera todo el contenido a un tubo estéril de 10 ml.
    5. Incubar el contenido durante 3 h en un agitador incubador ajustado a 37 °C y 200 rpm. Centrifugar el contenido en un tubo de microcentrífuga (4.000 × g, RT y 10 min), desechar el sobrenadante, resuspender el gránulo en 200 μL de medio rico estéril precalentado y extender la suspensión sobre placas de agar 7H11 recién vertidas que contienen ADC, Tween-80 y los antibióticos necesarios en concentraciones adecuadas.
      NOTA: Para el MSM, cuando sea necesario, use higromicina, kanamicina y apramicina en las concentraciones finales de 50 μg/mL, 25 μg/mL y 50 μg/mL, respectivamente. El MSM per se NO es resistente a estos antibióticos. Use estos antibióticos solo cuando use plásmidos con los genes resistentes apropiados para la selección/crecimiento de transformantes/colonias de MSM recombinantes.
    6. Incubar las placas de Petri en una incubadora de placas preajustada a 37 °C. Por lo general, los transformantes aparecen entre 3 y 5 días.
      NOTA: Si una proteína de interés es tóxica para el MSM, los transformantes pueden emerger más tarde o no emerger. En tales casos, clonar versiones truncadas de la longitud completa.
    7. Hacer las existencias de glicerol de las colonias emergentes de MSM después de verificar si hay clones positivos (igual que en el paso 3.7)
  11. Para enriquecer R-mEVs que contengan proteínas mCherry o EsxA, primero cultive R-Msm que expresen mCherry o exsA o esxA::3X FLAG siguiendo los pasos 1.2.1 a 1.2.3 y, a continuación, siguiendo los pasos 2.1 a 2.6. para enriquecer los R-mEV. Los R-mEVs eluyen en las fracciones4ª-7ª después del espín del gradiente de densidad (paso 2.5). El gránulo de R-mEVs después de la primera etapa de ultracentrifugación (2.3.1). Después de realizar un comportamiento idéntico al paso 2.3.1, confirme que los R-mEV son visibles como un gránulo de color púrpura oscuro a magenta de 5-7 mm de diámetro en la parte inferior central de la ultracentrífuga.
  12. Realizar análisis occidentales47 (no detallados aquí) para detectar la(s) proteína(s) de interés dentro de los R-mEVs enriquecidos.

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Representative Results

Utilizamos M. smegmatis (Msm) como micobacteria modelo para demostrar el enriquecimiento de mEVs nativos y recombinantes (R-mEVs). Este protocolo de enriquecimiento de mEVs resumido esquemáticamente (Figura 1) también funciona para el enriquecimiento de R-mEVs de Msm y EVs nativos de Mtb (con modificaciones menores como en las notas de protocolo de 1.2). La visualización de los mEV enriquecidos requiere teñirlos negativamente bajo un microscopio electrónico de transmisión36 (Figura 2A). Por lo general, los EV específicos de Msm se separan en las fracciones4ª-6ª de 1 mL del gradiente de densidad de 13 mL 6-60% (Figura 2B). Aproximadamente 80-100 μg de proteína equivalente de EVs se obtienen rutinariamente a partir de 2 L de cultivos axénicos logarítmicos medios de Msm. Sus diámetros suelen oscilar entre 20 nm y 250 nm (Figura 2C).

Uno de los objetivos a largo plazo de nuestro laboratorio es evaluar si los mEV de diferentes micobacterias podrían actuar como una subunidad de refuerzo de la vacuna existente, BCG. Dado que el enriquecimiento de los mEV generados por bacterias patógenas requiere mucho tiempo, es arriesgado y costoso, la explotación de los VE nativos y recombinantes de micobacterias avirulentas puede funcionar como una alternativa adecuada. Por lo tanto, nuestro objetivo no solo es estandarizar el protocolo para enriquecer los mEV de MSM, sino también construir y enriquecer sus R-mEV.

