Summary
Ce travail décrit un protocole pour l’impression 3D intégrée de forme libre de cellules souches neurales à l’intérieur de composites de matrice particule-extracellulaire recuits auto-cicatrisants. Le protocole permet la structuration programmable de constructions de tissus neuraux humains interconnectés avec une haute fidélité.
Abstract
L’impression 3D intégrée de cellules à l’intérieur d’un support granulaire est apparue au cours de la dernière décennie comme une approche puissante pour la biofabrication de formes libres de constructions de tissus mous. Cependant, les formulations de gel granulaire ont été limitées à un nombre limité de biomatériaux qui permettent la génération rentable de grandes quantités de microparticules d’hydrogel. Par conséquent, les milieux de support de gel granulaire n’ont généralement pas les fonctions adhésives cellulaires et instructives cellulaires trouvées dans la matrice extracellulaire native (ECM).
Pour résoudre ce problème, une méthodologie a été développée pour la génération de composites à matrice extracellulaire recuite auto-cicatrisante (SHAPE). Les composites SHAPE se composent d’une phase granulaire (microgels) et d’une phase continue (solution ECM visqueuse) qui, ensemble, permettent à la fois une impression haute fidélité programmable et un environnement extracellulaire biofonctionnel réglable. Ce travail décrit comment la méthodologie développée peut être utilisée pour la biofabrication précise de constructions neuronales humaines.
Tout d’abord, les microparticules d’alginate, qui servent de composant granulaire dans les composites SHAPE, sont fabriquées et combinées avec un composant continu à base de collagène. Ensuite, des cellules souches neurales humaines sont imprimées à l’intérieur du matériau de support, suivies du recuit du support. Les constructions imprimées peuvent être maintenues pendant des semaines pour permettre la différenciation des cellules imprimées en neurones. Simultanément, la phase continue de collagène permet la croissance axonale et l’interconnexion des régions. Enfin, ce travail fournit des informations sur la façon d’effectuer l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes et l’immunocytochimie pour caractériser les constructions neuronales humaines imprimées en 3D.
Introduction
L’impression 3D précise et programmable de constructions d’hydrogel chargées de cellules qui imitent les tissus mous in vitro présente un défi majeur. Par exemple, les tentatives basées sur l’extrusion directe d’hydrogels mous sont intrinsèquement problématiques, car les mauvaises propriétés mécaniques requises pour récapituler le microenvironnement in vivo entraînent un manque d’intégrité structurelle, des déformations des caractéristiques prédéfinies ou l’effondrement complet des structures fabriquées. Une solution de contournement conventionnelle pour ce problème consiste à imprimer un échafaudage de support à partir d’un matériau biocompatible plus rigide qui permet à la construction finale de conserver sa forme. Cependant, cette approche limite considérablement les possibilités de conception et nécessite un réglage rhéologique minutieux des encres adjacentes.
Pour surmonter les limites de l’impression 3D traditionnelle par extrusion couche par couche, l’impression 3D intégrée est apparue ces dernières années comme une alternative puissante pour la fabrication de matériaux mous et de tissus 1,2,3,4,5,6. Au lieu d’extruder l’encre dans l’air ambiant sur une surface, l’encre est directement déposée à travers une aiguille de seringue à l’intérieur d’un bain de support qui est solide au repos, mais fluidifie de manière réversible autour de la pointe de l’aiguille mobile pour permettre le dépôt précis d’un matériau chargé de cellules molles. Le matériau déposé est maintenu en place pendant que le support se resolidifie dans le sillage de l’aiguille. En tant que telle, l’impression 3D intégrée permet la fabrication libre haute résolution de structures complexes à partir de biomatériaux mous avec des possibilités de conception étendues 7,8.
Les gels granulaires ont été largement explorés comme matériaux de bain de support pour l’impression 3D intégrée, car ils peuvent être formulés pour présenter des transitions solide-liquide lisses, localisées et réversibles à des contraintes de faible rendement 9,10,11. Bien qu’ils présentent d’excellentes propriétés rhéologiques pour l’impression haute résolution, les gels granulaires ont été limités à une poignée de biomatériaux12. Le manque de diversité dans les formulations de gel granulaire, qui est particulièrement évident si l’on considère la large gamme de biomatériaux disponibles pour les formulations d’hydrogel en vrac, est causé par la nécessité de générer de manière rentable un grand nombre de microgels en utilisant des chimies simples. En raison du paysage biomatériau limité des supports de gel granulaire, le réglage du microenvironnement extracellulaire fourni par le support d’impression présente un défi sur le terrain.
Récemment, une approche modulaire a été développée pour la génération de supports d’impression 3D intégrés, appelés composites à matrice extracellulaire recuite auto-cicatrisante (SHAPE)13. Cette approche combine les propriétés rhéologiques distinctes des gels granulaires avec la polyvalence biofonctionnelle des formulations d’hydrogel en vrac. Le support composite SHAPE présenté est constitué de microparticules d’alginate emballées (phase granulaire, ~70% de fraction volumique) avec un espace interstitiel accru rempli d’une solution de prégel ECM visqueuse à base de collagène (phase continue, ~30% fraction volumique). Il a en outre été démontré que le support SHAPE facilite le dépôt à haute résolution de cellules souches neurales humaines (hNSC) qui, après le recuit du bain de support, peuvent être différenciées en neurones et maintenues pendant des semaines pour atteindre la maturation fonctionnelle. L’impression 3D intégrée à l’intérieur du bain de support SHAPE surmonte certaines des principales limitations liées aux techniques conventionnelles de biofabrication de tissus neuraux tout en offrant une plate-forme polyvalente.
Ce travail détaille les étapes de l’impression 3D intégrée des CSNh à l’intérieur du support SHAPE et leur différenciation ultérieure en neurones fonctionnels (Figure 1). Tout d’abord, les microparticules d’alginate sont générées par cisaillement lors de la gélification interne. Cette approche permet de générer facilement de grands volumes de microparticules sans avoir besoin d’équipement spécialisé et de réactifs cytotoxiques. En outre, l’alginate est une source de matériaux largement disponible et économique pour la formation de substrats d’hydrogel biocompatibles pour une gamme variée de types de cellules. Les microparticules d’alginate générées sont combinées avec une solution de collagène pour former le matériau de support composite SHAPE. Ensuite, les hNSC sont récoltés et chargés dans une seringue en tant que bio-encre cellulaire pour l’impression 3D. Une bio-imprimante 3D est utilisée pour l’impression embarquée par extrusion de hNSCs à l’intérieur du composite SHAPE. Les cellules imprimées en 3D sont différenciées en neurones pour donner lieu à des constructions neuronales humaines fonctionnelles et spatialement définies. Enfin, le protocole décrit comment les constructions tissulaires générées peuvent être caractérisées à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes et de l’immunocytochimie. De plus, des conseils d’optimisation et de dépannage sont fournis. Notamment, les composants des phases granulaire et continue pourraient être échangés avec d’autres formulations d’hydrogel pour s’adapter à différentes fractions biofonctionnelles, propriétés mécaniques et mécanismes de réticulation, comme l’exigent d’autres types de cellules et de tissus au-delà des applications neuronales.
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Protocol
1. Préparation des tampons et des réactifs
- Préparer le milieu de croissance cellulaire en ajoutant les suppléments suivants au DMEM/F12 avec du dipeptide L-alanyl-L-glutamine : 30 mM de glucose, 5 μM HEPES, 0,5 % p/v d’albumine sérique bovine riche en lipides, 40 μM de L-alanine, 40 μM de L-asparagine monohydratée, 40 μM d’acide L-aspartique, 40 μM d’acide L-glutamique, 40 μM de L-proline, 1 % de supplément de N2, 1 % de pénicilline-streptomycine et 20 ng/L de facteur de croissance épidermique (EGF) et de facteur de croissance des fibroblastes (FGF). Effectuez ces étapes dans un banc à flux d’air laminaire (LAF).
- Préparer la solution d’alginate à 1 % p/v dans de l’eau ultrapure en agitant vigoureusement pendant 4 h à 60 °C. Filtrer stérile la solution d’alginate chaude dissoute avec un filtre de la taille d’un pore de 0,45 μm dans un banc LAF. Conserver à 4 °C.
NOTE: Si la température de la solution d’alginate est inférieure à 60 ° C, il ne sera pas possible de la faire passer à travers le filtre. - Préparer une solution de NaHCO3 à 37 g/L dans de l’eau ultrapure. Ajuster le pH de la solution à 9,5 à l’aide de NaOH et stériliser par filtre dans un banc LAF. Conserver la solution à 4 °C.