Para construir los R-mEVs, primero seleccionamos las 10 proteínas más abundantes de los MSM EVs (Tabla 1; las identificamos a partir de análisis detallados de espectrometría de masas de los MSM EVs)30. Planteamos la hipótesis de que si una proteína extraña de interés se fusiona traduccionalmente con cualquiera de ellos, debería ser capaz de localizarse en mEVs. Luego, preseleccionamos a Cfp-29 entre las 10 porque es la más pequeña entre ellas (~29 kDa), está localizada en la membrana y es una proteína filtrada de cultivo con una estructura secundaria relativamente simple40,41,42,43. Fusionamos traduccionalmente el extremo N-terminal de mCherry (proteína fluorescente) con el extremo C-terminal de Cfp-29 y evaluamos su carga/entrega en mEVs. Una parte de los mEV enriquecidos de Msm se volvió rosada (Figura 3), lo que indica la capacidad de Cfp-29 para transportar una proteína extraña de interés a los EV de Msm.

Dada esta capacidad de Cfp-29 (Figura 3), evaluamos la administración de EsxA (Esat-6), una proteína inmunogénica importante37,38,39 en las EV de Msm. Una vez más, generamos dos fusiones traslacionales independientes al C-terminal de Cfp-29-only EsxA y EsxA + 3X FLAG tag (3X FLAG fusionado al C-terminal de EsxA. Como era de esperar, observamos el EsxA de Mtb en los vehículos eléctricos Msm (carriles 5, 6 y 10, Figura 4A, B), aunque en bajas cantidades. Curiosamente, Cfp-29::EsxA::3XFLAG era mucho más estable (carriles 3 y 4 más 8 y 9; Figura 4A) y acumulado en niveles más altos en mEV (carriles 3 y 4 más 8 y 9; Figura 4B). En resumen, demostramos el diseño, construcción y enriquecimiento de R-mEVs que contienen una proteína extraña de interés (Figura 3 y Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática del enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas. "Días" (en letra roja, en la parte superior de la figura) se refiere a los días necesarios para enriquecer los mEV de Msm (específicamente para los pasos 1 y 2 del protocolo). "Pasos" (en letra negra, en la parte inferior de la figura) se refiere a los pasos del protocolo como se describe en la sección de protocolo. Para enriquecer mEV a partir de Mtb, aunque todos los pasos son similares, se necesitan al menos 10 días para los diferentes pasos de cultivo (paso 1) hasta el primer paso de centrifugación (paso 2). Los pasos posteriores requieren una duración idéntica (como se indica en fuente roja). Antes del gradiente de densidad, los mEVs pellet + complejos extracelulares se ven incoloros cuando se enriquecen tanto los mEVs nativos como los R-mEVs. Sin embargo, aparecería de color rosado a azul (véase la Figura 3) cuando se enriquecen mEV que contienen mCherry. Después del gradiente de densidad, los mEV aparecerán en blanco (nativos y R-mEV) o rosados (si contienen mCherry) en el tubo de gradiente de densidad. Los colores de los mEV en la figura son solo para indicar claridad y no representan los colores exactos. Consulte la Figura 3 para obtener más claridad. Abreviaturas: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tuberculosis; 0,45 y 0,22 μm = tamaño de poro de las unidades de filtro de eliminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Las VE micobacterianas son circulares, se concentran con gradientes de densidad y varían en dimensiones . (A) Una imagen representativa de las VE de Msm en su visualización con tinción negativa y visualización bajo un microscopio electrónico de transmisión. Barra de escala = 200 nm. (B) Una imagen representativa de cómo aparecen los mEV en el tubo de ultracentrífuga al realizar un gradiente de densidad del 6-60%. Si el gradiente del 6-60% no se superpone con precisión, la posición de las bandas mayor (flecha abierta superior) y menor (flecha abierta inferior) de los mEV puede alterarse significativamente, alterando así el número de fracción de 1 mL. (C) Una imagen