2. Préparation du matériau composite SHAPE
- Génération de microparticules d’alginate
- Préparer une solution de CaCO3 à 2 mg/mL dans de l’eau ultrapure dans un bécher stérile. Mélangez-le 1:1 avec la solution d’alginate et agitez pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un agitateur magnétique.
- Ajouter l’acide acétique dans un rapport de 1:500 et laisser agiter toute la nuit à 650 tr/min.
REMARQUE: La solution d’alginate commencera à gélifier immédiatement. Assurez-vous d’utiliser un aimant d’agitation de la même longueur que le diamètre de la verrerie utilisée pour assurer une agitation optimale et homogène du gel de formage. Le lendemain, la solution générée par agitation pendant la gélification apparaîtra visqueuse (Figure 2A). - Fragmenter mécaniquement la solution gélifiée d’alginate en microparticules en l’homogénéisant à 15 000 tr/min pendant 10 min avec un homogénéisateur placé dans un banc LAF (Figure 2B).
- Centrifuger les microparticules à 18 500 × g pendant 20 min (Figure 2C) à température ambiante.
- Jeter délicatement le surnageant à l’intérieur du banc LAF, remettre en suspension les particules dans du DMEM contenant 2 mM de NaOH et 1 % P/S, et incuber pendant une nuit à 4 °C (Figure 2D).
REMARQUE: La couleur de la suspension doit revenir au rouge. Si la suspension reste jaune, ajouter du NaOH goutte à goutte et mélanger jusqu’à ce qu’elle devienne rouge (Figure 2E). - Homogénéiser les particules à 15 000 tr/min pendant 3 min, et centrifuger à 18 500 × g pendant 10 min à température ambiante.
- Observez la pastille (figure 2F) et retirez soigneusement le surnageant.
NOTE: La pastille de microparticules d’alginate bien emballées peut être conservée à 4 °C jusqu’à une utilisation ultérieure. Si la solution d’alginate n’a pas été stérilisée par filtre, les microparticules doivent être utilisées dans un délai de 1 semaine.
- Formulation composite SHAPE
- La veille de l’impression, remettre en suspension la pastille de microparticules d’alginate dans deux fois le volume de milieu de croissance contenant 4% de HEPES (1 M stock) et 4% de solution de NaHCO3 dans un banc LAF, et l’incuber pendant une nuit à température ambiante.
- Centrifuger la suspension de microgel à 18 500 × g pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
- Neutraliser le collagène à mélanger avec les microparticules d’alginate dans un banc LAF. Diluer la solution mère de collagène pour atteindre une concentration finale de 1 mg/mL et la neutraliser en ajoutant 4 % d’HEPES et 4 % de NaHCO3. Par exemple, pour 3 mL de composite SHAPE, mélanger 2 mL de microparticules d’alginate avec 1 mL de collagène neutralisé (0,12 mL de HEPES, 0,12 mL de NaHCO3, 0,16 mL de milieu de croissance et 0,6 mL de collagène).
REMARQUE: Tous les matériaux mélangés avec du collagène doivent être manipulés sur de la glace pour éviter la polymérisation du collagène. Dès que le collagène est neutralisé, la polymérisation commence lentement. - Générez le composite SHAPE en mélangeant la pastille de microparticules d’alginate avec le collagène dilué et neutralisé dans un rapport de 2:1. Bien mélanger le gel en le pipetant lentement de haut en bas sur la glace dans un banc LAF.
REMARQUE: Ne pas vortex, car cela introduirait des bulles dans le matériau de support. - Dans un banc LAF, transférer le matériau composite généré dans une plaque de micropuits refroidie ou tout récipient d’impression approprié, et utiliser dans les 30 minutes (figure 3E, F).
3. Culture hNSC et préparation de bio-encre
- Culture des cellules dans une fiole T75 enrobée d’extrait de membrane basale dans un milieu de croissance. Passez les cellules au moins deux fois après la décongélation avant de les utiliser pour une expérience d’impression 3D.
- Avant l’impression, dissocier les cellules par voie enzymatique à l’aide d’une solution de trypsine à 0,025 % pendant 5 min à 37 °C, neutraliser la trypsine avec le milieu de croissance et centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 5 min à température ambiante. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 2 à 3 ml de milieu de croissance.
- Effectuer une numération cellulaire, centrifuger les cellules à 400 × g et remettre en suspension la pastille dans un milieu de croissance supplémenté en gomme xanthane à 0,1 % (pour empêcher les cellules de sédimenter) à une concentration finale de 9 × 106 cellules/mL.
- Utiliser une aiguille métallique émoussée de 21 G pour charger 100 μL de microparticules d’alginate bien emballées dans une seringue (figure 3A).
REMARQUE: La création d’un bouchon avec les microparticules d’alginate a deux objectifs: il aide à maintenir la stabilité de l’extrusion pendant l’impression et permet l’extrusion complète de l’encre cellulaire chargée (pas de volume mort). - À l’aide de la même aiguille, chargez la suspension cellulaire préparée dans la seringue (figure 3B).
REMARQUE: Prenez soin de ne pas introduire de bulles d’air pendant les étapes de chargement de la seringue. Les bulles d’air provoqueront des instabilités lors de l’impression. - Remplacez l’aiguille de chargement par une aiguille métallique émoussée de 27 g, qui sera utilisée pour l’impression (figure 3C).
4. Impression 3D intégrée
- Concevoir une structure à imprimer à l’aide du logiciel référencé (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: Assurez-vous d’ajuster la hauteur initiale de la structure imprimée à l’intérieur de la profondeur du support composite SHAPE. Des suggestions de conception se trouvent à la figure 4A (dessins en spirale et en piles de bois). - Générez un G-Code en cliquant sur Générer.
- Insérez la seringue en verre chargée de cellules dans une tête d’extrusion volumétrique sur une bioimprimante à extrusion (Figure 3D).
- Mesurez la longueur de l’aiguille de la seringue en verre chargée de cellules en cliquant sur Mesure de la longueur de l’aiguille.
- Placez la plaque micropuits ou le conteneur chargé avec le composite SHAPE sur l’imprimante.
REMARQUE : Maintenir la plaque cellulaire ou le récipient à 4 °C jusqu’à l’impression pour éviter la réticulation prématurée du support. - Mesurez la hauteur de surface d’un puits vide dans la même plaque ou récipient micropuits dans lequel le gel SHAPE est chargé en cliquant sur SHM (mesure de hauteur de surface).
REMARQUE: Vous pouvez également déterminer la hauteur de surface manuellement en mesurant la hauteur du puits avec l’aiguille. - Réglez le débit d’extrusion à 3,6 μL/min et le débit d’alimentation à 0,3 mm/s.
REMARQUE: Assurez-vous de tester l’extrusion avant d’imprimer. La sédimentation cellulaire peut provoquer le colmatage de la buse et peut être évitée en pré-extrudant un petit volume avant l’impression intégrée réelle ou en ajoutant un volume de rétraction à la seringue volumétrique. Dans certains cas, le débit d’alimentation doit être maintenu en dessous de 0,5 mm/s lorsque l’aiguille est insérée dans ou sortie du gel SHAPE pour éviter le glissement de l’encre. - Chargez le G-Code dans l’interface utilisateur de l’imprimante.
REMARQUE: Un nouveau G-Code doit être généré chaque fois que des modifications sont apportées à la structure conçue. - Lancez la procédure d’impression en cliquant sur Exécuter (Figure 3G).
- Immédiatement après l’impression, placer le gel SHAPE à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire pendant 30 min pour le recuit.
- Ajouter doucement le milieu de croissance sur le support en gel SHAPE recuit.
- Le lendemain, remplacer le milieu de croissance par un milieu de différenciation formulé comme suit : DMEM/F12 avec du dipeptide de L-alanyl-L-glutamine avec 30 mM de glucose, 5 μM HEPES, 0,5 % p/v d’albumine sérique bovine riche en lipides, 40 μM de L-alanine, 40 μM de L-asparagine monohydratée, 40 μM d’acide L-aspartique, 40 μM d’acide L-glutamique, 40 μM de L-proline, supplément de N2 à 1%, 1% de pénicilline-streptomycine, 100 μM d’adénosine monophosphate dibutyryl-cyclique (dibutyryl-cAMP), et 2 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de lignées cellulaires gliales (GDNF).
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas endommager l’hydrogel pendant les changements de milieu. Inclinez la plaque et retirez doucement l’ancien milieu. Ajouter du milieu frais goutte à goutte sur la paroi du puits contenant le gel plutôt que directement sur le gel. N’utilisez pas d’aspirateur pour retirer le milieu. - Actualiser le milieu de différenciation tous les 2 jours jusqu’au point final expérimental.
5. Imagerie par fluorescence de cellules vivantes
- Retirez l’excès de milieu du gel.