representativa del análisis de nanotracking de mEVs enriquecidos de Msm. Los análisis de nanotracking revelan las proporciones y concentraciones de mEVs de diferentes tamaños y el número total de mEVs dentro de la preparación. En promedio, con el protocolo detallado aquí, ~ 1-3 × 1010 EV se enriquecen con 2 L de Msm y Mtb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diferentes pasos indicativos del enriquecimiento de mEVs que expresan mCherry. (A) Imagen representativa que muestra el cultivo axénico de Msm que expresa Cfp-29::mCherry. (B) Imagen representativa del gránulo bacteriano posterior a la centrifugación del cultivo axénico de Msm que expresa Cfp-29::mCherry. (C) Imagen representativa del concentrado de filtrado de cultivo obtenido después de concentrar los medios gastados del cultivo axénico de Msm que expresa Cfp-29::mCherry a través de concentradores de centricón. (D) Imagen representativa de mEVs + pellet de complejos extracelulares post ultracentrifugación del concentrado de filtrado de cultivo obtenido a partir de cultivo axénico de Msm que expresa Cfp-29::mCherry. Sin embargo, el gránulo permanecería incoloro si los mEV fueran nativos o recombinantes (tras la fusión con Cfp-29) para cualquier proteína extraña excepto mCherry. (E) Imágenes representativas de mCherry que contienen mEVs. Tenga en cuenta que no todos los mEV son de color rosa, lo que indica que no todos los mEV contienen Cfp-29. Bueno: Una imagen representativa que indica las diferentes bandas de mEV que normalmente se obtienen después del enriquecimiento para Cfp-29::mCherry EVs. Dado que los VE que contienen mCherry son más densos, se separan en fracciones posteriores. Pobre: Una imagen representativa que indica una separación deficiente (los mEV blancos se separan en la primera/segunda fracción y los mEV que contienen mCherry se separan en la10ª fracción (posiblemente debido a una mala resuspensión de los gránulos de mEV, es decir, el paso del protocolo 2.3.2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: MEVs recombinantes que contienen EsxA (ESAT-6), un inmunógeno codificado por Mtb en el lisado total de células de Msm y en los EV generados por Msm. (A) gel de Coomassie y (B) imágenes de análisis occidental (detectadas con anticuerpos policlonales específicos de ESAT6) que muestran la acumulación de ExsA fusionado tanto en el lisado de células totales de Msm como en los mEV que expresan cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, carriles 3 y 4 (lisado total) y carriles 8 y 9 (mEVs)) o cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, carriles 5 y 6 (lisado total) y carril 10 (mEVs)). Las flechas abiertas y rellenas indican Cfp-29::ExsA::3XFLAG y Cfp-29::ExsA acumulados, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imprimaciones:
Sl # Gen Cebador Secuencia (5' a 3') Fuente Para clonar en
1 CFP-29 Adelante CAGTTCGAA(BstBI)ATGAACAACCTCTATCGC ADN genómico de MSM pMV261
Marcha atrás GAAAAGCTT(HindIII)GGGGGTCAGCGCGACAG ADN genómico de MSM pMV261
2 mCherry Adelante GAAAAGCTT (HindIII) ggcggcggtggctcg (enlazador G4S)ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG Colección de laboratorio pMV261
Marcha atrás TGTGTTAAC(HpaI)CTACTTGTACAGCTCGTCC Colección de laboratorio pMV261
3 esxA Adelante GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (enlazador G4S) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG ADN genómico de Mtb pMV261
Marcha atrás TGTGTTAAC(HpaI)TCATGCGAACA
TCCCAGTGACGTTGCCTTCGGTCG		 ADN genómico de Mtb pMV261
4 BANDERA EXSA-3X Adelante GAAAAGCTT(HindIII)ggcggcggtggctcg (enlazador G4S) ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAG ADN genómico de Mtb pMV261
Marcha atrás TGTGTTAAC(HpaI)TCA
cttgtcgtcgtcgtccttgtagtcgatgtcgtg
gtccttgtagtcaccgtcgtggtccttgtagtc (3XFLAG) TGCGAACATCCCAGTGACGTTG
CCTTCGGTCGAAGCCATTGCCTGACC		 ADN genómico de Mtb pMV261