- Ajouter un volume égal de 20 μM de calcéine AM (diluée dans un milieu de différenciation de la solution mère) au volume du gel de support.
- Incuber pendant 40 min à 37 °C.
- Retirer la solution de Calcein AM et ajouter un volume approprié de milieu de différenciation frais.
- Transférer la plaque au microscope pour l’imagerie.
6. Immunocytochimie
- Retirez l’excès de milieu du gel.
- À l’aide d’une petite spatule, transférer le gel dans un récipient plus grand contenant du DPBS.
- Laver trois fois pendant 20 minutes à chaque fois avec DPBS et transférer la plaque dans une hotte.
- Retirer le DPBS, ajouter suffisamment de solution de formaldéhyde à 4% pour couvrir le gel et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Laver trois fois avec DPBS pendant 20 minutes à chaque fois.
- Préparer une solution de blocage composée de 5% de sérum d’âne, 0,25% de détergent et 0,02% d’azoture de sodium dans du DPBS.
NOTE: Préparez trois fois le volume nécessaire pour couvrir le gel; Il sera utilisé ultérieurement comme base pour les solutions d’anticorps primaires et secondaires. - Après le lavage avec DPBS, ajouter la solution bloquante au gel et incuber pendant 6 h à température ambiante pour éviter une liaison non spécifique. Bercez doucement l’assiette.
- Préparer la solution d’anticorps primaires en diluant l’anticorps TUBB3 dans une solution de blocage dans un rapport de 1:1 000.
- Retirer la solution bloquante du gel, ajouter la solution d’anticorps primaires et incuber pendant 48 h à 4 °C. Bercez doucement l’assiette.
- Laver trois fois avec DPBS pendant 20 minutes à chaque fois.
- Préparer la solution d’anticorps secondaires en diluant le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1:1 000) et l’anticorps secondaire (1:200) dans une solution de blocage.
- Après lavage avec DPBS, incuber le gel dans la solution d’anticorps secondaires pendant 24 h à 4 °C. Bercez doucement l’assiette.
- Laver trois fois avec DPBS pendant 20 minutes à chaque fois et conserver à 4 °C jusqu’à l’imagerie.
- Avant l’imagerie, transférer le gel coloré à l’aide d’une spatule dans un plat ou une assiette de puits avec un fond d’imagerie mince.
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Representative Results
La préparation de microgel d’alginate par amincissement par cisaillement pendant la gélification interne suivie d’une fragmentation mécanique donne des microgels d’alginate polydispersés de taille et de forme en flocons, comme le montre la figure 2G. La taille de ces particules irrégulières varie de moins de 1 μm à environ 40 μm de diamètre. Lorsqu’elles sont bien emballées, les microparticules forment un matériau en vrac transparent qui n’est que légèrement plus opaque que le milieu de culture cellulaire correspondant (Figure 2F). La transparence du matériau de support est un aspect important de la plate-forme car elle permet la visualisation des structures imprimées pendant la période de culture, ainsi que la microscopie confocale à haute résolution de constructions marquées à la fois avec des colorants de cellules vivantes et par immunocytochimie. Lorsqu’il est trempé dans un milieu de culture cellulaire tamponné, le gel ajusté au pH résultant doit avoir une couleur rouge, indiquant les conditions physiologiques (Figure 2F). Il est important de neutraliser le pH des microparticules d’alginate pour deux raisons. Les microparticules acides peuvent endommager directement les cellules. De plus, un environnement acide empêchera le recuit réussi du support composite SHAPE, car il interférerait avec la polymérisation du collagène.
L’impression de l’encre hNSC à l’aide des paramètres décrits ci-dessus donne un filament de cellules de ~200 μm de diamètre (Figure 4A). La géométrie programmée est conservée à la fois lors de l’impression dans un plan et lors de l’impression de structures les unes sur les autres. Dans le cas de l’impression multicouche, les structures imprimées restent intactes, avec une distance minimale couche à couche de 200 μm13. La viabilité des cellules ne doit pas être affectée de manière significative pendant la préparation de l’encre et l’extrusion. Les brins imprimés sont riches en cellules vivantes qui ont une morphologie ronde (Figure 4B, à gauche). Des trous dans les brins imprimés peuvent apparaître le lendemain de l’impression, même si la construction fabriquée ne présente aucune déformation immédiatement après l’impression. C’est très probablement le résultat d’un mélange inhomogène du support. Comme les cellules n’interagissent pas avec les microparticules d’alginate, elles migrent des zones riches en alginate vers les zones riches en collagène et en cellules, provoquant ainsi des ruptures dans les brins imprimés. De plus, le support SHAPE doit être sans bulles, car les poches d’air peuvent interférer avec la fidélité d’impression.