Tabla 1: Secuencias de cebadores. Se enumeran los cebadores directos e inversos para amplificar cfp-29, mCherry, esxA y esxA::3X FLAG y clonarlos en el vector de lanzadera pMV261.

Archivo complementario 1: A: pMV261 , su mapa circular, características principales y secuencia completa de nucleótidos. Secuencia de nucleótidos promotores hsp60 con resaltado amarillo; Sitios de restricción de resaltado verde y cian en los que se clonaron los amplicones mCherry, esxA y esxA::3X FLAG. B, C y D: Secuencias de nucleótidos de cfp-29, mCherry y esxA, respectivamente. Codo verde de parada de luz de cfp-29, mCherry y esxA. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Dado que el desarrollo de una nueva vacuna contra la tuberculosis que sea superior a la BCG y que pueda sustituirla sigue siendo un reto formidable, como alternativa, varios grupos están buscando el descubrimiento de diferentes vacunas antituberculosas de subunidades que puedan aumentar la potencia de la BCG y prolongar su duración protectora48,49. Dada la creciente atención a las VE bacterianas (bEV) como subunidades potenciales y como adyuvantes naturales50,51, el enriquecimiento constante de cantidades suficientes de mEV para su prueba/análisis posterior se ha convertido en un paso importante. Teniendo en cuenta estas preguntas de investigación, este protocolo tiene como objetivo enriquecer los mEV de cultivos axénicos y sus versiones recombinantes.

Durante los análisis detallados del proteoma por espectrometría de masas de las EV de Msm, Prados-Rosales et al. identificaron las 10 proteínas más abundantes30. Además, planteamos la hipótesis de que, con suficiente ingeniería molecular, una de ellas debería ser suficiente para transportar una proteína extraña de interés a los mEV. Curiosamente, Cfp-29 se destacó como la mejor opción posible debido a sus diversas características 39,40,41,42. De hecho, nuestros datos muestran que es suficiente para transportar mCherry y EsxA (aunque EsxA requirió una pequeña etiqueta en su extremo C para ser más estable) y acumularlos en los mEV. Recientemente, en 2021, Tang et al. demostraron que Cfp-29 es una encapsulina con la capacidad de transportar peroxidasas de tipo peroxidasa decolorante (DyP)40. Quizás, Cfp-29 también pueda transportar otras proteínas extrañas.

Exploramos EsxA porque es un inmunógeno prominente de Mtb 37,38,39, puede ser protector como vacuna de subunidad en modelo animal37,38,39, es de tamaño pequeño; y su ortólogo (MSMEG_0066) está curiosamente ausente en los EV de Msm. Aunque no discutimos esto aquí, hemos generado con éxito R-mEV para algunas otras proteínas Mtb (presentes de forma única en Mtb y no codificadas por Msm), incluido el antígeno 85B (Rv 1886c). Al mismo tiempo, curiosamente, tampoco logramos generar R-mEV para algunos otros, incluidos Rv2660c y Rv0288 de longitud completa, posiblemente porque las proteínas son tóxicas para el MSM. Concluimos así porque, a pesar de clonar las secuencias de nucleótidos correctas y realizar transformaciones repetidas, no emergieron transformantes de MSM. Dado que EsxA requería una etiqueta 3XFLAG en su extremo C-terminal para una mejor acumulación en mEV, agregamos una etiqueta 3XFLAG a todas las demás proteínas codificadas por Mtb que evaluamos. A pesar de la etiqueta, el Msm no sobrevivió, lo que indica que algunas proteínas Mtb siguen siendo tóxicas a pesar de la fusión de la etiqueta. Especulamos que, en estos casos, clonar solo las regiones de epítopos predichas o unir varios epítopos puede dar sus frutos (actualmente en evaluación en nuestro laboratorio). Se utilizó un pequeño enlazador de cinco aminoácidos (cuatro de glicina y uno de serina) entre Cfp-29 y mCherry/EsxA para minimizar la influencia negativa en el plegamiento de la proteína de interés44,45. Predecimos que sin este enlazador, el plegamiento de la proteína de interés estaría fuertemente influenciado por el plegamiento de Cfp-29.

Este protocolo de enriquecimiento es fácilmente ampliable al enriquecimiento de los vehículos eléctricos generados por Mtb. También especulamos que el enriquecimiento de mEV a partir de micobacterias ambientales también debería ser factible con este protocolo. A pesar de que el protocolo es simple y directo, todavía requiere de 7 a 8 días para enriquecer los EV y R-mEV generados por Msm. Por el contrario, se requieren entre 15 y 20 días para el enriquecimiento de los vehículos eléctricos generados por Mtb. Concentrar los vehículos eléctricos en un volumen más pequeño requiere mucho tiempo y es costoso, y actualmente estamos explorando la filtración de flujo tangencial y otros enfoques para resolver el problema del "tiempo".