Une différenciation réussie des CSNh devrait produire des structures riches en neurones 30 jours après l’impression, avec des cellules présentant une morphologie neuronale avec de petits corps cellulaires et de longs processus minces (Figure 4B, à droite). De plus, si des motifs denses sont imprimés, comme une feuille rectangulaire de cellules, il ne devrait pas y avoir de lacunes visibles ou d’agrégats se formant pendant la différenciation, mais plutôt une couche continue de cellules devrait rester intacte (Figure 4C). Dans ce protocole, une procédure d’immunocytochimie par fluorescence des échantillons imprimés en 3D est décrite. La coloration de TUBB3, un marqueur neuronal cytoplasmique, permet la visualisation directe des réseaux neuronaux générés. La microscopie à fluorescence des impressions différenciées devrait révéler des structures riches en TUBB3 et à géométrie maintenue (Figure 4D, à gauche). Au cours du processus de différenciation, les cellules ne migrent pas hors des brins imprimés, comme on peut l’observer en colorant les noyaux cellulaires avec DAPI (Figure 4D, au milieu). En conséquence, les corps neuronaux sont observés dans les limites de la géométrie imprimée, avec des projections axonales qui émanent des centaines de micromètres dans le support SHAPE entourant la construction. L’exploration axonale du volume environnant indique que le support SHAPE fournit des indices biofonctionnels qui permettent la recherche axonale. Des marqueurs neuronaux plus matures ou des marqueurs spécifiques à un sous-type pourraient être utilisés en immunocytochimie pour caractériser davantage les populations neuronales générées. De plus, la construction neuronale imprimée a pu être caractérisée à l’aide de la RT-qPCR ou de l’électrophysiologie13. Les deux approches nécessiteraient toutefois l’élimination du collagène à l’aide de collagénase, car la couche d’hydrogel obstrue à la fois l’extraction de l’ARN et l’accès physique aux cellules avec une micropipette.
Figure 1 : Illustration conceptuelle de l’approche d’impression intégrée SHAPE. Une solution de collagène est mélangée à des microparticules d’alginate pour former le composite SHAPE; le composite SHAPE est utilisé comme matériau de support pour l’impression 3D intégrée de hNSC, qui sont différenciés en neurones à l’intérieur du support recuit. Les propriétés biofonctionnelles du composite SHAPE permettent aux neurones d’étendre les projections et de peupler la partie vide du support avec leurs projections axonales. Cette figure a été modifiée à partir de Kajtez et al.13. Abréviations : SHAPE = matrice extracellulaire particule-extracellulaire auto-cicatrisante et recuitable; hNSCs = cellules souches neurales humaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation des microparticules d’alginate. (A) La solution d’alginate après gélification pendant la nuit. (B) Les microparticules d’alginate générées par homogénéisation. (C) La pastille de particules après centrifugation. (D) La pastille remise en suspension dans le DMEM (E) avant l’ajustement du pH et après l’ajustement du pH. (F) Les microparticules après incubation en milieu pendant une nuit et centrifugation. (G) Une image en fond clair des microparticules d’alginate fabriquées. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Préparation du processus d’impression 3D. (A) Un bouchon de boue (~100 μL) est chargé dans la seringue suivi de (B) du chargement de la bio-encre cellulaire (ici complétée par des billes colorées à des fins de visualisation). (C) L’embout conique en plastique (21 G) utilisé pour le chargement de l’encre est remplacé par un embout d’aiguille en métal émoussé de 27 G. (D) La seringue est insérée dans la tête d’impression 3D. (E,F) Le composite SHAPE est pipeté dans un puits d’une plaque de 48 puits. Le tube avec le composite SHAPE est maintenu sur la glace lorsqu’il n’est pas manipulé. (G) La pointe de l’aiguille d’impression est insérée dans le support SHAPE et l’impression du chemin défini par la conception informatique est lancée (ici, l’impression d’une spirale est représentée). Abréviation : SHAPE = matrice extracellulaire particule-extracellulaire auto-cicatrisante et recuitable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Constructions neuronales imprimées en 3D à l’intérieur du support composite SHAPE. (A) Images en fond clair des CSNh imprimées à l’intérieur de l’hydrogel de support. Les conceptions de constructions en spirale (à gauche) et en pile de bois (à droite) sont affichées. (B) Imagerie de cellules vivantes d’une