Por último, utilizamos Sauton y no 7H9 para enriquecer los mEV porque el suplemento 'ADC' contiene altas cantidades de albúmina sérica bovina que puede interferir con cualquier uso posterior de los mEV. Este protocolo puede extenderse fácilmente a cualquier otro medio específico (por ejemplo, medios con bajo contenido de hierro) que deba utilizarse para evaluar la composición de los mEV. Alternativamente, para ciertas aplicaciones, en el último paso (es decir, el paso 2.7.5 del protocolo), en lugar del tampón HEPES, se podría usar solución salina estéril al inyectar el mismo en ratones o conejillos de indias para diversos análisis in vivo.

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Disclosures

Todos los autores declaran que este trabajo de investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones/intereses comerciales o financieros que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen sinceramente a la Prof. Sarah M. Fortune por compartir amablemente las existencias de M. smegmatis mc2155. También reconocen a Servier Medical Art (smart.servier.com) por proporcionar algunos elementos básicos para la Figura 1. Agradecen sinceramente el apoyo del resto de los miembros del laboratorio para los ajustes de sus pacientes durante el uso prolongado de los agitadores, centrífugas y ultracentrífugas de la incubadora para el enriquecimiento de mEV. También agradecen al Sr. Surjeet Yadav, el asistente de laboratorio, por asegurarse siempre de que la cristalería y los consumibles necesarios estuvieran siempre disponibles y a mano. Por último, agradecen a los equipos administrativos, de compras y financieros de THSTI por su constante apoyo y ayuda en la ejecución sin problemas del proyecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A2 type Biosafety Cabinet Thermo Fisher Scientific, USA 1300 series
Bench top Centrifuge Eppendorf, USA 5810 R
BstB1, HindIII, HpaI NEB, USA NEB
Cell densitometer GE Healthcare, USA Ultraspec 10
Citric Acid Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Double Distilled Water Merck, USA ~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes Bio-Rad, USA 2 mm
Electroporator Bio-Rad, USA Electroporator
EsxA-specific Ab Abcam, UK Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Floor model centrifuge Thermo Fisher Scientific, USA Sorvall RC6 plus
Glassware Borosil, INDIA 1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Incubator shakers Thermo Fisher Scientific, USA MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller Hi Media, INDIA Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Magnetic stirrer Tarsons, INDIA Tarsons
mCherry-specific Ab Abcam, UK Rabbit monoclonal
Microwave LG, INDIA MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth BD, USA Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment BD, USA BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop Thermo Fisher Scientific, USA Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a NEB, USA a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol) Merck, USA Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit Hi Media, INDIA Hi Media
pH Meter Mettler Toledo, USA Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit Hi Media, INDIA Hi Media
Plate incubator Thermo Fisher Scientific, USA New Series
Plasmid pMV261 Addgene, USA *
*The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		 Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific, USA Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase NEB, USA NEB
Refrigerated circulating water bath Thermo Fisher Scientific, USA R20
Middlebrock 7H11 Agar base BD, USA BBL Seven H11 Agar base
SOC broth Hi Media, INDIA Hi Media
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase NEB, USA NEB
Tween-80 Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
Ultracentrifuge Beckman Coulter, USA Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL Beckman Coulter, USA Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL Beckman Coulter, USA Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator Thermo Fisher Scientific, USA Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators Merck, USA Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody Sigma-Aldrich, Merck, USA Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles Thermo Fisher Scientific, USA Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes Corning, USA Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli NEB, USA NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA This study MC2 155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG This study MC2 155
Mycobacterium smegmatis (Msm) Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA  MC2 155

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References

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Immunology and Infection Número 202 Vesículas extracelulares vesículas recombinantes Esat-6 micobacterias ExsA mCherry Cfp-29 bacterias

Erratum

Formal Correction: Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria
Posted by JoVE Editors on 02/01/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. The Authors section was updated from:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

to:

Praapti Jayaswal1
Mohd Ilyas1
Kuljit Singh1,2
Saurabh Kumar1,3
Lovely Sisodiya1
Sapna Jain1
Rahul Mahlawat1
Nishant Sharma1,4
Vishal Gupta1
Krishnamohan Atmakuri1
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine
3ICAR-Research Complex for Eastern Region
4Public Health Research Institute, Rutgers University

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias
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Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K.,… More

Jayaswal, P., Ilyas, M., Singh, K., Kumar, S., Sisodiya, L., Jain, S., Mahlawat, R., Sharma, N., Gupta, V., Atmakuri, K. Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (202), e65138, doi:10.3791/65138 (2023).

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