construction imprimée en 3D le lendemain de l’impression (à gauche) et après la différenciation neuronale (à droite). (C) Une construction carrée imprimée en 3D retirée d’un puits de culture avec une spatule présente une intégrité structurelle. (D) Images confocales de fluorescence de la même construction carrée immunomarquées pour un marqueur neuronal (TUBB3) et avec des noyaux contre-colorés (DAPI) confirmant la différenciation réussie des CSNh dans les constructions imprimées en 3D. Barres d’échelle = 500 μm (A, à droite); 100 μm (B,D). Les panneaux C et D de cette figure ont été modifiés à partir de Kajtez et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’approche des matériaux composites SHAPE offre une voie polyvalente pour la formulation de bains de support recuits et biofonctionnels pour l’impression 3D intégrée d’encres cellulaires. Bien que ce protocole fournisse un exemple d’impression 3D de constructions neuronales, la boîte à outils SHAPE pourrait facilement être adaptée à la biofabrication avec d’autres sources cellulaires pour l’ingénierie précise d’une gamme de types de tissus cibles. L’approche d’impression permettrait également de modéliser avec précision plusieurs types de cellules pour étudier leur interaction ou pour concevoir des tissus avec un arrangement spatial défini des compartiments cellulaires (par exemple, les neurones et les cellules gliales). Contrairement aux gels granulaires traditionnels, le composite SHAPE contient un espace interstitiel expansé (~30% fraction volumique pour la formulation présentée dans ce protocole). Le composant granulaire sert de modificateur rhéologique qui fournit au composite des propriétés de matériau favorables pour l’impression embarquée haute résolution. Cela ouvre la voie à une conception rationnelle du microenvironnement cellulaire en modifiant la formulation du composant continu tout en conservant le même composant granulaire. Par exemple, d’autres molécules ECM fonctionnelles pourraient être introduites dans le bain de support (p. ex. acide hyaluronique, laminines, fibronectine), ou différents mécanismes de réticulation pourraient être mis à profit (p. ex. enzymatique, à base de lumière)13. En outre, l’alginate dans le composant granulaire pourrait être remplacé par des microparticules provenant de différents matériaux hydrogels (par exemple, gélatine8, polyéthylèneglycol14,15, agarose 16) ou être fabriqué dans différentes tailles et formes en fonction des besoins de différentes applications d’ingénierie tissulaire ou de modélisation des maladies. Le rapport entre la phase granulaire et la phase continue peut être ajusté en fonction des besoins des projets d’impression 3D individuels, mais augmenter la phase continue au-delà de 30% pourrait compromettre la fidélité et la résolution de l’impression.
Pendant les étapes de production du microgel, il est essentiel que l’agitation de la solution d’alginate après l’ajout d’acide acétique soit efficace sur tout le volume de la solution gélifiante. Si la vitesse d’agitation est trop faible ou si l’agitateur magnétique est trop petit, l’agitation peut ne pas atteindre les couches supérieures de la solution, qui se transformeront en un grand volume d’hydrogel en vrac réticulé, tandis que les couches inférieures seront cisaillées. L’homogénéisation d’un hydrogel d’alginate cisaillé de manière incohérente entraînera la génération de microparticules d’alginate sous-optimales pour les applications d’impression 3D. En outre, les microparticules d’alginate doivent être soigneusement mélangées avec la solution de collagène, car un mélange non homogène entraînera des plaques du matériau de support dépourvues de collagène; Ces patchs ne seraient pas recuits et, par conséquent, manqueraient de fonctionnalités interactives cellulaires. Il pourrait également y avoir des patchs qui manquent de microparticules d’alginate et ne supporteraient donc pas l’impression. Un support d’impression mélangé de manière inhomogène ne serait donc pas en mesure de supporter l’impression haute fidélité et serait structurellement compromis, car il ne serait pas recuit sur tout son volume. Les bulles doivent également être évitées, non pas parce qu’elles pourraient être nocives pour les cellules, mais parce que les poches d’air pourraient provoquer des déformations lors de l’impression et interférer avec l’imagerie des constructions. Deux sources courantes de bulles sont le vortex (microbulles dans le support froid qui se dilatent pendant le recuit du support à 37 °C) et le pipetage vigoureux.
Le support composite SHAPE dans ce travail n’a pas été formulé comme un matériau sacrificiel à retirer après impression, mais plutôt comme un support biofonctionnel à long terme pour la différenciation des cellules souches et la croissance neuronale et la maturation fonctionnelle. Par rapport aux gels granulaires qui ne sont pas recuits après impression, la stabilité structurelle et la transparence du matériau composite SHAPE recuit fournissent un environnement protecteur pour les caractéristiques neuronales délicates pendant le processus de fixation et d’immunomarquage, et en tant que tel, ce matériau facilite la caractérisation morphologique via la visualisation des antigènes. Les rapporteurs de fluorescence pourraient également être utilisés pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire au fil du temps, ainsi que pour surveiller la prolifération cellulaire et la migration dans le support d’impression recuit. De plus, les approches d’imagerie calcique pourraient être utilisées pour fournir des informations sur l’activité cellulaire spontanée (par exemple, le déclenchement de potentiels d’action dans les neurones ou même l’activité synchrone du réseau neuronal). Cependant, la stimulation chimique des constructions cellulaires modifiées (par exemple, la stimulation neuronale utilisant KCl) peut être difficile en raison de la couche d’hydrogel entourant les cellules, ce qui ralentit la diffusion et empêche la modulation instantanée du microenvironnement cellulaire. La stimulation optogénétique présente une meilleure option pour le contrôle de l’activité cellulaire, car les hydrogels SHAPE n’obstruent pas l’accès optique aux cellules.
Des billes sensibles à l’oxygène pourraient être incorporées dans la bio-encre ou dans le matériau de support (par impression directe ou dispersion pendant la préparation du composite) pour permettre une cartographie spatiale et temporelle en direct des niveaux de tension d’oxygène à l’intérieur et autour des constructions imprimées avec une sensibilité élevée13. Cette approche non invasive de cartographie 3D de l’oxygène basée sur des mesures de la durée de vie de la phosphorescence fournit une voie vers l’ingénierie de constructions tissulaires avec une meilleure oxygénation, et probablement aussi un meilleur apport en nutriments. Une mauvaise oxygénation pourrait entraîner la formation de régions nécrotiques dans les constructions imprimées, interférer avec la différenciation des cellules souches et affecter le métabolisme neuronal. La cartographie de l’oxygène fournit une lecture sur la base de laquelle la conception de l’impression 3D pourrait être modifiée pour faciliter l’oxygénation uniforme tout au long de la construction, le réglage fin des niveaux d’oxygène pour correspondre aux conditions physiologiques ou la génération de gradients d’oxygène.
Des canaux techniques pourraient également être incorporés à l’intérieur du support d’impression recuit en imprimant une encre sacrificielle, telle que la gélatine, qui se solidifie à l’intérieur du bain de support froid mais peut facilement être évacuée à 37 °C 4,13. Des canaux seraient nécessaires pour fournir des nutriments et de l’oxygène aux constructions tissulaires ayant une densité cellulaire élevée ou des dimensions qui dépassent les capacités d’une approche de manipulation de la tension de l’oxygène fondée sur la conception. De plus, des canaux vasculaires pourraient être exploités pour créer des gradients de petites molécules qui déterminent la structuration de l’identité cellulaire, modulent l’activité cellulaire ou guident la chimiotaxie.
En résumé, l’impression 3D intégrée à l’intérieur du composite SHAPE offre une plate-forme de matériaux modulaire facilement adaptable et offrant un potentiel polyvalent pour la modélisation fonctionnelle des tissus mécaniquement sensibles. Le protocole présenté ici fournit une explication détaillée des étapes nécessaires et des principes de base nécessaires pour générer le matériau de support et imprimer l’encre cellulaire avec une haute fidélité. L’approche tire parti de matériel abordable et d’équipement accessible tout en offrant une marge de manœuvre pour personnaliser l’approche en fonction des besoins et des applications de chaque chercheur.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
La recherche a été principalement financée par le programme Horizon 2020 de l’Union européenne BrainMatTrain (n° H2020-MSCA-ITN-2015) dans le cadre du réseau de formation initiale Marie Skłodowska-Curie et de la convention de subvention n° 676408. C.R. et J.U.L. tiennent à remercier la Fondation Lundbeck (R250-2017-1425) et le Fonds de recherche indépendant du Danemark (8048-00050) pour leur soutien. Nous remercions le projet HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
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